Politecnico Di Milano Facoltà di Ingegneria Dei Sistemi
Corso di Laurea in Ingegneria Biomedica
ANALISI E CARATTERIZZAZIONE DI UN SENSORE OTTICO PER STRUMENTAZIONE PORTATILE DI REAL-TIME PCR SU LAB-ON-CHIP
RELATORE: Prof. Rafaelle Dellacà
CORRELATORE:
TESI DI LAUREA DI
Ing. Marco Bianchessi
Jorge Enrique Solorzano Pozo Matr. N. 720046
Anno Accademico 2009/2010
Ringraziamenti Desidero innanzitutto ringraziare il Professor Dellacà per i preziosi insegnamenti durante i due anni di laurea magistrale e le per le ore dedicate alla mia tesi. Inoltre, ringrazio sentitamente L'ingegnere Bianchessi che è stato sempre disponibili a dirimere i miei dubbi durante la stesura di questo lavoro. Inoltre, vorrei esprimere la mia sincera gratitudine ai miei colleghi, con cui sono trascorsi dodici mesi di tesi; ringrazio in modo particolare Alessandro, Pietro, Federica, Jasmin, Marco D., Marco C. per il gruppo Bio, Daniele, Davide e Luca per il gruppo Robot con cui ho imparato tanto sul controllo del sensore ottico. In ne, ho desiderio di ringraziare con aetto i miei genitori per il sostegno ed il grande aiuto che mi hanno dato, da lontano però sempre vicini nei miei pensieri e dentro il mio cuore ed in particolare Branka per essermi stata vicina ogni momento durante questo anno di lavoro .
1
Indice Ringraziamenti
1
Elenco delle gure
6
Elenco delle tabelle
9
Sommario
10
Summary
14
Introduzione
17
1 Tecniche di analisi nucleotidiche 1.1
Introduzione
1.2
Reazione a Catena della Polimerasi
18
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
. . . . . . . . . . . . . . . . .
19
1.2.1
I componenti della miscela di reazione . . . . . . . . . . . .
19
1.2.2
Meccanismo di funzionamento . . . . . . . . . . . . . . . .
22
1.2.3
E cienza di reazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
1.2.4
Rivelazione del DNA ampli cato . . . . . . . . . . . . . . .
27
2
1.2.5
1.3
1.4
Applicazioni
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
La Real-Time PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
30
1.3.1
Introduzione
30
1.3.2
Marcatura del DNA
1.3.3
La Fluorescenza
1.3.4
Ciclo soglia e quantità iniziale di DNA
1.3.5
Applicazioni
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
30
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
. . . . . . . . . . .
34
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
PCR vs Real-Time PCR
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 Sistema di Real-Time PCR basato su lab-on-chip
37
39
2.1
Introduzione
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
39
2.2
Il lab-on-chip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
40
2.3
La scheda di controllo
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
44
2.4
La componente meccanica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
2.5
La componente biologica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
48
2.6
Il sistema di illuminazione
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
49
2.7
I ltri ottici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
51
2.8
Il sensore ottico
53
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 Tecnologia dei sensori ottici 3.1
55
Introduzione ai sensori ottici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
55
3.1.1
55
Sensore CCD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
3.1.2
3.1.3
3.2
3.1.1.1
Concetti di basi sui CCD
. . . . . . . . . . . . .
55
3.1.1.2
Tipologia dei CCD . . . . . . . . . . . . . . . . .
56
3.1.1.3
Performance di un CCD . . . . . . . . . . . . . .
60
Sensore CMOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
63
3.1.2.1
Concetti di Base dei sensori a tecnologia CMOS
.
63
3.1.2.2
Il sensore CMOS per immagini
. . . . . . . . . .
64
3.1.2.3
Architettura di base . . . . . . . . . . . . . . . .
64
3.1.2.4
Riconoscimento colorimetrico . . . . . . . . . . .
65
Parametri Caratteristici di sensori d'immagini . . . . . . . .
67
Sensore ST - VS6724
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
69
3.2.1
Descrizione del sensore:
. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
69
3.2.2
Funzionamento del coprocessore . . . . . . . . . . . . . . .
71
4 Caratterizzazione del sensore VS6724
73
4.1
Introduzione
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
73
4.2
Set-up sperimentale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
73
4.2.1
4.2.2
Strumenti e programmi utilizzati per condurre gli esperimenti 76
4.2.1.1
Modulo Camera RVS: . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.1.2
Strumenti Programmabili: Agilent E3631A e Ag-
76
ilent 34410A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
77
Software implementati per l'acquisizione dei dati . . . . . .
79
4.2.2.1
79
Firmware di controllo del sensore
4
. . . . . . . . .
4.3
4.2.2.2
Creazione della sequenza di esperimenti . . . . . .
80
4.2.2.3
Software per l'avvio gli esperimenti . . . . . . . .
82
Prove sperimentali e risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
83
4.3.1
Esperimento 1
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
84
4.3.2
Esperimento 2
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
85
4.3.3
Esperimento 3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
87
4.3.4
Esperimento 4
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
90
4.3.5
Esperimento 5
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
92
4.3.6
Esperimento 6
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
93
Conclusioni e sviluppi futuri
95
Bibliogra a
97
A APPENDICE A
99
5
Elenco delle gure 1.1
Gli stadi della PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
1.2
Termociclatore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
23
1.3
Principio di funzionamento della PCR . . . . . . . . . . . . . . . .
25
1.4
Fasi della PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
27
1.5
Apparato di elettroforesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
28
1.6
Immagine di una corsa elettroforetica
. . . . . . . . . . . . . . . .
29
1.7
Molecola uorescente
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
1.8
Sonda Taqman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
1.9
Diagramma di Jablonsky sempli cato . . . . . . . . . . . . . . . .
33
1.10 Risultato della Real-Time PCR
. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
1.11 Rapporto fra numero di cicli termici CT e il logaritmo della concentrazione iniziale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
2.1
Lab-on-chip
40
2.2
Parte inferiore del chip - STMicroelectronics
2.3
Cameretta da 12 pozzetti
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . .
42
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
6
2.4
Cameretta da 9 pozzetti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
2.5
Cameretta da 6 pozzetti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
2.6
La scheda di controllo
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
44
2.7
La contattiera
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
2.8
La slitta
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
48
2.9
Simbolo circuitale del LED . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
49
2.10 Filtro passa banda ad una singola cavità
. . . . . . . . . . . . . .
52
2.11 Modulo di visione per la Real-Time PCR
. . . . . . . . . . . . . .
54
3.1
Sensore CCD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
56
3.2
Schema logico di un sensore CCD . . . . . . . . . . . . . . . . . .
57
3.3
Interline Transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
58
3.4
Frame Transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
3.5
Full Frame Transfer
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60
3.6
Rete Pull-up, rete Pull-down . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
63
3.7
Con gurazione di base del sensore CMOS . . . . . . . . . . . . . .
65
3.8
Beam splitter
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
66
3.9
Filtri a rotazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
66
3.10 Filtro Bayern
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
67
3.11 Formato Bayer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
4.1
Segnale di un duty-cycle del 20%
74
4.2
Circuito di controllo della intensità luminosa del LED 7
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
74
4.3
Setup-sperimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
75
4.4
Modulo RVS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
77
4.5
Interfaccia USB
77
4.6
Alimentatore Agilent E3631A
4.7
Multimetro Agilent 34410A
4.8
Sequenza di inizializzazione del sensore VS6724
. . . . . . . . . .
80
4.9
Scelta della modalità di lavoro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
80
4.10 Interfaccia gra ca per l'utilizzo del Modo Diretto . . . . . . . . . .
81
4.11 Interfaccia gra ca per l'utilizzo del Modo Compilato
. . . . . . . .
81
. . . . . . . . . .
82
4.13 Finestra per caricare ed eseguire gli esperimenti . . . . . . . . . . .
83
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
78
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
78
4.12 Finestra per la selezione del tipo di esperimento
°
4.14 Risultato esperimento n 1
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
° °
85
4.15 Risultato dell'esperimento n 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
87
4.16 Risultati dell'esperimento n 3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
88
4.17 Dettagli del gra co di Figura 4.16 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
89
°
4.18 Risultato dell'esperimento n 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
90
4.19 Curve isoluminose
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
91
4.20 Rapporto fra media dei pixel e varianza . . . . . . . . . . . . . . .
92
4.21 Linearità del sensore VS6724
94
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
Elenco delle tabelle 1.1
Vantaggi e svantaggi della PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
1.2
Vantaggi e svantaggi della Real-Time PCR
. . . . . . . . . . . . .
38
4.1
Valori impostati nell'esperimento n 1
. . . . . . . . . . . . . . . .
84
4.2
Valori impostati nell'esperimento n 2A
. . . . . . . . . . . . . . .
86
4.3
Valori impostati nell'esperimento n 2B
. . . . . . . . . . . . . . .
86
4.4
Valori impostati nell'esperimento n 3
. . . . . . . . . . . . . . . .
88
4.5
Valori impostati nell'esperimento n 4
. . . . . . . . . . . . . . . .
89
4.6
Valori impostati nell'esperimento n 5
. . . . . . . . . . . . . . . .
92
4.7
Valori impostati nell'esperimento n 6
. . . . . . . . . . . . . . . .
93
° ° ° ° ° ° °
9
Sommario La genomica è lo studio della struttura, del contenuto e dell'evoluzione dei geni. I progressi tecnologici, dovuti inizialmente al sequenziamento di nucleotidi su larga scala, hanno in seguito determinato una rapida crescita di questo campo di ricerca. Nuovi strumenti sempre più automatizzati hanno permesso un ulteriore sviluppo e progresso della ricerca in questo campo. Tra gli attuali loni di ricerca, e' sempre più rilevante lo studio dell'espressione genica di tipo comparativo: cioè identi care, tra i diversi campioni in esame, eventuali sottogruppi di geni che presentano differenti espressioni. Tra le diverse tecnologie sviluppate per questo tipo di analisi, ha rivestito per molti anni un ruolo predominante la tecnica basata su una iniziale PCR, acronimo di Polymerase Chain Reaction, che comporta un'ampli cazione del materiale genomico di interesse (sequenza speci ca) attraverso una reazione enzimatica attivata da un processo termico, seguita da una procedura di elettroforesi su gel o capillare, necessaria a determinare l'eventuale presenza nel campione biologico della sequenza nucleotidica di interesse. Due metodi più moderni per misurare la quantità di un singolo mRNA sono la real-time polymerase chain reaction (Real-Time PCR) o la reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), che permettono di quanti care la presenza di un determinato trascritto anche in pochi nanolitri di estratto cellulare. Per tale elevatissima sensibilità la RT-PCR è attualmente la tecnica di elezione, anche se i costi per gli strumenti ed i reagenti possono essere proibitivi. La tecnica di Real-Time PCR consente di monitorare in tempo reale l'ampli cazione di una sequenza target dal materiale genetico di partenza, sfruttando una marcatura a emissione di uorescenza del campione biologico. Il segnale di uorescenza proviene da marcatori intercalanti, ovvero molecole che si insinuano nella doppia catena di DNA, una volta intercalate diventano uorescenti per l'eetto 10
di separazione sica di una molecola uorescente e del quencher (in soluzione il marcatore risulta avvolto su se stesso e pertanto il quencher riassorbe i fotoni emessi dal uoro foro).
Pertanto la uorescenza globale del volume di reazione
(campione in analisi) e' proporzionale alla quantità di dna target presente, tale quantità raddoppia ad ogni ciclo termico di PCR, monitorando l'andamento della uorescenza ad ogni ciclo, si riesce a quanti care la concentrazione iniziale di DNA target calcolando il momento (numero del ciclo termico) nel quale si supera una certa soglia. La tecnica di Real Time PCR e' descritta in dettaglio nel capitolo 1.
STMicroelectronics sta sviluppando delle piattaforme LabOnChip per applicazioni diagnostiche di analisi molecolari. In particolare si sta investendo su un sistema di detection per real time PCR. Tali dispositivi renderanno più facile, agile e veloce l'analisi di determinate patologie, che oggi sono estremamente costose e complicate, tanto da essere svolte solo da personale specializzato in laboratori attrezzati con strumentazione molto costosa.
Pertanto lo scopo e' quello di realizzare pi-
attaforme di tipo Point Of Care , ove, mediante l'utilizzo di strumentazione a basso costo e semplice da utilizzare, queste tecniche diventano alla portata anche di utilizzatori meno esperti.
Il lavoro di tesi si inquadra nello sviluppo di una piattaforma per Real Time PCR, composta da un Lab On Chip disposable" ( usa e getta ) e uno strumento dedicato.
Lo strumento e' composto da una scheda a microcontrollore ARM per
il controllo della ciclatura termica, ed un modulo ottico con sensore CMOS per l'analisi della uorescenza.
Obbiettivo del lavoro di tesi è analizzare e caratterizzare il sensore di rilevazione della uorescenza composta da un sensore ottico a tecnologia CMOS fabbricato da STMicroelectronics, un microcontrollore per la regolazione dei parametri della camera , dei LED per l'eccitazione e i ltri ottici per la separazione della lunghezza d'onda di interesse.
Il lavoro di tesi è articolato quattro capitoli principali:
Il primo ore una panoramica relativa alle due principali tecniche di analisi molecolari:
PCR e Real Time PCR. Entrambe prevedono una iniziale fase di ampli -
cazione del materiale genomico a disposizione mediante la reazione a catena della
11
polimerasi.
Una semplice reazione di PCR deve, tuttavia, essere accompagnata
da una successiva analisi del campione biologico mediante elettroforesi su gel, con l'obbiettivo di valutare la presenza della sequenza nucleotidica di interesse.
La
Real Time PCR rappresenta una evoluzione di tale tecnica: in particolare consente una ampli cazione ed una quanti cazione simultanea delle molecole di DNA di interesse. Mediante un sistema di rilevazione del segnale di uorescenza è possibile monitorare in tempo reale l'eettiva ampli cazione delle catene nucleotidiche e risalire alla concentrazione iniziale del DNA di interesse.
La tecnica di PCR
e in particolare di Real-Time PCR, ha rivoluzionato il campo della diagnostica molecolare, fornendo nuovi e potenti strumenti per eettuare diagnosi precoci di alterazioni genetiche anche a livello di singolo nucleotide. L'estrema sensibilità e la possibilità di funzionare a partire da campioni non trattati si è rivelata ottimale nella diagnosi prenatale di malattie genetiche, nell'analisi precoce di marker tumorali e nei follow up clinici conseguenti ad asportazioni chirurgiche di tumori. Anche in campo forense e medico legale la PCR si è imposta come strumento essenziale sul quale si basano analisi di paternità e perizie medico-legali. Il secondo capitolo ore una dettagliata descrizione del sistema sviluppato da STMicroelectronics per realizzare su un unico dispositivo la reazione di PCR, l'ibridazione delle catene ampli cate con sonde ad emissione di uorescenza e la detection di tale segnale. Il sistema è costituito da: il Lab-on-chip, la scheda di controllo, una componente meccanica, una componente biologica, un sistema di illuminazione, i ltri ottici e il sensore ottico per la rilevazione del segnale di uorescenza. Il labOnChip è un dispositivo MEMS monolitico realizzato a partire da un unico substrato in silicio grazie alle tecniche di lavorazione dei semiconduttori. Il circuito di controllo è costituito da quattro blocchi: circuito di riscaldamento, circuito di rareddamento, circuito di controllo della temperatura e sistema di comunicazione verso PC. È stata progettata e realizzata una piccola camera di reazione in materiale polimerico tale da poter essere posizionata sopra il chip in silicio e contenente il campione biologico in esame. Il sensore ottico consente in ne la rilevazione del segnale di uorescenza eventualmente generato a seguito dell'ibridazione. Il terzo capitolo illustra due tecnologie impiegate per la fabbricazione dei sensori ottici: CCD e CMOS. Entrambe le tecnologie sono utilizzate per la rilevazione 12
della luminosità però con diverse caratteristiche, mentre il CCD immagazzina l'energia proveniente dai fotoni e richiede di un ulteriore processo per ottenere una rappresentazione digitale, il sensore CMOS, appro ttando la capacità di integrare convertitori analogo-digitale e altri circuiti elettronici per il processing del segnale proveniente dal sensore, non richiede di altri componenti esterni per elaborare l'informazione del sensore. Il costo del dispositivo è uno dei principali fattori per quanto riguarda la scelta Tra le due Tecnologie. Il sensore VS6724 appartiene al gruppo di sensori fabbricati con tecnologia CMOS, fabbricato da STMicroelectronics, scelto per le sue caratteristiche e le funzionalità.
Il quarto capitolo mostra una serie di esperimenti realizzati per quanti care le caratteristiche e prestazioni del sensore come la linearità, il rapporto segnale rumore e le variazioni di luminosità in funzione delle impostazioni di guadagno e tempo di esposizione. Per eseguire gli esperimenti è stato necessario l'utilizzo di strumentazione digitale.
I risultati di caratterizzazione del sensore permetteranno di ottimizzare
lo strumento per Real Time PCR, contenendone i costi e massimizzandone le prestazioni.
13
Summary The main starting point of this thesis has been understanding genomics i.e. the study of the genomes of organisms.
Research in genomic studies has recently
experienced rapid growth, and we can see more new tools created for studying genetics for continuing the research in an automatic manner.
Among the current areas of research, the study of comparative gene expression has become an important sector in which the basics of Polymerase Chain Reaction (PCR) are used. PCR involves ampli cation of genetic material through thermal processes. This procedure is followed by capillary or gel electrophoresis which is necessary to determine the speci c quantity of genetic material ampli ed in each PCR experiment.
Nowadays, there are two modern techniques that allow the measurement of quantities of single mRNA: Real-Time PCR and Reverse Transcription-Polymerase chain reaction (RT-PCR). These techniques are used to quantify the presence of a specific transcript inside a few nanoliters of the mix. For a highly sensitive test, RT-PCR is likely to be used even if instrumentation costs are high.
Real-Time PCR monitors the ampli cation of the target sequence inside the genetic material. Real time monitoring of the ampli cation of the target is accomplished by marking the sequence with a uorescent dye. As the target sequence is ampli ed the uorescent signal increases which is then detected by the sensor. Since there are uorescent markers which remain unattached to the target sequence, the presence of a quencher is required.
The main function of the quencher is to absorb the
photons emitted by the uorescent dye. Therefore, the overall uorescence emitted by the reaction solution is proportional to the amount of target sequence inside
14
the DNA. The uorescent signal doubles in each cycle of PCR. This characteristic permits the quanti cation of the initial concentration of target DNA by calculating the number of thermal cycles after a xed threshold value is surpassed.
STMicroelectronics is developing LabOnChip platforms for molecular analysis. They are investing eorts in a Real-Time PCR system which will simplify the analysis of various illnesses compared to instruments used in today's analyses.
Specially
trained employees are required for performing common Real-Time PCR tests, however, specially trained employees. For the development of the new instrument are not required.
The thesis is developed within a Real-Time PCR instrument based on LabOnChip composed by: ARM micro-controlled based circuit in charge of thermal cycling, and CMOS optic sensor used for uorescent detection. The main objective is the analysis and characterization of uorescent detection CMOS sensor, produced by STMicroelectronics.
The sensor is positioned inside a module that controls the
camera parameters and LED luminance.
The thesis is divided in four parts:
The rst chapter explains two main techniques for molecular analysis, like PCR and Real-Time PCR. The two of them provide an initial phase of genetic material ampli cation produced by the polymerase chain reaction. A simple PCR is followed by analysis of biological sample using electro-phoretic procedure for detecting the presence of target DNA sequence. Using a uorescent detection sensor is possible to follow the actual ampli cation state within the cycles. The Real-Time PCR has changed the eld of molecular diagnosis. The technique's sensibility and the possibility to use a non treated sample becomes useful for detecting genetic illnesses. There are many other applications of Real-Time PCR like the follow up of patients after a chirurgical session and paternity exam.
The second chapter oers a detailed description of Real-Time PCR instrument developed by STMicroelectronics.
This process is done by a single chip called
LabOnChip which response is measured by the optic sensor. The system has the following parts: LabOnChip, a control circuit, a mechanic component, a biological component, an illumination system, an optic lter and the optic sensor for detecting
15
uorescence.
LabOnChip is a MEMS device made with a single silicon layer,
the same used in semiconductors elaboration technique. made by four blocks:
The control circuit is
heating, cooling and temperature control circuits and a
PC communication system. A small polymeric chamber has been made to place a silicon chip over it with the biological sample. The optic sensor allows the detection of uorescent signal produced after the end of every thermal cycle.
The third chapter shows two kinds of technologies used for optic sensors fabrication: CMOS and CCD. Although these are dierent technologies, both of them are used to measure luminance.
The CCD saves energy produced by photons and
requires a next step for representing this information in digital format. The CMOS sensor takes advantage of the fabrication technique for inserting inside the circuitry another functional blocks like:
analog to digital converters, post-processing of
the image and algorithms for image conversion. The cost is an important factor that guides the user's choice between the two technologies. The VS6724 sensor belongs to the CMOS technology. It's created by STMicroelectronics and due to the performances and special characteristics is the sensor chosen for detecting the luminance.
The fourth chapter shows the experiments done to get the quantitative characteristics of the optic sensor like the linearity, the signal to stress the relation and the changes of luminance as the function of gain and exposure time. It was necessary to use digital instrumentation in order to proceed with the experimentation. The results obtained by the experiments will be used to optimize the Real-Time PCR instrument.
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INTRODUZIONE Il recente e rapido sviluppo della genomica e della diagnostica molecolare e' estremamente promettente per le diverse applicazioni in diversi campi. Le scienze biologiche e biomediche, come l'oncologia, l'epidemiologia e la tassonomia, hanno introdotto con entusiasmo l'analisi del DNA e dell'RNA nei loro ambiti sperimentali.
Conseguentemente è cresciuta la necessità di eettuare, anche sul campo, test molecolari come il sequenziamento del DNA, i saggi immunologici, le analisi di espressione genica per studi ambientali, medici, forensi.
Le tipiche piattaforme
cliniche attualmente utilizzate per realizzare tali test sono ancora ingombranti, ad alto consumo energetico, costo proibitivo e richiedono un numero elevato di reagenti, rendendole inadatte per queste applicazioni. L'utilizzo di tali strumentazioni e tecniche risulta particolarmente oneroso sia in termini di risorse umane (operatori specializzati) che temporali: per ottenere l'a dabilità richiesta è, infatti, spesso necessario che le analisi vengano ripetute diverse volte.
Gli sforzi compiuti recentemente in questo campo hanno portato allo sviluppo di soluzioni di tipo LabOnChip , dispositivi in grado di integrare funzioni, automatizzare reazione chimiche ed integrare sensori per la rilevazione delle molecole e specie target. In aggiunta alla riduzione della dimensione, dei costi e del consumo di energia, i LabOnChip possono incrementare notevolmente l'e cienza del sistema, contraendo i tempi e i costi di analisi e di lavoro. Tali tecnologie permettono analisi su volumi contenuti di campione; questa riduzione porta ad una diminuzione dei livelli di segnali biochimici generati, rendendo necessario concentrare gli sforzi nel miglioramento della sensibilità di rivelazione del segnale.
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Capitolo 1 Tecniche di analisi nucleotidiche 1.1 Introduzione La genomica è lo studio della struttura, del contenuto e dell'evoluzione dei genomi. I progressi tecnologici sono dovuti, da un lato, all'incremento signi cativo dell'informazione derivante dal sequenziamento completo del genoma di numerosi organismi, dall'altro allo sviluppo di tecnologie innovative per sfruttare tale informazione. Le analisi sperimentali sono sempre più accompagnate dallo sviluppo di nuovi strumenti di indagine, sempre più veloci e sempre più e cienti. Tra gli attuali loni di ricerca, occupa un ruolo rilevante lo studio dell'espressione genica di tipo comparativo; l'obbiettivo delle analisi è identi care, tra i diversi campioni in esame, eventuali sottogruppi di geni che presentano dierenti espressioni geniche. Tra le diverse tecnologie sviluppate per questo tipo di analisi, ha rivestito per molti anni un ruolo predominante la tecnica basata su una iniziale PCR (Polymerasi Chain Reaction) che comporta una ampli cazione del materiale genomico di interesse, seguita da una procedura di elettroforesi su gel o capillare, necessaria a determinare l'eventuale presenza nel campione biologico della sequenza nucleotidica di interesse. Negli ultimi anni, si è invece sviluppata una nuova tecnica di indagine de nita Real Time PCR, che consente di monitorare in tempo reale l'ampli cazione di una 18
sequenza bersaglio dal materiale genomico di partenza sfruttando una marcatura a emissione di uorescenza del campione biologico. Nel presente capitolo vengono confrontate le tecniche di PCR e Real Time PCR che permettono di arrivare ad un analisi dei vantaggi e degli svantaggi introdotti da ognuno di queste tecniche.
1.2 Reazione a Catena della Polimerasi La PCR è una tecnica di indagine genomica che consente la moltiplicazione di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. Mediante la reazione a catena della polimerasi è possibile ottenere in vitro una quantità di catene nucleotidiche su ciente per le successive applicazioni. Mediante elettroforesi su gel si valuta la presenza della sequenza nucleotidica di interesse.
1.2.1 I componenti della miscela di reazione Gli elementi fondamentali alla reazione di PCR sono:
Acqua (H2 O) ultrapura e sterile DNA templato
È il DNA di partenza, che fa da stampo per la reazione di polimerizzazione; la sequenza nucleotidica di partenza può anche non contenere la sequenza target che si vuole ampli care. La natura e il grado di purezza del templato ne determinano la quantità minima richiesta. L'unità di misura più corretta per quanti care il templato è la molarità, in quanto indica inequivocabilmente il numero iniziale di copie della sequenza target, che è un parametro fondamentale per valutare il risultato di una PCR. Quantità elevate di DNA templato facilitano il buon esito della PCR, ma aumentano la resa di prodotti non speci ci. 19
DNA - Polimerasi
È l'enzima che catalizza la reazione di polimerizzazione del DNA. La DNA polimerasi è un enzima che esiste in natura in ogni organismo; la replicazione cellulare di tutti gli esseri viventi dipende dalla sua attività, in quanto duplica accuratamente il DNA quando le cellule si dividono.
Una DNA polimerasi lega un lamento singolo di DNA e sintetizza il lamento complementare, procedendo in direzione 5'
3'; ha bisogno di un innesco (primer)
appaiato ad un singolo lamento di DNA, che fornisca un gruppo libero 3'OH necessario per l'inizio della sintesi.
I primers
Permettono la buona riuscita della PCR. Essi, infatti, devono potersi ibridare in maniera speci ca ed e ciente alla sequenza d'interesse, tralasciando quelle aspeci che. I primers sono piccole sequenze nucleotidiche costituite da poche decine di basi in grado di legarsi alla singola elica di DNA stampo mediante un processo de nito annealing
1 ; in questo modo si ottiene l'innesco della la fase di polimerizzazione con il vantaggio di poter decidere quale segmento di DNA replicare.
La tipologia di primer da usare varia a seconda dello scopo della PCR.
Grazie alle banche dati ed alle pubblicazioni scienti che stanno diventando sempre più disponibili le sequenze di acidi nucleotidici necessarie per poter disegnare i primer da utilizzare nelle PCR.
Una concentrazione di primer troppo elevata potrebbe portare all'ampli cazione di sequenze non speci che, mentre, al contrario, una troppo scarsa presenza di primer rende la PCR ine cace. 1 Il
termine è entrato nel gergo tecnico di laboratorio per indicare l'appaiamento di un primer o di una sonda di DNA ad una catena a singola elica di DNA durante una reazione a catena della polimerasi.
20
Deossiribonucleotidi trifosfati (dNTPs)
Sono i monomeri che servono per la polimerizzazione del DNA; vengono idrolizzati dalla DNA polimerasi a dNMP (deossiribonucleotide monofosfato), incorporato nella catena di DNA nascente, e PPi (pirofosfato), il by-product della reazione di sintesi del DNA. Sono 4 diverse molecole: dATP, dCTP, dGTP e dTTP. Tipicamente, ognuno dei 4 dNTPs è presente a una concentrazione di 20-200
µ M;
tale concentrazione è scelta in funzione della lunghezza dell'ampli cato e del numero di cicli. È importante che tutti e quattro i dNTPs siano presenti in uguale quantità, poiché altrimenti aumentano sensibilmente gli errori di incorporazione da parte della DNA polimerasi, così come quando i dNTPs sono presenti in concentrazione eccessiva. Inoltre, come i primers, i dNTPs non devono nemmeno essere mai limitanti, altrimenti l'e cienza di reazione ne risentirebbe.
Il magnesio
La concentrazione di magnesio è senza dubbio il fattore più critico di tutta la PCR. Questo parametro deve essere fatto oggetto d'una attenta procedura d'ottimizzazione in quanto può variare anche se si utilizzano diversi primer per ampli care una medesima regione di DNA. La presenza di magnesio condiziona l'attività della polimerasi, l'ibridizzazione dei primer ed aumenta la temperatura cui il DNA stampo si denatura.
Per allestire una PCR, di conseguenza, è bene allestire diverse
miscele di reazione contenenti quantità progressivamente scalari di magnesio che varino da un minimo di 0.05 mM ad un massimo di 5 mM (il più delle volte si utilizza magnesio 1,5 mM).
Tampone
La soluzione tampone ha il compito di mantenere il pH del campione biologico ad un valore ottimale per l'attività enzimatica della polimerasi. Tipicamente si usa un
°
tampone Tris-HCl 10-50 mM, con un pH compreso tra 8.3 e 9 a 25 C.
21
Cloruro di Potassio (KCl)
Dà la forza ionica necessaria alla soluzione, facilita l'annealing dei primers e aumenta l'emivita della Taq polimerasi. La concentrazione di KCl non deve superare 50 mM, altrimenti comincia ad inibire la Taq
1.2.2 Meccanismo di funzionamento All'interno di una cellula in divisione, la replicazione del DNA coinvolge una serie di reazioni mediate da molti enzimi, il cui risultato nale è una copia fedele dell'intero genoma. Durante la PCR, invece, un solo enzima è fondamentale, cioè una DNA polimerasi. Il meccanismo della PCR permette di ampli care in provetta solamente una porzione speci ca e determinata dell'insieme di acidi nucleici presenti nel campione. La speci cità è consentita dalla presenza nella miscela di reazione di una coppia di primers: si tratta di corti frammenti di DNA (oligonucleotidi), lunghi in media 20-30 nucleotidi, disegnati in modo da essere complementari alle sequenze che si trovano alle due estremità della regione target da ampli care. Un primer (forward) è complementare a uno dei due lamenti di DNA, in corrispondenza dell'inizio della regione target; l'altro primer (reverse) è complementare alla sequenza, sul lamento opposto, che si trova alla ne del frammento target ().
Figura 1.1: Gli stadi della PCR
Per eettuare una PCR, si mescolano in una provetta una soluzione acquosa tamponata, una piccola quantità di DNA templato (stampo), l'enzima DNA polimerasi, 22
la coppia di primers e i quattro deossiribonucleotidi trifosfati. Successivamente, la provetta viene posta all'interno di uno strumento apposito, chiamato termociclatore (Figura 1.2), che fa variare la temperatura all'interno della miscela di reazione in modo preciso e ciclico.
Figura 1.2: Termociclatore
In particolare, ogni ciclo di PCR si compone di tre fasi, ognuna a una diversa temperatura: la denaturazione, l'appaiamento e l'estensione (Figura 1.3).
°
1. Denaturazione: la miscela di reazione viene portata a 94-96 C per 30 secondi1 minuto. Il calore rompe i deboli legami idrogeno che tengono insieme le due eliche complementari di DNA, le quali dunque si aprono.
°
2. Appaiamento (annealing): la soluzione viene rareddata a 50-60 C (a seconda della sequenza dei primers e del DNA target) per 30 secondi - 1 minuto.
23
A queste temperature i due primers possono appaiarsi ai singoli lamenti di DNA, attraverso la formazione di legami idrogeno, in corrispondenza delle sequenze a loro complementari e vanno così a delimitare la regione da ampli care. 3. Estensione (polimerizzazione):
°
la miscela viene portata a 70-75 C per 40
secondi-qualche minuto. La DNA polimerasi si lega al gruppo ossidrile (OH) libero all'estremità 3' dei primers appaiati; dopodiché, l'enzima comincia ad allungare i primers, incorporando i nucleotidi complementari a quelli sul lamento stampo.
Si ottiene così la sintesi, o polimerizzazione, del DNA
target.
All'inizio di un protocollo di PCR si eettua una denaturazione iniziale (3-10
°
minuti a 94-96 C), per assicurare una completa denaturazione del lungo e complesso DNA templato di partenza; al termine dei cicli termici, tipicamente si ef-
°
fettua un'estensione nale (3-15 minuti a 72 C), per completare tutti i prodotti neosintetizzati.
24
Figura 1.3: Principio di funzionamento della PCR
1.2.3 E cienza di reazione In linea teorica ogni ciclo dovrebbe raddoppiare la quantità di DNA; ciò, tuttavia, non si realizza.
Per avere una stima su cientemente attendibile del numero di
lamenti di DNA ottenuti dopo n cicli si può ricorrere alla formula:
Yn = A · (1 + E)n
dove:
Y n=
DNA prodotto dopo n cicli 25
A=
quantità iniziale di DNA presente
n=
numero di cicli di PCR eettuati
E=
e cienza dell'ampli cazione (in genere compresa tra 0,7 e 0,8)
L'andamento della PCR nel tempo presenta quattro fasi (Figura 1.4):
All'inizio, la quantità di DNA sembra rimanere a un livello di background, ma è perché si è sotto la soglia di sensibilità di questo sistema di rilevazione.
1. Fase esponenziale. Dopo alcuni cicli, si comincia ad osservare un aumento esponenziale del prodotto, che corrisponde a quanto atteso, in base al meccanismo della PCR; ciò grazie al fatto che i reagenti sono ancora freschi e tutti disponibili. In questa fase, l'ampli cazione è molto speci ca e precisa. 2. Fase lineare.
Dopo un'ampli cazione esponenziale, si entra in una fase in
cui la quantità di prodotto aumenta linearmente.
Ciò è dovuto al fatto
che qualcuno dei reagenti inizia ad essere limitante e/o la DNA polimerasi comincia a perdere la propria attività. Questa fase è caratterizzata da un'elevata variabilità nella resa di ampli cazione, anche tra esperimenti replicati a confronto. 3. Plateau. Negli ultimi cicli, quando il prodotto comincia ad essere presente a concentrazione piuttosto elevata (0.3-1 nM), la reazione raggiunge un plateau: non si produce più ulteriore prodotto e se la miscela viene lasciata ad incubare per parecchio tempo, i prodotti cominciano a degradarsi.
Il
raggiungimento del plateau è molto variabile per ogni campione e può essere dovuto a diversi motivi:
degradazione di alcuni reagenti: DNA polimerasi o dNTPs, a causa delle alte temperature.
esaurimento di alcuni reagenti: primers, nel caso di prodotti corti, o dNTPs, nel caso di prodotti lunghi.
26
inibizione da prodotto nale: la reazione di polimerizzazione del DNA prevede la formazione di pirofosfato (PPi) come prodotto di scarto.
L'idrolisi di
questo legame ad alta energia è necessaria per far procedere la reazione di polimerizzazione.
La reazione opposta alla polimerizzazione del DNA è la
pirofosforolisi; verso la ne della PCR, quando il rapporto tra PPi e dNTPs è in netto favore di PPi, comincia ad avvenire anche la pirofosforolisi (che comunque è molto più lenta della polimerizzazione).
competizione per i reagenti da parte di prodotti non speci ci. competizione per il legame coi primers da parte dei prodotti, poiché questi sono ora presenti in concentrazione molto elevata ( no a 10nM); dunque, i prodotti ss iniziano a fare preferenzialmente re-annealing, piuttosto che appaiarsi coi primers.
Dunque, l'end-point detection su gel viene fatta quando la reazione è in fase di plateau; per questa ragione, l'intensità della banda osservata su gel non è necessariamente correlata con la quantità iniziale di DNA target presente nel campione analizzato.
Figura 1.4: Fasi della PCR
1.2.4 Rivelazione del DNA ampli cato Al termine di una PCR, un'aliquota della miscela di reazione viene caricata in un pozzetto di un gel di agarosio, che viene poi sottoposto ad elettroforesi (Figura 27
1.5), per determinare se l'ampli cazione desiderata sia eettivamente avvenuta. Infatti, nel gel o nel tampone di corsa è presente una sostanza che si intercala al DNA, emettendo uorescenza (tipicamente è il bromuro d'etidio, EtBr, che viene eccitato dagli UV ed emette nel visibile); dunque, i frammenti ampli cati possono essere visualizzati ad occhio nudo su gel come bande (Figura 1.6), poiché la PCR genera grandi quantità di prodotto, nell'ordine dei
µ
g. Inoltre, facendo correre in
contemporanea sullo stesso gel una miscela di frammenti di DNA di riferimento con dimensioni note, si possono valutare anche la correttezza dell'ampli cazione, in base alla dimensione in paia di basi (base pairs, bp) della banda d'interesse, e la speci cità dell'ampli cazione, in base alla presenza di una sola banda con la dimensione attesa.
Infatti, la mobilità elettroforetica di una molecola di DNA double-stranded (ds, ossia a doppio lamento) lineare è inversamente proporzionale al log10 delle dimensioni in bp.
Figura 1.5: Apparato di elettroforesi
Se durante una PCR si prelevano aliquote della miscela di reazione a vari cicli, le si sottopongono ad elettroforesi su gel e poi si eettua un'analisi densitometrica delle bande ottenute, si può avere un'idea della cinetica reale di reazione.
28
Figura 1.6: Immagine di una corsa elettroforetica
1.2.5 Applicazioni La PCR viene utilizzata in tutte quelle situazioni in cui bisogna ampli care un quantitativo di DNA no a livelli utili per analisi successive. cazione sono enormi.
I campi di appli-
La tecnica viene sfruttata, per esempio, in medicina per
la diagnostica microbiologica o per l'evidenziazione di cellule tumorali, in tumori liquidi, quando esse sono troppo poche per essere evidenziate da altre metodiche. Estremamente utile è l'uso della PCR in medicina legale. In biologia la PCR viene usata per le analisi di paleontologia e di antropologia molecolare ed in numerosi campi dell'ingegneria genetica.
Fondamentale è poi il suo utilizzo per lo studio
del genoma di organismi non coltivabili, quali numerosi batteri e protisti, e per lo studio di popolazioni in ecologia. Le diverse gradazioni di speci cità dei primer integrate alla diversa e cienza con cui essi si legano all'ampli cato a seconda della temperatura garantiscono a questa tecnica una straordinaria essibilità per studi a tutti i diversi livelli tassonomici.
29
1.3 La Real-Time PCR 1.3.1 Introduzione La PCR real-time, denominata anche PCR quantitativa o PCR quantitativa in tempo reale (rtq-PCR), è un metodo di ampli cazione e quanti cazione simultanee del DNA.
Il DNA è ampli cato da reazioni a catena della DNA-polimerasi. Dopo ogni fase di ampli cazione, il DNA è quanti cato. I metodi comuni di quanti cazione includono l'uso delle colorazioni uorescenti che intercalano con il DNA doppio- lamento(ds) e gli oligonucleotidi modi cati del DNA (denominati sonde) che sono uorescenti una volta ibridati con un DNA.
Spesso la PCR real-time è combinata con la PCR Retro Trascrizionale (RT-PCR) per quanti care i livelli di espressione di speci ci RNA: la retro-trascrizione (o trascrizione inversa) produce del DNA complementare a singolo lamento detto cDNA (complementary DNA) mantenendo inalterati i rapporti relativi di concentrazione delle diverse specie degli RNA. In questo modo è possibile, ad esempio, misurare l'espressione relativa di un gene ad un tempo particolare, o in una cellula o in un tipo particolare di tessuto. La combinazione di queste due tecniche è spesso denominata RT-PCR quantitativa.
1.3.2 Marcatura del DNA Esistono due tecniche principali di marcatura a uorescenza del DNA (Figura 1.7). La prima sfrutta dei coloranti che si intercalano alla doppia elica di DNA, come il SYBR Green, la seconda sfrutta il fenomeno del trasferimento di energia per risonanza dovuta a uorescenza (FRET) come la sonda TaqMan.
30
Figura 1.7: Molecola uorescente
SYBR Green
Il SYBR Green è un agente intercalante e si lega preferenzialmente a DNA a doppio lamento (dsDNA). Il complesso DNA-colorante assorbe luce blu ad una lunghezza d'onda
λ max
= 488 nm ed emette luce verde
λ max
= 522 nm.
Emette segnale di uorescenza solo se intercalata alla molecola di DNA. Questa caratteristica permette di ottenere un segnale di uorescenza proporzionale al numero di doppie eliche all'interno del campione biologico.
In funzione dell'in-
tensità di uorescenza è quindi possibile conoscere il numero di molecole di DNA ampli cate dalla polimerasi.
Tuttavia queste molecole si legano in modo non speci co a tutte le doppie eliche presenti in soluzione, anche ad eventuali primers inattivi e complementari che si sono tra loro appaiati o ad eventuali sequenze non speci che ampli cate. Nonostante questi limiti, la semplicità e i costi contenuti rendono tale metodica ampiamente utilizzata nei laboratori di analisi.
SYBR Green viene utilizzato sempre più spesso come alternativa al meno costoso bromuro di etidio. Infatti il bromuro è un potente mutageno mentre, u cialmente, il SYBR Green viene indicato come non pericoloso, sebbene deve essere maneggiato con cura a causa di legarsi al DNA con elevata a nità.
31
Sonde TaqMan
Si tratta di un oligonucleotide (Figura 1.8) che contiene in 5' un marcatore uorescente e in 3' un quencer (un gruppo colorante in grado di mascherare l'emissione luminosa).
Il quencer, inoltre, non è in grado di innescare la sintesi di nuovo
DNA. Quando colpita dalla luce, la molecola uorescente in 5' trasferisce energia al quencer, il quale, grazie alle sue proprietà mascheranti determina una inibizione della uorescenza del substrato.
Le sonde Taqman sono disegnate in
modo che si leghino ad una regione interna di un prodotto di PCR. Durante la PCR, la Taq polimerasi scalza la sonda, il che determina una separazione della molecola uorescente dal quencer, con una conseguente emissione di uorescenza.
Figura 1.8: Sonda Taqman
1.3.3 La Fluorescenza La uorescenza è il risultato di un processo sico composto da tre stadi successivi che avviene in certe molecole (generalmente idrocarburi policiclici o eterocicli), chiamati uorofori o uorocromi.
Una sonda uorescente non è altro che un
uoroforo espressamente progettato o per localizzarsi entro una speci ca regione di un campione biologico, o per rispondere ad uno speci co stimolo biologico, o entrambe le cose. Il processo responsabile della uorescenza dei uorofori può essere illustrato da un semplicissimo diagramma energetico chiamato diagramma di Jablonski (Figura 1.9). A causa della dissipazione di energia che avviene durante la permanenza del 32
uoroforo nello stato eccitato, l'energia del fotone emesso è minore di quella del fotone assorbito, e, di conseguenza, la lunghezza d'onda della luce di uorescenza è più grande di quella della luce di eccitazione. Uno schema estremamente semplice come il diagramma di Jablonski potrebbe, in realtà, essere valido solamente se riferito ad un singolo atomo, mentre i uorofori sono generalmente molecole poliatomiche.
Figura 1.9: Diagramma di Jablonsky sempli cato
La dierenza fra l'energia del fotone di eccitazione e quella del fotone di emissione, o, analogamente, la dierenza fra la lunghezza d'onda del picco di emissione e quella del picco di assorbimento, è una delle proprietà fondamentali che caratterizzano un uoroforo, e viene de nita Stokes shift
Un'altra importante conseguenza di quei processi che fanno perdere energia al uoroforo allo stato eccitato, è che alcuni degli elettroni che hanno assorbito un fotone ritornano direttamente allo stato fondamentale attraverso processi non radiativi, senza cioè emettere luce di uorescenza.
Fenomeni di questo tipo, come ad esempio collisioni con altre molecole, portano quindi ad uno spopolamento dello stato eccitato. Una misura del peso relativo di questi processi è dato da un altro dei parametri fondamentali della uorescenza che è il rapporto fra il numero dei fotoni di uorescenza emessi Nem ed il numero di fotoni assorbiti Nab . Questo parametro, che è evidentemente un numero sempre minore di uno, si chiama guadagno quantico.
33
Qy =
NEM NAB
I uorofori possono avere valori del guadagno quantico compresi fra 0.1 e poco meno di 1, ma per le applicazioni di carattere biologico vengono usate in pratica solamente molecole che abbiano un valore di guadagno quantico di almeno 0.4 0.5. Un altro aspetto fondamentale del processo di uorescenza consiste nella sua ciclicità.
A meno che il uoroforo non sia irreversibilmente deteriorato quando si
trova allo stato eccitato lo stesso uoroforo può essere ripetutamente eccitato, e ogni volta riemettere fotoni di uorescenza. In condizioni di forte intensità della luce di stimolazione, la distruzione irreversibile del uoroforo eccitato (photobleaching) diventa il fattore limitante per la rivelazione della uorescenza. Il rimedio più e cace contro il photobleaching è quello di massimizzare la sensibilità del sistema di rivelazione, consentendo così la riduzione della potenza della sorgente della luce di eccitazione.
E' opportuno, a questo
scopo, utilizzare come rivelatori strumenti come fotomoltiplicatori e telecamere intensi cate, servirsi di obiettivi ad alta apertura numerica e ltri di sbarramento con banda passante più larga possibile, compatibilmente con le esigenze di separazione dei segnali da rivelare.
Alternativamente, poiché la predisposizione al
photobleaching varia da uoroforo a uoroforo, la scelta deve cadere su uorofori meno fotolabili.
1.3.4 Ciclo soglia e quantità iniziale di DNA I coloranti e le sonde utilizzate per marcare le molecole di DNA appartengono alla famiglia dei uorofori, molecole che, eccitate ad una speci ca lunghezza d'onda, emettono radiazione luminosa ad una lunghezza d'onda maggiore di quella di eccitazione. Per rilevare il segnale di uorescenza, la cui intensità è proporzionale alla quantità di DNA presente nel campione, è necessario utilizzare un sistema ottico in grado 34
sia di inviare un segnale di eccitazione, la cui lunghezza d'onda è funzione del tipo di uoroforo utilizzato, sia di garantire la detection del segnale di uorescenza proveniente dai uorofori.
La sorgente di eccitazione genera un segnale ad una speci ca lunghezza d'onda funzione del tipo di uoroforo impiegato per marcare il DNA; le sorgenti sono generalmente laser, in grado di generare un segnale luminoso monocromatico, oppure lampade policromatiche: in questo caso è necessario l'utilizzo di ltri ottici per selezionare la lunghezza d'onda desiderata.
Il fascio luminoso prodotto incontra
un divisore di fascio che devia verso il campione biologico solo il fascio luminoso caratterizzato da una speci ca lunghezza d'onda, mentre viene attraversato dalle altre componenti. Il segnale di uorescenza, emesso dal uoroforo in seguito all'eccitazione, viene in ne raccolto da opportuni sensori generalmente costituiti da camere a tecnologia CCD o CMOS.
La quanti cazione accurata e riproducibile tramite real-time PCR è basata sul concetto di ciclo soglia (Threshold Cycle, CT). I valori di uorescenza vengono misurati ad ogni ciclo e rappresentano la quantità di prodotto ampli cato no a quel momento (Figura 1.10).
Più templato è presente all'inizio della reazione,
meno cicli saranno necessari a nché il segnale di uorescenza raggiunga un certo livello: il ciclo a cui ciò avviene è il CT. Il valore soglia di uorescenza viene scelto arbitrariamente: esso deve rappresentare un valore statisticamente signi cativo al di sopra del background che si ha ai primi cicli, quando il segnale è inferiore al limite di sensibilità dello strumento; dunque, il valore soglia è scelto in base alla deviazione standard media della uorescenza normalizzata nei primi cicli, che viene moltiplicata per un fattore intero aggiustabile (di solito, 2 o 3). Per una precisa quanti cazione è fondamentale che, col valore soglia scelto, tutti i campioni da analizzare abbiano un CT all'interno della fase esponenziale dell'ampli cazione.
2 viene normalizzato rispetto alla uorescenza di un altro
Il segnale del reporter
uoroforo presente in soluzione, che fa da riferimento interno passivo, cioè che non partecipa alla reazione di ampli cazione. Ciò serve per correggere le uttuazioni della uorescenza non dovute alla PCR, tra i campioni a confronto. 2 Fluoroforo
che emette il segnale di uorescenza
35
Figura 1.10: Risultato della Real-Time PCR
Nel gra co di una real-time PCR si osserva l'andamento della uorescenza del reporter in funzione del numero di cicli di ampli cazione. Di solito, la uorescenza viene riportata come
∆Rn ,
che equivale a:
− ∆Rn = R+ n − Rn
R+ nè
la uorescenza normalizzata del reporter per una reazione che contiene tutti
i componenti.
R− n
è invece il segnale normalizzato di un campione in cui non avviene un'ampli -
cazione rilevabile; questo valore può essere ottenuto dai primi cicli di una real-time PCR (quando si osserva ancora un segnale di background) oppure da una miscela di reazione che non contiene il templato (ossia un controllo negativo).
∆Rn
rappresenta la vera quantità di segnale generata da determinate condizioni di
PCR.
Si riporta dunque un valore di CT per ogni campione; questo valore viene poi trasformato nel vero dato quantitativo, relativo o assoluto (Figura 1.11).
36
Figura 1.11:
Rapporto fra numero di cicli termici CT e il logaritmo della
concentrazione iniziale
1.3.5 Applicazioni Di seguito si presentano le più importanti applicazioni della tecnologia descritta:
Determinazione del numero di copie di DNA e RNA (Sybr Green, TaqMan) .
Analisi delle Mutazioni (TaqMan, Sonde d'ibridazione) . Misura della variazione di espressione genica (Sybr Green, TaqMan). Ruolo centrale nella diagnostica e nella ricerca genetica. Analisi dell'e cacia di una particolare terapia. Musura del danneggiamento del DNA.
1.4 PCR vs Real-Time PCR La PCR e la Real-Time PCR sono due tecniche che presentano vantaggi e svantaggi. L'utilizzo di una tecnica piuttosto che l'altra dipende da tanti fattori, come quella economica, o il tempo che si impiega per avere dei risultati a dabili. 37
In Tabella 1.1 e Tabella 1.2 sono riportati i vantaggi e gli svantaggi delle due tecniche analizzate.
PCR Vantaggi
Svantaggi
Velocità e facilità d'uso, in poche ore si
Richiede l'analisi elettroforetica dei
possono ottenere millioni di copie della
prodotti di ampli cazione
sequenza di DNA Sensibilità, virtualmente è possibile
Non consente la quanti cazione del
utilizzare il DNA di una singola cellula
DNA bersaglio di partenza
come template Robustezza. Ampli cazione possibile
Tecnica complessa e richiede di
anche utilizzando DNA di bassa qualità
competenze specialistiche.
Consente di fare diagnosi certa perché
Costi elevati per la strumentazione
individua il DNA o RNA del patogeno Tempi di risposta rapidi
La presenza di DNA/RNA non implica a vitalità del microorganismo
Individuazione di diversi patogeni
Rispetto alla sierologia non consente di
contemporaneamente
rilevare un contatto progresso
Tabella 1.1: Vantaggi e svantaggi della PCR
Real Time PCR Vantaggi
Svantaggi
La metodica a sistema chiuso diminuisce
Richiede una elevata conoscenza tecnica
le possibilità di contaminazioni carry-over. Consente un notevole risparmio di
Alti costi per la strumentazione
tempo con una diagnosi molto accurata e sensibile. Le analisi di melting consentono una
Non è quantitativa a meno di non usare
rapida genotipazzione e l'identi cazione
particolari accorgimenti
di mutazioni di resistenza Riduce il tempo richiesto per il referto
Non è adatto per multiplexing
Turn-Around-Time Tabella 1.2: Vantaggi e svantaggi della Real-Time PCR
38
Capitolo 2 Sistema di Real-Time PCR basato su lab-on-chip 2.1 Introduzione Lab-on-a-chip (LOC) è un dispositivo che integra funzioni multiple che si possono svolgere in laboratorio in un singolo chip che va da pochi millimetri a qualche centimetro quadrato di grandezza ed è capace di trattare volumi di uidi estremamente piccoli, inferiore ai picolitri. I dispositivi Lab-on-a-chip sono un sottogruppo dei dispositivi MEMS (dall'inglese Micro Electro Mechanical Systems) e spesso
µ
indicati anche come Micro Total Analysis Systems ( TAS). Tuttavia, con il termine "Lab-on-a-Chip" si indica generalmente la misurazione di un singolo o un
µ
multiplo processo di laboratorio con un semplice chip, mentre " TAS" si dedica all'integrazione di tutte le sequenze di processi di laboratorio per eettuare analisi chimiche. Il punto di partenza per la maggior parte dei processi di fabbricazione dei LOC è la litogra a.
Inizialmente la maggior parte dei processi erano in silicio, dato
che queste tecnologie, ben sviluppate, erano direttamente derivate dalla fabbricazione dei semiconduttori. Data la richiesta di caratteristiche ottiche speci che, biocompatibili o chimico compatibili, minori costi di produzione e più veloce fase di prototipazione, nuovi processi sono stati sviluppati come incisione del vetro, 39
ceramica e metallo, deposition e bonding, processi PDMS (polidimetilsilossano), thick- lm e stereolitogra a allo stesso modo di metodi di replicazione veloce via electroplating, injection molding (formatura) e embossing (stampaggio).
Per di
più il campo dei LOC supera sempre più i con ni tra la tecnologia dei microsistemi basati sulla litogra a, nanotecnologia e ingegneria di precisione.
2.2 Il lab-on-chip Il dispositivo (Figura 2.1), progettato e realizzato da STMicroelectronics, consente di integrare in un unico chip in silicio le fasi di ciclatura termica, necessarie alla reazione a catena della polimerasi, e le successive operazioni di ibridazione e detezione delle catene nucleotidiche. Esso è costituito da tre parti: il chip in silicio, lo strato adesivo,la cameretta per la reazione.
Figura 2.1: Lab-on-chip
Il chip
Il chip è realizzato in silicio, materiale particolarmente adatto per la realizzazione dei cicli termici: infatti è caratterizzato da eccellenti proprietà termiche, che consentono un rapido trasferimento di calore alla miscela di reazione con cui è a contatto e un'ottima uniformità di temperatura all'interno della miscela stessa. Inoltre, il silicio rende possibile la combinazione di elementi meccanici, elettronici e uidici, miniaturizzati e integrati nello stesso supporto. 40
Poiché le tecniche di
produzione del lab-on-chip sono simili a quelle utilizzate per i circuiti integrati, è possibile utilizzare tutto il know-how e le linee di produzione preesistenti. Il chip è un substrato di silicio avente uno spessore di 675
µ
m e dimensioni 17.5
Ö
12 mm;
esso si compone di due parti: Parte inferiore: E' lo strato del chip in cui sono integrati il riscaldatore ed il sensore di temperatura (Figura 2.2), necessari rispettivamente per il riscaldamento ed il controllo della temperatura del chip durante le fasi della PCR. Il riscaldatore è una semplice resistenza metallica in alluminio, all'interno della quale viene forzato il passaggio di corrente: l'aumento di temperatura della resistenza determina la generazione, per eetto Joule, di un'elevata quantità di energia termica, che viene dissipata nel chip e nella miscela di reazione. Il sensore di temperatura (Resistance Temperature Detector, RTD) è anch'esso una resistenza che sfrutta la variazione di resistività del silicio al variare della temperatura come metodo di funzionamento.
In particolare, per i metalli esiste una relazione lineare che lega resistività e
temperatura:
ρ(T ) = ρ0 · (1 + α · (T − T0 ))
dove: T è la temperatura espressa in gradi Kelvin (K), materiale alla temperatura T , e
α
ρ0
ρ (T)
è la resistività del
è la resistività del materiale alla temperatura
un coe ciente che dipende dal materiale.
T0
Sfruttando la relazione che lega
resistenza e resistività mediante la sezione S e la lunghezza L del conduttore, si ottiene una relazione che permette di ricavare la temperatura (T ) da una semplice misura di resistenza (R).
R = ρ ·L·S
R(T ) = R0 · (1 + α · (T − T0 ))
Tuttavia, questa relazione è valida solo per stabilire la temperatura nelle immediate vicinanze del sensore, cioè all'interno del chip di silicio. Ciò implica che la 41
temperatura all'interno della miscela di reazione sia leggermente dierente rispetto alla temperatura nelle immediate vicinanze del sensore, nonostante il silicio goda di ottime proprietà termiche. Per questo motivo, è necessario tarare il dispositivo e quindi il sensore di temperatura, in modo da calcolare gli esatti coe cienti e avere così una misura accurata della temperatura reale all'interno della miscela di reazione.
Le terminazioni del riscaldatore e del sensore raggiungono dei pads sulla supercie dello strato del chip: essi sono messi in collegamento con la scheda di controllo mediante un'apposita contattiera.
Parte superiore: E' il retro del substrato di silicio sulla cui super cie viene alloggiata la miscela di reazione. Poiché il silicio può inibire la PCR, le super cie di questo strato vengono ricoperte con diossido di silicio
SiO2 ;
esso diminuisce l'inibizione
sulla PCR e aumenta l'idrolicità della super cie, favorendo il posizionamento della miscela.
Per ottenere uno strato di
SiO2 ,
si deposita sul silicio un vapore di tetra-etil-orto-
silicato (TEOS), che viene poi idrolizzato col calore a etanolo e
SiO2 .
Figura 2.2: Parte inferiore del chip - STMicroelectronics
La cameretta di reazione
Al ne di poter eettuare una reazione di Real-Time PCR è stato necessario realizzare delle camerette di reazione da posizionare sopra il chip in modo da contenere la soluzione biologica.
42
La cameretta di reazione sono realizzati in policarbonato che garantisce una buona biocompatibilità e vengono incollate sul chip in silicio mediante PDMS (silicone neutro). Esistono 3 con gurazioni: 6 (Figura 2.5), 9 (Figura 2.4) e 12 (Figura 2.3) pozzetti che possono contenere da 2 a 15 µl di mixdi reazione a seconda del protocollo chimico da eseguire.
Figura 2.3: Cameretta da 12 pozzetti
Figura 2.4: Cameretta da 9 pozzetti
Figura 2.5: Cameretta da 6 pozzetti
43
Lo strato adesivo
La cameretta di reazione viene fatta aderire alla super cie superiore del chip mediante un'apposito strato adesivo.
Attualmente viene utilizzato come collante il
PDMS (poli-dimetil-sillosano), comunemente noto come silicone, per le sue buone caratteristiche di biocompatibilità con la reazione di real-time PCR, per la sua resistenza alle alte temperature e per la sua idrofobicità. L'unico svantaggio nell'utilizzo del silicone è che il processo di incollaggio è poco meccanizzabile ed automatizzabile; attualmente il PDMS viene depositato sulla super cie del chip manualmente. Ciò in uisce sia sui tempi di realizzazione del singolo chip, che si allungano, sia sulle prestazioni nali dello stato adesivo, che viene deposto in modo poco ripetibile.
2.3 La scheda di controllo La real-time PCR richiede che, all'interno della camera di reazione, si realizzino cicli termici caratterizzati da precisi valori di durata temporale e di temperatura, e che l'accensione della sorgente di eccitazione avvenga in un istante preciso alla ne della fase di estensione di estensione.
Per questo motivo, si è progettato e
realizzato una scheda di controllo, che costituisce il cuore del sistema e che possiede dimensioni molto ridotte (5
Ö
4 cm) (Figura 2.6).
Figura 2.6: La scheda di controllo
44
In essa è presente un microcontrollore STM32F103, che controlla le fasi di riscaldamento e rareddamento, il campionamento dei sensori di temperatura e l'accensione e lo spegnimento della sorgente di eccitazione (LED). Il microcontrollore realizza ciò mediante tre segnali a modulazione di larghezza d'impulso (Pulse-Width Modulation, PWM). Il PWM è un segnale ad onda quadra che può assumere unicamente due livelli logici:
nel caso del microcontrollore STM32F103, esso può
assumere un valore pari a 0 V per il livello logico basso e pari a 3.3 V per quello alto. Il grande vantaggio del segnale PWM è dato dalla possibilità di poter modulare i tempi in cui il segnale assume valori logici alti e bassi.
Impostando opportuni
valori a particolari registri del microcontrollore, il segnale viene diviso in intervalli temporali di durata ben precisa; all'interno di ogni intervallo è possibile impostare il duty-cycle del segnale, cioè la frazione del periodo dell'onda quadra durante la quale il segnale resta ad un valore logico alto. Complessivamente l'intero sistema è composto da 5 blocchi:
circuito di riscaldamento:
Il circuito di riscaldamento serve per aumentare la temperatura all'interno della camera di reazione; è caratterizzato da due elementi:
Il riscaldatore, situato all'interno del chip, che ha il compito di trasformare la potenza elettrica fornita in potenza termica;
il circuito di pilotaggio della corrente: esso comprende un MOSFET (MetalOxide-Semiconductor Field-Efect Transistor), utilizzato come interruttore di corrente, e un segnale PWM in uscita dal microcontrollore, che pilota l'apertura o la chiusura del canale del MOSFET.
La funzione del MOSFET nel circuito di riscaldamento è quella di comportarsi come un interruttore di corrente: in funzione della tensione applicata al gate del MOSFET, direttamente correlata al segnale digitale PWM in uscita dal microcontrollore, è possibile determinare l'apertura o la chiusura del canale del MOSFET e, di conseguenza, permettere o impedire il passaggio di corrente attraverso il 45
riscaldatore. La tensione da applicare al gate del MOSFET per determinare l'apertura del suo canale deve essere uguale o maggiore della tensione di soglia.
In
risposta ad un valore logico alto del segnale PWM in uscita dal microcontrollore, si applica al gate del MOSFET la tensione su ciente per ottenere l'apertura del canale; al contrario, in risposta a valori di PWM corrispondenti ad un livello logico basso, il canale rimane chiuso.
circuito di rareddamento
Per velocizzare la fase di diminuzione della temperatura, è stato implementato un circuito di rareddamento della camera di reazione, caratterizzato dalla presenza di una piccola ventola assiale. Il sistema di attivazione della ventola è del tutto simile a quello realizzato per modulare la corrente attraverso i riscaldatori, nel circuito di riscaldamento: si utilizza dunque un secondo segnale PWM in uscita dal microcontrollore ed un secondo MOSFET.
circuito di controllo della temperatura
La necessità di garantire un buon monitoraggio della temperatura raggiunta durante le varie fasi di una PCR richiede la presenza nel lab-on-chip di un sensore di temperatura e di un convertitore analogico-digitale (Analog to Digital Converter, ADC) adibito al suo campionamento. Dal segnale digitale in uscita dal microcontrollore, è possibile risalire al valore analogico di tensione presente ai capi del sensore di temperatura e che entra nell'ADC.
circuito di pilotaggio del LED;
Il circuito di controllo del LED gestisce l'accensione del LED quando la reazione della polimerasi si trova alla ne della fase di estensione, circa 3 secondi prima del termine della stessa. Il sistema di attivazione del LED è molto simile a quello utilizzato per modulare la corrente nei riscaldatori attraverso il circuito di riscaldamento. Questo signi ca perciò utilizzare un terzo segnale PWM in uscita dal microcontrollore e un terzo MOSFET. 46
sistema di comunicazione verso personal computer.
La necessità di comunicazione tra utente e microcontrollore ha richiesto l'implementazione di un protocollo di comunicazione, per l'invio e la ricezione di dati e comandi. L'elasticità che contraddistingue tale protocollo consente di poter inviare al microcontrollore sia comandi relativi all'inizializzazione delle periferiche utilizzate, come ad esempio l'ADC, sia i parametri riguardanti alcune funzionalità del microcontrollore, come ad esempio il duty-cycle del segnale PWM. Tramite un software intuitivo, una Graphical User Interface (GUI) sviluppata in linguaggio C, l'utente può facilmente impostare la durata e le temperature dei cicli termici di PCR, salvare e richiamare dei protocolli termici e osservare in tempo reale i dati in uscita dal sistema, come la temperatura. Il protocollo di comunicazione implementato si appoggia sull'interfaccia USB utilizzando la Virtual-Com per comunicare, in modo da garantire un'ottima velocità di trasferimento dei dati e la compatibilità con tutti i personal computer attualmente in commercio.
2.4 La componente meccanica La interfaccia tra la scheda di controllo e le terminazioni del sensore e del riscaldatore, presenti sul chip, viene realizzata tramite una contattiera (Figura 2.7).
Il
sistema prevede che il chip monouso venga inserito nella posizione corretta e venga mantenuto in prossimità della contattiera mediante una slitta (Figura 2.8).
Figura 2.7: La contattiera
47
L'interfaccia tra la scheda di controllo e le terminazioni del sensore e del riscaldatore, presenti sul chip, viene realizzata mediante un'apposita contattiera.
Il sis-
tema prevede che il chip monouso venga inserito nella posizione corretta e venga mantenuto in prossimità della contattiera mediante una slitta.
Figura 2.8: La slitta
2.5 La componente biologica In una tecnica di real-tme PCR, per poter accoppiare la sintesi di DNA con l'aumento di un segnale di uorescenza si possono utilizzare diversi metodi come accenato nel capitolo 1. Nel sistema progettato da si utilizza come chimica di rivelazione la sonda TaqMan marcata con un uoroforo.
Attualmente, il sistema di real-time permette l'identi cazione di una singola sequenza nucleica, ma si prevede di includere nella miscela di reazione due sonde TaqMan, legate a due dierenti uorofori, per realizzare una tecnica di real-time quantitativa multipla. Lo strumento quindi possiederà due sorgenti di eccitazione, ed il lettore ottico dovrà essere in grado di distinguere i contributi di uorescenza provenienti dai rispettivi uorofori.
48
2.6 Il sistema di illuminazione Il sistema di real-time PCR a singola lunghezza d'onda, realizzato da STMicroelectronics, permette di illuminare la miscela di reazione mediante una precisa con gurazione di illuminazione. Essa comprende:
un LED (Light Emitting Diode) ad alta luminosità; un ltro ottico di eccitazione; un ltro ottico di emissione.
In particolare, il LED (Figura 2.9) è la sorgente di eccitazione che ha il compito di suscitare la uorescenza delle molecole di uoroforo presenti nel campione e, per realizzare ciò, deve essere tale che il suo spettro si sovrapponga almeno parzialmente allo spettro di eccitazione della molecola uorescente. Se così non fosse, l'eetto del LED sull'eccitazione della sonda sarebbe nullo e non si rivelerebbe alcun segnale di uorescenza dal campione.
Figura 2.9: Simbolo circuitale del LED
Dato che non è necessario che tutto lo spettro di eccitazione del uoroforo venga coperto dallo spettro del LED, per limitare le possibili interferenze tra l'eccitazione e l'emissione, a valle della sorgente è posto un ltro ottico. Esso è di tipo passa-banda ed ha il compito di tagliare le componenti spettrali del LED che si sovrappongono allo spettro di emissione del uoroforo; di fatto, scegliere questo ltro signi ca decidere a quali lunghezze d'onda il uoroforo verrà eccitato. Una volta che lo spettro del LED è stato ltrato, la luce entra nella cameretta di reazione. Lì, dopo aver sorpassato le sottili pareti in PC della cameretta, raggiunge 49
la soluzione e ne causa l'eccitazione. In ne, il ltro ottico di emissione ha il compito di selezionare la radiazione uorescente di interesse che deve essere rivelata dal sensore.
Attualmente lo strumento sviluppato permette di eseguire real-time PCR volte ad identi care una sola sequenza nucleotidica di interesse e, per fare ciò, nella miscela è inserita la sonda di idrolisi TaqMan legata covalentemente o al uorocromo 5(6)-Carbossi- uoresceina o al 5(6)-Carbossi-X- rodamina.
A seconda del uoroforo che viene utilizzato nel processo di marcatura, ne abbiamo bisogno d'una sorgente di luce diversa che riesca ad eccitare il uoroforo alla larghezza d'onda corrispondente. In totale si hanno fatto le prove con tre tipi di uorofori:
Il uoroforo 5(6)-FAM viene eccitato con un LED (LXK2-PB12-K00) ad alta luminosità prodotto da Lumileds Lighting caratterizzato da:
Lunghezza d'onda di picco: 470 nm;
Angolo di emissione: 140
V di funzionamento : 3.6 V;
I di funzionamento: 700 mA;
Flusso luminoso: 9.5 lumen
°
;
Il uoroforo 5(6)-ROX viene eccitato con un LED (L-7701C4SYC-H) ad alta luminosità prodotto da Kingbright caratterizzato da:
Lunghezza d'onda di picco: 590 nm;
Angolo di emissione: 50
V di funzionamento : 2.9 V;
I di funzionamento: 150 mA;
Intensità luminosa: 3700 mcd.
°
;
Il uoroforo NED viene eccitato con un LED (DS45) prodotto Lumileds caratterizzato da: 50
Lunghezza d'onda di picco: 530 nm;
Angolo di emissione: 140
V di funzionamento : 3.7 V;
I di funzionamento: 700 mA;
Flusso luminoso: 64 lumen
°
;
2.7 I ltri ottici Molti strumenti per la rivelazione della uorescenza comprendono ltri ottici per il controllo dello spettro di eccitazione e di emissione della luce; essi infatti permettono alla sola radiazione che cade nella banda di assorbimento del uoroforo di raggiungere il campione biologico e alla sola radiazione uorescente emessa di raggiungere il sensore di luce.
L'assenza dei ltri determinerebbe l'impossibilità del rivelatore di distinguere la uorescenza desiderata da altre sorgenti di luce, come la diusione della radiazione di eccitazione, l'auto uorescenza del campione, e la luce ambientale.
Un ruolo
chiave nelle applicazioni biologiche e biomediche è svolto dai ltri ottici dicroici (o thin-lm, o a interferenza) multistrato.
Principio di funzionamento
I ltri dicroici sono formati da strati multipli alternati di materiali ad alto e basso indice di rifrazione, dello spessore pari ad un quarto della lunghezza d'onda del picco di trasmissione, depositati su un substrato di vetro; l'insieme di questi strati è chiamato stack.
La loro modalità di funzionamento si basa sulla proprietà di
interferenza distruttiva della luce ri essa o trasmessa alle interfacce tra i vari strati.
In un ltro passa-banda (Figura 2.10) la combinazione di due stacks e uno spacer (sottile strato di un materiale dielettrico dello spessore pari a metà della lunghezza d'onda desiderata per il picco di trasmissione), dà origine ad una singola cavità e il numero di strati presenti in uno stack determina la larghezza della banda passante del ltro stesso.
51
Figura 2.10: Filtro passa banda ad una singola cavità
Generalmente, un ltro passa-banda a singola cavità non esibisce una ripida transizione tra le lunghezze d'onda interne ed esterne alla banda passante, perciò, nella pratica comune si sovrappongono più cavità su un unico substrato, tipicamente di vetro. Un ltro così costruito riduce notevolmente la trasmissione del ltro nelle lunghezze d'onda non di interesse.
Con un numero elevato di cavità, il pro lo
trasmissivo del ltro tende a diventare molto simile a quello di un ltro ideale (rettangolare) con il quale è garantita una transizione marcata tra la trasmissione in banda e fuori banda. In commercio esistono varie tipologie di ltri ad interferenza: passa-alto, passabasso, passa-banda e beamsplitter dicroici. In base alle loro caratteristiche, sono utilizzati con grande successo in applicazioni biologiche e biomediche. Vantaggi I ltri interferenziali sono utilizzati con successo per selezionare la banda passante in eccitazione e in emissione in dispositivi per la rivelazione della uorescenza. Il principale motivo del loro successo è da ricercarsi nelle ottime caratteristiche trasmissive che riescono a garantire in banda, fuori banda e nella transizione tra le due. La loro durevolezza nel tempo, adattabilità e facilità di pulizia, grazie ai loro rivestimenti resistenti, li rende adatti sia per applicazioni diagnostiche ad alti volumi sia nei laboratori di ricerca. I ltri ottici nel sistema di real-time PCR Nel sistema di real-time PCR in fase di prototipazione presso STMicroelectronics, vengono utilizzati due ltri ad interferenza. Il primo è un ltro di eccitazione di 52
tipo passa-banda con il compito di trasmettere al campione le lunghezze d'onda assorbite dal uoroforo, mentre il secondo è un ltro di emissione sempre di tipo passa-banda che permette il passaggio solo della radiazione uorescente emessa dalla miscela di reazione durante i cicli di PCR. Dato che il sistema può utilizzare come marcatore di DNA i due uorocromi 5(6)-Carbossi- uoresceina e 5(6)-Carbossi-X-rodamina, ogni uoroforo possiede il proprio set di ltri.
Precisamente, per il uoroforo 5(6)-FAM il ltro di eccitazione scelto è il modello FF01-479/40 prodotto da Semrock, centrato a 479 nm e con banda passante pari a 40 nm, mentre il ltro di emissione, modello FF01-523/20, permette il passaggio di lunghezze d'onda comprese in un intervallo di 20 nm intorno a 523 nm.
Per il uoroforo 5(6)-ROX, il ltro di eccitazione scelto è il modello FF01- 580/23 prodotto da Semrock, centrato a 580 nm e con banda passante pari a 23 nm, mentre il ltro di emissione, modello FF01-615/24, permette il passaggio di lunghezze d'onda comprese in un intervallo di 24 nm intorno a 615 nm.
Per il uoroforo NED, il ltro è il modello FF01-543/22-25 prodotto da Semrock, centrato a 543 nm e con banda passante pari a 22 nm, mentre il ltro di emissione, modello FF01-593/40-25, permette il passaggio di lunghezze d'onda in un intervallo di 40nm intono a 593 nm.
2.8 Il sensore ottico Gli strumenti di Real-Time PCR possiedono all'interno un sistema di rilevazione della luce composto da un sensore ottico di tecnologia CCD o CMOS. Queste tecnologie hanno caratteristiche diverse e in accordo alla nalità dell'uso si basa la scelta di utilizzare CCD piuttosto che CMOS.
Lo strumento per Real-Time PCR di STMicroelectronics utilizza il sensore CMOS VS6724 che si trova al interno del modulo di visione riportato in gura 2.11.
53
Figura 2.11: Modulo di visione per la Real-Time PCR
54
Capitolo 3 Tecnologia dei sensori ottici 3.1 Introduzione ai sensori ottici In un sistema di real-time PCR, la rivelazione della uorescenza avviene tipicamente mediante sensori di immagine quali CCD e CMOS. Entrambi sono basati su una matrice di fotosensori ma si diferenziano per la tecnologia costruttiva e, di conseguenza, per il funzionamento.
All'interno di questi dispositivi si trovano milioni di diodi fotosensibili, ciascuno dei quali registra la luminosità della luce incidente su di essi accumulando carica elettrica: maggiore è la luce incidente, maggiore sarà la carica accumulata.
Ad
oggi l'utilizzo dei sensori di immagine spazia in ambiti molto diversi come quello biologico, biomedico, robotico, multimediale e telemedico.
3.1.1 Sensore CCD 3.1.1.1
Concetti di basi sui CCD
Il CCD (acronimo dell'inglese Charge-Coupled Device) consiste in un circuito integrato formato da una riga, o da una griglia, di elementi semiconduttori in grado
55
di accumulare una carica elettrica proporzionale all'intensità della radiazione elettromagnetica che li colpisce. Questi elementi sono accoppiati in modo che ognuno di essi, sollecitato da un impulso elettrico, possa trasferire la propria carica ad un altro elemento adiacente.
Inviando al dispositivo una sequenza temporizzata d'impulsi, si ottiene in uscita un segnale elettrico grazie al quale è possibile ricostruire la matrice dei pixel che compongono l'immagine proiettata sulla super cie del CCD stesso.
Questa informazione può essere utilizzata direttamente nella sua forma analogica, per riprodurre l'immagine su di un monitor o per registrarla su supporti magnetici, oppure può essere convertita in formato digitale per l'immagazzinamento in le che ne garantiscano il riutilizzo futuro.
Figura 3.1: Sensore CCD
3.1.1.2
Tipologia dei CCD
I CCD maggiormente utilizzati sono gli Array CCD, caratterizzati da una schiera ordinata di fotoelementi generalmente disposti per righe e colonne a formare una matrice di m x n pixel, organizzata in maniera diversa in funzione dello schema di trasferimento di carica adottato: Interline Transfer, Frame Transfer o Full Frame Transfer.
56
Figura 3.2: Schema logico di un sensore CCD
Interline Transfer
I moderni CCD Interline Transfer (Figura 3.3) sono caratterizzati dalla particolare disposizione verticale dei registri di shift delle cariche elettriche accumulatesi durante il processo di integrazione.
Ad ogni colonna di elementi fotosensibili è
associata una colonna adiacente di elementi (registri) che godono in generale delle stesse proprietà.
Alla ne del processo di integrazione, le cariche accumulatesi
negli elementi fotosensibili sono istantaneamente trasferite nei registri verticali per poi essere trasferite, riga per riga, nel registro orizzontale di lettura del segnale di uscita del CCD. Lo shift delle cariche dai pixel ai registri verticali di lettura dura poco più di un milionesimo di secondo.
57
Figura 3.3: Interline Transfer
Le camere dotate di CCD Interline Transfer non hanno pertanto bisogno di disporre, come vedremo più avanti, di otturatori elettromeccanici, in quanto di per se dotate di e cientissimi e velocissimi otturatori elettronici. Molti anni fa criticati perché aetti da fenomeni di aliasing dell'immagine nale e da un'eccessiva riduzione della super cie sensibile, i moderni CCD Interline Transfer hanno ridotto ad un minimo trascurabile questi difetti, pur mantenendo i pregi di una migliore e cienza
1
quantica e di un e cientissimo schema di anti-blooming .
Frame Transfer
I CCD Frame Transfer (Figura 3.4) presentano due aree strutturalmente identiche sulla super cie del sensore. Una, sensibile alla luce, è la zona dove si accumulano le cariche durante la posa; l'altra, schermata con una lamina metallica, è la memoria dove al termine del processo di integrazione sarà parcheggiata l'immagine dopo un trasferimento dall'area sensibile.
Per questa ragione, anche se l'area attiva
del sensore, al termine della posa, continua a rimanere esposta al usso dei fotoni, l'immagine salvata nella memoria schermata adiacente sarà letta e trasferita intatta 1 Sistema
pixel attorno
incaricato di contenere la sovracarica di un pixel all'interno di sè senza caricare i 58
Figura 3.4: Frame Transfer
al processore.
Le camere dotate di CCD Frame Transfer non hanno pertanto
bisogno di essere equipaggiate con otturatori elettromeccanici.
Full Frame Transfer
I CCD Full Frame Transfer (Figura 3.5) hanno solamente l'area attiva. La lettura dell'immagine, al termine dell'esposizione, avviene mediante trasferimento progressivo verticale del contenuto delle righe della matrice del sensore dalla prima riga all'ultima, dalla quale il segnale è prelevato e campionato numericamente. Questo processo dura in genere alcuni secondi. Se l'area del sensore, nel frattempo, non è protetta dal usso incidente dei fotoni, l'immagine nale sarà aetta da smearing, ossia da un alone provocato dal continuo assorbimento di energia luminosa. Tale inconveniente, presente in alcune camere CCD può essere eliminato equipaggiando queste camere CCD con otturatori elettromeccanici in grado di schermare opportunamente l'area attiva del sensore durante il processo di lettura e campionamento dell'immagine.
59
Figura 3.5: Full Frame Transfer
3.1.1.3
Performance di un CCD
La performance è tra i fattori più importanti di valutazione di una camera CCD. Essa è data da un insieme di elementi di natura diversa che caratterizzano il modo di funzionamento del CCD. Comprendere la natura di questi elementi è essenziale, allo scopo di valutare la camera CCD alla luce dell'uso che s'intende farne. Esamineremo nel seguito gli elementi più importanti.
E cienza Quantica e Sensibilità Spettrale
Non tutti i fotoni incidenti sulla super cie di un pixel del CCD producono fotoelettroni. Il rapporto tra i fotoelettroni prodotti e i fotoni incidenti, mediamente, per secondo e per singolo pixel, è un numero inferiore all'unità ed esprime l'e cienza quantica del CCD. E' solitamente espresso in percentuale ed indica la sensibilità teorica di un CCD. Sensori a bassa qualità hanno una grande dierenza tra la sensibilità teorica e quella reale. La sensibilità tipica di una camera CCD non professionale varia tra lo 1% e il 60%, in base alla lunghezza d'onda dei fotoni incidenti.
Misurando l'e cienza
quantica per ogni valore di lunghezza d'onda in cui dividiamo lo spettro della luce 60
incidente, possiamo costruire la curva di sensibilità spettrale di ogni sensore. Un buon CCD deve possedere una curva spettrale abbastanza e ciente per lunghezze d'onda comprese tra i 400 e i 700 nm (spettro visibile), con valori limite di e cienza quantica non inferiori al 50% del valore di picco. I CCD che hanno curve spettrali con picco a 530-550 nm danno generalmente ottimi risultati. Altro fattore importante è l'uniformità dell'e cienza quantica su tutta la super cie del sensore. Variazioni di sensibilità tra pixel e pixel, a parità di lunghezza d'onda, sono causa di rumore e riducono la qualità delle immagini.
Capacità elettronica per pixel (Full Well Capacity)
La capacità di accumulo delle cariche di un pixel non è illimitata. Il valore massimo di fotoelettroni che un CCD può accumulare in un singolo pixel è una caratteristica propria di ogni sensore. La Full Well Capacity di un CCD è un fattore di grande importanza nella valutazione di una camera CCD; grandi valori di capacità elettronica di un pixel esprimono un maggior range dinamico del sensore a parità di rumore complessivo presente nel segnale. Maggiore è la capacità elettronica per pixel di un CCD, minore è l'impatto del rumore fotonico. I vantaggi di una maggiore capacità elettronica sono ancor più evidenti ove si pensi che occorrerà un maggior tempo di integrazione per saturare i pixel esposti alla luce di maggior intensità incidente. Una volta raggiunta la saturazione, i fotoelettroni in eccesso si spargeranno sui pixel adiacenti (preferibilmente lungo le colonne) dando luogo al noto fenomeno del blooming. Molti CCD sono oggi dotati di anti-blooming, un dispositivo in grado di eettuare il drenaggio automatico delle cariche in eccesso, impedendo a quest'ultime di raggiungere i pixel adiacenti.
Linearità del CCD
Il CCD è un rivelatore caratterizzato da una ottima linearità. In pratica ciò signi ca che il numero di elettroni generati in un pixel è direttamente proporzionale alla quantità di luce incidente. Questo comporta diversi vantaggi: 61
- La soglia minima di rivelazione è data dal rumore medio complessivo presente nell'immagine. Se il rumore è molto basso il CCD sarà in grado di rivelare dettagli estremamente deboli.
2 e quindi manterrà la stessa sensibilità
- Il CCD non sore dell'eetto Schwarzschild
ed e cienza quantica indipendentemente dalla durata dell'esposizione. - È possibile eettuare misure dirette di luminosità degli oggetti (fotometria di precisione).
Corrente nera (Dark Current)
Tutti i sensori CCD hanno la proprietà di produrre e accumulare spontaneamente elettroni, anche quando la loro super cie è schermata dalla luce incidente. A riposo il sensore continua a produrre elettroni no a saturare completamente i livelli di capacità dei pixel. E' pertanto logico azzerare le cariche prodotte spontaneamente dal sensore prima di iniziare una nuova esposizione. Ma la produzione spontanea di elettroni continua anche durante l'esposizione.
Ciò signi ca che nei pixel si
accumuleranno sia fotoelettroni prodotti dalla luce incidente sia elettroni prodottisi spontaneamente.
E' impossibile distinguere gli uni dagli altri.
Fortunatamente,
però, gli elettroni prodotti spontaneamente hanno caratteristiche tali da permettere di eliminare quasi interamente il loro eetto negativo. Il fenomeno della Dark Current è perfettamente riproducibile.
In identiche con-
dizioni di temperatura e di durata di una esposizione, un dato sensore genera sempre lo stesso numero di elettroni a meno di un fattore di dispersione statistica (Rumore Termico), variabile a seconda del tipo di sensore impiegato. La Dark Current prodotta dipende infatti fortemente dalla temperatura del sensore:
°
la sua intensità diminuisce in genere di un fattore 2 per ogni 6 C in meno di temperatura del sensore. Per questa ragione essa viene anche chiamata Corrente Termica (Thermal Current) e le cariche prodotte si chiamano Cariche Termiche (Thermal Charges). 2 Nelle
macchine fotogra che, si de nisce rapporto di reciprocità alla relazione tra diaframma (apertura incorporata nell'obiettivo), tempo di esposizione e velocità della pelicolla. La relazione è sempre lineare tranne nelle situazioni in cui si applicano tempi di esposizioni molto lunghi o molto brevi. 62
3.1.2 Sensore CMOS 3.1.2.1
Concetti di Base dei sensori a tecnologia CMOS
Il CMOS, acronimo di complementary metal-oxide semiconductor, è un tipo di tecnologia utilizzata in elettronica per la progettazione di circuiti integrati, alla cui base sta l'uso dell'invertitore a transistor MOSFET. Si tratta di una struttura circuitale costituita dalla serie di una rete di "Pull-Up" ed una di "Pull-Down": la prima s'incarica di replicare correttamente il livello logico alto (LL1) mentre alla seconda è destinata la gestione del livello logico basso (LL0). La rete di Pull-Up è costituita di soli P-MOS, ovvero transistor metallo-ossidosemiconduttore (MOSFET) a eetto di campo che si "accendono" solo se la tensione presente al loro gate (misurata rispetto il loro source) è minore della loro tensione di soglia, che per questi particolari componenti equivale a metà tensione di alimentazione. Inversamente la rete di Pull-Down è costituita di soli N-MOS, ovvero MOSFET che si accendono solo se la tensione presente al loro gate (misurata rispetto il loro source) è maggiore della loro tensione di soglia.
In Figura 3.6 si riporta la rete
Pull-up e Pull-down
Figura 3.6: Rete Pull-up, rete Pull-down
Uno dei principali vantaggi della logica CMOS è di avere una potenza statica dissipata idealmente nulla: questa caratteristica è dovuta alla complementarietà 63
del pull-down (n-Mos) e del pull-up (p-Mos); ossia, quando è acceso il pull-up, è spento il pull-down, e viceversa.
3.1.2.2
Il sensore CMOS per immagini
Una volta risolto i problemi iniziali legati sopratutto alla mancanza di uniformità del silicio di cui sono costituiti, la tecnologia CMOS ha trovato largo impiego in fotocamere e videocamere.
Nella maggior parte dei sensori cmos all'interno del chip stesso viene integrata una logica di elaborazione. Questa si occupa di ogni operazione di elaborazione dell'immagine, comprendendo la conversione di fotoni a elettroni, la conversione di elettroni a livelli di tensione e la conversione da analogico a digitale. I dati inviati dal sensore CMOS raggiungono quindi direttamente il sistema di elaborazione e/o memorizzazione dell'immagine.
Grazie ai recenti sviluppi, i sensori CMOS sono ora in grado di orire immagini di qualità equivalente a quella dei sensori CCD, ma sono comunque inadatti alle telecamere che devono generare immagini di altissima qualità.
I sensori CMOS
riducono signi cativamente il costo della telecamera poiché contengono tutti i componenti logici necessari per le telecamere.
Possono, inoltre, essere utilizzati
per telecamere di piccole dimensioni.
Uno dei limiti più signi cativi dei sensori CMOS deriva dalla loro minore sensibilità alla luce, che non rappresenta un problema in condizioni di normale illuminazione ma può diventarlo se la luce è scarsa. Le immagini generate da questi sensori in condizioni di scarsa illuminazione possono essere infatti molto scure o disturbate da rumore.
3.1.2.3
Architettura di base
In Figura 3.7 viene mostrata la con gurazione di base di un sensore CMOS.
Come si può osservare possiamo suddividere tale architettura in 3 parti:
64
Figura 3.7: Con gurazione di base del sensore CMOS
Controller: Unità di controllo che gestisce le temporizzazioni del sensore e continene le aree di memoria per il salvataggio dei dati dell'immagine.
Area attiva: È la zona sensibile del sensore in cui sono presenti le matrici di pixel.
Unità di elaborazione: A seconda del tipo d'uscita richiesta al sensore (digitale o analogica).
Questa unità provvede all'eventiale campionamento e
digitalizzazione dei dati.
3.1.2.4
Riconoscimento colorimetrico
I sensori CCD e CMOS non sono in grado di eettuare un riconoscimento dei colori in quanto sono sensibili alle sole variazioni di luminosità (ossia all'energia dei fotoni che impattano sui sensori).
Pertanto, si sono sviluppate diverse soluzioni
per ottenere un'immagine a colori a partire da un sensore di luce che, tipicamente, prevedono il posizionamento di uno speci co componente per la selezione delle lunghezze d'onda, a monte della fase di cattura del fotone.
Questi componenti
possono essere:
Beam splitter. E' composto da tre prismi che suddividono il fascio di luce in tre parti uguali in base alle loro caratteristiche colorimetriche (blu, verde e rosso); i tre fasci sono poi direzionati verso i tre sensori di immagine e, complessivamente, ognuno dei tre colori viene assegnato ad ogni pixel (Figura
65
3.8). Questa soluzione è la più costosa e tipicamente è usata nelle macchine digitali professionali in cui è richiesta un'ottima qualità di immagine.
Figura 3.8: Beam splitter
Filtri a rotazione.
E' un metodo più economico e per questo maggior-
mente utilizzato; consiste in un unico supporto,contenente una serie di ltri RGB (Red, Green, Blue), che viene ruotato di fronte ad un singolo sensore. Quest'ultimo memorizza così le tre immagini in rapida successione ed assegna, anche in questo caso, i tre colori per ciascun pixel. Un grande svantaggio di questa soluzione è la non contemporanea cattura delle immagini; ciò obbliga a mantenere il sensore stazionario per il tempo necessario alla completa acquisizione (Figura 3.9).
Figura 3.9: Filtri a rotazione
Filtro di Bayer.
E' il metodo più rapido ed economico per acquisire l'im-
magine a colori e consiste nel posizionare permanentemente sul sensore un 66
array di ltri (Figura 3.10): si alterna una riga di ltri rossi e verdi con una di verdi e blu. Così facendo i pixel non sono equalmente divisi tra i ltri ma si ha una maggiore presenza di verde; ciò è motivato dal fatto che l'occhio umano è più sensibile al verde rispetto agli altri due colori fondamentali. Inoltre, ogni pixel cattura solo uno dei tre colori e, complessivamente, viene immagazzinata il 50% della luce verde e solo il 25% della luce rossa e blu. Pertanto, all'acquisizione dell'immagine segue una complessa elaborazione basata sul metodo dell'interpolazione. In questa soluzione, sopra al ltro di Bayer è posizionato un array di microlenti per focalizzare la luce incidente sui singoli pixel
Figura 3.10: Filtro Bayern
Tecnologia Foveon. E' il metodo più recente e rivoluzionario per la cattura di un'immagine a colori. Si basa sulla presenza di tre strati separati di pixel ricavati nel silicio: dato che questo materiale assorbe diferenti lunghezze d'onda a diverse profondità, ogni strato cattura un singolo colore. Conseguentemente, il sensore rileva tutti e tre i colori ad ogni posizione
3.1.3 Parametri Caratteristici di sensori d'immagini I parametri principali di un sensore di immagini sono:
Rapporto segnale rumore (Signal to Noise Ratio, SNR): si riferisce alla grandezza relativa del segnale confrontato con l'incertezza che si ha sul
67
segnale stesso, considerando l'informazione pixel per pixel. In particolare, è il rapporto tra il segnale misurato ed il rumore complessivamente misurato (immagine per immagine) su quel pixel.
Rumore elettronico (read-out noise): è dovuto alle componenti elettroniche necessarie per il funzionamento del sensore ed è il responsabile principale nell'errore di misura del segnale. Generalmente il CMOS produce un rumore elettronico più elevato rispetto al CCD.
Risoluzione spaziale: è data dal numero sico di elementi fotosensibili presenti nel dispositivo di acquisizione dell'immagine.
Fill factor. E' la percentuale di area del pixel sensibile alla luce. La tecnologia CCD è decisamente superiore in quanto tutta la supercie del pixel è area attiva per la cattura dei fotoni; il suo Fill factor è quindi pari al 100%. La tecnologia CMOS, invece, ha valori decisamente più ridotti, intorno al 20-30%.
Dinamica (dynamic range, DR): E' l'intervallo di illuminazione che può essere rivelato dal sensore. Valori tipici di DR per il CMOS sono intorno ai 40-60 dB, mentre per l'occhio umano superano i 90 dB e per il CCD si aggirano intorno ai 78 dB.
Saturazione (pixel blooming). Si verica quando il numero di fotoni incidenti in un pixel supera la massima quantità di carica accettabile e, conseguentemente, si riversa sui pixel vicini.
Linearità.
Si riferisce alla trans-caratteristica tra il segnale fotonico in in-
gresso e il segnale digitalizzato in uscita; quest'ultimo dovrebbe variare linearmente con la quantità di luce incidente sul sensore.
Quando un sensore di immagini viene integrato in una camera digitale, vengono de niti altri due parametri caratteristici; essi sono:
Guadagno (Gain, G). Se si indica con ADU (Analog to Digital Unit) l'unità di misura dell'intensità luminosa di un pixel dell'immagine CCD, il guadagno
68
è un numero che esprime a quanti elettroni corrispondono ogni ADU nell'immagine generata dalla stessa camera.
In pratica è il valore numerico
associato ai pixel di un'immagine digitale e viene impostato dal costruttore della camera CCD in base alla scelta del convertitore analogico-digitale e tipicamente viene espresso in dB.
Tempo di esposizione (Exposure Time, ET ). E' il tempo in cui il sensore di immagini viene esposto alla radiazione luminosa: maggiore è il tempo di esposione, più fotoni incidono sul pixel e prima si giunge ad una condizione di saturazione.
3.2 Sensore ST - VS6724 3.2.1 Descrizione del sensore: Il sensore VS6724 è un sensore ottico fabbricato con tecnologia CMOS che viene utilizzato nei sistemi di telefonia mobile, sistemi medicali e sitemi di controllo di luce.
Le caratteristiche più importanti sono:
Tensione di alimentazione tra 2.4V e 3.0V Risoluzione dell'immagine di un massimo di 2 megapixel. Processamento d'immagini no a 30fps (frame al secondo). Coprocessore per la gestione del sensore. Interfaccia di comunicazione seriale
I 2C che permette il controllo del sensore.
Interfaccia parallela a 8 bit per trasferimento di dati.
Il sensore VS6724 include una vasta gamma di funzioni di ottimizzazione delle immagini, intese a garantire immagini di qualità tra cui:
69
Algoritmo di controllo automatico del tempo di esposizione. Bilanciamento automatico del bianco. Algoritmi di correzione dei difetti dell'immagine. Incremento dei dettagli di un'immagine (Sharpening).
3
Correzione gamma .
4
Algoritmo NORA per la riduzione del rumore .
Il sensore VS6724 presenta diversi formati d'uscita dei dati:
JPEG: Acronimo di Joint Photographic Experts Group, un comitato che ha de nito il primo standard internazionale di compressione per immagini a tono continuo, sia a livelli di grigio che a colori.
JPEG speci ca solamente come una immagine può essere trasformata in uno stream di byte, ma non come questo può essere incapsulato in supporti di memorizzazione. Un ulteriore standard chiamato JFIF (JPEG File Interchange Format), creato da Independent JPEG Group, speci ca come produrre un le appropriato per la memorizzazione su computer di uno stream JPEG.
Essenzialmente il JPEG opera in 3 passi fondamentali. Tali passi sono:
Rappresentazione in ambito frequenziale tramite DCT (trasformata discreta del coseno), se opera in modalità lossy (con perdita d'informazione), o tramite l'uso dei predittori in modalità lossless (senza perdita d'informazione).
Quantizzazione eettuata tramite opportune matrici, che solitamente, pesano i coe cienti di ordine più basso (rappresentano le basse frequenza spaziali) in maniera più decisa, in quanto, per le proprietà della DCT, sono più importanti ai ni della sintesi dell'immagine.
3 Nome
di una trasformazione non lineare usata per codi care e decodi care la luminanza acronimo inglese Noise Reduction Algorithm che permette la eliminazione di rumore
4 NORA,
residuo
70
5 ed eliminazione delle ridondanze di tipo statistico tramite 6 7 codi ca RLE e codici di Human ; la componente continua della DCT Codi ca entropica
invece è codi cata in DPCM (Dierential pulse-code modulation)
Bayern 8-bit: L'informazione ricavata dal sensore si organizza in accordo allo schema Bayer, dove ogni pixel possiede un solo colore (rosso, verde o blu). In questo stato, l'informazione ottenuta dal sensore non viene modi cata. In
8
si mostra la struttura Bayer 8-bit .
Figura 3.11: Formato Bayer
Per un maggior dettaglio delle caratteristiche del sensore si rimanda al datasheet (Appendice 1).
3.2.2 Funzionamento del coprocessore Il coprocessore integrato nel sensore si occupa delle seguenti funzioni:
Taratura del buio: Sfruttando array di pixel non esposti alla luce garantisce l'eliminazione della Dark Current.
5 Compressione
della rappresentazione dei coe cienti che sono stati calcolati col processo di quantizzazione. 6 Cerca nei dati da comprimere una serie di elementi uguali e la sostituisce con un solo elemento, 7 Algoritmo di codi ca dell'entropia usato per la compressione di dati, basato sul principio di trovare il sistema ottimale per codi care stringhe basato sulla frequenza relativa di ciascun carattere 8 Bayer 8-bit impiega 8 bit per rappresentare il valore del singolo pixel. 71
2
Gestione della communicazione seriale I C per la gestione dei registri e il controllo del sensore
Gestione della communicazione parallela a 8bit per la trasmissione dati. Cancellazione del Flicker: La frequenza di 50/60 Hz presenti in molte fonti di illuminazione è visibile quando il tempo d'integrazione non è un multiplo intero di questa frequenza. Il sensore VS6724 regola il tempo di integrazione per garantire che l'eetto icker sia ridotto al minimo.
72
Capitolo 4 Caratterizzazione del sensore VS6724 4.1 Introduzione L'obiettivo del lavoro è quello di analizzare e caratterizzare il sensore VS6724, al ne di poterlo utilizzare per completare il sistema di Real-Time PCR descritto nel capitolo 2. La scelta di tale sensore a tecnologia CMOS è dovuta in particolar modo all'elevato rapporto tra qualità e costo del sensore stesso.
Si vuole infatti realizzare
uno strumento a basso costo e performance paragonabile a quelle ottenute nei termociclatori di Real-Time PCR utilizzati normalmente nei laboratori di analisi.
4.2 Set-up sperimentale. Da quanto spiegato precedentemente, risulta chiara l'importanza di conoscere in dettaglio e controllare in modo preciso il sensore di immagini VS6724. Di particolare importanza è la necessità di studiare gli eetti di due parametri, guadagno e tempo di esposizione, relativamente alla risposta del sensore al variare 73
della uorescenza del campione, cercando di massimizzare il range di luminosità che puo' essere catturata dal sensore.
Per raggiungere questo obiettivo si è dovuto individuare una sorgente di luce con intensità variabile in modo lineare e con una ampia dinamica.
A tal ne si è
scelto di simulare l'emissione di uorescenza mediante la modulazione della potenza luminosa emessa da un LED verde, mediante la variazione del duty-cycle (DC) (Figura 4.1) di un segnale di pilotaggio ad onda quadra che agisce su un transistore MOSFET (Figura 4.2).
Figura 4.1: Segnale di un duty-cycle del 20%
Figura 4.2: Circuito di controllo della intensità luminosa del LED
In questo modo, ssato il valore di corrente di polarizzazione del LED e la frequenza del segnale ad onda quadra, aumentando il DC, si aumenta la potenza lumi-
74
nosa mediamente emessa dal LED e quindi si simula una uorescenza di intensità maggiore. Ripetendo il procedimento per dierenti valori di corrente di pilotaggio del LED, si ottiene un notevole ampliamento dell'intervallo di luminosità sul quale valutare la risposta del sensore di immagini al variare di guadagno e tempo di esposizione. Il set-up sperimentale utilizzato per caratterizzare la camera è schematicamente riassunto in Figura 4.3
Figura 4.3: Setup-sperimentale
Per caratterizzare la telecamera è necessario l'uso di componenti elettronici e strumenti di misura digitali che ci permettono di ottenere una quantità su ciente d'informazione da analizzare successivamente tramite software di calcolo matematico. I componenti elettronici utilizzati sono:
Sistema di visione RVS; LED LXK2-PB12-K00 (2.6); 75
MOSFET LL014N (2.3);
Lo strumento di misura digitale utilizzato è:
Multimetro digitale Agilent 34410A.
L'alimentazione del circuito avviene mediante un alimentatore digitale da banco Agilent E3631A, mentre il raredamento del LED, necessario a mantenere costante la temperatura e quindi la luminosità emessa, si realizza attraverso una ventola alimentata a 12V con un alimentatore analogico ELIND, modello 328, 0-0.8A, 0-32V.
4.2.1 Strumenti e programmi utilizzati per condurre gli esperimenti 4.2.1.1
Modulo Camera RVS:
L'intera elettronica necessaria al funzionamento del sensore CMOS è stata descritta nel Capitolo 3.
Il modulo di visione System on Module riportato in Figura 4.4 utilizzato come strumento di misura della uorescenza ha una dimensione di 30 X 30 mm ed esso è composto da:
4 × 16
Camera 2Mpx ST-VS6724 Microcontrollore STR912FA(Arm966 @ 96MHz) 16MB external burst PSRAM (100MHz) connettori per comunicazione
Interfaccia USB (Figura 4.5)
76
Il modulo consente di ottenere no a 5fps con risoluzione 320x240 in formato Bayer 8-bit e di 10fps in formato Jpeg.
Figura 4.4: Modulo RVS
Figura 4.5: Interfaccia USB
4.2.1.2
Strumenti Programmabili: Agilent E3631A e Agilent 34410A
Per eettuare gli esperimenti, sono necessari sia strumenti in grado di generare tensione costante, che strumenti necessari a misurare grandezze elettriche. 77
Appartiene alla prima categoria il generatore di tensione Agilent E3631A (Figura 4.6) con:
Uscita in tensione da 0V a
±25V
con corrente da 0 a 1A.
Uscita in tensione da 0V a +6V con corrente da 0 a 5A. Programmazione della tensione e corrente di uscita attraverso comunicazione seriale RS-232.
Figura 4.6: Alimentatore Agilent E3631A
Il multimetro digitale Agilent 34410A permette invece di misurare la corente inviata al LED; esso dispone di 6 1/2 cifre di risoluzione (Figura 4.7) ed è connesso al computer tramite porta USB permette di ottenere misure di corrente somministrata al LED.
Figura 4.7: Multimetro Agilent 34410A
78
La gestione degli strumenti collegati al computer si realizza mediante il programma Agilent I/O Libraries Suite. Una volta riconosciuto lo strumento Agilent collegato al computer, il programma con gura la porta di comunicazione (USB o RS232) permettendo il trasferimento d'informazione dal computer verso lo strumento e viceversa mediante istruzioni SCPI.
1
4.2.2 Software implementati per l'acquisizione dei dati 4.2.2.1
Firmware di controllo del sensore
Il sensore VS6724 allogiato nel modulo RVS, viene controllato attraverso il microcontrollore STR9 (host) che, tramite un rmware dedicato, si occupa di molteplici funzioni, quali:
1. Gestione del protocollo USB per la comunicazione con il computer. 2. Gestione del protocollo
(I 2C)2
per la scrittura dei registri del sensore (Figura
4.8). 3. Acquisizione delle immagini attraverso la comunicazione parallela a 8 bit. 4. Salvataggio delle immagini nella memoria RAM del host. 5. Pilotaggio del PWM per il controllo della luminosità del LED. 6. Impostazione del sensore. 1 Acronimo
inglese per Standard Commands for Programmable Instruments. Questo linguaggio rende compatibili, dal punto di vista della programmazione, strumenti di una stessa classe o strumenti aventi le stesse funzionalità. 2 Sistema di comunicazione seriale bi lare utilizzato tra circuiti integrati. Richiede due linee seriali di comunicazione: SDA (Serial DAta line) per i dati e SCL (Serial Clock Line) per il clock.
79
Figura 4.8: Sequenza di inizializzazione del sensore VS6724
4.2.2.2
Creazione della sequenza di esperimenti
Al ne di poter modi care l'impostazione dei parametri del sensore, in particolare il guadagno e il tempo di esposizione, è stato necessario implementare un software in grado di gestire direttamente le informazioni attraverso comunicazione USB tra PC e il modulo RVS. Le impostazioni della telecamera avvengono tramite la creazione di un le di testo (.txt) contenente le informazioni necessarie per modi care la con gurazione di esposizione della telecamera e la luminosità del LED. Il software, implementato in Matlab, permette la scelta della modalità di lavoro della telecamera (Figura 4.9). A seconda della scelta appare una nestra che con gurerà la telecamera in modo Diretto o in modo Compilato.
Figur 4.9: Scelta della modalità di lavoro
80
Modo diretto: Permette di impostare nei registri della telecamera i valori di con gurazione (Figura 4.10). Consente inoltre di inserire i valori di: Guadagno, Coarse integration line
3 e Fine integration pixels 4 .
Figur 4.10: Interfaccia gra ca per l'utilizzo del Modo Diretto
Modo compilato: Permette di impostare il tempo di esposizione mentre il guadagno viene calcolato in accordo con il tempo di esposizione scelto. Se la variazione di guadagno viene ridotta al minimo (limite massimo e limite minimo uguali), si può impostare un unico valore di guadagno.
Figur 4.11: Interfaccia gra ca per l'utilizzo del Modo Compilato 3 Corrisponde 4 Corrisponde
al numero di linee d'integrazione che il sensore utilizza per ogni frame. al periodo d'integrazione di ogni pixel 81
Figura 4.12: Finestra per la selezione del tipo di esperimento
4.2.2.3
Software per l'avvio gli esperimenti
Il software implementato permette di scegliere il modo in cui saranno caricati gli esperimenti (Figura 4.12): utilizzare il le (.txt) creato con il programma sviluppato in Matlab descritto precedentemente o impostare i valori di con gurazione inserendoli direttamente nel programma. Una volta caricati i dati d'impostazione degli esperimenti, il software inzia la communicazione USB fra la telecamera e il computer. In Figura 4.13 viene mostrata la nestra principale.
Il programma è in grado di:
Cambiare sia la modalità di lavoro del sensore sia l'ordine con cui si variano il guadagno e il tempo di esposizione.
Salvare le immagini ottenute dal sensore. Inserire i parametri di controllo della telecamera. Inserire i parametri che modi cano la luminosità del LED (modi cando la tensione, interagendo direttamente con il generatore di tensione digitale su RS-232, e il PWM generato dal host).
Visualizzare lo stato dell'esperimento e il contenuto dei registri del sensore.
82
Figura 4.13: Finestra per caricare ed eseguire gli esperimenti
4.3 Prove sperimentali e risultati Il sensore VS6724, utilizzato come strumento di misura della uorescenza, è parte integrante del sistema di Real-Time PCR e, pertanto, è importante avere il pieno controllo e conoscenza dei parametri del sensore. Per soddisfare ciò ed eetuare la caratterizzazione del sensore si è scelto di lavorare in modo diretto. Gli esperimenti sono stati eettuati seguendo questi passaggi:
Attraverso il software creato in Matlab,vengono impostati i parametri della
5
telecamera (Coarse Integration Line e Guadagno ) e la intensità della luce, con gurando il PWM e la tensione; viene creato un le .txt.
Il le viene caricato nel programma principale e dopo la scelta del percorso per il salvataggio delle immagini si inizia con l'esperimento.
I risultati sperimentali vengono salvati in un le di testo ed i dati corrispondenti vengono memorizzati in sei colonne: Numero d'immagine, tensione, corrente, guadagno, tempo di esposizione e pwm
5 Il
Guadagno scritto (X) varia da 0 a 254; il guadagno eettivo viene calcolato mediante la 256 relazione G= 256−X 83
6 delle immagini acquisite vengono analizzate mediante il software
Le ROI
Matlab. I valori di lumiosità media sono aggiunti come ultima colonna nel le contenente i risultati.
4.3.1 Esperimento 1 Obiettivo di questo primo esperimento è l'identi cazione dell'eetto del Coarse Integration Line sulla luminosità media della ROI al variare del guadagno.
Per
realizzare ciò, telecamera e LED sono stati con gurati come indicato in Tabella 4.1. Tensione (V)
2.09
PWM (%)
50
Coarse integration lines
Variazione da 0 a 1000
Passo
1
Guadagno
0-254
Passo
64
°
Tabella 4.1: Valori impostati nell'esperimento n 1
Risultato: 6 Acronimo
inglese per Region Of Interest, è un sottoinsieme di campioni che si trovano all'interno di un insieme d'informazione
84
°
Figura 4.14: Risultato esperimento n 1
In gura (Figura 4.16) è mostrato il risultato dell'esperimento 1; si può notare che il Coarse integration line provoca una variazione della luminosità media della ROI no al valore di 640 per guadagno uguale a 1.
Oltre questo valore non si
producono variazioni di luminosià. Per questo motivo, per gli esperimenti futuri si utilizzeranno valori di Coarse integration line compressi fra 0 e 640.
4.3.2 Esperimento 2 Con questo secondo esperimento si vogliono identi care i due punti di lavoro del sensore che corrispondono alle due condizioni limite: saturazione e buio. Quando il segnale di uorescenza del campione è alto, i parametri di guadagno e Coarse integration Line devono essere impostati al minimo; si lavora in condizione di 85
minima sensibilità. Al contrario, quando il campione ha una bassa uorescenza, tali parametri devono essere aumentati; si lavora in condizione di massima sensibilità. Per poter simulare, mediante il LED, queste due condizioni limite è necessario identi care rispettivamente il massimo ed il minimo valore di tensione applicabile al LED (punti di lavoro A e B).
Per trovare il punto A la telecamera e l'intensità luminosa del LED sono stati impostati come indicato in Tabella 4.2. Tensione (V)
Varia da 0.1 a 3.0
PWM (%)
90
Coarse integration lines
1
Coarse ne integration pixel
0xFFFF
Guadagno
1
°
Tabella 4.2: Valori impostati nell'esperimento n 2A
Per trovare il punto B la telecamera e l'intensità luminosa del LED sono stati impostati come indicato in Tabella 4.3 Tensione (V)
Varia da 3.0 a 0.1
PWM (%)
10
Coarse integration lines
645
Coarse ne integration pixel
0xFFFF
Guadagno
256
°
Tabella 4.3: Valori impostati nell'esperimento n 2B
86
°
Figura 4.15: Risultato dell'esperimento n 2
In Figura 4.15 è mostrato l'andamento della luminosità media rispetto alla tensione; si possono identi care i due punti di lavoro. Il punto A si trova alla tensione di 2.41V con una luminosità corrispondente di 254 mentre il punto B si trova alla tensione di 1.85V corrispondente a una luminosità di 1.80.
4.3.3 Esperimento 3 Nell'esperimento 3 si vuole capire l'eetto che la variazione di guadagno provoca sulla luminosità media della ROI per diversi valori di Coarse Integration Line.
Si procede con la con gurazione della telecamera e l'intensità luminosa del LED come indicato nella Tabella 4.4.
87
Tensione (V)
2.09
PWM (%)
50
Coarse integration lines
Variazione da 0 a 1000
Passo
1
Coarse ne integration pixel
0xFFFF
Guadagno
0-254
Passo
64
°
Tabella 4.4: Valori impostati nell'esperimento n 3
°
Figura 4.16: Risultati dell'esperimento n 3
In gura 4.16 è riportato l'andamento della luminosità verso il guadagno, mentre la Figura 4.17ne mostra i dettagli.
88
Figura 4.17: Dettagli del gra co di Figura 4.16
Da questi risultati si può notare che la variazione di luminosità non avviene per ogni incremento di guadagno. Mediante l'analisi dei dati in Matlab, si è infatti osservato che no al valore di guadagno pari a 240 si ha una variazione di luminosità ogni 16 incrementi del valorestesso. Oltre questo valore, la luminosità cambia ogni 4 incrementi, arrivando alla saturazione del sensore.
Inoltre si osserva che per valori di Coarse integration line da 1 a 101 si ha una variazione signi cativa di luminosità, pertanto si è deciso di esplorare maggiormente lo spazio compreso fra tali valori. Si è quindi con gurato la telecamera e l'intensità luminosa del LED come indicato nella Tabella 4.5 Tensione (V)
2.09
PWM (%)
50
Coarse integration lines
Variazione da 1 a 100
Passo
10
Coarse ne integration pixel
0xFFFF
Guadagno
Variazione da 1 a 255
Passo
1
°
Tabella 4.5: Valori impostati nell'esperimento n 4
89
°
Figura 4.18: Risultato dell'esperimento n 4
Dalla Figura 4.18 si può vedere che l'andamento del guadagno precedentemente individuato per valori di Coarse integration line compresi tra 101 e 501 è confermato anche per valori tra 0 e 101.
4.3.4 Esperimento 4 Dopo aver indagato l'eetto che guadagno e Coarse integration line hanno sulla luminosità della ROI, si è deciso di trovare una funzione che descrive il rapporto esistente fra loro che fornisca come risultato lo stesso valore di luminosità media. Si vogliono quindi ottenere le curve di isoluminosità. Esse sono state individuate mediante il software Matlab e sono riportate in Figura 4.19.
Note le curve isoluminose, grazie al tting toolbox di Matlab si è trovata la relazione che vincola il guadagno e il Coarse integration line:
90
C=
61.23 0.05588 + G
Dove:
C = Coarse integration line
G = Guadagno
Questa relazione è di fondamentale importanza perchè è possibile controllare la luminosità media rilevata dal sensore mediante il ne controllo dei due parametri di interesse.
Figura 4.19: Curve isoluminose
91
4.3.5 Esperimento 5 In questo quinto esperimento si vuole identi cazione il rapporto Segnale Rumore (SNR) del sensore mediante il calcolo della media e della varianza di tutti i pixel corrispondenti a una precisa sequenza d'immagini.
Si procede con la con gurazione della telecamera e dell'intensità luminosa del LED come indicato nella Tabella 4.6. Tensione (V)
2.20
PWM (%)
100
Coarse integration lines
300
Passo
0
Coarse ne integration pixel
0xFFFF
Guadagno
1
Passo
0
°
Tabella 4.6: Valori impostati nell'esperimento n 5
Figura 4.20: Rapporto fra media dei pixel e varianza
92
In Figura 4.20 si mostrano i valori di ogni pixel del sensore corrispondenti ai colori RGB (rosso, verde e blu). Come si vede nel gra co, i pixel meno luminosi contengono una componente di rumore minore, mentre i pixel luminosi, contengono una componente di rumore maggiore. Per determinare ciò, si calcola la media e la varianza di tutti i pixel corrispondenti a una sequenza d'immagini ottenute dal sensore.
4.3.6 Esperimento 6 In ne, con questo ultimo esperimento si determina la linearità della telecamera rispetto alla variazione di luminosità.
Si procede con la con gurazione della telecamera e l'intensità luminosa del LED come indicato nella Tabella 4.6. Tensione (V)
2.20
PWM (%)
Variazione da 2 a 98
Coarse integration lines
300
Passo
0
Coarse ne integration pixel
0x0032
Guadagno
1
Passo
0
°
Tabella 4.7: Valori impostati nell'esperimento n 6
93
Figura 4.21: Linearità del sensore VS6724
In Figura 4.21 è riportato il risultato dell'esperimento di linearità del sensore. In questo esperimento si è studiato il comportamento della luminosità del singolo pixel e dell'insieme dei pixel. La curva verde mostra i valori per singolo pixel, mentre la curva nera rappresenta la media di tutti i pixel. Possiamo vedere che al variare del PWM la luminosità varia in maniera lineare in entrambi i casi.
Gli esperimenti condotti hanno permesso di caratterizzare le prestazioni del sensore VS6724 al variare dei parametri di controllo.
94
Conclusioni e sviluppi futuri Il presente lavoro di tesi è inserito in un progetto dell'azienda STMicroelectronics, nalizzato allo sviluppo di una piattaforma dedicata all'analisi molecolare mediante Real-Time PCR su lab-on-chip. La rilevazione delle molecole e' eettuata mediante l'acquisizione di segnali uorescenti proporzionali alla concentrazione delle molecole target. La strumentazione classica di laboratorio impiega sensori so sticati ad elevata sensibilità, quali CCD rareddati, PMTs o fotodiodi SPAD. Lo sviluppo di una piattaforma LowCost vuole dimostrare che una fotocamera commerciale in tecnologia CMOS, può essere ottimizzata al ne di ottenere gli stessi livelli di sensibilità nella rilevazione di tali segnali di uorescenza. Questo consentirà di ridurre notevolmente il costo dello strumento e la sua complessità, permettendo di realizzare piattaforme Point of Care , che consentiranno di poter eettuare tali analisi in maniera completamente automatizzata senza rinunciare alle prestazioni necessarie. Lo sviluppo del lavoro di tesi si focalizza sull'ottimizzazione dei parametri di controllo del sensore VS6724, impiegato nella realizzazione dello strumento di Real Time PCR. I parametri principali per la caratterizzazione del sensore sono: il guadagno e il tempo di esposizione. I due parametri sono controllati direttamente mediante registri software, questo signi ca che il coprocessore non modi ca né calcola automaticamente i valori inseriti, pertanto il software di controllo dovrà essere in grado di regolarli in funzione del livello del segnale. Le prove sperimentali hanno mostrato che il sensore in esame ha una caratteristica ingresso-uscita lineare. Per quanto riguarda il rumore, il sensore ottico risponde 95
di maniera proporzionale; vale a dire che, con l'incremento dell'intensità luminosa del segnale rilevato, il rumore aumenta linearmente.
Con software di calcolo matematico si è stabilito il rapporto esistente tra Guadagno e Coarse integration line che permette di sapere la luminosità totale dell'immagine che si otterrebbe con determinati coppie di valori.
Ciò permette di conoscere a
priori le coppie di valori di tempo di esposizione e guadagno che permettono di ottenere una esposizione dell'immagine equivalente.
Più in dettaglio, la variazione di luminosità non avviene per ogni incremento di guadagno. Mediante l'analisi dei dati in Matlab, si è infatti osservato che no al valore di guadagno pari a 240 si ha una variazione di luminosità ogni 16 incrementi del valorestesso.
Oltre questo valore, la luminosità cambia ogni 4 incrementi,
arrivando alla saturazione del sensore.
Le misure eettuate hanno permesso di rilevare segnali provenienti da campioni reali con prestazioni confrontabili a quelle ottenute con strumentazione di riferimento, dimostrando che l'utilizzo di un sensore CMOS standard può essere impiegato per la costruzione di uno strumento per analisi molecolare.
I risultati ottenuti verranno impiegati per la progettazione dei nuovi sensori CMOS, permettendo una migliore ottimizzazione dei parametri di controllo migliorandone le prestazioni in condizioni di bassa luminosità ambientale.
La caratterizzazione del sistema di rilevazione ottica permetterà in futuro l'implementazione di un sistema di controllo automatico che imposti i parametri del sensore per rilevare la luminosità tenendo sotto controllo i valori di guadagno e coarse integration line. Ottenere una regolazione automatica dell'immagine e' di fondamentale importanza nella realizzazione di strumentazione user-friendly , dove si vogliano garantire le prestazioni limitando il più possibile l'intervento dell'utente.
96
Bibliogra a [1] Cocci Alessandro. Progetto e sviluppo di un sistema di controllo della temperatura per real time pcr su lab-on-chip. Master's thesis, Politecnico di Milano, 2005/2006. [2] Gabriela S. Dveksler Carl W.Dieenbach. PCR Primer: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003. [3] Mohamad Sawan Ebrahim Ghafar-Zadeh. CMOS capacitive sensors for Labon-chip applications. Springer Dordreecht, 2010. [4] John P. Hays Elizabeth Van Pelt-Verkuil, Alex van Belkum. Principles and Technical Aspects of PCR ampli cation. Springer, 2008. [5] Guerinoni Federica. Progetto e sviluppo di un lettore ottico per la real-time pcr su lab-on-chip. Master's thesis, Università degli studi di Pavia, 2007/2008. [6] Rita Zappa Franco Zappa. Fondamenti di elettronica. Esculapio. [7] R.K. Saiki Arnheim Ehrlich H Gyllenstein Li H, Cui X.U.B. Ampli cation and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature, 1988. [8] Nick Saunders Julie Logan,
Kristin Edwards.
Real-Time PCR Current
Tecnology and Applications. 2009. [9] Susan J. Karcher. Laboratorio di Biologia Molecolare. Zanichelli. [10] Bengtsson
M.
Forootan
A.
Jonak
J.
Lind
K.
Sindelka
Andrade J.M. The real time polymerase chain reaction. 2006.
97
Kubista
M.,
[11] Cereda Marco. Sviluppo e applicazioni diagnostiche di un sistema point-ofcare basato su real-time pcr. Master's thesis, Università degli Studi MilanoBicocca, Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali, 2006-2007. [12] Hooly Moore. Matlab per l'ingegneria. Pearson, Prentice Hall, 2008. [13] Junichi Nakamura.
Image Sensors and Signal Processing for Digital Still
Cameras. Taylor & Francis Group, 2006. [14] Ralph Etiene Cummings Orli Yahid Pecht.
CMOS Imagers:
From Photo
transduction to image processing. Kluwer Academic Publishers, 2004. [15] QIAGEN. Critical Factors for Successful Real Time PCR. 01 2004. [16] Stan Sholik Ron Eggers. The Master Guide to Digital SLR cameras. Amherst Media, 2005. [17] Stoel S. Scharf S. Higuchi R. Horn G.T. Mullis K.B. Erlich H.A. Saiki R.K., Gelfand D.H. Primer directed enzymatic ampli cation of DNA with a termostable DNA polymerase. Science, 1994. [18] Scott T. Smith.
Matlab. Advanced GUI development.
Dog Ear Publisher,
2006. [19] STMicroelectronics. VS6724. [20] Freeman W.M. Quantitative RT-PCR: Pitfalls and Potential Biotechniques. 1999. [21] www.molecularlab.it. [22] www.pubmed.org. [23] www.st.com. [24] www.wikipedia.org. [25] Rossa W. K. Chiu Y.M.Dennis Lo. Clinical Application of PCR. Humanapress, 2006.
98
Appendice A APPENDICE A
99
VS6724 2 Megapixel single-chip camera module Preliminary Data
Features ■
1600H x 1200V active pixels
■
Class leading 30 fps UXGA progressive scan
■
2.2 µm pixel size, 1/3.8 inch optical format
■
Quad-element plastic lens, F# 3.2, 52° horizontal field of view
■
8.0 x 8.0 x 5.55 mm ultra low profile fixed focus camera module with embedded passives
■
RGB Bayer color filter array
■
Integrated 10-bit ADC
■
Integrated digital image processing functions, including defect correction, lens shading correction, image scaling, interpolation, sharpening, gamma correction and color space conversion
■
Integrated power management with power switch, automatic power-on reset and powersafe pins
■
Low power consumption, ultra low standby current
■
24-pin 8.0 mm x 8.0 mm x 5.55 mm shielded socket option
■
Embedded hardware JPEG compression (4:2:0 or 4:2:2) delivering 30 fps streaming performance
■
Mobile phone, videophone
■
Embedded camera controller for automatic exposure control, automatic white balance control, black level compensation, 50/60 Hz flicker cancelling, flashgun support.
■
PDA, toys
■
Medical
■
Biometry
■
Fully programmable frame rate and output derating functions
■
Bar code reader
■
Lighting control
■
Low power 30 fps up to SVGA for video capture
■
ITU-R BT.656-4 YUV (YCbCr) 4:2:2 with embedded syncs, YUV (YCbCr) 4:0:0, RGB 565, RGB 444, JPEG, Bayer 10-bit or Bayer 8bit output formats
■
8-bit parallel video interface, horizontal and vertical syncs, 80 MHz (max) clock
■
Two-wire serial control interface
■
On-chip PLL, 6.5 to 27 MHz clock input
■
Analog power supply, from 2.4 V to 3.0 V
■
Separate I/O power supply, 1.8 V or 2.8 V levels
July 2007
Applications
Description The VS6724 is a UXGA resolution CMOS imaging device designed for low power systems, particularly mobile phone applications. Manufactured using ST 0.18 µm CMOS Imaging process, it integrates a high-sensitivity pixel array, digital image processor and camera control functions.
Rev 1
This is preliminary information on a new product now in development or undergoing evaluation. Details are subject to change without notice.
1/118 www.st.com
1
Overview
VS6724
1
Overview
1.1
Description The VS6724 is a UXGA resolution CMOS imaging device designed for low power systems, particularly mobile phone applications. Manufactured using ST 0.18 µm CMOS Imaging process, it integrates a high-sensitivity pixel array, digital image processor and camera control functions. The VS6724 is capable of streaming UXGA video up to 30 fps JPEG and up to 15 fps with ITU-R BT.656-4 YCbCr 4:2:2 format. It supports 1.8 V or 2.8 V interface and requires a 2.4 to 3.0 V analog power supply. Typically, the VS6724 can operate as a 2.8 V single supply camera or as a 1.8 V interface / 2.8 V supply camera. The integrated PLL allows for low frequency system clock, and flexibility for successful EMC integration. An input clock is required in the range 6.5 MHz to 27 MHz. The VS6724 camera module uses ST’s second generation “SmOP2” packaging technology: the sensor, lens and passives are assembled, tested and focused in a fully automated process, allowing high volume and low cost production. The device contains an embedded video processor and delivers fully color processed images at up to 30 fps UXGA JPEG, or up to 30 fps SVGA YCbCr 4:2:2. The video data is output over an 8-bit parallel bus in JPEG (4:2:2 or 4:2:0), RGB, YCbCr or Bayer formats and the device is controlled via an I²C interface. The VS6724 also includes a wide range of image enhancement functions, designed to ensure high image quality, these include:
8/118
●
Automatic exposure control
●
Automatic white balance
●
Lens shading compensation
●
Defect correction algorithms
●
Interpolation (Bayer to RGB conversion)
●
Color space conversion
●
Sharpening
●
Gamma correction
●
Flicker cancellation
●
NoRA noise reduction algorithm
●
Intelligent image scaling
●
Special effects
VS6724
1.2
Overview
Signal description The VS6724 has 20 electrical connections which are described in Table 1. The package details and electrical pinout of the flex connector are shown in Figure 45 on page 115 and Figure 46 on page 116. Table 1.
Signal description
Pad name
Type
Description
Reference voltage
GND
PWR
Ground(1)
HSYNC
OUT
Horizontal synchronization output
VDD
VSYNC
OUT
Vertical synchronization output
VDD
SCL
IN
I²C clock input
VDD
CLK
IN
Master clock input - 6.5MHz to 27MHz
VDD
SDA
I/O
I²C data line
VDD
VDD
PWR
Digital supply
1.8 V OR 2.8 V
AVDD
PWR
Analogue supply
2.4 V to 3.0 V
PCLK
OUT
Pixel qualification clock
VDD
CE
IN
Chip enable signal active HIGH
VDD
DO5
OUT
Data output D5
VDD
DO4
OUT
Data output D4
VDD
GND
PWR
Ground(1)
DO3
OUT
Data output D3
VDD
DO2
OUT
Data output D2
VDD
DO1
OUT
Data output D1
VDD
DO0
OUT
Data output D0
VDD
DO6
OUT
Data output D6
VDD
DO7
OUT
Data output D7
VDD
FSO
OUT
Flash output
VDD
1. The two GND pins are connected together on the device substrate.
9/118
Functional description
2
VS6724
Functional description The VS6724 simplified block diagram is shown in Figure 1, with the following main blocks: ●
UXGA-sized pixel array
●
Video pipe
●
Statistics gathering unit
●
Clock generator
●
Microprocessor
●
Video timing generator
Figure 1.
Simplified block diagram
CLK
CE VDD GND
Microprocessor
RESET VREG
Video Timing Generator
Statistics Gathering
AVDD GND
UXGA Pixel Array
Video Engine Bypass
2.1
SDA SCL
I²C Interface I²C
Clock Generator
Video Compressor (JPEG engine) Bypass
FSO Output Coder Bypass
VSYNC HSYNC PCLK D[0:7]
Operation A video timing generator controls a UXGA-sized pixel array to produce raw Bayer images. The analogue pixel information is digitized and passed into the video pipe. The video pipe contains a number of different functions (explained in detail later). At the end of the video pipe, data is output to the host system over an 8-bit parallel interface along with qualification signals. The whole system is controlled by an embedded microprocessor that is running firmware stored in an internal ROM. The external host communicates with this microprocessor over an I²C interface. The microprocessor does not handle the video data itself but is able to control all the functions within the video pipe. Real-time information about the video data is gathered by a statistics engine and is available to the microprocessor. The processor uses this information to perform real-time image control tasks such as automatic exposure control.
10/118
VS6724
Functional description
2.2
Imaging pipe diagram The details of the imaging pipe are shown in Figure 2. The main functions contained within this diagram are detailed in this chapter.
Figure 2.
Imaging pipe block diagram
Bayer
Sensor array
Recovery engine
Lens shading Defect correction Noise reduction
Channel gains & offsets
AE & AWB engine
Bayer scaling Stats. gathering
Intermediate Bayer data
Color reconstruction (Interpolation, alias)
Host
Color matrix Gamma correction
Colorspace conversion & JPEG compression
Front end Scaler
Aperture correction
Output formatter
RGB, YCbCr, JPEG
Color engine
11/118
Functional description
2.3
VS6724
Sensor array The VS6724 physical pixel array is 1616 x 1216 pixels (see Figure 3), with a pixel size of 2.2 µm by 2.2 µm. The image size read from the array is mode dependent. For UXGA mode the image size read from the array is 1608x1208. For SVGA mode it is 1616x1208. Figure 3.
Sensor array
1216 pixels
1208 pixels
1600 x 1200 pixels (1608x1208 including borders)
1200 pixels
Visible array
4 Border Columns 4 Dummy Columns
4 Dummy Columns 4 Border Columns
4 Dummy Rows 4 Border Rows
4 Border Rows 4 Dummy Rows 1600 pixels 1608 pixels 1616 pixels
2.3.1
Sensor mode control The VS6724 can operate it’s sensor array in two modes controlled by register SensorMode within Mode setup. ●
●
2.3.2
SensorMode_UXGA - the full array can be read out at 30 fps and the VS6724 can achieve: –
30 fps JPEGs up to UXGA
–
30 fps YCbCr or RGB up to SVGA
–
15 fps YCbCr or RGB over SVGA
SensorMode_SVGA_analogue binning - this is a reduced power mode which uses the full array and a technique of analogue binning output SVGA at up to 30 fps.
Horizontal mirror and vertical flip The image data output from the VS6724 can be mirrored horizontally or flipped vertically (or both).
12/118
VS6724
2.4
Functional description
Recovery engine (RE) The RE is used to process raw Bayer input from the sensor array to an intermediate Bayer which is correctly white balanced and noise reduced, and can be supplied to the interpolation engine.
2.4.1
Channel offsets To achieve the desired black level of Bayer pixel data it is often necessary to apply an offset to the data. This module provides the functionality to apply color channel dependent offset on active pixel data, i.e. not dark or black data.
2.4.2
Channel gains Color dependent gains are applied to active pixel data within this module as part of the automatic white balance function. The gain inputs are re-synchronized to the first active line.
2.4.3
Lens shading compensation The lens shading is used to compensate for attenuation in the optical signal caused by primary and micro lens roll off. The module uses internal counters to determine the input pixel position in terms of imaging array, to which it applies a simple polynomial gain function. This gain is dependent on two coefficients which are system specific.
2.4.4
Bayer scaling The RE architecture includes an optional Bayer scaler/smoothing module which produces a Bayer image fully compatible with existing image reconstruction techniques. The scaling factor is fixed at downscale-by-3 (in both x & y), with the basic principle of subsampling from successive 3x3 blocks to produce a pseudo-Bayer pattern (2x2 Bayer pattern generated from 6x6 Bayer input as illustrated in Figure 4). This module is intended for use during viewfinder modes to provide a lower power (and reduced quality) image for display on LCD.
13/118
Functional description Figure 4.
VS6724 Scaling of Bayer image
A B C D E F 1 2 3 4 5 6 (a)
Q1
Q2
Q3
Q4
(b)
(c)
(d) a)
is a 6x6 pixel section of a Bayer patterned pixel array.
b)
shows four 3x3 pixel regions which divide the 6x6 pixel array into quarters.
c)
shows the pixels in each quarter used to calculate the sub-sampled pixel (and the spatial positioning of the sub-sampled pixel shown by the dashed colored line)
d)
shows the final sub-sampled 2x2 Bayer data
The sub-sampled pixel value is the average value of the specific color pixels in each quarter. Smoothing is required in order to regulate the data rate through the image reconstruction chain so as to match any system bandwidth limits.
2.4.5
Cropping module The VS6724 cropping module can be used to define a window of interest within the full UXGA array size, with all pixels falling outside this window of interest appearing as blanking. The crop block is also used by the scaler to allow configuration of certain output frame dimensions. The user can set a start location and the required output size. Figure 5 shows the example with of the crop.
14/118
VS6724
Functional description Figure 5.
Crop controls Sensor array horizontal size
Sensor array vertical size
uwManualCropHorizontalStart uwManualCropVerticalStart Cropped ROI uwManualCropVerticalSize
uwManualCropHorizontalSize FFOV
2.4.6
Zoom The zoom function found in the pipe context control sections can be used to achieve a continuous zoom by simply selecting the commands zoom_in, zoom_out and zoom_stop. It is also possible to perform a single step of zoom by selecting Zoom_step_in and Zoom_step_out. It is possible to zoom between the sensor size selected and the output size (the output size must be smaller that the sensor mode size, UXGA or SVGA).
2.4.7
Pan It is possible to pan left, right, up and down when the output size selected is smaller than the sensor size selected (if the output size selected equals the sensor mode size then no pan can take place). The pan step size in both the horizontal and vertical directions are selectable.
2.4.8
Derating The VS6724 contains an internal derating module. This is designed to reduce the peak output data rate of the device by spreading the data over the whole frame period and allowing a subsequent reduction in output clock frequency. The maximum achievable derating factor is x400 for an equivalent scale factor of x20 downscale. As a general rule the allowable derating factor is equal to the square of the scaling factor.
Note:
The interline period is not guaranteed to be consistent for all derating ratios. This means the host capture system must be able to cope with use of the sync signals or embedded codes rather than relying on fixed line counts.
15/118
Functional description
2.4.9
VS6724
Defect correction 1 & 2 The input to the defect correction filters is a 5x5 pixel matrix from which a centre pixel and a neighborhood of 8 pixels is extracted. The 8 pixel neighborhood is used to determine the validity of the corresponding centre pixel. This is achieved using the ranked output of a Batcher-Banyan sort architecture. The defect correction filters perform both detection and weighted correction on all data. Defect correction 1 is weighted to work horizontally and vertically. Defect correction 2 is weighted to operate on the diagonal elements.
2.4.10
Spatial noise reduction The noise reduction module implements an algorithm based on the human-visual system and adaptive pixel filtering that reduces perceived noise in an image whilst maintaining areas of high definition.
2.4.11
Interpolation The interpolation module converts Bayer pixel data to RGB and applies an anti-alias filter to the data. It also generates the sharp data used in the aperture correction block.
2.5
Color engine (CE block) The role of the CE is to process the RGB data from the recovery engine into a specific format requested by the host, e.g. RGB565 for LCD display, or YCbCr for the JPEG encoder.
2.5.1
Color matrix A matrix color correction transform is performed on the outputs of the scaler, the matrix is detailed in Figure 6. Figure 6.
Color matrix rcof00
rcof01
rcof02
rcof10
rcof11
rcof12
rcof20
rcof21
rcof22
The matrix equations are: Ro = Rin.rcof00 + Gin.rcof01 + Bin.rcof02 Go = Rin.rcof10 + Gin.rcof11 + Bin.rcof12 Bo = Rin.rcof20 + Gin.rcof21 + Bin.rcof22
Note:
16/118
The neutral-preserving (“eigen-grey”) property of the matrix can be achieved by ensuring the matrix rows sum to unity.
VS6724
2.5.2
Functional description
Aperture correction The aperture correction module is used to add a certain amount of sharpening to the scaled RGB, it can be programmed to reduce as the light level drops. The aperture correction module also includes a function known as coring which allows control of the minimum magnitude which any edge on the image must exceed before sharpening is applied. This ensures that small edges such as noise are not amplified by the sharpening. The coring can be programmed to increase as the light level drops.
2.5.3
Special effects The special effects module is used to apply simple transforms onto the input data. The supported effects are: Black and White, Hue, Sepia, Negative, Antique, sketch, caricature and Emboss. There are also a number of color effects which can only be applied to YCbCr data.
2.5.4
Gamma correction The gamma module is a gain curve applied to each of the three image components from the sharpening module. The shape of the gain curve is fully programmable.
2.5.5
YCbCr conversion This module performs color space conversion from RGB to YCbCr. It is used to control the contrast and color saturation of the output image as well as the fade to black feature.
2.5.6
Dither The dither block is used in RGB modes to reduce contouring in the image when the data is truncated to lower ranges. This is achieved by determining the error introduced by truncation and adding/subtracting this residual energy to/from the subsequent pixel.
2.6
Video compression module The JPEG encoder receives YCbCr data from the image reconstruction engine and encodes it using baseline sequential JPEG technique. It outputs a standard JPEG data stream with all the required markers and segments required by decoders.
2.6.1
Features ●
Supports YCbCr 422 as input data format.
●
Converts YCbCr 422 to 420 format internally, format selectable.
●
Baseline ISO/ IEC 10918-1 JPEG compliance.
●
Programmable quantization tables.
●
Capable of streaming the UXGA image at a rate of 30 frames per second.
●
Manual / automatic compression control via scaled quantization tables.
●
Automatic compression control targeted at file size and/or peak bit-rate.
●
Progressive high-frequency roll-off option for increased compression.
●
Intraframe rate-control via zig-zag sequence truncation.
17/118
Functional description
VS6724
Quantizer Quantizer scales the DCT coefficients with programmable luminance and chrominance Qtables. These Q-tables are programmed according to image characteristics, and modified by the squeeze setting. The larger the squeeze setting, the more severe the quantization and the greater the compression achieved. Squeeze values can be manually set via the 8-bit register user_squeeze, or automatically set, and dynamically adjusted, by the autosqueeze module.
Entcoder16 The entcoder16 (entropy coder with 16-bit output) converts the quantized data stream to a symbol stream, including differential encoding of DC samples and run-length encoding of zero-valued AC samples according to the JPEG standard, and finally Huffman-encodes the symbol stream using hardwired baseline JPEG tables to compress the image. It also includes the JPEG header and embeds restart interval markers (if requested by nonzero restartinterval setting) as per the JPEG standard.
Autosqueeze Autosqueeze is the VC’s in-built dynamic compression control system. It adjusts the squeeze parameter based on measurements of two key criteria derived from the previous frame: output file size, and FIFO fullness. Squeeze is subsequently driven iteratively towards the optimal value, satisfying the two conditions:
2.6.2
1.
FIFO stability, i.e. fullness has not exceeded a user-defined dead-zone, AND
2.
output file size <= a user-defined target.
JPEG compression At the simplest level the video compressor has one control which is the Squeeze setting: this tells the system how hard to compress. A change in compression is achieved by scaling the quantization tables. Figure 7.
QCLK options
Firmware control
Control Squeeze bOIFCLK ratio
UYV 422 to 420 YUV 422
18/118
Video compression engine
JPEG output FIFO JPEG
VS6724
Functional description The FIFO shown in the figure above is being constantly monitored with fixed break points, if the FIFO fill state passes one of these break points the squeeze value is increased or decreased. The amount of data in the FIFO is dependant on a number of factors
2.6.3
●
The squeeze factor set
●
The complexity of the scene
●
The speed at which the FIFO is being emptied (bOIFClkRatio)
JPEG squeeze controls The strength of compression or the level of squeeze operated on the image (and therefore the quality of the final image) can be controlled in two ways via the bJpegSqueezeSettings register (note each context can be set independently); bJpegSqueezeSettings0 0x00 SET_USER_SQUEEZE_MODE 0x01 SET_AUTO_SQUEEZE_MODE In auto squeeze mode, the JPEG compression engine is trying to achieve a target file size and constantly changes the compression ratio. This is the preferred mode when using the output JPEG to create a video, or in preview mode. wJpegTargetFileSize {0x03c3, 0x03c4}: Input required size in KBytes In user squeeze mode, the JPEG compression engine will use a constant level of squeeze. This is recommended when trying to capture a high quality image and for snapshot or flashgun modes. For ease of use, the level of squeeze can be adjusted for each pipe context between a high, medium or low level. The value of these squeeze settings can be configured by using the following registers: bJpegImageQuality0 0x00 High quality. Value set in bHiSqueezeValue {0x2508} 0x01 Medium quality. Value set in MedSqueezeValue {0x250a} 0x02 Low quality. Value set in bLowSqueezeValue {0x250c} It is also possible to select between the YCbCr formats input to the video compression engine: bJpegImageFormat 0x00 YCbCr 422 0x01 YCbCr 420
19/118
Functional description Figure 8.
VS6724
JPEG Compression image size to squeeze value relationship Image size to squeeze relationship
1800 1600
Scene1 Scene2
1400
Scene3 Image size KB
1200
Scene4 Scene5
1000
Scene6 Scene7
800
Scene8 600
Scene9 Scene10
400
Scene11 MEAN
200
12 5
11 5
10 5
95
85
75
65
55
45
35
25
15
6
0
Squeeze value
2.6.4
FIFO control The rate which the FIFO is emptied (and therefore the output PCLK frequency) can be controlled using the bOIFClkRatio register. Changing the FIFO readout rate will in turn change the FIFO’s fullness and therefore the squeeze factor used. Section 2.11.2: PLL operation on page 39 describes the calculations for PCLKmax frequency. This frequency is divided by the bOIFClkRatio to give the max JPEG PCLK output from the device: bOIFClkRatio {0x2514}
20/118
1.
PCLK is 2 times slower
2.
PCLK is 4 times slower
3.
PCLK is 8 times slower
4.
PCLK is 16 times slower
5.
PCLK is 32 times slower
6.
PCLK is 64 times slower
VS6724
2.6.5
Functional description
JPEG output as a conventional frame To keep compatibility with conventional frame format, the JPEG frame is output in a series of packets targeted to look like image lines. The Hsync envelopes each packet (line) of data and the Vsync envelopes the complete frame. The start of the frame is indicated by a transition of the Vsync and Hsync. This will occur when the output FIFO has accumulated enough JPEG data for the first line (default line size 512 = 1KBytes). When this line is output, it will then output blocks of blank data (16Byte blocks) until the next 512Bytes of data is available. The number of bytes per line can be programmed using the following registers, both 16 bit registers should be programmed with the same value:
Note:
●
wLineLength {MSB 0x2511, LSB 0x2512} default = 512
●
wThres {MSB 0x251b, LSB 0x251c}
The number of PCLKs in a line is equal to 2 x the line length and the maximum line length is 2K. In most cases the JPEG data will not fill the last line of data and padding data is added after the JPEG end of image marker FFD9h filling the remainder of the last line. Note that it is possible that the JPEG data will exactly fill the line and no padding is required. The value of padding bytes can be programmed using the following registers, both registers should be programmed with the same value; ●
bJPEG_FILL_VAL {0x23b4} default = 0xA5
●
bJPEG_PADDING {0x23b6}
It is not possible to control the timing of the Vsync and Hsync signals in JPEG mode. You can however change the polarity of the signals and select if the Hsync is present or not during the interframe period. PCLK can be made to be present only during active JPEG data, and therefore not present during the interline or interframe periods. The rising edge of PCLK is always half clock delayed from both Hsync and Vsync.
21/118
Functional description Figure 9.
VS6724
JPEG frame
Beginning of JPEG stream(FF D8)
JPEG packet size programmable
Padding data at the end of the JPEG stream
JPEG data End of JPEG FF D9
End of JPEG stream
PCLK
HSYNC
VSYNC
Packet dispatching depends on the image content. This results in a variable blanking duration. JPEG packet data
Padding data 0xA5 (Programmable)
Note:
The minimum inter-packet (line) blanking time is 16 clock cycles, and is always a multiple of 16 clock cycles Table 2.
JPEG data embedded markers Marker function
22/118
Name
Value
Start of image
SOF
FFD8
Define Quantization tables
DQT
FFDB
State of frame for baseline
DCT SOF
FFC0
Define Huffman Tables
DHT
FFC4
Start of Scan
SOS
FFDA
End of image
End of image
FFD9
VS6724
2.7
Functional description
Microprocessor functions The microprocessor inside the VS6724 handles the I²C communication with the host processor. From this communication it allows the host control over the device via the User interface registers. Dark calibration: The microprocessor uses information from the array to ensure that the optimal and consistent ‘black’ level is achieved from the output. Automatic exposure control: Using the information output by the statics gathering engine the appropriate exposure settings for the scene is calculated and using a combination of exposure control, analogue gain and digital gain the device will outputs a correctly exposed image. The host can program the exposure target within a range of EV values or can control the system manually setting a known Exposure time, analogue gain and digital gain. Flicker cancellation: The 50/60 Hz flicker frequency present in many lighting sources is visible when the integration time is not a integer multiple of this frequency. The VS6724 will adjust the integration time to ensure that the flicker effect is minimized. Note that flicker is present when using a integration time shorter than the period of the lighting frequency (less than 8.333 ms for 60 Hz, and less than 10 ms for 50 Hz). Automatic white balance: Using the information output by the statics gathering engine the microprocessor adjusts the gains applied to the individual color channels in order to achieve a correctly color balanced image. In addition to the standard white balance operation a constrainer operates on this information which ensures that the white balance achieved fits within the expected color temperature of real life illuminants. Frame rate control: VS6724 contains a firmware based programmable timing generator. This automatically designs internal video timings, PLL multipliers, clock dividers etc. to achieve a target frame rate with a given input clock frequency. Optionally an automatic frame rate controller can be enabled. This system examines the current exposure status and adapts the frame rate based on this information. This function is typically useful in low-light scenarios where reducing the frame rate extends the useful integration period. This reduces the need for the application of analog and digital gain and results in better quality images. Active noise management: The microprocessor is able to modify certain video pipe functions according to the current exposure settings determined by the automatic exposure controller. The main purpose of this is to improve the noise level in the system under low lighting conditions. Functions which ‘strength’ is reduced under low lighting conditions (e.g. aperture correction) are controlled by ‘dampers’. Functions which ‘strength’ is increased under low lighting conditions are controlled by ‘promoters’. The fade to black operation is also controlled by the microprocessor Fade to Black: Using programmable levels the microprocessor will fade the output signal to black, this ensures that under the darkest conditions when the image is not of sufficient quality the device will output black. This operation is achieved by scaling the RGB to YCbCr matrix.
23/118
Functional description
2.7.1
VS6724
Operational mode control The microprocessor allows high level control of the modes in which the VS6724 can operate, this avoids the need for the host to be concerned with the complexity of controlling the timing or power management during mode changes.
Figure 10. State machine at power -up and user mode transitions Supplies turned-on & CE pin LOW Supplies Off
Supplies turned-off
CE pin LOW
Supplies turned-off
State Machine at power-up I2C controlled user mode transitions
Power-Down
Standby Uninitialised
1
CE pin HIGH
It is possible to enter any of the user modes direct from the uninitialised state via an I2C command
Stop Mode
Snapshot
Note; Depending on the snapshot exit transition settings the device will revert to RUN or PAUSE state automatically after snapshot
Pause Mode
Flashgun
Run Mode
Host initiated state changes System state changes
The power down mode is entered and exited by driving the hardware CE signal. Transitions between all other modes are initiated by I²C transactions from the host system or automatically after time-outs.
24/118
VS6724
Functional description Power Down/Up: The power down state is entered when CE is pulled low or the supplies are removed. During the power-down state (CE = logic 0) ●
The internal digital supply of the VS6724 is shut down by an internal switch mechanism. This method allows a very low power-down current value.
●
The device input / outputs are fail-safe, and consequently can be considered high impedance.
During the power-up sequence (CE = logic 1) ●
The digital supplies must be on and stable.
●
The internal digital supply of the VS6724 is enabled by an internal switch mechanism.
●
All internal registers are reset to default values by an internal power on reset cell.
Figure 11. Power up sequence POWER DOWN
uninitialised mode
standby t1
VDD (1.8V/2.8V)
t2
AVDD (2.8V) CE
t3 CLK t4
SDA SCL
t5 Constraints:
t1 >= 0 ns t2 >= 0 ns
low level command(0xC003): enable clocks
setup commands
t3 >= 0 ns t4 >= 200 µs t5 >= 7 ms (based on 12 MHz external clock frequency, delay is inversely proportional to external clock. Max delay for 6 MHz = 14 ms.)
STANDBY mode: The VS6724 enters STANDBY mode when the CE pin on the device is pulled HIGH. Power consumption is very low, most clocks inside the device are switched off. In this state I²C communication is possible when CLK is present and when the microprocessor is enabled. All registers are reset to their default values. The device I/O pins have a very highimpedance. Uninitialised = RAW: The initialize mode is defined as supplies present, the CE signal is logic 1 and the microcontroller clock has been activated. During initialize mode the device firmware may be patched. This state is provided as an intermediary configuration state and is not central to regular operation of the device. The analogue video block is powered down, leading to a lower global consumption
25/118
Functional description
VS6724
STOP mode: This is a low power mode. The analogue section of the VS6724 is switched off and all registers are accessed over the I²C interface. A run command received in this state automatically sets a transition through the Pause state to the run mode. If a STOP command is issued while streaming an incomplete frame may be generated, it is recommended that a Pause command is issued and a timeout set in bTimeToPowerdown to force an automatic transition to STOP. The analogue video block is powered down, leading to a lower global consumption. Pause mode: In this mode all VS6724 clocks are running and all registers are accessible but no data is output from the device. The device is ready to start streaming but is halted. This mode is used to set up the required output format before outputting any data. The analogue video block is powered down, leading to a lower global consumption
Note:
The PowerManagement register can be adjusted in PAUSE mode but has no effect until the next RUN to PAUSE transition. RUN mode: This is the fully operational mode. In running mode the device outputs a continuous stream of images, according to the set image format parameters and frame rate control parameters. The image size is derived through downscaling of the UXGA image from the pixel array. ViewLive: this feature allows different sizes, formats and reconstruction settings to be applied to alternate frames of data, while in run mode. Snapshot mode: The device can be configured to output a single frame according to the size, format and reconstruction settings in the relevant video pipe context. In normal operation this frame will be output, once the exposure, white balance and dark-cal systems are stable. To reduce the latency to output, the user may manually override the stability flags. The snapshot mode command can be issued in either Run or Stop mode and the device will automatically return previous state after the snapshot is taken. The snapshot mode must not be entered into while ViewLive is selected. FLASHGUN mode: In flashgun mode, the array is configured for use with an external flashgun. A flash is triggered and a single frame of data is output and the device automatically switches to Pause Mode. VS6724 supports the following flashgun configurations:
26/118
●
Torch Mode - user can manually switch on/off the FSO IO pin via a register setting. Independent of mode.
●
Pulsed Mode - the flash output is synchronized to the image stream. There are two options available: –
Pulsed flash with snapshot. Device outputs a single frame synchronized to flash.
–
Pulsed flash with viewfinder. Device outputs a flash pulse synchronized to a single frame in the image stream.
–
In the pulsed mode there are two possible pulse configurations:
–
Single pulse during the interframe period when all image lines are exposed. This is suitable for SCR and IGBT flash configurations. The falling edge of the pulse can be programmed to vary the width of the pulse.
–
Single pulse over entire integration period of frame. This is suitable for LED flash configurations.
VS6724
Functional description
Mode transitions Transitions between operating modes are normally controlled by the host by writing to the Host interface manager control register. Some transitions can occur automatically after a time out. If there is no activity in the Pause state then an automatic transition to the Stop state occurs. This functionality is controlled by the Power management register, writing 0xFF disables the automatic transition to Stop. The users control allows a transition between Stop and Run, at the state level the system will transition through a Pause state.
2.8
Video pipe context configuration
2.8.1
Video pipe setup The VS6724 has a single video pipe, the control of this pipe can be loaded from either of two possible setups Pipecontext0 and PipeContext1;
PipeContext0 and PipeContext 1, control the operations shown below: ● Image size ● Zoom control ● Pan control ● Crop control ● Image format (YCbCr 4:2:2, RGB565, etc....) ● Image controls (Contrast, Color saturation, Horizontal and vertical flip)
2.8.2
Context switching In normal operation, it is possible to control which pipe context is used and to switch between contexts without the need to stop streaming, the change will occur at the next frame boundary after the change to the register has been made. For example this function allows the VS6724 to stream an output targeting a display (e.g. QQVGA RGB 444) then switch to capture an image (e.g. UXGA JPEG) with no need to stop streaming or enter any other operating mode. It is important to note the output size selected for both pipe context must be appropriate to the sensor mode used, i.e. to configure PipeContext0 to QQVGA and PipeContext1 to UXGA the sensor mode must be set to UXGA. The register Mode setup allows selection of the pipe context, by default the PipeContext0 is used.
2.8.3
ViewLive operation ViewLive is an option which allows a different pipe context to be applied to alternate frames of the output data. The controls for VIewLive function are found in the register bank where the fEnable register allows the host to enable or disable the function and the binitialPipecontext register selects which pipe context is output first.
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Functional description
VS6724
When ViewLive is enabled the output data switches between PipeContext0 and PipeContext 1 on each alternate frame. Figure 12. ViewLive frame output format Frame output
Active Video Pipe context0
Interline Blanking
Interframe Blanking
Active Video Pipe context1
Interline Blanking
Interframe Blanking
2.9
Output formats
2.9.1
Image size An output frame consists of a number of active lines and a number of interframe lines. Each line consists of embedded line codes (if selected), active pixel data and interline blank data. Note that by default the interline blanking data is not qualified by the PCLK and therefore is not captured by the host system. The image size can be either the full output from the sensor, depending on sensor mode, or a scaled output, The output image size can be chosen from one of 9 pre-selected sizes or a manual image size can be used. The VS6724 supports the following data formats: ●
JPEG (4:2:2, 4:2:0)
●
YCbCr 4:2:2
●
YCbCr 4:0:0
●
RGB565
●
RGB444 (encapsulated as 565)
●
RGB444 (zero padded)
●
Bayer 10-bit
●
Bayer 8-bit
The required data format is selected using the bdataFomat control found in the pipe context registers. The various options available for each format are controlled using the bRgbsetup and bYCbCrSetup registers found in the Dither control registers.
28/118
VS6724
2.9.2
Functional description
Line / frame blanking data The values which are output during line and frame blanking are an alternating pattern of 0x10 and 0x80 by default. These values may be changed by writing to the BlankData_MSB and BlankData_LSB registers in the Dither control bank.
2.9.3
YCbCr 4:2:2 data format YCbCr 422 data format requires 4 bytes of data to represent 2 adjacent pixels. ITU601-656 defines the order of the Y, Cb and Cr components as shown in Figure 13.
Figure 13. Standard Y Cb Cr data order HSYNC SIGNAL
EAV Code
START OF DIGITAL ACTIVE LINE
8 1 F 0 0 X Cb 0 0 F 0 0 Y
Y
Cr
Y
Cb
Y
Cr
Y
Cb
Y
Cr
Y
4-data packet The VS6724 bYCbCrSetup register can be programmed to change the order of the components as follows: Figure 14. Y Cb Cr data swapping options register bYCbCrSetup
2.9.4
Bit [1] Y first
Bit [0] Cb first
DEFAULT
Components order in 4-byte data packet 1st 2nd 3rd
1
1
Y
0
1
Cb
1
0
0
0
4th
Cb
Y
Cr
Y
Cr
Y
Y
Cr
Y
Cb
Cr
Y
Cb
Y
YCbCr 4:0:0 The ITU protocol allows the encapsulation of various data formats over the link. The following data formats are also proposed encapsulated in ITU601-656 protocol: ●
YCbCr 4:0:0 - luminance data channel
This is done as described in Figure 15. In this output mode the output data per pixel is a single byte. Therefore the output PCLK and data rate is halved. It is possible to reverse the overall bit order of the component through a register programming. 29/118
Functional description
Note:
VS6724
False synchronization codes are avoided in the LSByte by adding or subtracting a value of one, dependent on detection of a 0 code or 255 code respectively. Figure 15. YCbCr 4:0:0 format encapsulated in ITU stream START OF DIGITAL ACTIVE LINE
Pixel10
Pixel9
Pixel8
Pixel7
Pixel6
Pixel5
Pixel4
Pixel3
F 0 0 X F 0 0 Y
Pixel2
YCbCr 4:0:0
Pixel1
EAV code F 0 0 X D D D D D D D D D D F 0 0 Y 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ..................
..................
where:
Pixeln = Yn[7:0]
See Dither control for user interface control of output data formats.
2.9.5
RGB and Bayer 10 bit data formats The VS6724 can output data in the following formats:
Note:
●
RGB565
●
RGB444 (encapsulated as RGB565)
●
RGB444 (zero padded)
●
Bayer 10-bit
Pixels in Bayer 10-bit data output are defect corrected, correctly exposed and white balanced. Any or all of these functions can be disabled. In each of these modes 2 bytes of data are required for each output pixel. The encapsulation of the data is shown in Table 16.
30/118
VS6724
Functional description
Figure 16. RGB and Bayer data formats (1) RGB565 data packing Bit
7
6
5
4
3
2
1
0
Bit
R4 R3 R2 R1 R0 G5 G4 G3
7
6
5
4
3
2
1
0
G2 G1 G0 B4
B3
B2
B1
B0
first byte
second byte (2) RGB 444 packed as RGB565 Bit
7
6
5
4
R 3 R2 R1 R0
3 1
2
1
0
Bit
G3 G2 G1
7
6
5
4
3
2
1
0
G0
1
0
B3
B2
B1
B0
1
3
2
1
0
G3 G2 G1 G0 B3
B2
B1
B0
first byte
second byte (3) RGB 444 zero padded Bit
7
6
5
4
0
0
0
0
3
2
1
0
Bit
R3 R2 R1 R 0
7
6
5
4
first byte
second byte (4) Bayer 10-bit Bit
7
6
5
4
3
2
1
0
1
0
1
0
1
0
b9
b8
Bit
7
6
5
4
3
2
1
0
b7
b6
b5
b4
b3
b2
b1
b0
second byte
first byte
Manipulation of RGB data It is possible to modify the encapsulation of the RGB data in a number of ways: ●
swap the location of the RED and BLUE data
●
reverse the bit order of the individual color channel data
●
reverse the order of the data bytes themselves
Dithering An optional dithering function can be enabled for each RGB output mode to reduce the appearance of contours produced by RGB data truncation. This is enabled through the DitherControl register.
31/118
Functional description
2.9.6
VS6724
Bayer 8-bit The ITU protocol allows the encapsulation of various data formats over the link. The following data formats are also proposed encapsulated in ITU601-656 protocol: ●
Truncated from 10-bit
The output is shown in Figure 17. In this output mode a single byte is output data per pixel, therefore the output PCLK and data rate is half that of the 10bit modes. It is possible to reverse the overall bit order of the individual Bayer pixels through a register programming.
Note:
False synchronization codes are avoided in the LSByte by adding or subtracting a value of one, dependent on detection of a 0 code or 255 code respectively. Figure 17. Bayer 8 output START OF DIGITAL ACTIVE LINE
8-bit Bayer
Pixel11
Pixel9
Pixel7
Pixel5
Pixel3
Pixel1
EAV Code F 0 0 X D D D D D D D D D D D D F 0 0 Y 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3
F 0 0 X L L L L L L L L L L L L S S S S S S S S S S S F 0 0 Y S B0 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10B11 where:
2.10
LSBn = Bayern[7:0]
Data synchronization methods External capture systems can synchronize with the data output from VS6724 in one of two ways: 1.
Synchronization codes are embedded in the output data
2.
Via the use of two additional synchronization signals: VSYNC and HSYNC
Both methods of synchronization can be programmed to meet the needs of the host system.
2.10.1
Embedded codes The embedded code sequence can be inserted into the output data stream to enable the external host system to synchronize with the output frames. The code consists of a 4-byte sequence starting with 0xFF, 0x00, 0x00. The final byte in the sequence depends on the mode selected. Two types of embedded codes are supported by the VS6724: Mode 1 (ITU656) and Mode 2. The bSyncCodeSetup register is used to select whether codes are inserted or not and to select the type of code to insert. When embedded codes are selected each line of data output contains 8 additional clocks: 4 before the active video data and 4 after it.
32/118
VS6724
Functional description
Prevention of false synchronization codes The VS6724 is able to prevent the output of 0xFF and/or 0x00 data from being misinterpreted by a host system as the start of synchronization data. This function is controlled the bCodeCheckEnable register.
Mode 1 (ITU656 compatible) The structure of an image frame with ITU656 codes is shown in Figure 18. Figure 18. ITU656 frame structure with even codes Line 1
SAV 80
Frame of image data
EAV 9D
Line blanking period
2.10.2
Line 480 SAV AB
Frame blanking period
EAV B6
The synchronization codes for odd and even frames are listed in Table 3 and Table 4. By default all frames output from the VS6724 are EVEN. It is possible to set all frames to be ODD or to alternate between ODD and EVEN using the SyncCodeSetup register in theDither control register bank. Table 3.
ITU656 embedded synchronization code definition (even frames) Name
Description
4-byte sequence
SAV
Line start - active
FF 00 00 80
EAV
Line end - active
FF 00 00 9D
SAV (blanking)
Line start - blanking
FF 00 00 AB
EAV (blanking)
Line end - blanking
FF 00 00 B6
33/118
Functional description Table 4.
VS6724 ITU656 embedded synchronization code definition (odd frames)
Name
2.10.3
Description
4-byte sequence
SAV
Line start - active
FF 00 00 C7
EAV
Line end - active
FF 00 00 DA
SAV (blanking)
Line start - blanking
FF 00 00 EC
EAV (blanking)
Line end - blanking
FF 00 00 F1
Embedded synchronization EXT-CSI The structure of a CSI image frame is shown Figure 19. Figure 19. CSI 2 frame structure (VGA example)
Frame of image data
LS
LE
Line blanking period
Line 1
FS
FE
Line 480
Frame blanking period
For CSI, the synchronization codes are as listed in Table 5. Table 5.
CSI - embedded synchronization code definition Name
34/118
Description
4-byte sequence
LS
Line start
FF 00 00 00
LE
Line end
FF 00 00 01
FS
Frame Start
FF 00 00 02
FE
Frame End
FF 00 00 03
VS6724
Functional description
CSI logical DMA channels The purpose of logical channels is to separate different data flows which are interleaved in the data stream, in the case of the VS6724 this allows the identification of the pipe context used for an image frame. The DMA channel identifier number is directly encoded in the 4byte CSI embedded sync codes. The receiver can then monitor the DMA channel identifier and de-multiplex the interleaved video streams to their appropriate DMA channel. The bChannelID register can have the value 0 to 6. The DMA channel identifier must be fully programmable to allow the host to configure which DMA channels the different video data stream use. ●
Logical channel control
The channel identifier is a part of CSI synchronization code, upper four bits of last byte of synchronization code. Figure 20. CSI frame structure (VGA example) illustrates the synchronization code with logical channel identifiers. Figure 20. CSI frame structure (VGA example) 32-bit embedded ITU-CSI sync code
F
F
0
0
0
0
DC LC
DMA Channel Number Valid channels = 0 to 6
Line code 0x0 = Line Start 0x1 = Line End 0x2 = Frame Start 0x3 = Frame End
2.10.4
VSYNC and HSYNC The VS6724 can provide two programmable hardware synchronization signals: VSYNC and HSYNC. The position of these signals within the output frame can be programmed by the user or an automatic setting can be used where the signals track the active video portion of the output frame regardless of its size.
Horizontal synchronization signal (HSYNC) The HSYNC signal is controlled by the bHSyncSetup register. The following options are available: ●
enable/disable
●
select polarity
●
all lines or active lines only
●
manual or automatic
35/118
Functional description
VS6724
In automatic mode the HSYNC signal envelops all the active video data on every line in the output frame regardless of the programmed image size. Line codes (if selected) fall outside the HSYNC envelope as shown in Figure 21. Figure 21. HSYNC timing example
hsync=0
hsync=1
BLANKING DATA
EAV Code
ACTIVE VIDEO DATA
SAV Code
FF 00 00 XY 80 10 80 10 80 10
80 10 FF 00 00 XY D0 D1 D2 D3 D0 D1 D2 D3
EAV Code D2 D3 FF 00 00 XY
If manual mode is selected then the pixel positions for HSYNC rising edge and falling edge are programmable. The pixel position for the rising edge of HSYNC is programmed in the bHSyncRising registers. The pixel position for the falling edge of HSYNC is programmed in the bHSyncFalling registers.
Vertical synchronization (VSYNC) The VSYNC signal is controlled by the bSyncSetup register. The following options are available: ●
enable/disable
●
select polarity
●
manual or automatic
In automatic mode the VSYNC signal envelops all the active video lines in the output frame regardless of the programmed image size as shown in Figure 22.
36/118
VS6724
Functional description Figure 22. VSYNC timing example
BLANKING
V=0 V=1
ACTIVE VIDEO
BLANKING
vsync
V=0 V=1
ACTIVE VIDEO
If manual mode is selected then the line number for VSYNC rising edge and falling edge is programmable. The rising edge of VSYNC is programmed in the bVsyncRisingLine registers, the pixel position for VSYNC rising edge is programmed in the bVsyncRisingPixel registers. Similarly the line count for the falling edge position is specified in the bVsyncFallingLine registers, and the pixel count is specified in the bVsyncFallingPixel registers.
2.10.5
Pixel clock (PCLK) The PCLK signal is controlled by the Dither control register. The following options are available: ●
enable/disable
●
select polarity
●
select starting phase
●
qualify/don’t qualify embedded synchronization codes
●
enable/disable during horizontal blanking
37/118
Functional description
VS6724
Figure 23. QCLK options data
D0
D1
D2
Negative edge None-active level - High
Positive edge PCLK Negative edge
None-active level - Low
Positive edge
The YCbCr, RGB and Bayer timings are represented on Figure 24, with the associated qualifying PCLK clock. The output clock rate is effectively halved for the Bayer 8-bit and YCbCr4:0:0 modes where only one byte of output data is required per pixel. Figure 24. Qualification clock 16-bit data output formats - 2 bytes per pixel
Data[7:0] YCbCr
Cbn,n+1
Yn
Crn,n+1
Yn+1
Cbn+2,n+3
PCLK
RGB565 RGB444
Bayer 10-Bit
Data[7:0]
Pix0_lsb
Pix0_msb
Pix1_lsb
Pix1_msb
Pix2_lsb
Pix0_lsb
Pix0_msb
Pix1_lsb
Pix1_msb
Pix2_lsb
PCLK Data[7:0]
PCLK 8-bit data output formats- 1 byte per pixel
Bayer 8-Bit
Data[7:0]
Pix0
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PCLK
YCbCr 4:0:0
Data[7:0]
PCLK
In practice the user is likely to require to write some additional setup information prior to receive the required data output.
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VS6724
Functional description
2.11
Timing control
2.11.1
Input clock The VS6724 requires provision of an external reference clock. The external clock should be a DC coupled square wave and may have been RC filtered. The clock input is fail-safe in power down mode. The VS6724 contains an internal PLL allowing it to produce accurate frame rates from a wide range of input clock frequencies. The allowable input range is from 6.5 MHz to 27 MHz. The external clock frequency must be programmed in the registers found in Table 19: Video timing parameter host inputs.
2.11.2
PLL operation The VS6724 contains a firmware based programmable timing generator which automatically configures the internal video timing, PLL multipliers, clock dividers to achieve a target operation. The timing generator is controlled and constrained by the required PLL frequency, framerate and scaling factor, this in turn effects the output PCLK frequency.
Timing control The bSysClkMode register selects the mode in which the system clock manager works, ●
<0> SYSCLK_MODE_NORMAL
●
<1> SYSCLK_MODE_USER
In normal mode the VS6724 can achieve UXGA at 30 fps and is based on an internal PLL frequency of 260 MHz, the clock management system ensures a maximum output frequency of 80 Mhz (YCbCr). In user mode the VS6724 can be configured to allow the VS6724 to meet the input frequency constraints of a host application. The fpUserPLLCLK register sets the maximum frequency generated by the system clock manager and therefore limits the output frequency and is based on the following equation: fpUserPLLClk = 2 * PCLKmax The PCLKmax may be a limitation on the host and using the following approximate calculation can help work out the framerate achievable with this output PCLK rate; Framerate = PCLKmax / (Image size * data format * 1.10) ●
Image size = 1600 x 1200 for UXGA sensor mode
●
Image size = 800 x 600 for SVGA sensor mode
●
Data format = 2 for YCbCr 4:2:2, RGB and Bayer10 (as these are 2 Bytes per pixel)
●
Data format = 1 for YCbCr 4:2:0 and Bayer 8 (as these are 1 Byte per pixel)
●
(1.10) is a 10% increase to take into account interline and interframe.
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Functional description
2.11.3
VS6724
Derating When the scaler is operating the clock manager employs derating to reduce the peak output rate of the device by spreading the data over the full frame period. The derating employed can be found by dividing the input size to the scaler by the output size of the scaler and rounding up to the nearest even number. Example: VGA output scaled from the full UXGA array = 1600x1200 / 640x480 = 6.25 rounded up to the nearest even number = 8, therefore the VGA output is 8 times slower than that for the full UXGA output.
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