2013

                        PROGETTO “ VERSO IL FUTURO CON L’INGEGNERIA GENETICA” a.s. 2012/2013                                                                       PROTOCOLLI SPERIMENTALI  FASE 1: Preparazione delle cellule competenti ­ modificato da Maniatis – Metodo

Materiali

Utilizzare i ceppi di E.coli Top 10  o   DH5α  ed   effettuare   prima  dell'esperimento   un   controllo   di  fertilità in LB agar e di sensibilità  all’ampicillina in LBagar + Amp.

Ceppi di E.coli Top 10 o DH5α

Terreno LB (Luria­Bertani)broth 10 g triptone 5 g estratto di lievito 10 g NaCl 1. Inoculare una colonia singola in  Aggiungere   950   ml   di   dH2O,  20mL   di   LB   broth   e   incubare   in  aggiustare   il   pH   a   7.0   con   5   N  agitazione o/n a 37°C NaOH. Portare il volume a 1 L con  dH2O. Autoclavare a 121°C per 15  minuti.   Per i terreni solidi aggiungere 15  g/L di Bacto Agar. Ampicillina Concentrazione stock: 50 mg/mL in dH2O (conservare in aliquote a  –20°C). Concentrazione d’uso: 50 µg/mL 2.   Trasferire   un’aliquota   della  Terreno LB broth sterile brodocoltura   o/n   in   LB   broth  sterile   in   beuta,   effettuando   una  diluizione   1:100   (es.   250 µL   di  inoculo in 25 mL di brodo fresco) e  controllare l’O.D. a λ=595nm.   L’   O.D.   non   dovrebbe   essere  superiore a 0.05. 

Motivazioni I controlli permettono di verificare  che il ceppo test cresca in LB agar  e non cresca in LBagar + Amp,  essendo sensibile all’ampicillina.

Strumenti Bilancia, autoclave, incubatore per  piastre, incubatore con agitazione (  a più di 100 oscillazioni per  minuto, meglio a 200­230). Anse sterili, spatole, vetreria,  Bunsen con treppiedi e reticella Cappa di sicurezza per  microbiologia

Pipette sterili e pipettatrici  automatiche, micropipette con  puntali Spettrofotometro e cuvette Incubatore con agitazione

Far   crescere   in   agitazione   a   37°C  da 3 a 4 ore circa.  3.   Controllare   l’O.D.   a  λ=595nm,  Contenitore con ghiaccio avendo   presente   che   le   cellule  vanno   raccolte   quando   la  brodocoltura   ha   raggiunto  un’O.D. ,a λ =595nm, pari a 0.4. Se   l’O.D.   va   bene   raffreddare   le  cellule, incubandole per 10 min in  ghiaccio tritato. 4.   Trasferire   2   mL   della  brodocoltura   in   provettine   da   2  mL,   preparando   tanti   campioni  quante   saranno   le   trasformazioni  da   effettuare.   Oltre   ai   campioni  preparare   anche  le  provette  per  i  controlli   negativi   della  trasformazione.   Centrifugare   a  13000   rpm   per   2   min   a   4°C   o   a  4200 rpm per 10 min a 4°C 5. Scartare il surnatante e  risospendere   il   pellet   di   ogni  campione   in   1   mL   di   soluzione  fredda di MgCl2 e CaCl2. 6. Centrifugare a 13000 rpm per 2  min a 4°C  7. Scartare il surnatante e  risospendere   il   pellet   di   ogni  campione   in   50  µL   di   soluzione  0,1M di CaCl2 freddo.

Provettine da 2 mL, puntali sterili

Soluzione fredda di MgCl2 e CaCl2  80mM MgCl2 e 20mM CaCl2

Per una trasformazione  efficace   è  Spettrofotometro e cuvette,  importante   che   il   numero   di  tritaghiaccio cellule   vitali   non   superi   108  cell/mL. Per la maggior parte dei  ceppi   di   E.coli   una   O.D.,  a λ =595nm,   pari   a   1   corrisponde   a  circa 109cell/mL. L’incubazione   in   ghiaccio   serve  per bloccare la crescita. Centrifuga refrigerata,  micropipette

Micropipette

Centrifuga Soluzione 0,1M CaCl2 freddo, contenitore con ghiaccio

Il   trattamento   a   freddo   e   con   le  Centrifuga, micropipette soluzioni   saline   serve   ad  indebolire   le   membrane   per  permettere   l’ingresso   del   DNA  plasmidico. In particolare gli  ioni  Ca2+andrebbero  a  neutralizzare   le  cariche   negative   del   DNA   e   ne 

8. Utilizzare le cellule subito per la  Contenitore con ghiaccio trasformazione,   mantenendole  comunque   in   ghiaccio,   o  conservarle a – 20°C per una notte  e usarle il giorno dopo. 

faciliterebbero   il   passaggio  attraverso le membrane. Le  cellule  competenti  sono molto  Micropipette fragili.

N.B. Tutte le soluzioni devono essere sterili (sterilizzazione in autoclave oppure per filtrazione con filtri da 0,22 µm) e tenute in ghiaccio.          Le operazioni vanno effettuate in sterilità Come controllo, da utilizzare nella trasformazione, possono essere conservate anche delle cellule non rese competenti cioè alla condizione del  punto 3. 

FASE 2:     Trasformazione batterica (metodo heat shock) Metodo 1. Spostare le cellule competenti (E.   Coli,   TOP10) dal freezer al ghiaccio  e tenerle in ghiaccio per un paio di  minuti   prima   dell’aggiunta   del  DNA   plasmidico.   Per   ogni  trasformazione batterica usare 50 µL  di cellule competenti.

Materiali/ avvertenze Motivazioni Le cellule competenti sono molto fragili! 50 µL di cellule competenti (E. Coli,  TOP10) DNA plasmidico con resistenza  all’Ampicillina Nota: tenere sempre le cellule  competenti in ghiaccio, mai a  temperatura ambiente prima  della trasformazione 2. Aggiungere 25 ng (o al massimo  25 ng (o 50 ng) di DNA  50   ng)   di   DNA   plasmidico   alle  plasmidico cellule   competenti.   Se   la   soluzione  di   DNA   plasmidico   è   10   ng/µL,  contenitore con ghiaccio tritato aggiungere 2.5 µL (oppure 5 µL).  Come   controllo   negativo   della  pennarello vetrografico trasformazione   impiegare   provette  con 50 µL di cellule competenti a cui  puntali sterili non va aggiunto il DNA plasmidico. Le   prove   di   controllo   seguiranno  Campioni da preparare:

Strumenti Freezer –20°C per conservare cellule  e DNA Tritaghiaccio

Micropipette

l’iter dei campioni. Incubare in ghiaccio per 30 min.

­ ­

cellule + DNA controllo negativo:  cellule senza DNA

3. Incubare le cellule a 42°C per 40  Con tempi superiori le cellule si  Lo shock termico sembra favorire  sec (shock termico). rovinano e muoiono.  l’ingresso del DNA nelle cellule

Bagnetto termostatato a 42°C

4. Incubare le cellule in ghiaccio per  contenitore con ghiaccio tritato 2 min. 5. Aggiungere alle cellule batteriche  250 µL   di   LB   broth   fresco   (senza  antibiotici!)   ed   incubare   in  agitazione a 37°C per 40 min.

Terreno   LB   (Luria­Bertani)  broth 10 g triptone 5 g estratto di lievito 10 g NaCl Aggiungere   950   mL   di   dH2O,  aggiustare il pH a 7.0 con 5 N  NaOH. Portare il volume a 1 L  con   dH2O.   Autoclavare.   Per   i  terreni   solidi   aggiungere   15  g/L di Bacto Agar.

L’incubazione a 37°C per 40 min serve  Micropipette alle cellule per riprendersi dopo lo shock  Agitatore termostatato termico,  effettuare un ciclo di  a 37°C replicazione ed esprimere il gene per la  resistenza all’ampicillina. 

6.   Piastrare   in   LB   agar   +   Amp  aliquote   differenti   di   cellule  trasformate quali: ­ 5 µL di cellule trasformate ­ 10 µL di cellule trasformate ­ 50 µL  di cellule trasformate ­ 100 µL di cellule trasformate.

Ampicillina Concentrazione   stock:   50  mg/mL in dH2O (conservare in  aliquote a –20°C). Concentrazione   d’uso:   50  µg/mL

La  presenza dell’antibiotico nel  terreno  Micropipette di coltura inibisce la crescita delle cellule  non   trasformate,   selezionando   le  Incubatore per le piastre a 37°C. trasformate   che,   riproducendosi,  formeranno   colonie   visibili   ad   occhio  nudo.

Spatole ad L sterili Piastrare anche aliquote di 20 o 50  µL   delle   cellule   di   controllo   non  Puntali sterili  

trasformate   sia   su   LB   agar   +  Amp(controllo   negativo)   sia   su   LB  agar   senza   ampicillina   (controllo  positivo). Incubare o/n a 37°C. 7. Osservare le piastre con le cellule  Pennarello vetrografico,  trasformate   e   procedere   al   calcolo  righello, cartoncino nero dell’efficienza di trasformazione. A  tal   fine   scegliere   le   piastre   con  colonie   ben   isolate   e   contabili.  Contarle direttamente o, se troppe,  dividere   la   piastra   in   4   settori.  Contare   le   colonie   di   due   settori  contrapposti,   fare   la   media   e  moltiplicare per 4. Si ottiene il n° di  colonie per piastra.   Procedere   alla   lettura   delle   piastre  con i controlli.

8.   Conservare   le   piastre   da  Sacchetti per autoclave utilizzare  in frigorifero.  Raccogliere   in   sacchetti  autoclavabili le piastre da eliminare  in   modo   da   poterle     sterilizzare,  prima di procedere all’eliminazione. 

L’efficienza   di   trasformazione   viene  Contacolonie espressa come n° cellule trasformate/µg  DNA   e   calcolata   con   la   seguente  formula: n°   colonie   di   una   piastra   x   fattore  diluizione/ngDNA x 1000 Va bene un’efficienza di trasformazione  dell’ordine   di   105  o   106  cellule  trasformate / µg DNA. N.B.  La   presenza   di   piccole   colonie  (colonie   satelliti)   vicine   alle   altre   può  essere   dovuta   alla   crescita   di   cellule  sensibili all’antibiotico che hanno potuto  crescere   grazie   al   consumo  dell’antibiotico   da   parte   delle   cellule  trasformate Frigorifero Autoclave

NOTA Il giorno prima dell’inizio della fase 3 allestire la brodo coltura fresca del clone trasformato prelevando una colonia singola positiva cresciuta   su LBagar+Amp e inoculandola in 2mL di LB broth+Amp. Incubare in agitazione a 37°C o/n.  Allestire tanti inoculi quante sono le prove da  effettuare. Al momento dell’utilizzo l’inoculo deve essere ben torbido, con O.D. maggiore di 1.8.

FASE 3:  Minipreps di DNA (metodo: Wizard Minipreps DNA Purification System) Metodo Materiali/ avvertenze 1.   Trasferire   2   mL   di   coltura  Provette da 2 mL batterica   cresciuta   o/n   in   una  provetta da 2 mL.  2.   Centrifugare   la   coltura   batterica  Nota: Il pellet deve essere ben  per   3   min   a   13000   rpm   a  visibile, altrimenti non ci sono  temperatura ambiente. sufficienti batteri per purificare  il DNA. 3.   Scartare   il   surnatante,  Cell Resuspension Solution  capovolgendo   la   provetta   su   carta  assorbente,   e   risospendere   il   pellet  50 mM Tris­Hcl pH 8 in   200 µL   di  Cell   Resuspension  10 mM EDTA Solution  (nessuna   traccia   di   pellet  100 µl/ml RNasi A deve essere visibile).

4. Aggiungere 200 µL di  Cell Lysis  Cell Lysis Solution Solution  e   agitare   per   inversione  delicatamente   (7­8   volte)   per  0.2 N NaOH favorire   la   lisi   delle   cellule   (non  1% SDS utilizzare   il   vortex   in   questo  passaggio). Incubare   5   min   a   temperatura  ambiente

Motivazioni

Strumenti  Pipettatrice automatica con pipetta  sterile o micropipetta

Centrifuga

NOTA: si tratta di una soluzione in cui  Micropipitte con puntali  vengono   risospese   le   cellule   a   pH  ottimale   (basico)   per   salvaguardare   il  DNA durante la lisi. La presenza della  ribonucleasi A permette la degradazione  dell’RNA che si libera nella fase di lisi  alcalina. L’EDTA blocca le DNasi La   presenza   di   un   forte   detergente  Micropipitte con puntali  anionico (l’SDS, sodio dodecil solfato) e  il   pH   fortemente   basico   determina   la  Bagnetto termostatato rottura   della   parete   cellulare   e   la  denaturazione   del   DNA   cromosomiale.  Il DNA plasmidico, sebbene la soluzione  alcalina   distrugga   l’appaiamento   delle  basi   nel   genomico,   rimane   intatto   (se  vengono rispettati i tempi!) a causa della  sua topologia (anche il DNA plasmidico  si denatura ma i due filamenti di DNA  rimangono connessi l’uno all’altro come  se fossero due anelli l’uno nell’altro).

Sostanzialmente l’SDS denatura il DNA  cromosomiale   perché   essendo   più  grande   lo   “attacca”   prima.   Se   si   lascia  più   tempo   c’è   il   rischio   che   anche   il  DNA   plasmidico   possa   essere  degradato. Micropipitte con puntali

5. Aggiungere 10 µL di soluzione di  Proteasi alcalina proteasi alcalina, invertire 4 volte e  incubare   5   minuti   a   temperatura  ambiente. 6.   Aggiungere   350  µL   di  Neutralization Solution Neutralization Solution e mescolare  per   inversione   (no   vortex!)  1.32 M potassio acetato pH 4.8 delicatamente 7­8 volte. Nota: il ceppo TOP10 è EndA­  perciò   bastano   350  µL   di  soluzione,   in   caso   di   ceppi  EndA+,   aggiungere   400  µL   e  attendere 10 min a temperatura  ambiente prima di centrifugare.

Il DNA genomico denaturato forma dei  Micropipitte con puntali grandi   complessi   ricoperti   da   SDS.  Questi   macrocomplessi   precipitando  inglobano anche carboidrati e proteine.

7. Centrifugare a 13.000 rpm per 10  min. 

In questo passaggio il DNA genomico  denaturato e i detriti cellulari  precipitano.

EndA­ indica la mancanza del gene che  codifica   per   le   endonucleasi.   Il   ceppo  TOP10   EndA­   è   un   ceppo  ingegnerizzato!

Centrifuga

8.   Trasferire   tutto   il   surnatante   in  Colonnine Wizard per  una colonnina Wizard. purificazione DNA plasmidico 9. Centrifugare a 13.000 rpm per 1  min.

Il   DNA   plasmidico   passa   attraverso   la  Centrifuga colonnina   e   rimane   attaccato   alla  membrana,   mentre   il   resto   passa  attraverso   il   filtro   finendo   sul   fondo 

della provetta. 10. Scartare l’eluato 11. Aggiungere 750  µL di  Washing  Washing Solution Solution e centrifugare a 13000 rpm  80 mM potassio acetato 8.3 mM Tris­HCl per 1 min 40 µM EDTA aggiungere etanolo prima  dell’utilizzo. 12. Scartare l’eluato

Il tampone Washing Solution serve per  Micropipette con puntali  lavare la membrana a cui si  è legato il  DNA e a ripulirla da eventuali impurità  Centrifuga che   si   sono   legate   nel   passaggio  precedente.

13. Aggiungere 250 µL   di Washing  Solution e centrifugare a 13000 rpm  per 1 min.

Questo passaggio permette di eliminare  Micropipette con puntali  l’eccesso di sali che sono precipitati con  Centrifuga il DNA (è un lavaggio).

14. Scartare l’eluato.  15.   Centrifugare   di   nuovo   a   13000  rpm per 2 min.

16.   Trasferire   la   colonnina   in   una  provetta da 1.5 mL e aggiungere al  centro della colonna 40 µL di 10 mM  TrisHCl   pH   8   oppure   acqua  deionizzata

17.   Incubare   1   min   a   temperatura  ambiente 18. Centrifugare a 13000 rpm per 2  min.

Questo   passaggio   serve   per   eliminare  Centrifuga completamente   le   tracce   di   etanolo  presenti   nella  Washing   Solution  e   che  possono essere rimaste sulla membrana. Tampone 10 mM TrisHCl pH 8 Micropipette con puntali L’acqua   non   deve   contenere  nucleasi   che   possono   rompere  il DNA. Nota:   fare   attenzione   a   non  toccare   la   membrana   con   il  puntale Questo   passaggio   serve   per   permettere  al   tampone   di   diffondersi   nella  membrana e di staccare il DNA. In questo passaggio il DNA viene eluito,  Centrifuga rimanendo in soluzione; non precipita. 

FASE 4: Controllo del DNA mediante elettroforesi su gel d’agarosio 1 Metodo 1. Sciogliere 1 g di agarosio in 100  ml di tampone TAE 1X.

materiali Agarosio per biologia molecolare 50X tampone TAE

motivazioni Strumenti 100 ml di gel sono sufficienti per una  Bunsen oppure microonde. cella elettroforetica di medie dimensioni,  per una cella piccola calcolare 70 ml/gel

242 g Tris base 57.1 ml Acido Acetico Glaciale 100 ml EDTA 0.5 M Portare il volume a un litro con dH 2O e  autoclavare. 2. Portare la miscela ad ebollizione 3. Lasciare raffreddare e aggiungere  SYBR GREEN (Molecular Probes),  10 µL di SYBR GREEN (diluizione  agente intercalante 1:10.000)

Il sybr green si lega al DNA e lo colora.  Micropipetta con puntali Le bande colorate possono essere viste  con un transilluminatore a luce­ blu. Il   sybr   green   è   un   colorante   del   DNA  alternativo   all’etidio   bromuro   che,  essendo mutageno, presenta rischi per la  manipolazione e l’eliminazione.  Il   sybr   green   ha   passato   i   test   di  laboratorio   e   non   presenta   attività  mutagena o ha attività veramente molto 

bassa   tanto   da   non   essere   classificato  come   rifiuto   pericoloso   dalla   U.S.  Federal   regulations.   Va   in   ogni   caso  maneggiato con le dovute attenzioni.   4. Predisporre la cella elettroforetica  Nastro adesivo da autoclave sigillando   i   lati  della   slitta   con   del  nastro   adesivo   da   autoclave   e  posizionando il pettine.  Versare   il gel nella  slitta e   lasciare  solidificare. 5. Trasferire 12  µL di DNA estratto  6X   Tampone   di   Caricamento   per  in una provetta pulita, aggiungere 4  campioni di DNA 0.25 % (w/v) blu di bromofenolo µL di tampone di caricamento. 0.25% (w/v) xilene cianolo 30% (w/v) glicerolo in dH2O

Camera elettroforetica e  pettine per pozzetti 

I coloranti presenti nel tampone servono  Micropipetta con puntali per valutare la migrazione del DNA che  essendo incolore non si vede. Lo   xilene   (azzurro)   migra   lentamente,  come   un   frammento   di   DNA   di   circa  4000   pb,   mentre   il   blu   di   bromofenolo  migra   più   velocemente,   come   un  frammento   di   DNA   di   circa   300   pb.  Oltre   alla   banda   blu   può   esserci   una  banda   gialla   dovuta   alla   dissociazione  del blu di bromofenolo o alla presenza  di   qualche   altro   componente   nella  miscela La corsa va fermata quando la banda blu  è a 1 o 2 cm dalla fine del gel. Il glicerolo serve per rendere più densa  la   soluzione   di   DNA   e   farla   entrare  meglio nel pozzetto.

6. Posizionare la cella su un cartone  nero   e   caricare   tutti   i   16 µL   di  campione di DNA + il tampone in  un pozzetto. Oltre   ai   campioni   di   DNA   estratti  dalle   cellule   trasformate   possono  essere caricati anche: ­ DNA plasmidico puro, come  controllo ­ 1   kb   DNA   ladder,   come  marcatore  della dimensione  delle molecole di DNA (2 µL  marker +2 µL loading dye +  8 µL d H2O) ­ estratti   da   cellule   non  trasformate   Avviare la corsa elettroforetica: con  voltaggio 70 ­ 100 V, il tempo della  corsa è di circa 40 minuti. 7.Trasferire   il   gel   sulla   piastra   del  transilluminatore   a   luce   blu   e  procedere   all’osservazione   e   alla  lettura delle bande 

Nota: se il campione caricato  dovesse risalire dal pozzetto (per  presenza   di   etanolo   nel   campione)),  aggiungere altri 4 µL di tampone di caricamento.

Generatore di voltaggio

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