Esperimenti FT-NMR a impulsi La RF applicata contiene un intervallo di frequenze centrate alla frequenzza ν0. La durata dell’impulso dipende dall’ampiezza dello spettro osservata. Si usano impulsi brevi e di elevata potenza per garantire l’eccitazione di tutti i nuclei in quanto si genera una banda larga (di frequenze).
Sequenza di impulsi
Recupero della magnetizzazione M0 S N
~
nScan
PW = ampiezza dell’impulso t1 = tempo di asquisizione d1 = tempo di recupero (delay (delay))
L’accumulo di molti FID consente di migliorare il rapporto S/N. Il rapporto S/N aumenta proporzionalmente alla radice quadrata del numero di scansioni
Esperimenti FT-NMR a impulsi
Dipendenza della fase del segnale dalla direzione dell’impulso Queste sequenze vanno sotto il nome di “phase cycling” e sono alla base delle moderne tecniche di indagine NMR.
Esperimenti FT-NMR a impulsi Si registra un segnale RF oscillante nel tempo che tende a decadere in seguito ai processi di rilassamento (FID). Si registra l’intensità del segnale in funzione del tempo!!!! Al fine di ottenere l’informazione di frequenza si applica la trasformata di Fourier.
Esperimenti NMR-2D Negli esperimenti bidimensionali, le due dimensioni sono rappresentate da due assi che riportano misure di frequenza (chemical shift); in realtà l’intensità del segnale è nella terza dimensione! Si eseguono due trasformate di Fourier su due domini dei tempi indipendenti e ottenuti da opportune sequenze di impulso.
Intensità
Prototipo di sequenza per un esperimento 2D; il tempo incrementale ∆t1 (µs) e il tempo di acquisizione t2 (s) sono trasformati (FT) nei valori di frequenza ν1 e ν2 delle due dimensioni.
νA ν1 νx νx
ν2
νA
Esperimenti NMR-2D Tutte le sequenze bi-dimensionali si basano sullo stesso principio e hanno un formato base che può essere suddiviso in 4 fasi: 1.Preparazione 2.Evoluzione 3.Mixing 4.Detection (Acquisizione del segnale)
Nel periodo di evoluzione si determinano le condizioni per la seconda dimensione in quanto consente l’ottenimento di una variazione della magnetizzazione in funzione del tempo.
Esperimenti NMR-2D Consideriamo la seguente sequenza a due impulsi di 90° applicata ad un sistema con un solo nucleo, es. CHCl3.
Effetto della sequenza a due impulsi sulla magnetizzazione netta.
Evoluzione in base al chemical shift
L’intensità del segnale dipenderà dal fattore sin360νt1 e sarà correlata al tempo di evoluzione
Esperimenti NMR-2D
Analizzando i vari FID ottenuti variando il tempo di evoluzione t1, si ottengo una serie di spettri i cui segnali mostrano una intensità che varia nel tempo. Nel’esempio è riportato il risultato relativo al CHCl3.
Si riconosce una modulazione di ampiezza nel tempo. Il segnale inoltre diminuisce di intensità per alti valori di t1 a causa del rilassamento T2*
Esperimenti NMR-2D La variazione di intensità nel tempo consente di ricavare un secondo FID che è funzione di t1. Sottoponendo questo nuovo FID creato “artificialmente” è possibile ricavare la seconda dimensione f1 con l’informazione di chemical shift.
f1
La notazione f1 e f2 segue l’ordine derivante dai tempi t1 e t2.
f2
Esperimenti NMR-2D Rappresentazione di uno spettro 2D come contour plot con curve di livello
f1
f2
νA
νx
νA
νx
Esperimenti NMR-2D Esperimenti di correlazione attraverso i legami: -Omonucleare COSY, DQF-COSY, COSY-β , TOCSY, INADEQUATE ….. -Eteronucleare HMQC, HSQC, HMBC, HETCOR …….
Esperimenti di correlazione attraverso lo spazio: effetto NOE -Omonucleare NOESY (1D, 2D), ROESY (1D, 2D), EXSY ….. -Eteronucleare HOESY ….
COSY: COrrelation SpectroscopY In questo tipo di tecnica 2D si ritrovano diverse sequenze d’impulso che consentono di realizzare esperimenti di diverso tipo (COSY, DQF-COSY, COSY-b, COSY-90). Da questi esperimenti è possibile ricavare informazioni riguardanti la correlazione di protoni (o nuclei dello stesso tipo) accoppiati tra loro a 2 o 3 legami (accoppiamento scalare).
AcO 3 OAc 4 H 1 O 1 N N3 2 2 5 O 5 O 6 6 O O AcO 4
3 OAc
A
B
Spettro COSY 500 MHz di un carbopeptide. carbopeptide. I due residui dello zucchero sono contrassegnati con le lettere A e B. In rosso sopra la diagonale sono evidenziate le correlazioni per lo zucchero A e in nero, nero, sotto la diagonale, quelle per lo zucchero B
COSY: COrrelation SpectroscopY
1
7
8+6
4
5
5 2
3
3
COSY: COrrelation SpectroscopY
6
CH2 7
5 4H
CH2
HO
8
3
H3C
1
2
CH3 1
Esperimenti di correlazione attraverso i legami: Eteronucleare In questo tipo di esperimenti è possibile ricavare informazioni eteronuclei. Ad esempio nella correlazione 13C-1H è possibile direttamente legati a protoni. Usando particolari sequenze correlazioni a lunga distanza.
di correlazioni tra risalire ai carboni è possibile fare
HETCOR: con rilevazione sul canale del Carbonio
HMQC, HSQC, HMBC: con rilevazione sul canale del protone
HETCOR: con rilevazione sul canale del Carbonio
C7 C6
=CH2 C8
C4(OH)
C3 C5
C1 C2
HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) con rilevazione sul canale del protone
CH2 5
6
4H
7
CH2
HO
8
3
H3C
1
2
CH3 1
HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) con rilevazione sul canale del protone. Si osservano correlazioni long range 2JCH e 3JCH
Il tempo delay 1\2J puo’ essere ottimizzato a seconda della J che si desidera trovare. Nello spettro HMBC non si osservano le costanti dirette. 6
CH2 7
5 4H
CH2
HO
8
3
H3C
1
2
CH3 1
NOESY (Nuclear Overhauser Spectroscopy) E’ una tecnica utile per le analisi strutturali e le determinazioni stereochimiche. Si sfrutta l’interazione dipolare (NOE) tra nuclei spazialmente vicini. I picchi di correlazione sono in antifase rispetto alla diagonale. 2.67 H16
2.06, H17 2.40, H13 H10
3.35, H11
4.18, H10
5.29, H5
NOESY (Nuclear Overhauser Spectroscopy)
scambio
Correlazione H13 – H17
scambio
13C
1H(ppm ) H(ppm)
(ppm ) (ppm)
1
146.38
q
2
142.23
q
3
133.43
CH
4
131.13
q
5
128.30
CH
6
127.30
q
7
119.58
CH
6.57
8
113.03
CH
6.66
9
91.39
CH
4.89
10
66.43
CH
4.18
11
58.92
CH
3.35
12
56.40
CH3
3.84
13
46.47
CH2
2.59, 2.40
14
43.12
CH3
2.44
15
42.99
q
16
40.82
CH
2.67
17
35.85
CH2
2.06, 1.88
18
20.46
CH2
3.04, 2.30
OH
2.99
5.71
5.29
CHININA Spettro 1H 600 MHz chinina DMSO
OH
HF
HK HL
HS HP
H HT2 Q
HO
HT HT1
HN
N
HU
HO HG
HR
1
H3CO
N
2
HF
3
HU
4 5
HL,K HG
H HO S
HN
HT,T2
DMSO
HR,Q HS
HU HT1
COSY (Correlation Spectroscopy) CHININA
HF
HK
HS
HL
HP
HQ
HT2 HO
HT HT1
HN
N
HU
HO HG
HR
1
H3CO
N
2
3
HU
4 5
COSY (Correlation Spectroscopy) CHININA
HF
HK
HS
HL
HP
HQ
HT2 HO
HT HT1
HN
N
HU
HO HG
HR
1
H3CO
N
2
3
HU
4 5
NOESY (Nuclear Overhauser Spectroscopy) CHININA
HF
HK
HS
HL H HT2 Q HO
HP
HT HT1
HN
N
HU
HO HG
HR
1
H3CO
In blu sono indicati i picchi di correlazione in antifase rispetto alla diagonale. Nota due picchi di scambio in rosso
N
2
3
HU
4 5
HL
HS HP
H HT2 Q
HO
HT HT1
HN
N
HU
HO HG
HR
1
H3CO
N
2
NOESY (Nuclear (Nuclear Overhauser Spectroscopy) Spectroscopy) CHININA
HF
HK
3
HU
4 5
NOESY (Nuclear (Nuclear Overhauser Spectroscopy) Spectroscopy) CHININA
HF
HK HL
HS HP
H HT2 Q
HO
HT HT1
HN
N
HU
HO HG
HR
1
H3CO
N
2
Picchi di correlazione in rosso
3
HU
4 5
