PROGNOSTISK SIGNIFIKANS AV SATB1 OCH SATB2 UTTRYCK I KOLOREKTAL CANCER

Hälsa och samhälle

PROGNOSTISK SIGNIFIKANS AV SATB1 OCH SATB2 UTTRYCK I KOLOREKTAL CANCER ESHRAGH TARATNIYA

Biomedicinsk laboratorievetenskap V

Malmö högskola

BA561A

Hälsa och samhälle

Biomedicinska analytikerprogrammet

205 06 Malmö

VT 2012

e-post: [email protected]

PROGNOSTISK SIGNIFIKANS AV SATB1 OCH SATB2 UTTRYCK I KOLOREKTAL CANCER ESHRAGH TARATNIYA Taratniya, E. Prognostisk signifikans av SATB1 och SATB2 uttryck i kolorektal cancer. Examensarbete i Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 poäng. Malmö högskola: Hälsa och Samhälle, enheten för Biomedicinsk laboratorievetenskap, 2012. Kolorektal cancer (CRC) är en av de vanligaste cancersjukdomarna i världen med cirka 1 miljon nya detekterade fall per år. Special AT-rich sequence-binding protein1 (SATB1) är ett celltyp-specifikt kärnmatrix-associerat DNA-bindande protein, vilket utgörs av AT-rika DNA sekvenser. Det har tidigare demonstrerats att en annan medlem i SATB-familjen, SATB2, uttrycks på ett vävnadsspecifikt sätt i normal mukosa i nedre mag-tarmkanalen och i CRC. β-catenin är en intracellulär mediator i Wnt/β-catenin signaleringsvägen, som spelar en viktig roll i kolorektal carcinogenes. Uttryck av SATB1, SATB2 och β-catenin har studerats i tissue microarrays med tumörprover från 270 CRC patienter. Deras inbördes korrelation samt koppling till recidivfri överlevnad har studerats med hjälp av Spearman´s korrelationstest respektive Kaplan-Meier analys och log-rank test. Resultatet från immunhistokemiska färgningar visar att det finns en korrelation mellan de analyserade markörerna. Därutöver fann vi att SATB1 uttryck är kopplat till kortare recidivfri överlevnad i tumörer med lågt SATB2 uttryck.

Nyckelord: β-catenin, immunhistokemi, kolorektal cancer, prognostisk signifikans, SATB1, SATB2, tissue microarrays. 2

PROGNOSTIC SIGNIFICANCE OF SATB1 AND SATB2 EXPRESSION IN COLORECTAL CANCER ESHRAGH TARATNIYA Taratniya, E. Prognostic significance of SATB1 and SATB2 expression in colorectal cancer. Degree project in Biomedical Laboratory Science 15 credits points. Malmö University: Health and Society, department of Biomedical Laboratory Science, 2012. Colorectal cancer (CRC) is one of the most common cancers in the world with about 1 million new cases annually. Special AT-rich sequence binding protein 1 (SATB1), is a cell type specific nuclear matrix associated DNA binding protein, which consists of AT-rich DNA sequences. It has previously been demonstrated that another member in SATB-family, SATB2, is expressed in a tissue-specific manner in normal mucosa in the lower gastrointestinal tract and in CRC. β-catenin is an intracellular mediator of the Wnt/ β-catenin signaling pathway and plays an important role in colorectal carcinogenesis. Expression of SATB1, SATB2 and βcatenin was analyzed in tissue microarrays with tumors from 270 CRC patients. Spearman´s correlation test was used to assess the correlations and the impact of SATB1 and SATB2 on recurrence free survival was assessed by Kaplan-Meier analysis and log-rank test. The result of immunohistochemical staining shows that there is a correlation between the analyzed markers and that SATB1 expression is a poor prognostic factor in tumors expressing low levels of SATB2.

Keyworsds: β-catenin, colorectal cancer, immunohistochemistry, prognostic significance, SATB1, SATB2, tissue microarrays.

3

INNEHÅLLSFÖRTECKNING

INLEDNING

5

SATB1 & SATB2

6

β-catenin

7

Syfte

7

Frågeställning

7

MATERIAL & METOD

7

Material

7

Metod

8

Tissue microarray (TMA) konstruktion och

8

immunhistokemi Analys av immunhistokemisk färgning

9

Statistisk analys

9

Etisk bedömning

9

RESULTAT

9

Immunhistokemiskt uttryck av SATB1, SATB2

9

och β-catenin i kolorektalcancer Korrelation mellan undersökta markörer samt

10

till patient och tumörkarakteristika Överlevnadsanalyser

11

DISKUSSION

13

Slutsats

14

Framtida värde

15

REFERENSER

16

4

INLEDNING Kolorektal cancer (CRC) är en av de vanligaste cancersjukdomarna i världen med ca 1 miljon nya detekterade fall per år [1]. CRC är den näst vanligaste cancerformen hos både kvinnor och män [2]. Tidig detektion av sjukdomen, lämplig kirurgisk excision samt optimal adjuvant behandling (strålbehandling och/ eller cytostatika) är av yttersta vikt för att kunna bota sjukdomen. Möjligheten att diagnostisera sjukdomen i ett tidigt skede och att kunna besluta om behandling med hjälp av molekylärbiologiska metoder har inte förbättrats nämnvärt under de senaste decennierna, till skillnad från situationen vid t ex bröstcancer [3]. Därför avlider ca 40- 45 procent av patienterna inom fem år, enligt Socialstyrelsen (2006) [4]. För beslut om kirurgi och neoadjuvant/adjuvant behandling är den histopatologiska diagnostiken av största betydelse. Fastställande av tumörstadium och differentieringsgrad är viktiga prognostiska faktorer och de används till att estimera 5-årsöverlevnaden hos patienten [2]. Tumörstadieindelningen (TNM) omfattar primärtumör (T), regionala lymfkörtlar (N) samt fjärrmetastaseringar (M), som baseras på tumörens storlek, om den invaderat närliggande organ, spridits till lymfkörtlar eller metastaserat [5- 6]. T stadium omfattar de djupa delarna i tarmväggen där primärtumören utvecklats, medan N stadium handlar i stort sett om tumörcellernas spridning till regionalaoch perirektala lymfkörtlar samt andra involverade körtlar. M stadium innefattar fjärrmetastaser framför allt i icke-regionala lymfkörtlar, figur 1.

Figur 1: Schematisk bild över utveckling och vandring av tumörcellerna samt olika stadier av tumörcellerna i kolon [7] . 5-årsöverlevnaden är en värderingsgrund på hur länge en patient lever efter avsedd behandling. Överlevnaden är relaterad till vilket stadium tumören befinner sig i. Överlevnaden är sämre ju aggressivare cancertumören är. 5

Fjärrmetastaseringar ger ännu sämre överlevnad hos patienten, så att mindre än 3 % överlever under en 5-årsperiod [5- 6], tabell 1. Tabell 1. Tabellen nedan presenterar den prognostiska betydelsen av korrelation mellan TNM och 5-årsöverlevnaden i CRC [5- 6]. TNM Steg 0, I (Tis, T1; N0; M0)

5-årsöverlevnad (%) >90 %

Steg I (T2; N0; M0)

80–85 %

Steg II (T3, T4; N0; M0)

70–75 %

Steg III (T2; N1–3; M0)

70–75 %

Steg III (T3; N1–3; M0)

50–65 %

Steg III (T4; N1–3; M0)

25–45 %

Steg IV (M1)

<3 %

Tumörgraden klassificeras i tre eller fyra stadier [5- 6]. En högt differentierad cancer liknar sin normala motsvarighet i normal vävnad och är ofta lågmalign. Ju mindre cancern liknar sin normala motsvarighet desto lägre differentieringsgrad och högre aggressivitet. Differentieringsgraden delas in i 4 grader; grad 1: högt differentierade, grad 2: medelhögt differentierad, grad 3: lågt differentierad samt grad 4: odifferentierad. Trots att det pågår ett oavbrutet arbete för att finna molekylära biomarkörer för identifiering av högrisksjukdom och för urval av patienter för adjuvant behandling, har inga visat sig vara tillräckligt bra för användning i klinisk praxis [3]. SATB1 & SATB2 Special AT-rich sequence-binding protein1 (SATB1) är ett celltyp-specifikt kärnmatrix-associerat DNA-bindande protein, vilket utgörs av AT-rika DNA sekvenser. SATB1 är även en nukleär transkriptionsfaktor, som deltar i modifieringen av kromatin och sammankopplar specifika DNA sekvenser till ett nätverk [8- 10]. Proteinet är viktigt för reglering av T-cellers funktion [11], vilket har påvisats i en studie, som visar att SATB1 till största delen uttrycks i kärnan hos tymocyter. Borttagande av SATB1 leder till derepression av flera gener i tymocyter med nedsatt T-cells utveckling och funktion. Detta resultat visar även en biologisk funktion av SATB1 proteinet in vivo [11]. SATB1 uttryck har också visat sig korrelera med sämre prognos i bland annat bröst- och magcancer [9, 1213]. Det har tidigare demonstrerats att SATB2, en annan medlem i SATB familjen [14], uttrycks på ett vävnadsspecifikt sätt i normal mukosa i nedre magtarmkanalen och i CRC [15]. Dessutom har förlust av SATB2 uttryck visat sig korrelera med dålig prognos i kolon men inte i rektalcancer [3], och associationen 6

mellan förlust av SATB2 och dålig prognos i CRC patienter har också demonstrerats i andra studier [16]. En ny studie visar att förhöjda mRNA och protein nivåer av SATB1 korrelerar med ogynnsamma tumörparametrar i rektalcancer, men dess prognostiska betydelse har ännu inte rapporterats [8]. Studien omfattade 93 patienter och SATB1 var uppreglerat i invasiv cancer jämfört med normal rektalmukosa, men 50 % av cancercellerna uttryckte SATB1, vilket tyder på att det, till skillnad mot SATB2, inte är vävnadsspecifikt uttryckt men kan spela en viktig roll i utvecklingen av CRC [8]. Det finns uppgifter om att SATB2 kan nedreglera uttrycket av SATB1 i CRC cellinjer in vitro [16]. β-Catenin I epitelcellernas plasmamembran finns ett protein, β-catenin, som vid celladhesion bildar ett komplex med E-cadherin och a-catenin [17]. β-catenin är också en intracellulär mediator i Wnt/β-catenin signaleringsvägen och spelar viktig roll i samverkan med andra proteiner som till exempel de aktinbindande proteinerna facin och presenilin [17- 18]. Eftersom aktivering av Wnt-signalering och dess viktigaste mediator, β-catenin, är av betydelse vid kolorektal carcinogenes [19], och SATB1 har visat sig interagera med β-catenin [20], är det av intresse att studera relationen mellan SATB1 och β-catenin uttryck i CRC. Syfte Syftet med denna studie är att med immunhistokemi analysera uttrycken av SATB1, SATB2 och β-catenin, dess inbördes korrelation och prognostiska betydelse i en konsekutiv CRC kohort (n=270). Frågeställning Finns det någon korrelation mellan de analyserade markörerna och har det någon prognostisk betydelse inom CRC kohorten?

MATERIAL & METOD Denna kohort studie omfattar 270 paraffin-inbäddade vävnadsprover med hög andel tumörceller av kolorektal cancer, vilka snittades och färgades med immunhistokemiska färgningar samt bedömdes under mikroskop. Statistiska analyser utfördes i statistikprogrammet SPSS (IBM Statistics 20.0). Material Mikrotom (Leica RM2255), mikroskop (ZEISS AXIO), halv-automatiserad vävnads array (TMArrayer; Pathology Devices, Inc, Westminster, MD, USA), färgnings maskin (Autostainer Plus, DAKO, Glosturp, Denmark), PT-link system (DAKO, Glosturp, Denmark), inkubationstank (PT Link Spare Tank), antikroppar SATB1 (spädd 1:100, kanin monoklonal, Epitomics, Burlingame, California), SATB2 (spädd 1:100, mus monoklonal, Atlas Antibodies AB, Stockholm, Sverige) och β-catenin (spädd 1:5000, kanin polyklonal, BD Bioscience, San Jose California, USA), sekundär antikropp (Labelled polymer, kod SM802, EnVision FLEX/HRP), färgnings reagenser: basisk reagens (DM828, EnVision™ FLEX, 7

Target Retrieval Solution High pH, x50) och wash buffer (DM831, EnVision™ FLEX, 20X, Dako). Metod Tissue microarray (TMA) konstruktion och immunhistokemi Morfologiskt representativa områden med tumörvävnad inbäddade i paraffin märktes in på objektsglas med 2 µm snitt infärgade med hematoxylin och eosin. Tumörområdet identifierades på ursprungsklossar och två stansar från varje tumör placerades i en mottagarkloss med en halv-automatisk vävnads array (TMArrayer; Pathology Devices, Inc, Westminster, MD, USA). Varje kloss konstruerades i tre uppsättningar med 120 stansar i varje, placerades i ett värmeskåp i 45˚C i en timme och snittades därefter till 4 µm tjocka snitt. För närmare beskrivning av TMA konstruktion hänvisas till tidigare beskrivningar [21- 22]. Antal glas registrerades och reagenserna programmerades enligt angivna krav på reagenser/volymer och kodade etiketter skrevs ut och klistrades på glasen (Software, Autostainer Plus, DAKO, Glosturp, Denmark). Avparaffinering, demaskering av epitoper och hydrering av 4 µm TMA snitt utfördes i ett PT-link system. Inkubationstanken fylldes med 30 ml basisk reagens (DM828) och 1470 ml destillerat vatten till totalvolymen 1 500 ml. Antigen retrieval programmet för epitop demaskering kördes med glasen i 20 minuter i 90ºC. Därefter placerades glasen i Wash buffer (DM831), spädd i destillerat vatten till en totalvolym på 1 500 ml. Vävnaderna infärgades med antikroppar mot proteinerna SATB1, SATB2 och β-catenin i en färgningsmaskin. Färgningsmaskinen är programmerad för ett antal immunhistokemiska metoder och antikropps-infärgningar, enligt tillverkarens instruktioner [23]. För färgning av SATB1, SATB2 och β-catenin användes en indirekt metod i två steg, där primärantikroppen binder till antigenet och en inmärkt sekundär antikropp binder till den primära antikroppen och komplexet visualiseras med en brun infärgning enligt grundschemat (Visualization System Report (FLEX, FLEX+ Rabbit) DAKO) avsett för färgnings metod, tabell 2- 3. Efter avslutad färgning dehydrerades glasen och monterades med pertex. Tabell 2. Immunhistokemisk färgnings procedur, grund schema. FLEX Category Code* Reagent Name 1 Rinse Buffer 2 Endogenous Enzyme Block SM801 EnVision Flex PeroxidaseBlocking Reagent 3 Primary Antibody 4 Labelled Polymer SM802 EnVision FLEX/HRP 5 Rinse Buffer 6 Substrate-Chromogen SM803 Substrate Working Solusion (mix) 7 Counterstain SM806 EnVision FLEX Hematoxylin 8 Rinse Buffer *Kod för färgningskit kompatibelt med Autostainer Plus, Dako

8

Incubation 5

20 5 10 5 5

Tabell 3. Immunhistokemisk färgnings procedur, grund schema. FLEX+ Rabbit Category Code* Reagent Name 1 Rinse Buffer 2 Endogenous Enxyme Block SM801 EnVision Flex PeroxidaseBlocking Reagent 3 Primary Antibody 4 Secondary Reagent SM805 EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) 5 Labelled Polymer SM802 EnVision FLEX/HRP 5 Rinse Buffer 6 Substrate-Chromogen SM803 Substrate Working Solusion (mix) 7 Counterstain SM806 EnVision FLEX Hematoxylin 8 Rinse Buffer *Kod för färgningskit kompatibelt med Autostainer Plus, Dako

Incubation 5

15 20 5 10 5 5

Analys av immunhistokemisk färgning Den immunhistokemiska infärgningen bedömdes (annoterades) under mikroskop. Proteinerna SATB1 och SATB2 uttrycktes i cellkärnor och både antalet infärgade cellkärnor (fraktion) och kärninfärgningens styrka (intensitet) bedömdes. Kärnfraktionen klassificerades i fyra kategorier, 1 (0 -1%), 2 (2- 25%), 3 (2675%) och 4 (> 75 %) och färgintensiteten bestämdes mellan 0- 3, vilket motsvarar 0= negativ, 1= svag, 2= måttlig och 3= stark intensitet. β-catenin uttrycktes både i cellmembran, cytoplasma och cellkärnorna. Cellmembranen bedömdes som infärgade (0) och negativa (1). Intensiteten av cytoplasma och kärna bedömdes var och en för sig och rangordnades (0-3). Statistik analys Spearman´s korrelations test, Kaplan-Meier analys och log-rank test användes för statistiska beräkningar av markörernas inbördes korrelation samt koppling till överlevnad. Programvara: IBM Statistics 20.0. Etiks bedömning Etiskt tillstånd för studien har erhållits från etikprövningsnämnden vid Lunds universitet (ref. 530/2008).

RESULTAT Immunhistokemiskt uttryck av SATB1, SATB2 och β-catenin i kolorektalcancer Efter optimering av antikroppen och immunhistokemisk infärgning var 267 tumörer (98,9%) visualiserade för annotering. 192 tumörer, d v s 71,1% av tumörerna var negativa för β-catenin, 154 tumörer (57%) var negativa för SATB1 och 82 tumörer (37,2%) var negativa för SATB2. Några exempel på immunhistokemiska bilder av SATB1, SATB2 och β-catenin infärgningar i kolorektal cancer och närliggande mukosa visas i figur 2. 9

A

Beta-catenin

SATB1

SATB2

SATB1

SATB2

B

Beta-catenin

C

Beta-catenin

SATB1

SATB2

Figur 2. Immunhistokemiska bilder av SATB1, SATB2 och β-catenin infärgningar i kolorektal cancer och närliggande mukosa med A) viss korrelation mellan SATB2 och β-catenin, B) högt uttryck av alla tre proteinerna och C) negativitet för samtliga markörer i vävnaden, med undantag för membranöst β-catenin uttryck. Korrelation mellan undersökta markörer samt till patient och tumörkarakteristika Korrelation mellan de graderade proteinernas uttryck beräknades i statistik program (IBM Statistics 20.0), vilket presenteras i tabell 4. Resultatet visar att högt SATB2 (nf= kärnfraktion) korrelerar med högt SATB1 (nf) (p<0.001) och även högt SATB2 (nf) korrelerar med lågt T (p=0.042) och lågt N (p=0.032) stadium. Medan högt SATB2 (nf) korrelerar med högt β-catenin (3 cat)* (p=0.015) korrelerar högt SATB1 (nf) också med högt β-catenin (3 cat) (p=0.046).

* β-catenins 3 kategorier: kärn-, cytoplasma- och membraninfärgning.

10

Tabell 4. Korrelation mellan β-catenin, SATB1, SATB2, tumörstadium och differentieringsgrad. T-stadium

N-stadium

T-stadium

Korrelation 1,000

N-stadium

Korrelation ** 0,447 p< 0,001 Korrelation ** 0,162 P= 0,008 Korrelation ** -0,243 P< 0,001 Korrelation -0,067 P= 0,279 Korrelation * 0,126 P= 0,042 Korrelation -0,031 P= 0,619

Korrelation ** 0,447 p< 0,001 Korrelation 1,000

M-stadium

Differentie ringsgrad SATB1 (nf)

SATB2 (nf) Β-catenin

Korrelation ** 0,314 P< 0,001 Korrelation ** -0,282 P< 0,001 Korrelation -0,078 P= 0,211 Korrelation * 0,132 P= 0,032 Korrelation 0,013 P= 0,834

Mstadium Korrelation ** 0,162 P= 0,008 Korrelation ** 0,314 P< 0,001 Korrelation 1,000 Korrelation * 0,144 P= 0,022 Korrelation 0,069 P= 0,265 Korrelation 0,013 P= 0,838 Korrelation 0,045 P= 0,469

Differentieringsgrad Korrelation ** -0,243 P< 0,001 Korrelation ** -0,282 P< 0,001 Korrelation * -0,144 P= 0,022 Korrelation 1,000 Korrelation -0,012 P= 0,855 Korrelation 0,095 P= 0,135 Korrelation -0,007 P= 0,914

SATB1 (nf)

SATB2 (nf)

Β-catenin

Korrelation 0,067 P= 0,279 Korrelation -0,078 P= 0,211 Korrelation 0,069 P= 0,265 Korrelation -0,012 P= 0,855 Korrelation 1,000

Korrelation * -0,126 P= 0,042 Korrelation * -0,132 P= 0,032 Korrelation 0,013 P= 0,838 Korrelation 0,095 P= 0,135 Korrelation ** 0,340 P< 0,001 Korrelation 1,000

Korrelation -0,031 P= 0,619 Korrelation 0,013 P= 0,834 Korrelation 0,045 P= 0,469 Korrelation -0,007 P= 0,914 Korrelation ** 0,124 P= 0,046 Korrelation * 0,150 P= 0,015 Korrelation 1,000

Korrelation ** 0,340 P< 0,001 Korrelation ** 0,124 P= 0,046

Korrelation * 0,150 P= 0,015

**korrelation är signifikant när p≤ 0,01 *korrelation är signifikant när p≤ 0,05 Överlevnadsanalyser Nedan visas Kaplan-Meier kurvor som visar den prognostiska betydelsen av SATB1 och SATB2 i alla tumörer.

Figur 3. Korrelation mellan SATB1 och recidivfri överlevnad i hela kohorten. Övre linjen visar negativt SATB1uttryck medan nedre linjen visar positivt SATB1 uttryck. 11

Korrelationen mellan SATB1 uttryck, både lågt och högt och överlevnaden presenteras i figur 3. Patienter med tumörer som uttryckte SATB1 hade en sämre recidivfri överlevnad än patienter som hade SATB1 negativa tumörer, men detta var inte signifikant enligt erhållet p-värdet (p=0.074) utifrån Kaplan-Meier analys och log-rank test i statistisk programmet.

Figur 4. Korrelation mellan SATB2 och recidivfri överlevnad i hela kohorten. Övre linjen visar positivt SATB2 uttryck och nedre linjen visar negativt SATB2 uttryck. Korrelationen mellan SATB2 uttryck och recidivfri överlevnad presenteras i figur 4. Patienter med tumörer som hade högt SATB2 uttryck (>75% positiva celler) hade en kortare recidivfri överlevnad än patienter med lågt SATB2 uttryck, dock var detta inte heller signifikant utifrån statistiken (p=0.086).

12

Figur 5. Korrelation mellan SATB1 och SATB2 och överlevnad. Övre linjen visar negativt SATB1 och nedre linjen visar positivt SATB1. Lågt SATB2 uttryck gäller för både linjerna. Figur 5 visar korrelation mellan både lågt och högt SATB1 uttryck, som även uttryckte lågt SATB2, och överlevnaden. Intressant nog visar resultatet att SATB1 var en negativ prognostisk faktor i tumörer med lågt SATB2 uttryck (Figur 5), p= 0,023. Detta innebär att positivt SATB1 korrelerade med lågt SATB2, vilket leder till sämre prognos och kortare recidivfri överlevnad hos patienter.

DISKUSSION SATB1 och SATB2 är två proteiner i SATB familjen, som utgörs av AT-rika DNA sekvenser. SATB1 är ett tymocyt-specifikt matrix-associerat DNA-bindande protein, som även är involverat i utvecklingen av CRC oberoende av Wnt/ βcatenin signaleringsvägen [10]. SATB2, en homolog till SATB1, är en transkriptionsfaktor och epigenetisk regulator, och är identifierat som ett högt vävnadsspecifikt protein, vilket uttrycks främst i körtelcellerna i nedre magtarmkanalen och CRC [3, 15]. SATB1, SATB2 och β-catenin har undersökts i flera studier för att man vill försöka påvisa proteinernas uttryck och funktion i vissa cancerformer, som t ex mag- och bröstcancer. I en studie, där syftet var att undersöka korrelation mellan SATB1 uttryck och histopatologiska faktorer samt dess prognostiska betydelse inom magcancer, visade man att positivt SATB1 uttryck korrelerade med både ålder och TNM stadium hos patienter med magcancer. Förutom det visade 13

Kaplan-Meier analysen att SATB1 överexpression associerade med sämre prognos, vilket också var signifikant [10]. Ytterligare analyser tydde på att SATB1 kan vara en prognostisk oberoende markör för magcancer [10, 14]. I vår studie var det av intresse att utföra denna kohortstudie för att undersöka proteinernas uttryck, dess korrelation och prognostiska betydelsen i kolorektal cancer, CRC. Resultatet från immunhistokemiska färgningar visar att av totalt 267 visualiserade tumörprover var det 185 st (62,8 %), som uttryckte SATB2 och 113 st (43 %) som uttryckte SATB1. Endast 75 st (28,9 %) av tumörer uttryckte β-catenin. SATB2 hade högre uttryck än de andra markörerna och endast SATB2 uttrycktes i normal kolorektalslemhinna, vilket överensstämmer med tidigare studier [8, 15]. Utifrån en tidigare studie [3], har det även påvisats att högt SATB2 uttryck kan vara en oberoende markör för bättre prognos för koloncancer, dock ej för rektalcancer. I studien som omfattade 527 st CRC prover fann man även att SATB2 kan modulera känsligheten mot både kemoterapi och strålnings behandling, på så sätt att högt SATB2 uttryck i rektalcancer korrelerade med en ökad effekt av neoadjuvant terapi. Patienter i steg III-IV inom TNM stadium, med tumörer som hade högt SATB2 uttryck, hade en signifikant fördel av adjuvant och/ eller neoadjuvant behandling [3]. Detta gav intresse att undersöka SATB2 uttryck i kolorektal cancer och samband med överlevnad. I våra Kaplan-Meier kurvor visar vi att högt SATB2 uttryck, det vill säga tumörer med mer än 75 % infärgade kärnor med SATB2, ger kortare recidivfri överlevnad jämfört med patienter som har tumörer med lågt eller inget uttryck av SATB2. I vår studie erhölls dock inga signifikanta värden. Intressant nog har man i en annan studie påvisat att lågt SATB2 uttryck korrelerar med tumörprogression och dålig prognos i patienter med CRC [16]. Här visar vi att tumörer med högt SATB1 uttryck korrelerar med sämre recidivfri överlevnad jämfört med negativa tumörer, dock var detta inte heller signifikant. Korrelationer mellan SATB1 och höga protein- och mRNA nivåer i invasiva tumörer i TNM stadiet i rektalcancer har visats i en studie, fast dess prognostiska betydelse har ännu inte studerats [8]. SATB1 och SATB2 var inte prognostiskt signifikanta i hela kohorten i vår studie, men vi fann däremot att tumörer med lågt SATB2 uttryck som samtidigt uttryckte SATB1 hade en signifikant kortare tid till återfall än tumörer som saknade SATB1 uttryck. Framtida studier kring eventuell antagonism mellan SATB1 och SATB2 i CRC är därför av intresse att genomföra. Resultatet från korrelationstabellen visar att det finns en signifikant inbördes korrelation mellan SATB1, SATB2 och β-catenin. Förutom att högt SATB2 uttryck korrelerar med högt SATB1, vilket även är signifikant, korrelerar proteinet också med låga T och N tumörstadier. Korrelationen mellan SATB1 och β-catenin är i enlighet med tidigare studier [10, 20]. Förutom korrelationen mellan SATB1 och β-catenin har denna studie visat en ännu starkare koppling mellan SATB2 och β-catenin, så att högt SATB2 uttryck korrelerar med högt β-catenin uttryck, vilket inte visats tidigare. Slutsats Utifrån resultatet i den här studien kan man dra slutsatsen att det finns en signifikant relation mellan uttryck av SATB1, SATB2 och β-catenin i kolorektal 14

cancer. Därutöver har vi visat att SATB1 är en negativ prognostisk faktor i tumörer med reducerat SATB2 uttryck. Framtida värde Det behövs nya biomarkörer för förbättrad behandling av patienter med kolorektal cancer (CRC). SATB1 och SATB2 är exempel på potentiella prognostiska markörer, som har validerats i denna studie.

15

REFERENSER 1. Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P (2002) Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 2005, 74-108. 2. National Cancer Institute (2011) Colorectal cancer screening. At the National Institutes of Health. 3. 4. Eberhard, J & Gaber, A & Wangefjord, S & Nodin, B & Uhlén, M & Lindquist, K and Jirström, K (2012)A cohort study of the prognostic and treatment predictive value of SATB2 expression in colorectal cancer. British Journal of Cancer, 931- 938. 4. Socialstyrelsen (2006) Medisinskt och hälsoekonomiskt faktadokument, Preliminär version. Nationella riktlinjer för kolorektalcancersjukvård (Artikelnr 2006-102-6). 5. Nationellt vårdprogram (2008) Kolorektal cancer (Tryckt på Onkologiskt

centrum, Umeå). 6. Carolyn, C & Compton, M.D & (2003) Colorectal Carcinoma: Diagnostic, Prognostic, and Molecular Features. Department of Pathology and University Health center, McGill University, Montreal, Quebec, 16, 4 (4), 376. 7. Figur 1 >http://www.managecrc.com/articles/ArticleReader.aspx?article=327&pag e=1< 2012-06-03 8. Meng, WJ & Yan, H & Zhou, B & Zhang, W& Kong, XH & Wang, R & Zhan, L & Li, Y & Zhou, ZG & Sun, XF (2011) Correlation of SATB1 overexpression with the progression of human rectal cancer. Int J Colorectal Dis, 2, 143- 150. 9. Lu, X & Cheng, C & Zhu, S & Yang, Y & Zheng, L & Wang, G & Shu, X & Wu, K & Liu, K & Tong, Q (2010) SATB1 is an independent prognostic marker for gastric cancer in a Chinese population. Oncol Rep, 981-987. 10. Meng, W-J & Yan, H & Li, Y & Zho, Z-G (2011) SATB1 and colorectal cancer in Wnt/β-catenin signaling: Is there a functional link? Medical Hypothese,s 76, 277- 279. 11. Alvarez, JD &Yasui, DH & Niida, H & Joh, T & Loh, DY & KohwiShigematsu, T(2000) The MAR-binding protein SATB1 orchestrates temporal and spatial expression of multiple genes during T-cell development. Genes Dev, 521-535.

16

12. Han, HJ & Russo, J & Kohwi, Y & Kohwi-Shigematsu, T (2008) SATB1 reprogrammes gene expression to promote breast tumour growth and metastasis. Nature, 187-193. 13. Cheng, C & Lu, X & , G & Zheng, L & Shu, X & Zhu, S & Liu, K & Wu, K & Tong, Q (2010) Expression of SATB1 and heparanase in gastric cancer and its relationship to clinicopathologic features. APMIS, 855-863. 14. Dobreva, G & Dambacher, J & Grosschedl, R (2003) SUMO modification of a novel MAR-binding protein, SATB2, modulates immunoglobulin mu gene expression. Genes Dev, 3048-3061. 15. Magnusson, K & Wit, M & Brennan, DJ & Johnson, LB & McGee, SF &

Lundberg, E & Naicker, K & Klinger, R & Kampf, C & Asplund, A (2011) SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas. Am J Surg Pathol, 937-948. 16. Wang, S & Zhou, J & Wang, XY & Hao, J-M & Chen, JZ & Zhang, XM & Jin, H & Liu, L & Zhang, YF & Liu, J (2009) regulated expression of SATB2 is associated with metastasis and poor prognosis in colorectal cancer. J Pathol, 219. 17. Vala Sciences: Beta catenin. Monitoring expression and distribution of βcatenin >http://www.valasciences.com/assets/appnotes/Vala_Sciences_Beta_Catenin.pdf< 24-06-2012 18. Tetsu Akiyama (2000) Wnt/b-catenin signaling. Cytokine & Growth Factor Reviews, 11, 273-282 19. Klaus, A & Birchmeier, W (2008) Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer, 387-398. 20. Notani, D & Gottimukka, KP & Jayani, RS & Limaye, AS & Damle, MV & Mehta, S & Purbey, PK & Joseph, J & Galande, S (2010) Global regulator SATB1 recruits beta-catenin and regulates T(H)2 differentiation in Wnt-dependent manner. PLoS Biol, 8 (19:e1000296.) 21. Kallioniemi, O-P & Wagner, U & Kononen, J & Sauter, G (2001) Tissue microarrays (TMAS) for high-throughput molecular profiling of cancer. Oxford University Press, Human molecular genetics, 10, (7) 657- 662. 22. Nocitoi, J & Kononen, O-P & Sauter, G (2001) Tissue microarrays (TMAS) for high-throughput molecular pathology research. Int. J. Cancer, 94, 1–5. 23. Dako Denmark A/S (2006) Handbok till Dako Autostainer Plus, Dako Autostainer Plus Handbook. Dokumentnummer 0000646. >http://www.dako.com/0000646_rev_man_autostainer_plus_handbook_s wedish.pdf< 2012-04-26

17

18