Università Politecnica delle Marche Facoltà di Medicina e Chirurgia DIPARTIMENTO DI SCIENZE CLINICHE E MOLECOLARI LABORATORIO DI PATOLOGIA SPERIMENTALE Dottorato di Ricerca in Medicina e Chirurgia curriculum: “Scienze della Sicurezza e della Tutela della Salute negli Ambienti di Lavoro” XII CICLO
MicroRNA circolanti nell'invecchiamento e nelle patologie età-‐associate
Dottorando:
Dott. Gabriele Santini
Coordinatore: Chiar.mo Prof. Antonio Procopio
Tutor: Chiar.mo Prof. Antonio Procopio
Triennio 2011-‐2013
Indice Introduzione MiRNA miRNA: struttura, biogenesi e funzione Biogenesi dei miRNA Regolazione dei target ad opera di miRNA MiRNA circolanti Ruolo dei miRNA nelle patologie umane Malattie cronico-‐degenerative:
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Scopo della Tesi
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Quantificazione dei miR circolanti
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Tecnologia impiegata PCR; RT-‐PCR Real Time-‐PCR MiRNA Profiling
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Casistica
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Materiali e metodi Partecipanti allo studio: Estrazione RNA da plasma umano MiRNA Profiling RTq-‐PCR validazione. RTq-‐PCR validazione di mRNA TGF-‐βR2 in Leucociti. Analisi statistica EFA (ExploratoryFactor Analysis) Predizione dei pathways di miRNA Analisi di regressione e correlazione
30 30 30 31 31 33 33 34 34 35
Risultati Profiling dei miRNA circolanti: Analisi statistica EFA dei miRNA circolanti: Pathways identificati dal sistema statistico EFA. Validazione dei miRNA circolanti. Livello di espressione del miRNA-‐21 circolante in casi di CVD e figli di centenari. TGF-‐β come target del miR-‐21
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Conclusioni
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Bibliografia
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Introduzione L’età media della popolazione dei paesi sviluppati ed in via di sviluppo sta aumentando ad un ritmo alquanto veloce e questo comporta che una percentuale sempre più crescente di soggetti è a rischio di sviluppo di malattie cronico-‐ degenerative come il diabete, l’infarto del miocardio o la degenerazione del sistema nervoso (Parkinson e Alzheimer). Nella continua corsa alla ricerca di una cura efficace per queste malattie cronico-‐ degenerative, si è cercato di identificare marcatori diagnostici sempre più precoci, sensibili e specifici. In ambito diagnostico stanno emergendo nuove tecnologie capaci di diminuire il tempo di attesa della diagnosi e di migliorarne l’accuratezza. Proprio nell’ambito della Biologia Molecolare è stato possibile trovare nuovi marcatori molecolari utili ad identificare e quindi promuovere un tempestivo intervento: si tratta dei microRNA (miRNA), ovvero piccole sequenze di RNA capaci di modulare la traduzione della maggior parte dei geni codificanti per le proteine. Ad oggi i miRNA stanno suscitando un forte interesse in ambito sia diagnostico sia prognostico sia terapeutico per le principali malattie cronico-‐degenerative.
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MiRNA Sin dalla scoperta del DNA e dalla sua identificazione strutturale ad opera di Watson e Crick, la comunità scientifica internazionale si è sempre domandata quale fosse l’entità del materiale genetico umano. Soltanto tramite il Progetto Genoma Umano, completato nel 20031, è stato possibile identificare il numero delle basi di DNA presenti in ogni singola cellula umana: si tratta di miliardi di nucleotidi che, potenzialmente, codificherebbero per un numero infinito di proteine. Tuttavia, da ulteriori analisi i ricercatori hanno definito che il 90% del materiale genetico umano non viene impiegato per codificare le proteine e per questo era stato precedentemente definito come materiale genetico spazzatura (Junk DNA). Perchè la cellula dovrebbe investire risorse energetiche per mantenere una quantità così grande di DNA che non serve per produrre proteine? La risposta più accreditata ed ancora in fase di definizione è che il DNA non codificante abbia negli eucarioti una funzione di regolazione dell’espressione del DNA codificante. Il suddetto DNA non codificante viene trascritto in RNA formando le numerose specie di non-‐coding RNA, fra cui la classe di microRNA.
miRNA: struttura, biogenesi e funzione I miRNA sono molecole di RNA a singolo filamento costituite da ≈20 nucleotidi. La loro presenza all’interno del genoma umano è molto diffusa e sono dislocati in svariate regioni presenti su tutti i cromosomi. La funzione principale, finora individuata, di questi filamenti di RNA è un sistema di regolazione di espressione genica a livello dell’ RNA messaggero (mRNA). 1 http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml 4
Mediante la loro funzione, essi possono regolare: 1. Sviluppo embrionale e cellulare 2. Differenziazione cellulare 3. Proliferazione 4. Morte cellulare 5. Metabolismo (Klosterman 2006, Gangaraju 2009, Bushati 2007) Approcci sperimentali e ricerche computazionali indicano che un singolo miRNA può avere centinai di siti target in diversi mRNA. Inoltre, più del 60% dei geni codificanti proteine nell’uomo contengono dei siti di legame per i miRNA (Selbach 2008). I miRNA eseguono la loro attività biologica mediante l’associazione con un complesso multi-‐proteico denominato RNA Induced Silencing Complex (miRISC). Questo complesso richiede la presenza di un dimero miRNA-‐mRNA, nel quale vi è una non-‐ perfetta complementarietà tra le sequenze del miRNA e del mRNA. Il sito target del miRNA si trova principalmente nella regione 3’-‐untraslated region (UTR) del mRNA bersaglio, ma occasionalmente si possono trovare siti nella regione 5’-‐UTR (Lytle 2007) o nella regione codificante (Forman 2008). L’assenza di complementarietà perfetta tra il miRNA e la sequenza target indica che una componente del miRNA presenta una evoluzione conservativa per poter innescare la regolazione genica: questa porzione è rappresentata dalla regione 3’ che ha la capacità di identificare il sito target nel mRNA (Bartel 2009). Il meccanismo molecolare della regolazione genica mediata dai miRNA è alquanto incompreso: ad oggi è possibile ipotizzare che i miRNA provochino un blocco della traduzione nella fase di iniziazione e/o elongazione. In alternativa, si prospetta che i miRNA potrebbero essere sequestrati e trasferiti nei “processing-‐bodies” p-‐bodies, dove essi verrebbero degradati (Bhattacharyya 2006) 5
Biogenesi dei miRNA Il meccanismo di biogenesi dei miRNA (Figura 1) è uno dei sistemi più conservativi tra le varie specie viventi. In prima analisi, all’interno del nucleo, il filamento di RNA (pri-‐miRNA) viene trascritto dalla Polimerasi II (POL II) e processato mediante un complesso proteico denominato Drosha (un enzima della famiglia delle RNAsi di tipo III di classe 2), il quale esegue un taglio del filamento di RNA per ottenere un frammento di lunghezza compresa tra 60 e 100 nucleotidi che prende il nome di pre-‐ miRNA. Questo stato intermedio è costituito da una struttura ad harpain-‐loop dove la complementarietà delle basi che costituiranno il miRNA permette il riconoscimento e il successivo clivaggio ad opera di Drosha. La seconda fase prevede il trasporto attivo del pre-‐miRNA all’esterno del nucleo tramite le proteine Exportina-‐5 e Ran-‐GTP; quest’ultima agisce come un canale attivato dalla proteina GAP (GTPase Activator Protein), la quale idrolizza il GTP a GDP+Pi attivando il canale di passaggio dal nucleo al citoplasma e permettendo così il trasporto di sequenze di RNA da parte delle esportine. L’ambiente citoplasmatico impedisce la permanenza di molecole di RNA che non devono essere tradotte: questo rappresenta un sistema di auto-‐controllo per evitare la diffusione di sequenze errate di RNA che potrebbero condurre a traduzioni errate. Proprio per questo motivo i pre-‐miRNA vengono immediatamente catturati dal Complesso Dicer: esso catalizza la prima reazione del processo di RNA interference, producendo le molecole di siRNA (RNA a doppio filamento di 21 nucleotidi con estremità 3' sporgente). L'enzima appartiene alla famiglia delle RNAsi di classe III (specifiche per i dsRNAs), ed opera il taglio in modo ATP-‐dipendente. Questa agisce riconoscendo le estremità 3'derivanti dal processamento di Drosha e crea così due 6
molecole a singolo filamento lunghe circa 21 nucleotidi: una sarà il miRNA maturo e l’altra sarà un filamento che verrà degradato o costituirà un ulteriore miRNA contraddistinto dal simbolo “*”. I miRNA interagiscono in maniera specifica con le proteine Argonauta (sottofamiglia Ago) e sono incorporati in grandi complessi di ribonucleoproteine effettrici chiamati RISC. RISC, acronimo di “complesso di silenziamento indotto da RNA”, ha un centro catalitico rappresentato dalle proteine Argonauta: si tratta di proteine di circa 100 kDa, chiamate anche proteine "PPD" perché costituite dai domini PAZ e PIWI. È proprio il dominio PAZ della proteina Argonauta che prende contatto con il filamento 3’ protrudente mentre il filamento 5’ della stessa estremità contenente il fosfato viene legato dal dominio Mid. All’interno del RISC, il doppio filamento di RNA viene svolto e questo porta alla selezione di uno dei due filamenti come miRNA maturo; l’altro filamento, invece, viene rapidamente degradato (processo di selezione del filamento).
Figura 1: Rappresentazione schematica della biogenesi dei miRNA.
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Regolazione dei target ad opera di miRNA I miRNA espletano la loro funzione biologica andando a destabilizzare la struttura del mRNA target, così da provocare una riduzione della funzionalità del meccanismo di traduzione e, conseguentemente, la mancanza della proteina target. Ciò avviene sia negli animali sia nelle piante e la via più utilizzata dai miRNA rappresenta la degradazione del mRNA e la conseguente interruzione del processo di traduzione. Esistono, tuttavia, altri meccanismi simili (Figura 2).
Figura 2: Meccanismo di regolazione dei geni target ad opera dei miRNA. (eIFs): complesso dei fattori di iniziazione eucariotici; (PABPC): Cytoplasmyc poly(A)-‐biding protein; (AGO): Argonaute; (FMR1): Fragile X Mental retardation Protein 1.
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Inizialmente si forma un complesso proteico denominato eIFs, il quale interagisce con il complesso PABPC permettendo l’avvicinamento dell’estremità 5’ con l’estremità 3’: ciò promuove l’attivazione del meccanismo di traduzione operata dai ribosomi (Figura 2, in rosa). I meccanismi di regolazione dei miRNA sono (Figura 2): a) Taglio endonucleolitico: il perfetto appaiamento miRNA-‐mRNA induce un taglio endonucleolitico ad opera di proteine denominate argonauta (AGO) con la conseguente degradazione del mRNA. b) Deadenilazione e degradazione: un appaiamento imperfetto tra il miRNA e la regione 3’ UTR causa la deadenilazione del mRNA tramite l’aggregazione con il complesso CCR4-‐NOT (miRISC) e GW182. Ciò comporta la dissociazione del mRNA dalla PABPC e la conseguente degradazione dello stesso. c) Inibizione dell’inizio di Traduzione: il complesso miRSC, tramite l’associazione con CCR4-‐NOT e GW182, blocca l’inizio della traduzione. d) Inibizione post-‐ inizio traduzione: il complesso miRSC causa la proteolisi del peptide nascente o la dissociazione dei ribosomi. e) Stimolazione della Traduzione: in alcuni casi si osserva un aumento di espressione di alcuni geni target ad opera dei miRNA; ciò avviene quando un fattore (FMR1, nell’esempio riportato in Figura 2) si associa alla proteina AGO e impedisce la degradazione del mRNA promuovendo la traduzione dello stesso.
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MiRNA circolanti Se è vero che la biogenesi dei miRNA è un processo del tutto intracellulare, è ormai chiaro che tali molecole vengono rilasciate dalle cellule nell’ambiente circostante, e possono essere internalizzate dalle cellule target su cui esplicano la loro attività biologica. L’azione dei miRNAs risulta quindi di tipo paracrino. Il rilevamento di microRNA in circolo ha dimostrato però che tali molecole possono agire anche a distanza, muovendosi appunto attraverso il torrente circolatorio. La presenza di miRNA nel circolo sanguigno è una scoperta recente. In condizioni normali i filamenti di RNA, come il DNA, non possono circolare liberi nel torrente sanguigno in quanto andrebbero incontro a degradazione ad opera di RNAsi o DNAsi. Nel caso specifico dei miRNA, ciò non avviene poiché essi sono inglobati all’interno di strutture che li proteggono dalla degradazione (Zhu 2011). Sono stati individuati diversi sistemi di trasporto dei miR circolanti quali: •
Microvescicole: sono componenti cellulari attivamente prodotte dalle cellule, il cui contenuto è nella maggior parte dei casi costitutito da interleukine e miRNA. Sulla superficie esterna presentano delle proteine che fungono da siti recettori per la comunicazione cellulare: ciò consente alle microvescicole di essere assorbite da una cellula ospite e rilasciare il loro contenuto nel citoplasma del ricevente. In questo caso i miRNA sono potenzialmente attivi e funzionali per svolgere la loro funzione anche nella cellula ricevente.
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Corpi apoptotici: recentemente sono stati individuati dei corpi apoptotici di cellule endoteliali ricchi di miR-‐126. Questi corpi, incubati con cellule ombelicali (HUVEC) hanno prodotto il trasferimento del miR-‐126 nelle cellule 10
accettrici e la conseguente diminuzione di espressione del gene RGS16, un target conosciuto del miR-‐126. (Zhu 2011) •
Trasporto Proteina-‐mediato: alcuni studi hanno messo in evidenza come alcuni miRNA non sono presenti all’interno dei sistemi sopra citati ma sono liberi nel torrente sanguigno. Essi verrebbero immediatamente degradati se non fossero complessati con proteine quali Ago2 o NPM1 (Nucleophoismin 1) o con alcuni metaboliti cellulari come HDL (miR 373) che ne permettono la sopravvivenza nel sangue. Questi complessi proteina-‐miRNA vengono poi riconosciuti da cellule e possono esser degradati o assorbiti nel citoplasma ricevente.
Il meccanismo cellulare alla base della produzione di miRNA circolanti è facilmente rappresentabile nel caso dell’infarto del miocardio: esso è uno stato infiammatorio acuto dove alcune cellule muscolari miocardiche vanno incontro a morte per necrosi. La loro morte può dipendere da diversi fattori come la mancanza di apporto di ossigeno ad opera delle coronarie (aterosclerosi). Questo stato di stress provoca la morte cellulare e i miRNA che vengono prodotti in risposta allo stress vengono riversati nel circolo sanguigno dove essi vengono trasportati e assorbiti dalle cellule riceventi presenti nei distretti lontani dell’organismo (Figura 3).
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Figura 3: Rappresentazione schematica della produzione di miRNA-‐circolanti in risposta ad uno stress cellulare come l’infarto del miocardio.
I miR circolanti rappresentano quindi dei potenziali biomarcatori sistemici che potrebbero avere valenza clinica per la diagnosi/prognosi di specifiche patologie umane.
Ruolo dei miRNA nelle patologie umane Nel campo genetico l’espressione di un gene è spesso correlata con la produzione di una proteina che svolge la sua funzione biologica in maniera fisiologica. Si conoscono numerose malattie genetiche che, a causa di singole mutazioni genetiche, presentano proteine mancanti o difettose (ad esempio la Distrofia di Duchenne). I miRNA sono altresì coinvolti nell’evoluzione patologica di alcune malattie poiché regolano 12
l’espressione di geni che possono essere fondamentali per lo status fisiologico dell’organismo. La deregolazione dei miRNA in alcune patologie è legata alla loro dislocazione all’interno del genoma. Essi, infatti, essendo presenti all’interno dei mRNA, sono soggetti agli stessi sistemi di controllo pre-‐trascrizionale e post-‐ trascrizionale. Di conseguenza un miRNA può essere inoffensivo se viene regolato in maniera corretta dal sistema cellulare ma diventa molto pericoloso nel caso ciò non avvenga. In queste condizioni il miRNA viene iper-‐espresso (di conseguenza anche il mRNA che lo contiene) e questo va a determinare una repentina diminuzione del mRNA target con la conseguente perdita di funzionalità della proteina target. I miRNA sono riscontrabili anche all’esterno dei mRNA e in queste condizioni una loro iper-‐espressione è associata a modificazioni della struttura del genoma. In determinate condizioni patologiche alcune porzioni di genoma vengono attivate e, se queste presentano dei miRNA, anch’essi verranno espressi: questa è la condizione presente in loci genomici ricchi in sequenze ripetute definite Elementi Transponibili (TE), ad esempio le sequenze Alu e L1. In questi loci, la presenza di una famiglia di miRNA può subire modificazioni regolatorie in base all’attività trascrizionale delle sequenze TE presenti nelle vicinanze: ciò favorisce la duplicazione di famiglie di miRNA (ZQ 2013). Alcuni miRNA sono correlati a specifici tessuti (muscolo scheletrico, fegato, cuore) e ciò dipende dal fatto che alcune famiglie di miRNA sono dislocate in porzioni del genoma che sono attive solo in quel determinato tessuto e di conseguenza vengono attivati i miRNA precedentemente citati. Nello studio delle patologie, i miRNA possono essere impiegati nello specifico come biomarkers predittivi per alcune disfunzioni.
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Malattie cronico-‐degenerative: Le malattie cronico degenerative rappresentano una classe di patologie correlate all’aumentare della longevità. Molto probabilmente queste alterazioni sono dovute alla sommatoria di piccole disfunzioni che, accumulandosi, sfociano in una determinata patologia. Le malattie cronico-‐degenerative riguardano quasi tutti i tessuti dell’organismo poiché in essi il ciclo cellulare, subendo delle alterazioni, viene compromesso e di conseguenza la normale funzionalità biologica viene modificata. All’interno di questa classe è possibile riscontrare numerose patologie tra le quali le più importanti (per frequenza) sono: •
Diabete
•
Patologie Cardiovascolari
Diabete Mellito (DM) Fa parte del gruppo delle patologie metaboliche ed è caratterizzato da un’eccessiva presenza di glucosio nella circolazione sanguigna dovuta alla carenza di insulina prodotta dalle cellule β nel pancreas (isole di Langherans) (Shoback 2011). In condizioni fisiologiche l’insulina prodotta dal pancreas permette l’accumulo del glucosio sotto forma di glicogeno, riducendo la quota di glucosio ematico. L’elevata concentrazione di glucosio in circolo induce una sintomatologia caratteristica in cui si riscontrano: •
Poliuria
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Polidipsia
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Polifagia
Esistono tre principali tipologie di Diabete: 14
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DM tipo 1: l’organismo non è capace di produrre insulina e, a causa di questa carenza, il glucosio rimane libero nel circolo sanguigno. Questa tipologia viene anche classificata come immuno-‐mediata o idiopatica. Nella maggior parte dei casi di DM 1, le cellule β vengono distrutte da attacchi immuno-‐mediati ad opera dei Linfociti T (Rother 2007): in questo caso il paziente è obbligato ad iniettarsi insulina . Questa tipologia di patologia viene anche definita come “ Diabete Mellito Insulino-‐Dipendente” o “Diabete Giovanile”.
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DM tipo 2: l’organismo sviluppa una resistenza all’insulina , creando una situazione in cui le cellule non riescono ad utilizzare in maniera appropriata l’insulina. Questa tipologia di Diabete viene definita anche “Diabete Mellito Insulino-‐Indipendente” ed è riscontrabile nelle persone adulte o anziane.
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DM tipo 3: è definita anche “Diabete Gestazionale” e si manifesta quando una donna incinta, senza una diagnosi accurata, sviluppa un elevato livello di glucosio nel sangue. Questa tipologia si tramuterà, nel corso del tempo, in DM di Tipo 2.
Il DM tipo 1 può essere curato tramite la somministrazione di insulina, mentre nel diabete di tipo 2 è necessario intervenire con interventi dietologici o farmacologici di tipo ipoglicemizzante. Se non oppurtunamente curato, il DM può causare diverse complicanze quali: •
Patologie cardiovascolari
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Retinopatia diabetica
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Nefropatia
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Neuropatie
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Patologie Cardiovascolari Comunemente vengono definite come malattie cardiache e sono una classe di patologie che colpiscono prevalentemente il cuore, i vasi sanguigni o entrambi. Queste patologie dipendono da diversi fattori di rischio come ipertensione o aterosclerosi e si presentano nella maggior parte dei casi come asintomatiche. Le malattie cardiovascolari sono al primo posto nella classifica di morte dal 1970 e vengono sempre più messi a punto nuovi marcatori per prevenire questi tipi di patologia. La tipologia più rappresentativa di questa classe di malattie è l’infarto del miocardio, in cui il cuore non è più capace di esercitare la pressione sufficiente per far circolare la giusta quantità di sangue all’interno dei tessuti. In questo caso il cuore si trova in una condizione di sforzo prolungato a cui consegue un’acutizzazione dello stato infiammatorio miocardico: ciò causa l’accumulo di molecole tossiche che danneggiano il muscolo cardiaco (McMurray 2005). Lo stato infiammatorio cronico del miocardio può avere delle conseguenze patologiche croniche o acute. •
Croniche: o Aterosclerosi o Scompenso cardiaco o Alterazione dei tessuti sanguigni
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Acute: o Infarto del miocardio
Le complicanze insorgono parallelamente all’avanzare dell’età e in presenza di fattori di rischio associati alle malattie cardiovascolari come: •
Assunzione di alcol
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Fumo di sigarette 16
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Dieta ricca in acidi grassi animali e povera di fibre vegetali
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Predisposizione genetica
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Stress.
Il fattore stress sta riscuotendo sempre maggiore interesse, includendo in questo ambito sia stress fisici che psichici. Le malattie cardiovascolari devono essere prevenute, diagnosticate in maniera tempestiva e curate in maniera appropriata. Nella civiltà moderna l’insorgenza dell’infarto del miocardio avviene ad età sempre più avanzate, anche se stanno aumentando anche i casi di infarto in età più giovanile. La patologia interessa maggiormente gli uomini rispetto alle donne che sono in età fertile, probabilmente protette dagli elevati livelli ormonali. Dopo la menopausa, però, il rischio di infarto nella donna aumenta progressivamente fino a raggiungere dopo i sessanta anni i livelli di rischio osservati nell’uomo. La ricerca ha consentito di migliorare nel tempo i sistemi diagnostici per le malattie cardiovascolari. Molto utili risultano essere anche i markers circolanti: fra i markers di maggiore utilizzo nella pratica clinica ricordiamo la Proteina-‐C Reattiva (PCR), il cui aumento indica la presenza di uno stato pro-‐infiammatorio del miocardio, e le troponine cardiache I e T, il cui aumento si associa a necrosi dei cardiomiociti. Purtroppo anche questi marcatori hanno delle limitazioni, soprattutto con i pazienti più anziani, in cui i livelli di proteina C reattiva possono aumentare per la presenza di stati infiammatori cronici ed i livelli di Troponina I e T possono essere aumentati in presenza di patologie diverse dall’infarto del miocardio. (Goch 2009, Alcalai 2007, Agewall 2011). E’ quindi giustificato lo sforzo dei ricercatori per identificare nuovi marcatori circolanti più sensibili e specifici per la diagnosi precoce dell’infarto del miocardio, e di altre patologie cardiovascolari. 17
Scopo della Tesi Per poter valutare la reale rilevanza clinica di specifici microRNA circolanti nelle malattie associate all’invecchiamento, è necessario identificare eventuali cambiamenti età-‐associati dei livelli dei microRNA circolanti in soggetti sani.
Quantificazione dei miR circolanti Come precedentemente descritto, nell’organismo umano esiste una grande quantità di miRNA che vengono più o meno espressi in tutti i vari tessuti. I miRNA possono essere presenti anche in circolo e proprio i miR circolanti rappresentano i biomarcatori sistemici più promettenti per migliorare la diagnosi/prognosi delle patologie umane. Alcuni elementi critici per l’ utilizzo dei miRs come markers di patologie sono: •
Specificità e sensibilità dei microRNA associati alla patologia
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Sistema di determinazione veloce e accurato.
Ad oggi le tecniche di determinazione delle molecole circolanti prevedono l’utilizzo di sistemi automatizzati. Alcuni marcatori, se determinati con questi metodi, presentano degli svantaggi: •
Minore accuratezza nella determinazione
•
Processamento del campione con conseguente perdita di materiale.
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Il metodo qui identificato prevede l’impiego della tecnica di PCR (Polimerase Chain Reaction) che permette di quantificare in maniera relativa la concentrazione di una determinata sequenza miRNA presente in un campione.
Tecnologia impiegata PCR; RT-PCR Il metodo della PCR è un sistema di determinazione molecolare inventato negli USA negli anni ’70 che prevede l’utilizzo di un enzima TaQ Polimerasi per amplificare una sequenza target utilizzando dei primer a DNA di innesco (Figura 4). La PCR prevede la presenza di una sequenza di DNA target che funge da filamento di stampo per la duplicazione. Nella miscela di reazione, l’enzima TAQ Polimerasi utilizza un primer di innesco a DNA (primer Farward e primer Reverse), complementare al DNA target, per aggiungervi nucleotidi, producendo una copia esatta. Mediante questa reazione la sequenza target viene amplificata e il ciclo viene ripetuto per aumentarne la concentrazione. Mediante la tecnica della PCR è possibile eseguire due tipologie di determinazione: •
Qualitativa: il risultato della reazione di PCR viene caricato su un gel elettroforetico e, data la grande quantità della sequenza target, si osserverà una banda corrispondente alla lunghezza della sequenza amplificata, indicando la presenza/assenza della sequenza Target. 19
•
Quantitativa: nelle stesse condizioni di reazione vengono amplificati dei campioni a concentrazione nota di sequenza Target, i quali fungeranno da punti di calibrazione per la costruzione di una retta di taratura che servirà per la determinazione della concentrazione della sequenza Target incognita.
La tecnica della PCR prevede la duplicazione del DNA in quanto la TaQ polimerasi non è capace di amplificare sequenze di RNA. Per lo studio dell’espressione genica, viene utilizzata una variante della tecnica di PCR denominta RT-‐PCR (RetroTrascriptase-‐ PCR), dove una Trascrittasi inversa produce un filamento di DNA a partire da una sequenza di RNA: in questo modo il filamento di RNA viene convertito in uno a DNA e, quindi, la reazione di PCR può avvenire con le modalità descritte precedentemente . Le tecniche qui descritte prevedono l’impiego di un termociclatore, ossia un sistema capace di modificare la temperatura della reazione e mantenerla stabile per un determinato periodo di tempo dipendente dalla metodica utilizzata.
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Figura 4: Rappresentazione schematica della reazione di PCR. Aumentando la temperatura del sistema di reazione avviene la denaturazione del doppio filamento di DNA. Ad una data temperatura (definita temperatura di Annealing) i primer di innesco (specifici per la sequenza target) si legano alle sequenze complementari, successivamente l’enzima TAQ Polimerasi, utilizzando i primer d’innesco aggiungono nucleotidi complementari alla sequenza target replicandola. Il Ciclo si ripete aumentando la concentrazione della copie della sequenza target.
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Real Time-PCR Le tecniche della PCR e della RT-‐PCR vengono definite come “end-‐point” in quanto le reazioni non sono misurabile in tempo reale ma esclusivamente a reazione conclusa: ciò pone come svantaggio l’impossibilità di controllare la reazione durante il suo sviluppo e di osservare la presenza di addotti o amplificati aspecifici. Per ovviare a questa limitazione è possibile utilizzare la tecnica della Real Time-‐PCR che prevede l’utilizzo di una sonda a DNA che, se eccitata, emette un segnale di fluorescenza registrato dal termociclatore e trasformato in un segnale elettronico capace di monitorare l’andamento della reazione. Esistono varie tecnologie di emissione del segnale ad opera della sonda ed il sistema impiegato per la determinazione dei miRNA viene definito come TAQMAN. Esso prevede che una sonda a DNA complementare ad una porzione della sequenza amplificata si leghi al sito di riconoscimento; inoltre, sfruttando la capacità 5’esonucleasica della TAQ Polimerasi, la sonda viene degradata ed un cromogeno ad essa legata emette un segnale di fluorescenza. Sfruttando questo metodo è possibile monitorare tutta la reazione di PCR in quanto il termociclatore esegue una lettura del segnale di fluorescenza ad ogni ciclo producendo un grafico (Figura 5).
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Figura 5: Grafico di Real Time PCR. L’intensità di fluorescenza della sonda aumenta all’aumentare del numero di cicli di reazione in quanto aumentano il numero dei duplicati della sequenza target.
La tecnica qui descritta prevede l’utilizzo di un termociclatore con un sistema di rilevazione della fluorescenza. La tecnica della Real-‐Time PCR viene comunemente impiegata nello studio dei livelli di espressione genica di mRNA in quanto, se accoppiata ad una fase di retro trascrizione, determina il livello di espressione di un mRNA all’interno di un campione utilizzando un controllo interno (normalmente un gene comunemente e quantitativamente sempre espresso ad esempio GAPDH). Lo studio dei miRNA presenta un’ulteriore complessità poiché i miRNA maturi presentano una lunghezza di circa 20 nucleotidi e questo ne impedisce il riconoscimento del primer di innesco per la TAQ polimerasi in quanto esso stesso ha una lunghezza di circa 20 nucleotidi. Per ovviare a questo limite, la società Applied Biosystems (Life Technologies s.d.)ha sviluppato un sistema di rilevazione dei miRNA in Real-‐Time PCR che prevede ulteriori passaggi. 23
Nel dettaglio: 1. Fase di Retrotrascrizione: la procedura prevede l’utilizzo di un primer per RT, il quale presenta una forma di loop in cui alcuni nucleotidi mostrano una complementarietà. Una porzione del primer è complementare a sua volta con il miRNA target nella posizione 3’. La funzione del primer con forma di loop è anche quella di proteggere l’estremità 3’ del miRNA maturo che, altrimenti, verrebbe degradato nella fase di RT. Infine, il primer presenta anche una sequenza di innesco per la reazione di RT. In seguito al riconoscimento del primer con il miRNA target, si verifica la produzione di un filamento di DNA complementare (cDNA) al miRNA Target (Figura 6).
Figura 6: Reazione di Retrotrascrizione (RT). Il filamento rosso corrisponde al miRNA target, il filamento blu corrisponde al Primer per RT, il filamento verde corrisponde alla sequenza di innesco per la RT.
2. Fase di Real-‐Time PCR: successivamente alla produzione del cDNA ottenuto dal miRNA target si procede con la fase di Real-‐Time PCR dove un primer d’innesco, complementare al cDNA specifico del miRNA target, promuove la duplicazione della sequenza. Al momento della duplicazione della sequenza avviene il riconoscimento del target ad opera di una sonda: essa si lega in siti
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differenti sia al primer RT sia al cDNA del miRNA; grazie a questo sistema la sonda è particolarmente sensibile per l’analisi di piccoli frammenti di RNA. La sonda utilizza un quencher ossia un attenuatore del cromoforo. Nello stato di riposo il quencher è legato al cromoforo; solamente quando la sonda riconosce il sito target, il quencher si distacca dal cromoforo, che è quindi libero di emettere fluorescenza (Figura 7).
Figura 7: Reazione di Real-‐Time PCR. NFQ: non-‐fluorescent Quencher, MGB: minor groove binder, R: reporter (cromoforo).
La funzionalità e la specificità del sistema applicato sono due vantaggi di questa tecnica oltre alla rapidità di analisi come dimostrato in Figura 8, fattore importante per la diagnostica molecolare.
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Figura 8: Timing di reazione RT/Real Time PCR per la determinazione dei miRNA. Tempo stimato di analisi circa 3 ore.
MiRNA Profiling La determinazione di miRNA circolanti presuppone una fase iniziale di screening dei miRNA presenti nel campione. Questo procedimento consente l’identificazione di miRNA circolanti di cui non si hanno dati noti sulla loro presenza nel campione di origine. In questo caso è impossibile analizzare un campione e testarlo per tutti i miRNA conosciuti e presenti in letteratura scientifica. Per ovviare a questo limite viene utilizzata la tecnica del miRNA profiling che esegue uno screening di numerosi miRNA di una selezionata specie utilizzando le metodiche precedentemente descritte della RT/Real-‐Time PCR. Tramite questa procedura è quindi possibile eseguire una valutazione semi-‐quantitativa e qualitativa della presenza o meno di un miRNA di interesse. Inoltre, è anche possibile determinare un pattern di espressione di miRNA in risposta a stress o a particolari condizioni: ad esempio nel campo delle malattie 26
cronico-‐degenerative è possibile comparare un campione di un paziente sano con un campione di un paziente con infarto del miocardio NSTEMI o con insufficenza cardiaca (CHF) (Olivieri 2012). La società Lifetechnologies (Life Technologies s.d.) ha sviluppato un sistema che permette questa identificazione, sfruttando la capacità di analizzare in parallelo diversi miRNA su di un unico supporto in maniera tale da ottenere un pattern di miRNA impiegando un periodo di tempo limitato. Il fulcro di questa procedura risiede nella dispensazione del campione (tessuto, siero o plasma) su di una micro-‐plate dove in ciascun pozzetto di reazione sono presenti i primer specifici per ciascun miRNA di interesse (Figura 9). Nel caso specifico di questo studio sono stati analizzato 365 diversi miRNA maturi e alcuni “small nucleolar RNA”(snoRNA). Il campione viene pretrattato con una reazione di pre-‐ amplificazione grazie alla quale la quantità dei miRNA viene aumentata in maniera non selettiva: il campione viene poi inserito all’interno delle piastre dove avviene l’amplificazione selettiva del miRNA di interesse. La procedura che richiede la pre-‐amplificazione viene impiegata per far aumentare la sensibilità del sistema e rendere la procedura più efficace. Il limite di questa tecnica risiede nel fatto che non è possibile eseguire un’analisi quantitativa in quanto tutti i miRNA vengono amplificati in maniera non selettiva durante la fase di pre-‐ amplificazione: ciò comporta che, dopo aver individuato un pattern di miRNA di interesse, si debba eseguire la determinazione utilizzando il metodo della RT/Real-‐ Time PCR specifica per ciascun miRNA.
27
Figura 9: Rappresentazione schematica dei primers specifici per i miRNA presenti nella piastra di analisi per il Profiling (Life Technologies s.d.)
28
Casistica I partecipanti allo studio sono stati reclutati presso l’Istituto Nazionale di Ricovero e Cura per l’Anziano (I.N.R.C.A.) di Ancona, coinvolto nel Programma di Prevenzione delle malattie Cardiovascolari, e presso l’Università di Bologna e di Firenze, centri aderenti al programma “Biomarkers of longevity”. Lo studio in esame si basa sull’analisi dei miRs su campioni di plasma prelevati da soggetti sani di differente età e prevede una prima casistica su cui è stata effettuata l’analisi di profiling ed un ulteriore casistica più ampia impiegata per la validazione dei risultati ottenuti dal profiling. •
CASISTICA PROFILING o 20-‐30 anni o 30-‐80 anni o 80-‐100 anni o Ultra centenari (>100 anni)
•
CASISTICA VALIDAZIONE o 111 soggetti tra i 20 e i 100 anni di età.
Questi soggetti sono stati selezionati per l’assenza di malattie cronico-‐degenerative quali l’Infarto acuto del miocardio, l’insufficienza cardiaca congestizia (CHF), la malattia di Alzheimer, il Diabete mellito di tipo 2 (T2DM) o il cancro. Inoltre sono stati selezionati 15 figli di centenari e sono stati reclutati 34 pazienti con malattie cardiovascolari (CVD), quali CHF e infarto acuto del miocardio (NSTEMI), diagnosticati secondo le linee guida “European Society of Cardiology (ESC)”
29
Materiali e metodi Partecipanti allo studio: •
Casistica per il Profiling dei miRs circolanti: o 4 pazienti di 20 anni o 4 pazienti di 80 anni o 3 pazienti centenari
•
Casistica per la validazione dei miRs circolanti: o 111 pazienti sani (CTR) tra i 20 e i 105 anni, inclusi 30 ultracentenari. o 15 figli di pazienti centenari (Centenarian Offspring (CO)) o 34 pazienti affetti da malattie cardio-‐vascolari (CVD) comprendenti infarto del miocardio congestizio (CHF) e infarto del miocardio non-‐ST (NSTEMI). Criteri di inclusione: essere in buono stato di salute, assenza di malattia tumorale.
Estrazione RNA da plasma umano Il sangue venoso periferico è stato prelevato dai pazienti in provette contenenti EDTA. L’RNA totale è stato estratto a partire da un volume di 100μL utilizzando un sistema di estrazione per RNA (NorgenBiotek Corporation): questa metodica permette di isolare e arricchire la componente degli RNA di piccole dimensioni compresi i miRNA. L’RNA estratto è stato stoccato a -‐80°C fino al suo utilizzo. 30
MiRNA Profiling L’analisi di profiling dei miRNA maturi è stata condotta sullo strumento 7900HT (Applied Biosystem) per la Real-‐PCR utilizzando l’array microRNA Array Pool A (Applied Biosystem). L’RNA estratto da 100μL di plasma viene convertito a cDNA utilizzando un mix di primer a forma di loop (Megaplex Kit, Applied Biosystem) seguendo il metodo standard. In primo luogo è stata eseguita una procedura di pre-‐amplificazione utilizzando 3μL di campione. Un volume di 9μL della reazione dipre-‐amplificazione è stato utilizzato per la fase di profilingsu una piastra con 348 pozzetti contenenti ciascuno una sonda per un miRNA specifico.
RTq-PCR validazione. La determinazione dei livelli di espressione dei miRNA è stata eseguita con la tecnica della Real-‐Time PCR utilizzando i“TaqMan miRNA reverse transcription kit” e il “miRNA Assay kit”(Applied Biosystem). 1. Fase della Trascrizione inversa: Lo schema per la preparazione della miscela di reazione è il seguente:
Componenti
Volume (μL)
Loop-‐primer specifico RNA (input) dNTPs (10mM) Trascrittasi inversa Buffer (10X) RNA inhibitor Acqua Totale
1 1.67 0.4 0.3 0.5 0.6 0.5 5
31
La miscela così ottenuta è stata sottoposta al seguente schema di incubazione:
Steps
Temperatura (°C)
Tempo (minuti)
1 2 3
16 42 85
30 30 5
2. Fase di Real-‐Time PCR: Lo schema di preparazione della miscela è il seguente:
Componenti
Volume (μL)
TaqMan miRNA assay (20X) TaqMan Universal Master Mix (2X)-‐no UNG Prodotto RT Acqua
0.25 2.5 2.25 5
I componenti così miscelati sono stati sottoposti al seguente schema di incubazione:
N° cicli
Step
Temperatura (°C)
Tempo (minuti-‐secondi)
1
1 2 3
95 95 60
2min 15sec 1min
40
In letteratura sono riportati diversi sistemi di normalizzazione per l’espressione dei miRNA circolanti; tuttavia non esiste ad oggi un’indicazione univoca su quale sia il metodo migliore. L’espressione relativa dei miRNA è stata condotta utilizzando il miR-‐17-‐5p come normalizzatore, mentre la quantificazione assoluta è stata effettuata utilizzando il miR di interesse sintetico in quantità nota. La determinazione assoluta dei miRNA avviene tramite una diluizione seriale di un miR-‐sintetico che viene poi quantificato simultaneamente alla determinazione del 32
campione, ottenendo cosi una curva di diluizione. Interpolando il valore ottenuto dal campione con la curva di diluizione viene definito il numero di copie/mL. Il cel-‐miR-‐39, miRNA sintetico di C.Elegans, viene aggiunto al campione prima dell’estrazione per poter determinare la resa del processo di estrazione: solamente le estrazioni con rese maggiori del 95% sono considerate accettabili.
RTq-PCR validazione di mRNA TGF-βR2 in Leucociti. Il livello di espressione del mRNA TGF-‐βR2 è stato determinato tramite il metodo qPCR. I seguenti oligonucleotidi (5’-‐3’) sono stati impiegati per il test: •
TGF-‐βR2 forward: CTG GGC TCC TGA TTG CTC
•
TGF-‐βR2 reverse: TGA AAC GCT GTG CTG ACC
Analisi statistica I livelli di espressione dei miRNA dell’array sono stati quantificati considerando la loro espressione relativa rispetto al valore mediano di ciascun array (DCT = Ct miR valore X-‐mediana di tutti Ct di miR rilevabili): l'espressione relativa di ogni miR è stata riportata come 2-‐DCT. Le variabili che non presentano una distribuzione normale, come l'espressione relativa e assoluta di miR-‐21, sono state trasformate in logaritmo prima dell’analisi.
33
EFA (ExploratoryFactor Analysis) L’ExploratoryFactor Analysis (EFA) è stata utilizzata per raggruppare le variabili (cioè i valori di espressione dei miRNA circolanti), in base alla loro correlazione. EFA è in grado di ridurre le variabili in un numero minore di fattori sulla base della correlazione dei livelli di espressione dei miRNA. E’ stata poi applicata l’analisi delle componenti principali (PCA). La PCA trasforma un insieme di variabili in una combinazione lineare che rappresenta sia la percentuale massima della varianza totale sia una nuova serie di componenti non correlate. I risultati ottenuti sono stati descritti in un diagramma di Venn che comprende i miRs con una correlazione uguale o maggiore di 0.8. Questo valore cut-‐off è indicativo di una correlazione molto alta tra il fattore latente e le variabili analizzate. Inoltre, il punteggio standardizzato secondo i fattori per ciascun soggetto è stato estratto a partire dai fattori latenti al fine di confrontare i valori medi nei tre diversi gruppi di età con un test di Kruskal -‐ Wallis non parametrico . I sottoinsiemi dei miRNA identificati da un peso fattoriale maggiore o uguale a 0.8 sono stati scelti per identificare i pathways comuni.
Predizione dei pathways di miRNA L'identificazione veloce ed efficiente dei pathways specifici per i miR circolanti è stato ottenuto tramite il database DIANA microT v3.0 (Prediction Programme) (Maragkakis 2009). Criteri multipli sono stati usati per identificare pathways con la più alta probabilità di essere bersagliate da un sottoinsieme specifico di miR circolanti. DIANA -‐microT v3.0 calcola il -‐ln(valore p) che riflette la somma ponderata
34
dei punteggi di tutte le sequenze di riconoscimento dei miRNA conservati e non conservati sul 3’UTR del mRNA bersaglio . Questo punteggio si correla bene con la soppressione della proteina ed è indi anche per i cluster di miR (Satoh 2011, Maragkakis 2009). Un -‐ln(valore p) superiore a 18 è stato utilizzato come valore cut-‐ off identificando mRNA ad elevata probabilità di essere bersagliati da uno specifico sottogruppo di miRNA (Satoh 2011). Inoltre, il target di oltre il 30% dei geni appartenenti alla stessa via viene considerato una misura della bontà della predizione. Infine, il numero di miRNA con più dell’ 80% dei geni bersaglio appartenenti agli stessi fattori è stato considerato una misura della probabilità che l'intero percorso possa essere modulato.
Analisi di regressione e correlazione Le correlazioni tra i parametri sono state calcolate utilizzando il coefficiente di correlazione Rho di Spearman. Per comprendere la relazione matematica tra miR-‐21 (y) ed età (x), i dati sono stati rappresentati graficamente e la funzione interpolante (lineare o polinomiale) è stata scelta sulla base del valore massimo R2 delle curve di regressione stimate. La significatività statistica è stata definita come valore-‐p a due code: <0.05.
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Risultati In base ai dati ottenuti nella determinazione dei miRNA circolanti tramite il Profiling e la successiva validazione dei miRNA selezionati tramite il metodo statistico EFA, sono emersi i seguenti risultati.
Profiling dei miRNA circolanti: E’ necessario eseguire uno screening dei miRNA circolanti per selezionare quelli più espressi in determinate condizioni. Per questo studio è stato eseguito il test di profiling per differenziare i miRNA circolanti che subiscono delle modulazioni al variare dell’età dei soggetti. Nel caso specifico sono stati analizzati 11 soggetti tra i 20 e i 100 anni di età, le cui caratteristiche demografiche sono elencate in Tabella 1. La procedura di profiling prevede l’analisi di 365miRNA e successivamente la convalida di quelli che presentano variazioni nell’espressione. Dei 365 miR analizzati, solo 127 hanno mostrato livelli rilevabili e sono stati inclusi nelle analisi successive: il miRNA-‐ 223 ha mostrato la più alta espressione tra i miRNA circolanti, a conferma dei dati già presenti in letteratura (Hunter 2008).
36
Tabella 1: Caratteristiche demografiche e biomarkers dei campioni sottoposti a Profiling dei miRNA circolanti.
20 yrs (n. 4) 80 yrs (n. 4) 100 yrs (n. 3)
Uomini n. (%)
2 (50)
2 (50)
1 (25)
Glucosio (mg/dl)
107 ± 10
110 ± 15
95 ± 20
Proteina C Reattiva (mg/l)
0.30 ± 0.40
0.67 ± 1.23
0.99 ± 1.2
Colesterolo Totale (mg/dl)
200 ± 41
204 ± 41
198 ± 30
HDL Colesterolo (mg/dl)
58 ± 3
59 ± 10
58 ± 12
Trigliceridi (mg/dl)
114 ± 21
134 ± 41
129 ± 48
Creatinina (mg/dl)
0.99 ± 0.20
0.99 ± 0.30
0.98 ± 0.30
cTnT (ng/ml)
0.02 ± 0.01
0.02 ± 0.01
0.02 ± 0.01
NT proBNP (pg/ml)
289 ± 197
341 ± 217
450 ± 209
Analisi statistica EFA dei miRNA circolanti: Il sistema statistico EFA viene impiegato per eliminare l’insieme delle variabili e si basa sulla definizione di una matrice di correlazione tramite l’identificazione di variabili non correlate che prendono il nome di Fattori. Nel corso di questo studio sono stati determinati 10 fattori EFA di cui è possibile osservarne un esempio in Figura 10.
37
Figura 10: Rappresentazione esemplificativa dei fattori di correlazione EFA determinati per i miRNA circolanti in pazienti sani a diverse età. I fattori determinati sono 10 e per ciascun miRNA analizzato viene calcolato un punteggio: maggiore è il punteggio, maggiore è la correlazione nella medesima modulazione di un gruppo di miRNA. I fattori con un punteggio maggiore di 0.8 (valori in grassetto) sono considerati come significativi e utilizzabili nelle successive analisi.
Applicando il criterio di inclusione di una percentuale di varianza superiore al 10% della varianza totale, sono stati selezionati tre fattori principali: Fattore 1: rappresenta circa il 43% della varianza totale Fattore 2:rappresenta circa il 18% della varianza totale Fattore 3: rappresenta circa il 10% della varianza totale Utilizzando il metodo EFA è stato possibile identificare tre fattori principali che rappresentano congiuntamente il 71 % della varianza nei dati. I valori medi marginali dei punteggi fattoriali standardizzati sono stati confrontati in tre gruppi di età, come mostrato in Figura 11. •
Fattore 1: mostra delle modulazioni correlate al variare dell’età ma queste differenze non hanno raggiunto la significatività statistica (χ2 = 2.05 , p = 0.36).
38
•
Fattore 2: mostra livelli significativamente più alti nel gruppo degli 80ennirispetto ai 20enni e lievemente maggiori rispetto ai centenari. (Kruskal-‐ Wallis χ2 = 6.71 , p = 0.01).
•
Fattore 3: i miRNA che appartengono a questo gruppo presentano una forte modulazione nei centenari rispetto al gruppo degli 80enni e dei 20enni(Kruskal -‐ Wallis χ2 = 6.39 , p = 0.02).
Figura 11: Medie marginali stimate per i fattori 1, 2 e 3 nei tre gruppi di età (soggetti di 20, 80 e 100 anni).
Pathways identificati dal sistema statistico EFA. Lo studio di miRNA circolanti prevede la necessaria individuazione dei target di riferimento per ciascun miRNA analizzato al fine di comprendere quali siano le vie coinvolte nel rilascio dei miRNA nel circolo sanguigno. Analizzando quali target con maggiore probabilità sono modulati da un miRNA, è possibile ipotizzarne i pathways coinvolti. Dall’analisi EFA sono stati estrapolati tre fattori suddivisi in base alle loro caratteristiche di varianza tra i dati ottenuti: ciò ha permesso di identificare tre classi di miRNA che seguono il medesimo andamento nei campioni di età differenti. I miRNA presenti nei tre gruppi sono rappresentati in Figura 12. 39
Figura 12: Diagramma di Venn dei gruppi di miRNA identificati tramite il metodo EFA presentanti un punteggio fattoriale maggiore o uguale a 0.8, indicativo di un livello significativo di correlazione tra i fattori e le variabili analizzate. Il Fattore 1 è rappresentato da 46 miRNA, il Fattore 2 da 12 miRNA e il Fattore 3 da 5 miRNA.
Poiché ciascun miRNA ha contemporaneamente più geni target, è utile identificare quali siano i bersagli comuni tra i miRNA presenti nello stesso gruppo e allo stesso tempo identificare quali siano i pathways modulati da tali miRNA. Per eseguire questa analisi è stato utilizzato il Tool DIANA microT2 che prevede l’utilizzo del Database KEGGS al fine di individuare i pathways coinvolti nell’espressione di un miRNA o di un gruppo di miRNA. Nell’analisi sono stati inclusi i miRNA appartenenti ai fattori 2 e 3 poiché la variazione delle medie marginali nei campioni ad età differenti è risultata significativa.
2 http://diana.cslab.ece.ntua.gr/ 40
Il Tool DIANA è stato utilizzato per l’analisi dei pathways di miRNA dello stesso gruppo secondo i seguenti parametri: •
punteggio–ln(pValue)>18
•
presenza di almeno il 30% di mRNA target appartenenti al medesimo pathway
•
l’80% dei miRNA appartenenti allo stesso gruppo devono presentare siti target nello stesso pathway.
Utilizzando questi criteri di inclusione, è stato possibile identificare quattro pathways comuni miRNA appartenenti allo stesso fattore (Tabella 2). Tabella 2: Pathways cellulari target dei miRNA appartenenti ai fattori 2 e 3 secondo il Database DIANA microT.
KEGG pathway (has-‐ID)
N°. (%) geni-‐
N° (%) di miRNA -‐ln(pValue)
Target Fattore 2
Assoni (4360)
41 (32)
11 (92)
22
TGF-‐beta (4350)
31 (37)
10 (83)
18
TGF-‐beta (4350)
26 (31)
5 (100)
28
Carcinoma Renale (5220)
21 (30)
4 (80)
25
Fattore 3
Degno di nota è il pathway TGF-‐β in quanto è un bersaglio per i miRNA appartenenti sia al fattore 2 sia al fattore 3: in particolare, tutti i miRNA del fattore 3 hanno dei siti bersaglio in questa via cellulare.
41
Validazione dei miRNA circolanti. Analizzando i risultati ottenuti dal profiling dei miRNA circolanti in campioni con età differenti, oltre ad identificare i gruppi di miRNA che presentano modulazioni simili tra loro (metodo EFA) è anche possibile effettuare una quantificazione relativa dei miRNA analizzati (Figura 13, 14, 15). Per eseguire tale analisi è stata adottata la seguente formula: 𝑅𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑄𝑢𝑎𝑛𝑡𝑖𝑡𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝐴. 𝑈. = 2!∆!" Dove: ∆𝐶𝑡 = 𝐶𝑡 𝑚𝑖𝑅𝑁𝐴 𝑋 − 𝑀𝑒𝑑𝑖𝑎𝑛𝑎 𝐶𝑡 𝑑𝑒𝑖 𝑚𝑖𝑅𝑁𝐴 𝑑𝑒𝑡𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖 Il valore Ct rappresenta il numero di ciclo in cui la reazione di Real-‐Time PCR incontra il valore di Treshold, identico per tutti i miRNA analizzati.
Figura 13: Espressione Relativa dei miRNA appartenenti al Fattore 1.
42
Figura 14: Espressione Relativa dei miRNA appartenenti al Fattore 2.
Figura 15: Espressione Relativa dei miRNA appartenenti al Fattore 3.
43
Alcuni miRNA del Fattore 1 presentano livelli di espressione elevati ma, poiché nell’analisi delle medie marginali tra i campioni a diverse età è risultato che la modulazione dei miRNA non è significativa, i suddetti miRNA non possono essere presi in considerazione per la validazione. Nella Figura 14 si osserva che il miRNA-‐21 presenta un elevato livello di espressione rispetto ai miRNA appartenenti allo stesso Fattore e al Fattore 3. Essendo il miRNA-‐21 il più espresso nei campioni sottoposti a profiling, è stata eseguita una validazione su una più ampia casistica di soggetti sani (CTR) che presentano diverse età (Tabella 3): ciò consente di individuare con più precisione l’andamento del miRNA-‐21 e di osservarne la corretta modulazione già analizzata con il metodo statistico EFA. L’individuazione del miRNA più espresso deriva dalla necessità di determinare il miRNA con maggiore concentrazione nel circolo sanguigno, in quanto si suppone una correlazione tra quantità e funzionalità.
44
Tabella 3: Caratteristiche demografiche e biomarker dei campioni sottoposti a validazione del miRNA-‐21 circolante.** >96 yrs vs 20-‐65 yrs, p<0.05.
20-‐65 yrs
66-‐95 yrs
>96 yrs
(n. 33)
(n. 40)
(n. 38)
Uomini n. (%)
18 (55)
25 (62)
5 (13) **
Glucosio (mg/dl)
108 ± 11
111 ± 22
91 ± 25**
Proteina C Reattiva (mg/l)
0.32 ± 0.45
0.72 ± 1.13
3.1 ± 3.8**
Colesterolo Totale (mg/dl)
205 ± 45
209 ± 42
186 ± 40**
HDL Colesterolo (mg/dl)
58 ± 9
59 ± 11
58 ± 10
Trigliceridi (mg/dl)
124 ± 29
124 ± 43
117 ± 58**
Creatinina (mg/dl)
1.00 ± 0.20
0.99 ± 0.30
0.98 ± 0.30
cTnT (ng/ml)
0.02 ± 0.01
0.03 ± 0.01
0.04 ± 0.02
NT proBNP (pg/ml)
156 ± 50
289 ± 46
551 ± 95
Allo stato dell’arte la letteratura scientifica non evidenzia metodi di normalizzazione predefiniti per i miRNA circolanti (Meyer 2011). Per ovviare a questa mancanza di informazioni si è deciso di procedere alla determinazione quantitativa assoluta: costruendo una curva di calibrazione con un miRNA sintetico maturo e creando varie soluzioni a concentrazione nota, si determina una curva di calibrazione lineare e si interpola il dato incognito con l’equazione della calibrazione. La quantificazione relativa viene condotta utilizzando il normalizzatore miRNA-‐17-‐ 5p, in quanto presenta un livello di espressione significativo (Figura 13) indipendente dal sesso dei pazienti e dall’ età. Al fine di validare la quantificazione del miRNA-‐21 utilizzando il miR-‐17-‐5p come normalizzatore, si procede alla determinazione assoluta del miRNA-‐17-‐5p nei campioni sottoposti alla validazione (Figura 17). 45
Figura 16: Quantificazione assoluta del miRNA-‐17-‐5p in soggetti sani (CTR) suddivisi per età.
Dai risultati ottenuti si osserva che il miRNA-‐17-‐5p non presenta modulazioni significative nei pazienti con età diverse: ciò è in accordo con il risultato ottenuto tramite il metodo EFA in quanto il miRNA-‐17-‐5p è rappresentato nel fattore 1 e quindi il suo impiego per la determinazione relativa del miRNA-‐21 è accettabile. Il miRNA-‐21 circolante presenta un andamento non-‐monotonico correlato all’età dei campioni analizzati (Figura 18, 19; Tabella 4).
46
Figura 17: Quantificazione assoluta del miRNA-‐21 circolante in soggetti sani (CTR) suddivisi per età. *p<0.05 vs <65, #p<0.05 vs 66-‐95
Figura 18: Quantificazione relativa del miRNA-‐21 circolante in soggetti sani (CTR) suddivisi per età. *p<0.05 vs <65.
47
Tabella 4: Analisi statistica dei risultati di Espressione Relativa e Assoluta del miR-‐21 circolante.
Relativa (Media a.u.)
Assoluta (Media n° copie/mL Plasma)
>96
30.18 ± 26.51
289.548 ± 178.549
66-‐96
33.7 ± 29.8
317.012 ± 226.804
20-‐65
22.6 ± 13.7
189.206 ± 200.759
I dati ottenuti (Tabella 4) evidenziano come il miRNA-‐21 sia più espresso nei campioni con età compresa tra 66-‐96 anni e come l’aumento sia significativo verso i campioni con età compresa tra 20 e 65 anni. I campioni con età maggiore di 96 anni presentano un livello di espressione del miR-‐21 significativamente inferiore rispetto al gruppo 66-‐96 ma maggiore rispetto al gruppo 20-‐65. In Figura 20 è rappresentata la distribuzione del miRNA-‐21 nei campioni analizzati tramite la quantificazione assoluta e relativa. La regressione quadratica si adatta in maniera ottimale alla distribuzione del miRNA-‐21 (Espressione relativa: Regressione lineare R2 = 0,03 vs regressione quadratica R2 = 0.14; Espressione assoluta: Regressione lineare R2 = 0,03 vs regressione quadratica R2 = 0.07).
48
Figura 19: Distribuzione relativa e assoluta del miRNA-‐21 circolante in soggetti sani (CTR) in funzione dell’età. Nella figura sono riportate le regressioni lineare(linea tratteggiata) e quadratica (linea continua) che rappresentano l’andamento della distribuzione del miRNA circolante.
49
L’andamento del miRNA-‐21 è in accordo con il metodo statistico EFA e l’analisi delle medie dei valori ottenuti tramite quantificazione assoluta o relativa indica un aumento del miRNA-‐21 nel gruppo di campioni conun età compresa tra 66 e 95 anni e una successiva diminuzione nei campioni con età maggiore di 95 anni.
Livello di espressione del miRNA-21 circolante in casi di CVD e figli di centenari. Dalla precedente analisi statistica è possibile individuare una significativa correlazione tra la concentrazione di miRNA-‐21 circolante e l’età del paziente. Nelle analisi eseguite precedentemente, i campioni sono stati caratterizzati come controlli sani. Successivamente, sono stati analizzati campioni che presentano patologie cronico-‐degenerative come infarto NSTEMI o CHF. In lavori precedenti (Olivieri 2012) sono stati individuati alcuni miRNA correlati alla presenza di queste patologie e il miRNA-‐21 è tra questi: per questo motivo esso è stato quantificato in questa classe di pazienti per evidenziarne una correlazione (Tabella 5).
50
Tabella 5: Caratteristiche demografiche e biomarkersdei campioni in pazienti CVD, CO e CTR di età comparabili. *p<0.05; CVD vs CTR. **p<0.05; CO vs CTR. CTR=soggeti sani; CVD=soggetti con malattie cardio-‐vascolari; CO=figli di centenari.
CTR (n. 40)
CVD (n. 34)
CO (n. 15)
Uomini n. (%)
20 (50)
17 (50)
9 (60)
Età (anni)
86 ± 7
87 ± 8
72 ± 6**
Glucosio (mg/dl)
111 ± 22
121 ± 25*
85 ± 13**
Proteina C Reattiva (mg/l)
0.72 ± 1.13
6.4 ± 6.4*
1.9 ± 1.12
Colesterolo Totale (mg/dl)
209 ± 42
179 ± 41
209 ± 44
HDL Colesterolo (mg/dl)
59 ± 11
56 ± 10
53 ± 20
Trigliceridi (mg/dl)
124 ± 43
130 ± 41
122 ± 48
Creatinina (mg/dl)
0.99 ± 0.30
1.09± 0.40
0.9 ± 0.26
cTnT (ng/ml)
0.03 ± 0.01
2.09 ± 0.34*
N.D.
NT proBNP (pg/ml)
289 ± 46
9,828 ± 1,071*
N.D.
Dalle determinazioni eseguite (Figura 21) si evince come sia presente una significativa diminuzione del miRNA-‐21 nei figli di centenari (CO), i quali presentano circa il 70% in meno di rischio di sviluppare malattie cardiovascolari rispetto ai pazienti sani (CTR). I pazienti con patologie cardio vascolari (CVD) presentano un aumento significativo del miRNA-‐21 circolante. È importante notare come i campioni CO presentino la variabilità e il livello più bassi tra i tre gruppi testati.
51
Figura 20: Espressione Relativa del miRNA-‐21 circolante in campioni di controlli sani (CTR), figli di centenari (CO) e pazienti con malattie cardio vascolari (CVD). *p<0.05 vs CTR; #p<0.05 vs CO.
TGF-β come target del miR-21 Sottoponendo i miRNA ottenuti dall’analisi EFA al sistema di analisi dei loro pathways comuni, è emerso che il TGF-‐β sia il pathway comune tra i miRNA del fattore 2, comprendente il miRNA-‐21. La Figura 22 mostra lo schema dei miRNA che presentano come siti bersaglio geni coinvolti nel pathway del TGF-‐β: tra loro degno di nota è il miRNA-‐21 che ha TGF-‐βR2 come gene target.
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Figura 21: Rappresentazione schematica del pathway TGF-‐β e i miR aventi i propri siti bersaglio tra i geni coinvolti in questa via cellulare.
In seguito all’individuazione del pathway comune è stata determinata la concentrazione del mRNA TGF-‐βR2 nei leucociti di pazienti a differenti età. Come si osserva dalla Figura 23, il miRNA-‐21 segue l’andamento descritto dal sistema EFA e successivamente confermato dalla casistica ampliata mentre il mRNA TGF-‐βR2 decresce negli ottantenni e aumenta nei centenari: questo andamento è correlato alla presenza di un sito target nel mRNA TGF-‐βR2 del miRNA-‐21 che determina l’inibizione del gene stesso.
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Figura 22: Livello di espressione del miRNA-‐21 e mRNA TGF-‐βR2 in leucociti di giovani, anziani e centenari sani (sono stati analizzati 5 individui per ciascuna fascia di età). Il livello di espressione è stato normalizzato rispetto alla β-‐actina.
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Conclusioni Dai dati ottenuti da questo lavoro è emerso come l’espressione di alcuni miRNA circolanti cambia in maniera significativa con l’età in soggetti sani, suggerendo come una modulazione di specifici miRNA in circolo possa far parte dell’attuazione di meccanismi di compenso da parte dell’organismo. Un dato da sottolineare è che non tutti i miR cambiano allo stesso modo: alcuni aumentano ed altri diminuiscono. Nel gruppo 2, i miRNA aumentano nei campioni di pazienti ottantenni per poi decrescere nei centenari; nel gruppo 3, invece, si osserva un andamento inverso. Il secondo gruppo include miR molto espressi in circolo e fra questi il miR-‐21 che è il più espresso. Per verificare l’andamento del miR-‐21, è stata analizzata la sua espressione su una ulteriore casistica di 111 pazienti sani, utilizzando sia la quantificazione assoluta che relativa. I risultati mostrano il medesimo trend osservato con i dati di profiling. Il miR-‐21 è stato anche dosato in pazienti con malattie cardiovascolari (CVD) e in soggetti figli di centenari (CO): è stato evidenziato che nei CO il miR-‐21 è meno espresso rispetto ai campioni sani (CTR), mentre nei campioni CVD il miR-‐21 è maggiormente espresso. Il gruppo di figli di centenari è stato incluso quale gruppo di controllo negativo per malattie cardiovascolari, poiché hanno un rischio di sviluppare malattie cardiovascolari molto inferiori rispetto ai coetanei che non sono figli di centenari. Si ipotizza quindi una correlazione tra presenza del miR-‐21 e infiammazione sistemica: infatti lo stato di CVD può essere associato ad uno stato infiammatorio cronico. Proprio per indagare in maniera più accurata questo aspetto, è stata eseguita 55
una ricerca su database per identificare quali pathways metabolici possono essere target per i miRNA appartenenti ai due gruppi selezionati con il miR-‐Profiling. È interessante notare come il gruppo a cui appartiene il miR-‐21 abbia come pathway target quello del TGF-‐β (uno dei sistemi più importanti per la modulazione dello stato infiammatorio (Olivieri 2012a)) che prevede una minore concentrazione del miR-‐21 all’interno del flusso sanguigno di soggetti giovani, sani o figli di centenari, cioè di individui con basso stato infiammatorio. I dati supportano anche l’ipotesi di un’aumentata quantità del miRNA-‐21 nei pazienti che presentano malattie croniche come le patologie cardiovascolari. I risultati ottenuti mostrano un andamento non-‐monotonico con l’età. Questo dato è molto rilevante perché suggerisce che i soggetti che raggiungono le età estreme mantengono profili molecolari circolanti più simili a quelli dei soggetti più giovani. Inoltre i miRNA circolanti possono fungere da marcatori di patologie, poiché vengono espressi differentemente al variare dell’età e delle condizioni di salute del paziente. Osservando i miRNA circolanti nell’ottica di futuri sistemi molecolari utili alla diagnostica predittiva o differenziale di alcune patologie (come l’infarto del miocardio), è importante conoscere le variazioni età associate per definire cut-‐off diagnostici corretti per età e ottenere le miglior performance diagnostiche.
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