Incontro di Genetica Clinica Genova, 27 giugno 2011
Cosa c’è di nuovo nella Sindrome di Beckwith-Wiedemann Margherita Cirillo Silengo Dipartimento di Scienze Pediatriche Università degli Studi di Torino
Che cosa è l’imprinting genomico ? -Processo di modificazione chimica dei nucleotidi (metilazione) a seguito del quale un solo allele per quasi 70 loci umani è attivo in base all’origine parentale. Anche modificazioni degli istoni e miRNA’s giocano un ruolo. -Processo dinamico che si instaura nelle cellule germinali e si modifica dopo la fertilizzazione -Meccanismo epigenetico di regolazione genica -Eccezione al mendelismo= complementarietà degli alleli per un dato locus -Significato evoluzionistico : teoria del conflitto dei sessi (Kinship theory)
Interesse materno limitare l’accrescimento del proprio feto Interesse paterno a trasmettere i propri geni attraverso un neonato “grosso”in grado di sopravvivere
Ciclo dell’imprinting genomico 1- Imprinting paterno /materno presente via metilazione alla fertilizzazione 2- rapida fase di demetilazione postfertilizzazione esclusi i loci imprintati nell’inner mass che è conservata fino allo stadio di blastocisti 3-l’imprinting paterno/materno è mantenuto dopo la fertilizzazione e si trasmette in ciascuna divisione cellulare successiva. 4-demetilazione globale genomica, inclusi i loci imprintati, nelle PGC = cancellazione dell’imprinting (2°-4° settimana di sviluppo all’arrivo delle PGC nel genital ridge) 5- rimetilazione negli spermatogoni –spermatozoi maturi con restaurazione imprinting paterno 6- negli ovociti il processo di rimetilazione si completa solo all’ovulazione
Sindrome di Beckwith-Wiedemann (BWS) (OMIM 130650) Sindrome con iperaccrescimento Classicamente definita dalla triade Onfalocele macroglossia macrosomia Prevalenza 1:13.700 nati vivi
BWS e.....dintorni…
1-fecondazione assistita/infertilità 2-meccanismi patogenetici noti, locus classico 11p15 3-nuovi meccanismi patogenetici locus 11p15: microduplicazione materna e alterato assetto istonico 4-perdita di metilazione a loci multipli materni imprintati HIL 5-anomalie di imprinting 11p15 per mutazione di geni su altri cromosomi 6-sindromi BWS-like da riarrangiamenti genomici senza anomalie imprinting
1-Gravidanza medicalmente assistita (ART) e BWS Segnalata in letteratura l’associazione tra tecniche di riproduzione assistita (ART) e anomalie epigenetiche di imprinting incidenza BWS post ART 1: 4000 vs 1:13.700 popolazione generale 6 of 149 cases reported from a British BWS registry (J Med Genet 2003; 40: 62-64) IC2 epimutations (KvDMR1 loss of methylation) in 24 of the 25 children with BWS post ART tested. Ann Endocr 2010 on line Imprinting disorders and ART Curr Opin in Endocrinol, diabets & obesity 2010
Macrosomia macrocrania Lieve emiiperplasia BWS frusta In neonato FIVET Equivalente dei “large offspring “da ART dei bovini-ovini manipolazione embrionale preimpianto possibile causa di disturbo dell’imprinting per perdita di metilazione KvDM/IC2 con ridotta espressione del gene materno growth suppressor CDKN1C Maher et al, Hum Molec Genet 14, 133-138, 2005.
BWS
BWS post ART
IC2 LOM
IC2 ipometilation
Difetti di imprinting e ART Tierling S et al. Assisted reproductive technologies do not enhance the variability of DNA methylation imprints in human. J Med Genet. 2010 Jun;47(6):371-6. Epub 2009 Nov 30. Owen CM et al. Imprinting disorders and assisted reproductive technology. Semin Reprod Med. 2009 Sep;27(5):417-28. Epub 2009 Aug 26.
Dati della letteratura non univoci
E’ l’infertilità stessa, che richiede ART, la causa e/o l’effetto di difetti di imprinting ??
Imprinting e subfertilità DKanber3, A. Poplinski1, F. Tüttelmann2, J. Gromoll1
Idiopathic male infertility is strongly associated with aberrant methylation of MEST and IGF2/H19 ICR1 International Journal of Andrology 33: 642–649, 2010 Horsthemke B, Gross S, Katalivic A, Sutcliffe A, Varon R, Ludwig M Subfertility is associated with an increased risk of conceiving a child with an imprinting defect. Am J Hum Genet 113; 40,2004 Ludwig M,Katalinic A, Greb S, Sutcliffe A, Varon R, Horsthemke B Increased prevalence of imprinting defects in patients with Angelman sydrome born to subfertile couples. J Med Genet 42:289, 2005
2-Meccanismi patogenetici classici Cluster 11p15.5 Regolazione normale dei due cluster imprintati IC2 e IC1 Silenziato
Silenziato
Fattore di crescita espresso dal cromosoma paterno
Silenziato
ICR2 è il promoter di KCNQ1OT1 gene non codificante contenuto all’interno del gene KCNQ1. IC2 è metilato sul l’allele materno e KCNQ1OT1 è silenziato mentre CDKN1C è espresso
Silenziato
Oncosoppressore espresso solo dal cromosoma materno
Eterogeneità molecolare difetti classici locus 11p15
1. Anomalie metilazione IC2 (50%) 2. UPD11 paterna (20%) 3. Anomalie metilazione IC1 (5-10%) 4. Inversioni, delezioni, traslocazioni (2%) IC1/IC2 5. Mutazione puntiforme CDKN1C in IC2 (10%)
Sottogruppi molecolari noti
Ipermetilazio ne DMR1 4%
Mutazione di CDKN1C 10%
UDP paterna 20%
Duplicazione paterna 1%
Traslocazion e/Inversione materna 1% Ipometilazion e DMR2 50%
Sconosciuti 14%
Anomala Metilazione IC2
Normale
Loss of maternal methylation IC2
Espressione biallelica di KCNQ1OT1 e assente trascrizione dell’oncosoppressore CDKN1C
50%
Anomala Metilazione IC1
Normale
Gain of Methylation IC1
Espressione biallalica di IGF2 + Assente espressione di H19
5‐10%
Disomia Uniparentale Paterna
Normale
UPD 11 pat
Assente trascrizione dell’oncosoppressore dal cromosoma materno
+
Espressione biallalicadi IGF2 + Assente espressione Oncosoppressore materno
20%
Principali quadri epigenetico-clinici BW,locus 11p15.5 Ipometilazione IC2
UPD 11
Macrosmia Macroglossia No tumore di Wilms Epatoblastoma Neuroblastoma
Difetti di parete addominale -
Gastroschisi Onfalocele Ernia ombelicale Diastasis recti Macroglossia
Macrosomia emiperplasia Macroglossia estrema Visceromegalia Wilms e epatoblastoma
Ipermetilazione IC1
Macrosomia spiccatissima Macroglossia e macrostomia Nefromegalia Wilms e epatoblastoma
Correlazione epigenotipo /rischio oncologico BWS locus 11p15.5
Metanalisi su 580 pazienti 55 hanno sviluppato neoplasie Gruppo I (50%)
LOI IC2, ipometilazione KvDMR1 CDKN1C
4%
Gruppo II (2-7%)
LOI IC1, ipermetilazione H19
37%
Gruppo III (20%)
LOI H19 e KvDMR1 CDNK1C (UPD11p15)
25%
Gruppo IV (15%)
pattern metilazione normale
13%
Rump P, Zeegers MP, van Essen AJ. Tumor risk in Beckwith-Wiedemann syndrome: A review and meta-analysis. Am J Med Genet A. 2005 ;136:95-104.
Anomalie genomiche locus 11p15
Duplicazioni allele paterno
Inversioni/Traslocazioni/Delezioni allele materno
1‐2%
Microdelezione IC1
Partial deletion of the H19 imprinting center in two families, leading to IGF2 overexpression. Sparago A, Cerrato F, Vernucci M, Ferrero GB, Silengo MC, Riccio A. Microdeletions in the human H19 DMR result in loss of IGF2 imprinting and BWS. Nat Genet. 2004;36;958-60.
Le delezioni in IC1 sono effetto della ricombinazione tra sequenze omologhe contenenti siti-target per CTCF e causano ipermetilazione di DMR1 La penetranza del fenotipo dipende dal numero di CTCF perdute a causa della ricombinazione CTCF sono “chromatin insulator” che si legano all’IC1 non metilato permettendo l’azione dell’”enhancer” e l’espressione di H19
enhancer
BWS da mutazione mendeliana senza epigenotipo Mutazioni CDKN1C
10% (50% delle forme ereditarie)
Mutazioni CDKN1C
Look for first, not only in BWS with cleft palate (as previously described) but also in BWS patients presenting with polydactyly, extra nipple and/or genital anomalies” Romanelli V et al. CDKN1C (p57(Kip2)etc Am J Med Genet A. 2010 152A(6):1390-7
Fenotipo della sindrome di Simpson- Golabi-Behemel di Glypican3 Notevole overlap clinico con BWS da mutazione CDKN1C Macrosomia Macroglossia Palatoschisi (occasionale) Onfalocele Capezzoli sovrannumerari Dismorfismi facciali Brachidattlia Polidattilia Nefromegalia Epatomegalia Età ossea avanzata Ritardo mentale Rischio oncologico ( 10% circa) per : Wilms epatoblastoma neuroblastoma gonadoblastoma
3a-Nuovo meccanismo molecolare 11p15 in BWS familiare Duplicazione materna della regione 11p15 che include parte di CDKN1C, ICR2 e 20kb del 5’ di KCNQ1OT1
La trasmissione materna della duplicazione
Perdita di metilazione ICR2, espressione della proteina tronca KCNQ1OT1 e fenotipo BWS da perdita di metilazione IC2
Microduplicazione IC2
A
B
Fig. A-B:The proband at 1 year of age. typical BWS features as macroglossia with mandibular prognathism, and surgically corrected congenital omphalocele. Hypotonia and retarded motor development are possibly due to premature birth complications. C: The mother of the proband shows the abdominal scar tissue as a consequence of the surgical correction of the large umbilical hernia she underwent soon after birth. She had mild dysmorphic features as prognathism
C
Microduplicazione IC2 I 1
II
2
3
5
6
7
III 1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
7
6
Pedigree. Individuals carrying the mutation and showing BWS phenotype are represented as black circles and squares. Individual n. I.5 carries the microduplication, but she doesn’t show any phenotype . (paternal transmission of the duplication)
Microduplicazione IC2
Expected duplication from MSMLPA SNP-array 166kb duplication (2.656.737-2.822.824)
Black bars represent the microduplication extension after MSMLPA experiment, redefined by SNP array analysis. The microduplication comprises ICR2 and the 5’ part of KCNQ1OT1 and is in cis as revealed by FISH.
Microduplicazione parziale ICR2 Analisi del pattern di metilazione con MS-MLPA 1,0
KVDMR 132 nt
IC2
KVDMR 164 nt
0,5
KVDMR 274 nt KVDMR 392 nt
0,0 proband
mother
granmother
uncle
father
unaffected sister
1,0
Histogram bars represent 4 probes for the KVDMR (ICR2) domain: in the proband as in her mother, granmother and maternal uncle, there is a slight hypomethylation, while in her father and in the unaffected sister methylation index is around 0.5.
H19DMR 177 nt
IC1
H19DMR 182 nt
0,5
H19DMR 236 nt H19DMR 300 nt
0,0 proband
mother
granmother
uncle
father
unaffected sister
Histogram bars represent 4 probes for the H19DMR (ICR1): all family members had normal values of methylation index around 0.5, suggesting no hypermethylation.
3b- Nuovo meccanismo patogenetico al locus 11p15.5 BWS
Ruolo delle modificazioni locali degli istoni e del legame CTCFcoesina nelle anomalie di imprinting ICR1 H19/IGF2 La sovrastruttura della cromatina (in aggiunta alla metilazione )gioca un ruolo nell’anomalia epigenetica al locus H3K9me3/H4K20me3 è normalmente associato con la normale metilazione ICR1pat H3K4me2/ H3K27me3 + H2K9ac-CTCF coesina – normale ipometilazione ICR1 mat nei paz BWS si osserva un assetto istonico H3K9me3/H4k20me3 anceh sul cromosoma materno con guadagno di metilazione L’opposto avviene nei SRS Nativio R,Riccio A et al Hum Mol Genet 2011, 20, 1363-1374 5 casi BWS con ipermetilazione IC1
Anomalia della conformazione cromatinica e perdita imprinting materno ICR1
Il legame CTCF-coesina/ICR1 blocca l’interazione tra le due CTCF fiancheggianti il locus. ICR-metilato con assetto istonico paterno si associa alla CTFC a valle sequestrando l’enhancer con conseguente iperespressione di IGF2 e BWS
4-Nuovo meccanismo molecolare della BWS (e SRS)
Ipometilazione di geni multipli materni imprintati : MEST HIL PLAG1 IGFR2 IGFR2R KvDMR IC2 KCNQ1OT1 H19 Gnas/NESPAS GRB10 Ipometilazione sia parziale che completa : possibile origine postzigotica del difetto di metilazione
DNA METHYLTRANSFERASE 3-LIKE PROTEIN; DNMT3L gene candidato come
trans-
acting factor (nl topo è responsabile dell’imprinting materno) non osservate
mutazioni patogenetiche nei 2 BWS con ipometilazione completa
Nuovo meccanismo molecolare BWS
Perdita di metilazione di loci multipli imprintati materni (HIL) Older sister
TNDM a
Younger sister
BWS a
Prenatal growth retardation
+
+
+
Overgrowth
Postnatal growth
Overgrowth
+++
-
Overgrowth
Preterm delivery Polyhydramnios Large placenta Neonatal hyperglycaemia Failure to thrive first 6 months Macroglossia
Oligohydramnios +
+
-
+ + +
+
+
+
Hypoglycaemia
-
+++
++
-
+
+
+
+
Abdominal wall defect +
+
+
+
Hemihypertrophy Cardiomyopathy
-
+
-
+ (+)
Postaxial polydactyly
+
-
-
(+)
Psychomotor retardation
+
+++
-
(+)
Diabetes later in life
+
Not known
+
-
Un subset di pazienti BWS (17 su 81) con perdita di metilazione materna IC2 presenta ipometilazione a loci multipli iperaccrescimento postnatale Correlazione genotipo-fenotipo meno macrosomici spesso prematuri difficoltà alimentazione ritardo psicomotorio Bliek J ,Riccio A Eur J Hum Genet 17:611-619,2009 e del linguaggio
5- BWS da mutazione di geni non 11p15.5 con anomalie dell’imprinting della regione
1-Mutazione del gene NLRP2 su 19q13 che influenza a distanza l’imprinting di 11p15.5. Ipometilazione IC2 2- Mutazione di geni che influenzano a distanza l’imprinting 11p15.5 al locus 18q22-23 Perdita di metilazione IGF2
5-1 Mutazioni NLRP2 (NALP2) locus 19q13 Caratteristiche tipiche della sindrome: macroglossia, macrosomia, ernia ombelicale, polidramnios tritest positivo per HCG, gravidanze molari precedenti, ipoglicemia
2 figli affetti con differenti alleli 11p15 (cosa che esclude un meccanismo in cis) presentano ipometilazione IC2 e normale metilazione IC1 e senza anomalie genomiche ai CGH array in una famiglia con complicata consanguineità
Riscontro di zona ad elevata omozigosità su 19q13.4 contente i geni NLRP2 eNLRP7. Successivo sequenziamento ha evidenziato mutazione frameshift inattivante di NLRP2 omozigote nella madre e in uno dei due probandi ed eterozigote nel secondo I due affetti presentano perdita di metilazione materna ICR2 che è assente nel soggetto sano che pure è portatore eterozigote della mutazione NLRP2
.
NLRP2 ha ruolo nello stabilire/mantenere l’imprinting genomico e lo stato di metilazione di IC2
NALP proteins, such as NALP2 and NALP7 , are characterized by an Nterminal pyrin (608107) domain (PYD) and are involved in the activation of caspase-1 (CASP1; 147678) by Toll-like receptors (see TLR4; 603030). Chromosome locus 19q13.4 1° segnalazione di effetto in trans di NALP2 sulla metilazione locus 11 p15.5 Meyer E, Lim D, Pasha S, Tee LJ, Rahman F, Yates JR, Woods CG, Reik W, Maher ER. Germline mutation in NLRP2 (NALP2) in a familial imprinting disorder (Beckwith-Wiedemann Syndrome). PLoS Genet. 2009 5(3):e1000423
Mutazioni germinali di NALP7 in forme familiari di mola idatiforme
Fenotipo BWS-like in paziente con delezione 18q22 (23 )e perdita di imprinting IGF2 Fenotipo BWS con macroglossia e perdita di imprinting IGF2 in paziente con delezione 18q
trans-activating regulator element for maintenance of IGF2 imprinting su 18q2223 ???? Brewer CM, et al Beckwith-Wiedemann syndrome in a child with chromosome 18q 22.1 deletion. J Med Genet. 1998 35:62-4. Rivalutato in Lirussi F et al :delezione con minimo overlap con quella del 2° paziente senza difetto di imprinting. AJMG 143 A 2796-2803,2007
Circa il 15 dei soggetti BWS non manifesta anomalie genetiche o epigenetiche pur in presenza di fenotipo e criteri clinici di BWS: Questo gruppo di pazienti include: 1.
Mosaicismo UPD confinato (positività solo su biopsia tissutale)
2. Overlapping clinico con altre sindromi con iperaccrescimento 3. Sindromi con iperaccrescimento BW-like da riarrangiamenti genomici 4. Meccanismi molecolari non ancora noti “The investigation of the role of other loci and the complexities of higher-order imprinted gene regulation will be important avenues for further elucidation of the molecular basis of BWS” Choufani S, Shuman C, Weksberg R. Beckwith-Wiedemann syndrome. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 2010 Aug 15;154C(3):343-54.
BWS senza difetti genetici/epigenetici rilevabili da mosaicismo tissutale per UPD 11p paterna Alti livelli di pUPD 11p15 correlano con fenotipo classico e severo, rischio estremamaente elevato di tumore. Se analisi negativa sul sangue, possibile ricercare positività su biopsia tissutale
Smith AC, Shuman C, Chitayat D, Steele L, Ray PN, Bourgeois J, Weksberg R. Severe presentation of Beckwith-Wiedemann syndrome associated with high levels of constitutional paternal uniparental disomy for chromosome 11p15. Am J Med Genet A. 2007 Dec 15;143A(24):3010-5. Mussa A, Ferrero GB, Ceoloni B, Basso E, Chiesa N, De Crescenzo A, Pepe E, Silengo M, de Sanctis L. Neonatal hepatoblastoma in a newborn with severe phenotype of Beckwith-Wiedemann syndrome. Eur J Pediatr. 2011
BWS con molecolare negativa –Overlapping clinico con altre sindromi con iperaccrescimento Cutis Marmorata Telangiectatica Congenita (CMTC)
Simpson–Golabi– Behmel
Sotos
Sotos
Costello
Perlman
Sovrapposizione fenotipica nelle più comuni sindromi con iperaccrescimento
SOTOS WEAVER Fenotipo faciale Convulsioni Malformazioni SNC Scoliosi
Difficoltà di suzione Emipertrofia Anomalie renali congenite Dilatazione ventricolare
BWS Nevo flammeo faciale prognatismo
Idramnios Ipoglicemia Iperaccrescimento pre e post natale Anomalie cardiache congenite Difetti parete addominale Ipotonia congenita Età ossea avanzata Macroglossia Pectus escavatum Omfalocele Displasia ungueale Sviluppo NPI normale Rime oculari oblique Visceromegalia Polidattilia Neoplasie
Aspetto caratteristico Capezzoli sovrannumerari Difetti di segmentazione vertebrale Difetti diaframmatici
SGBS
Sindromi con iperaccrescimento BW-like da riarrangiamenti genomici Gruppo di casi eterogenei fenotipicamente e geneticamente Genotipicamente classificabili in Forme con alterazione secondaria dei centri di imprinting della BWS es. delezione 18q22-23
Alterazione metilazione assente
Genotipo e rischio oncologico assimilabile al rispettivo gruppo di BWS classici
Genotipo ampiamente eterogeneo (BWS-”plus”), frequente il ritardo mentale, e rischio oncologico non stimato
Ai CGH array si riscontra un’alta frequenza di CNVs in pazienti con iperaccrescimento sindromico di difficile inquadramento o con fenotipoBWS-like Anomalie potenzialmente causative sono state riscontrate in 7/93 pazienti (7.5%)
Malan V et al. Array-based comparative genomic hybridization identifies a high frequency of copy number variations in patients with syndromic overgrowth. Eur J Hum Genet. 2010 18(2):227-32
Fenotipo BWS-like in delezione 1q41-42 Occasionale descrizione di altri casi con macroglossia visceromegalia, palatoschisi . Ritardo costante
Casi personali senza anomalie di metilazione 11p15.5
Sindrome Beckwith-Wiedemann-like macrosomia, macroglossia, ernia ombelicale, ipoglicemia neonatale Caso personale Delezione 7p15-7p12 che include il gene imprintato GRB10
Duplicazione dello stesso gene per disomia uniparentale materna 7 da origine alla sindrome di Silver-Russell
Del 7p12-13 La delezione include GRB10 (growth factor receptor - bound protein 10, 7p12-11.2), gene imprintato implicato nell’accrescimento. .
Naik S. Large de novo deletion of 7p15.1 to 7p12.1 involving the imprinted gene GRB10 associated with a complex phenotype including features of Beckwith Wiedemann syndrome. Eur J Med Genet. 2011 Jan-Feb;54(1):89-93.
Fenotipo BWS-like in paziente con delezione 12q24.31 Macrosomia, macroglossia, ernia ombelicale, ipoglicemia da iperinsulinismo neonatale Gene HNF1 mappato sulla delezione coivolto nel metabolismo glucidico
Baple E et al A microdeletion at 12q24.31 can mimic BWS neonatally Mol Syndromol 1:42-46,2011
Fenotipo BWS-like in paziente con delezione 18q23 senza anomalia imprinting 11p15.5
3.8-5.6 Mb di overlap con la delezione del paziente con il difetto di imprinting
Ipotesi : Forma di macroglossia BWS-like recessiva delezione paterna + mutazione sull’allele materno ?
Lirussi F et al. Beckwith-Wiedemann-like macroglossia and 18q23 haploinsufficiency. Am J Med Genet A. 2007 Dec 1;143A(23):2796-803.
Stessi criteri di selezione clinica per difetti imprinting e riarrangiamenti ?? genomici ?? Anomalie dell’accrescimento pre e post-natale
segno maggiore
Malformazioni e dismorfismi Ritardo mentale –epilessia
segno frequente segno sindrome-specifico
Razionale
1-Arrays-CGH identificano alta frequenza di CNV in pazienti con iperaccrescimento. Malan V et al. EJHG 18:227-232,2010 2-Anomalie genomiche in sindromi BWS-like, SRS-like ,PW-like
Investigation of 90 patients referred for molecular cytogenetic analysis using aCGH uncovers previously unsuspected anomalies of imprinting† Rebecca L. Poole1,2,*, Emma Baple3, John A. Crolla2,4, I. Karen Temple1,5, Deborah J.G. Mackay AJMG 152A :1990-1993,2010 Methylation analysis was performed at 13 imprinted loci [PLAGL1, IGF2R, MEST, GRB10, H19, IGF2 DMR2 ,KCNQ1OT1 (KvDMR), MEG3, SNRPN, PEG3, GNAS,-NESPAS 6/90 have a methylation defect,
1 difetto metilazione KvDMR e BWS 2 difetto metilazione IGF2R e SRS-like phenotype
Conclusioni • Progressiva delineazione di correlazioni epigenotipogenotipo-fenotipo nelle sottoclassi ICR1,ICR2, pat UPD, mut CDKN1C, ipometilazione di geni multipli materni (HIL) consente di “scorporare” i casi BWS classici in 5 diverse sindromi cliniche
• L’utilizzo degli array CGH ha consentito la definizione di numerosi casi BWS-like e sottende interessanti prospettive per l’inquadramento delle forme di iperaccrescimento sindromico.
Il gruppo di genetica clinica pediatrica università di Torino
Grazie dell’attenzione
