UNIVERSITE
FACULTE
DE
DE
MEDECINE
PARIS
DE
PARIS
-
SUD
ANNEES - 1972 / 73 / 74
THESE POUR LE DOCTORAT EN BIOLOGIE
HUMAINE
par Humberto GOMES DE OLIVEIRA ( P r o f e s s e u r de Biophysique à la Faculté de Médecine de V a l e n ç a ) Rio de Janeiro - Brésil
Travail de r e c h e r c h e r é a l i s é à l'Institut de e a * c é r a L o g f ë et d'Immunogénétique (ICTG) - Villejuif - France
I C I G - 7 3 , UN NOUVEL A D J U V A N T DANS LA MACHINERIE IMMUNITAIRE
Thèse présentée et soutenue publiquement
INSTITUTO D E ENERGIA ATÔMICA
II
AU GOUVERNEMENT FRANÇAIS EU M i n i s t è r e des A f f a i r e s E t r a n g è r e s , au M i n i s t è r e de la Santé et de la Sécurité S o c i a l e , à 1' U . E . R . - M é d i c a l e de 1 ' U n i v e r s i t é de P a r i s - S u d , au C e n t r e International des Etudiants et Stagiaires 1
et à la C i t é Internationale de l U n i v e r s i t é de P a r i s ,
Ma profonde r e c o n n a i s s a n c e .
III
A MONSIEUR LE PROFESSEUR GEORGES MATHE D i r e c t e u r de l'Institut de C a n c é r o l o g i e et d ' I m m u n o g é n é t i q u e , Professeur de C a n c é r o l o g i e Expérimentale à la Faculté de Médecine de Paris-Sud, Chef du S e r v i c e d ' H é m a t o l o g i e de 1 ' Institut Gustave Rous et M e m b r e de 1 ' Organisation Européenne de Recherche sur l e Traitement du Cancer (O.E.R.T.C.)
Pionnier français de l ' I m m u n o l o g i e , auquel j e rends hommage ainsi qu'à son équipe de Villejuif - FRANCE.
IV
A L'AGENCE INTERNATIONALE DE L'ENERGIE ATOMIQUE ( I . A . E . A . ) ( Vienne - A u t r i c h e )
C h a r g é e de ma formation scientifique à l ' U n i v e r s i t é de LIEGE et au S e r v i c e m é d i c a l du C e n t r e de l ' E n e r g i e N u c l é a i r e de M O L , en BELGIQUE,
Mes
remerciements.
V
DEUTSCHER AKADEMISCHER AUSTAUSCHDIENST DER HAUPTGESCHAFTSFUHRER ( Bonn - A l l e m a g n e F é d é r a l e )
Chargé de mon stage scientifique au M A X - P L A N C K INSTITUT FUR BIOPHYSIK ( Frankurt/M ) et au RADIOLOGISCHES INSTITUT DER UNIVERSITÄT - F r e i b u r g ,
mes r e m e r c i e m e n t s .
VI
A L'ORGANISATION DES NATIONS UNIES POUR L ' E D U C A T I O N , LA SCIENCE ET LA CULTURE -
U.N.E.S.C.Q. ( Paris - FRANCE )
C h a r g é e de mon P r o g r a m m e d'entraînement en Biophysique 1' ACADEMIE DES SCIENCES DE I ' U . R . S . S . - M o s c o u ,
Mes
remerciements.
VII
A LA VILLE DE VALENCA ( Rio de J a n e i r o - B r é s i l ) à la Fundacao Educacional Dom A n d r é A r c o v e r d e , à la D i r e c t i o n de la Faculté de Médecine de Valença et ses Etudiants, à l ' A c a d é m i e Valencienne des L e t t r e s ,
Mes
hommages.
VIII
A MANNE, mon Epouse
A v e c toute mon affection.
IX
A JOSEPH DE CHENELLE,
Une Mission a c c o m p l i e .
X
C e t r a v a i l de thèse comporte : I - RESUME II - INTRODUCTION III - MATERIEL ET METHODES I V - RESULTATS V - CONCLUSIONS V I - REFERENCES
I - RESUME Le titre de la substance que j ' a i utilisée dans mes r e c h e r c h e s ,
c'est
ICIG - 73 - le s i g l e de l'Institut de C a n c é r o l o g i e et d'Immunogénétique ( ICIG ) 1
et de 1 'année 1973, date de l achèvement de c e t r a v a i l conçu et mis au point par moi-même. ICIG-73 intéresse l e domaine de la Cancérologie y c o m p r i s l ' I m m u n o l o g i e . Les résultats obtenus confirment q u ' i l s ' a g i t d'un A D J U V A N T de l ' i m m u n i t é . L'application thérapeutique c o n c e r n e r a l e comportement immunologique des o r g a nismes cancéreux, et l e coût s e r a assez b a s .
II - INTRODUCTION ICIG - 73 est un compose d'Edestine avec le cation Ca Le choix du Calcium c o m m e un stimulant des lymphocytes thymiques est justifié par le fait que cet élément est le principal régulateur de la prolifération de ces cellules in v i v o (Balk, Mac M anus, P e r r i s , Rixon, Weiss et W h i t f i e l d ) . Le comportent Edestine ( Boussangoult, Chibnall, D a n i e l s s o n , Liebig, Quensel, Sandegren et S a v e r b o r n ) est une p r o t é i n e , globuline d ' o r i g i n e v é g é t a l e .
XI
8
On peut 1 e x t r a i r e d'une plante monocotylédone - 1' ORGE. Par ultracentrifugation des extraits des grains d ' o r g e , et après d i a l y s e , l'Edestine est p r é c i p i t é e sous f o r m e c r i s t a l i n e . A p r è s l e s é c h a g e , on obtient une poudre, c o m p o s é e de cristaux m i c r o s c o p i q u e s . D è s 1937, QUENSEL et SVEDBERG ont o b s e r v é l ' h é t é r o g é n é i t é de la fraction !
" Albumine globuîine " de l ' o r g e , soumise à 1 ultracentrifugation» Poursuivant sur la globuîine - Edestine de l ' o r g e , QUENSEL, à 1942, a mis au point un fractionnement de l ' e x t r a i t de chlorure sodique d ' o r g e par l e sulfate d ' a m m o n i u m , contrôlé par ultracentrifugation à 68.000 tours par minute. QUATRE CONSTITUANTS ONT ETE IDENTIFIES - P r é c i p i t é jusqu'à 15 p . 100 de saturation en sulfate d'ammonium : beta globuîine; - P r é c i p i t é entre 40 et 70 p* 100 de saturation en sulfate d'ammonium : alpha, g a m m a et delta g l o b u î i n e . CARACTERISTIQUES DE CES CONSTITUANTS - Alpha globuîine, poids m o l é c u l a i r e - Beta globuîine
"
"
-
- Gamma globuîine
"
"
_
~ Delta globuîine
"
"
-
-
-
-
-
26.000, pH = 5 100.000, pH = 4.9
_
_
_
-
-
_
166.000, pH = 5.7 300.000, pH = ?
CARACTERISTIQUES DE I ' EDESTINE 1 - Présentation -- poudre à cristaux microscopiques 2 - Solubilité - en solution isotonique de chlorure de sodium 3 - Poids moléculaire - 50.000 4 - Toxicité - nulle 5 - Structure chimique - c o m p o s é e en 18 acides aminés 6 - Riche en globuîine - alpha, beta, gamma et delta, par o r d r e croissant de leur masse m o l é c u l a i r e . 7 - Existant sur l e marché : a ) U S A , Sigma C h e m i c a l C o . ; b ) FRANCE, Union Chimique Française
Paris»
xri
-
TABLEAU I ( Chitman, A . C
ANALYSE DE L'EDESTINE
FRACTION
MERCAPTLDE
WT. A S % OF EDESTINE
PRECIPITATES
HUM IN
-
-
-
-
-
-
1.16
CYSTINE
-
-
-
-
-
-
1.37
METHIONINE A N D TYROSINE
-
1.44
CRUDE TYROSINE-
-
-
4.13
GLUMATIC ACID -
-
ASPARTIC A C I D
-
-
-
-
11.95
AMMONIA
-
-
-
-
-
2.36
ARGININE
-
-
-
-
-
11.69
HISTIDINE
-
-
-
-
-
2.39
-
2 „32
MONOAMINO - ACIDS, crop 1
8.61
MONOAMINO - ACIDS, crop 2
4.17
M O N O A M I N O - ACIDS , c r o p 3
12.32
M O N O A M I N O - A C I D S , crop 4
19,56
LYSINE
PROLINE -
-
-
-
-
-
-
20.50
-
-
-
-
-
3.23
XIII
- TABLEAU II -
( Chibnall, A . C )
STRUCTURE CHIMIQUE DE L'EDESTINE
PERCENTAGE OF A M I N O - A C I D GIVEN ON HYDROLYSIS
A M I N O - ACID :
ARGENTINE
-
-
-
-
-
-
HISTXDINE
-
-
-
-
-
-
2.41
-
-
-
-
-
-
2.37
-
-
-
-
-
-
4.34
-
-
1.50
LYSINE
-
TYROSINE TRYPTOPHAN
-
METHIONINE
-
-
16.71
-
_
-
-
_
2.35
GLUTAMIC A C I D
-
-
-
-
20.70
ASPARTIC A C I D -
-
-
-
-
12.10
AMMONIA
-
-
-
2.15
-
-
AS RESIDUES BEFORE HYDROLYSIS :
GLUTAMIC A C I D
-
GLUTAMINE
- ASPARTIC ACID
-
ASPARAGINIC.
>
xrv
LA SOLUBILITE DE L ' I C I G - 73 DANS LES SOLUTIONS DE CHLORURES
( Chibnall, A . C . )
XV
III - MATERIEL ET METHODES
Deux recherches ont été poursuivies en vue de v é r i f i e r 1 ' action de 1 ' ICIG -73 , in v i t r o et in v i v o . 1 - IN VITRO Protocole - 0 — Expérience : ICIG - 73 sur une culture de l e u c é m i e L - 1210 - Date : l e 20 Septembre 1973. 5
a ) Inoculer des flacons avec 2 x 10 de cellules L - 1210/ml de milieu dans un volume total de 5 m l ; b ) P r é p a r e r 12 flacons; c ) A 3 flacons ajouter l ^ g / m l de l ' I C I G - 73 (concentration finale) ; d ) A 3 flacons ajouter 5 ^ g / m l de l ' I C I G - 73; e ) A 3 flacons ajouter 10 y g / m l de l ' I C I G - 73; f ) 3 flacons à g a r d e r c o m m e t é m o i n s . Tous les jours bien m é l a n g e r les cellules et p r é l e v e r 0.1 ni 1 de chaque flacon pour compter au bleu do trypan. A r r ê t e r l e comptage lorsque les témoins a r r i v e n t au plateau ( 2 jours consécutifs avec le m ê m e c o m p t a g e ) .
2 - M VIVO Protocole - 1 -
Expérience : A c t i o n de l ' I C I G - 73 sur la l e u c é m i e L - 1210
4
chez la souris D B A / 2 . La L - 1210
est une l e u c é m i e lymphoblastique, chimio - induite
par le methylcholantrene chez les souris D B A / 2 .
XVI
Cette l e u c é m i e est g r e f f é e aux souris D B A / 2 ou aux hybrides D B A / 2 . Il y a deux méthodes de g r e f f e s . La f o r m e d ' a s c i t e - après l e p r é l è v e m e n t n é c e s s a i r e , les c e l l u l e s leucémiques sont infectées par voie intrapéritoneale ( IP ) ; la f o r m e solide - l ' i n j e c t i o n des c e l l u l e s leucémiques est faite par voie souscutanée ( SC ) . Les essais comportent t r o i s étapes :
1er Test
L'évaluation de la toxicité du produit, en recherchant la DL/50;
2ème Test L'évaluation sirrultanée de la fiabilité du test de la D L / 5 0 aiguë et la mesure 1
de 1 efficacité du produit sur la L - 1210 ; 3ème Test Confirmation des r é s u l t a t s . 1
L évaluation de la D L / 5 0 aiguë est basée sur la F o r m u l e de KARBER. P a r a m è t r e s de l ' e x p é r i e n c e 1 - Leucémie L - 12,10
4
( l e u c é m i e chimio - induite ) ;
2 - Souris - lignée D B A / 2 - 3 m o i s d ' â g e - f e m e l l e s ; 3 - Début de l ' e x p é r i e n c e - le 8 Septembre 1973; 4 - V o i e d'administration - intrapéritoneale ( IP ) ; 5 - ICIG - 73 - dose - 0.002 g / souris / IP; 6 - N o m b r e total de souris - 60 7 - N o m b r e de groupe - 10
XVII
Observations N o m b r e de groupes - 6 4
T-0
- groupe témoin - sans greffe ( L - 1210 ) ni traitement ( ICIG - 73 ) ;
T-l
- groupe témoin - greffé une seule f o i s , au début ( L - 1210 ) et sans
4
traitement; T-2
- groupe témoin - sans greffe et traité ( ICIG - 73 ) t r o i s fois ;
GR-1 - groupe t r a i t é
- t r a i t é deux fois et greffé à la fin;
GR-2 - groupe t r a i t é
- traité deux fois avec la greffe i n t e r p o s é e ;
GR-3 - groupe t r a i t é
- traité deux fois et greffé au début.
TABLEAU
Jour - 1 ( 8/9/1973 )
x
T-0
x
x
T - l ( L - 1210 )
x
x
T-2 ( ICIG - 73 )
X
( ICIG - 73 )
X
( ICIG - 73 )
GR-1
( ICIG - 73 )
X
( ICIG - 73 )
X
( L - 1210 )
GR-2
( ICIG - 73 )
X
( L - 1210 )
X
( ICIG - 73 )
GR-3
( L - 1210 )
X
( ICIG - 73 )
X
( ICIG - 73 )
-
-
-
4
Jour - 8 ( 15/9/1973 )
x
4
4
4
Jour - 15 ( 22/9/1973 )
2 - IN V I V O Protocole - 2 - E x p é r i e n c e avec une l e u c é m i e virus - induite THYMUS VIRUS GROSS ( T V G ) chez les souris C3HcB/Fe et traitées par l ' I C I G - 7 3 . Paramètres 1 - Culture in v i t r o de THYMUS VIRUS GROSS ( T V G ) passage A ; 2 - Lignée - souris C3HeB/Fe ( sans facteur Bit tuer ) ; 3 - Greffe du TVG - une seule fois à un jour d ' â g e , par voie intrapéritoneale ;
XVIII
4 - Leucémie - 100 % au bout de t r o i s m o i s e n v i r o n .
C h r o n o g r a m m e opérationnel 1
Juin 1973 - naissance de 40 s o u r i s ,
mixte;
2
Juin 1973 - les 40 souris nouvelles n é e s , g r e f f é e s avec THYMUS VIRUS G ROSS ( TVG ) , l m l - v o i e IP;
2
Juin 1973 - 20 souris randomisées ( mixte ) - g r e f f é e s ( TVG ) et sans traitement
( ICIG - 73 ) - Groupe t é m o i n .
25 Juin 1973 - 20 souris randomisées ( mixte ) - g r e f f é e s ( TVG ) et traitées ( ICIG - 73 ) - Groupe t r a i t é . 25 Juin 1973 - Groupe traité = piqué avec ICIG - 73, - 0 . 0 0 2 g / I P ; 9 Juillet I
73 - accouplement dans chaque g r o u p e ;
Août 1973 - apparition de nouvelles nées dans chaque groupe ;
29 Août 1973 - mort du Groupe t é m o i n . 29 Août 1973 - mort des nouvelles nées du Groupe témoin;
I I Octobre 73 - mort du G roupe t r a i t é ;
11 Octobre 73 - descendantes du Groupe t r a i t é - v i v a n t e s .
IV - RESULTATS 1 - IN VITRO Protocole - 0 - Expérience : ICIG - 73 sur une culture de leucémie L - 1210 ( Tableaux I - II - I I I , pages 19 - 20 et 21.) Compte tenu du résultat de cette e x p é r i e n c e , 1' ICIG - 73 n ' a g i t pas sur la courbe de c r o i s s a n c e de la I. - 1210 et ne semble pas a v o i r une action cytostatique.
XIX
* *fï n i
î J i. + ^ ^ f . - f j - ^ i i
i i i j tH
t'
' "~J
H=y 't
1.'
T
t
TABLEAU N ° I
lia',1
T
u ,-J~, i , ,
Courbe de c r o i s s a n c e
L - 1210 + 1CJG - 73
1 « S
44.4'• i
-.-H^i;ti±-t-1-h 1*1
_
4
i±fH.Ï:
-4 h
-M- ,4 4-L—4-t ^ , a ~t-t UXUtt- tt-H-f-H+Tti-t-H t -t-i *- -"i44-ff+r: t ' t -t i- s1]-"1 - -1 1
"I \
J_ Septeftïfcîe 1973 J : L L L .!4"4.;-i-i-.'l.u-l
4 4-t-f-! ^
L
4
* l } 1H ' *IfN 1 i-,
' L4-J4-4
1
une
-f-pr
jours
XX
TABLEAU N " Nombre
2
SOURIS
XXII
2 - m vivo 4
Protocole - 1 - E x p é r i e n c e : Action de 1 ' ICIG - 73 sur la L - 1210 chez les souris D B 2 / 2 . Le Tableau en annexe, page 23 montre les résultats de ces expériences. 1 - Le Groupe témoin - T - 0 , sans greffe ni traitement SURVIE DE 100 % , après 32 jours ; 2 - Le Groupe témoin - T - l , g r e f f é au départ et sans traitement - SURVIE DE 0 , après 32 jours ; 3 - Le Groupe témoin - T - 2 , traité trois fois et sans greffe - SURVIE DE 70 %, après 32 j o u r s ; 4 - Le Groupe traité - GR-1 - traité deux fois avant la greffe - SURVIE DE 100 %, après 32 jours ; 5 - Le Groupe traite ~ GR-2 - , traité avec la greffe interposée - SURVIE DE 80 %, après 32 j o u r s . 6 - Le Groupe traité - G R - 3 , traité deux fois après la greffe - SURVIE DE O , après 32 j o u r s .
2 - I F VIVO P r o t o c o l e - 2 - E x p é r i e n c e avec une l e u c é m i e virus-induite chez les souris C3HeB/Fe et traitées par l ' I C I G - 73. Dans ces e s s a i s , c o m m e montre l e Tableau à la page 24, les résultats sont fort significatifs car la s u r v i e des animaux est d ' o r d r e de 150 % par rapport à la durée de vie du Groupe témoin, m ê m e avec une seule dose de 0.002 g d ' I C I G - 73 au 25 è m e jour d ' â g e . Un fait à r e m a r q u e r : les descendantes de ce Groupe t r a i t é , vivent e n c o r e , sans aucun traitement depuis leur naissance»
XXIII
Le produit ICIG - 73 assure un état immunologique de protection de la tumeur chez ces descendantes.
V - CONCLUSIONS
1 - Les médecins disposent aujourd'hui,
pour le traitement des
c a n c e r s , de t r o i s types de médicaments : a ) ceux de l ' h o r m o n o t h é r a p i e , steroi'des, androgènes, oestrogènes et progestatifs ; b ) ceux de la chimiothérapie non hormonale ou cytostatiques ; c ) ceux de l ' i m m u n o t h é r a p i e , stimulants ou adjuvants " systémiques " de l ' i m m u n i t é .
2 - La stimulation immunitaire par d' adjuvants de l ' i m m u n i t é peut f a i r e r é g r e s s e r une tumeur.
3 - Le praticien doit a v o i r à c o l l a b o r e r avec les unités de d é v e l o p pement thérapeutique qui procèdent à des e s s a i s
d'immunothérapie.
4 - Finalement, le produit ICIG - 73 se c o m p o r t e c o m m e un A D J U V A N T de l ' i m m u n i t é .
XXIV
REFERENCES
1 - ANDERSON, J. and c o l l . - J. Exp. M e d . - 137 - 1973 2 - BOUSSANGOULT - A g r o n o m i e - C h i m i e a g r i c o l e et Physiologie Paris - M a l i e t , 3 v o l s . - 1860 3 - CHIBNALL, A . C . - Protein - metabolism in plant - London H . M i l f o r d - 1939 4 - CHIBNALL, A . C . - P r o c . Royal S o c . - London, s e r i e s B - 1942 5 - CHIBNALL, A . C . - Bioch. J . ,
37 - 1943
6 - DANTELSSON, C E . and SANDEGREN, E. - A c t a e h e m . scand. I - 917 - 1947 7 - GARATTINI, S. and c o l l s . - Europ. J. C a n c e r , v o l . 8 , p p . 185 - 196 Pergamon Press - Great Britain - 1972 8 - HOGG, N . M . and GREÄVES, M . F . - Immunol. 22 - 1972 9 - LIEBIG, J. - C h i m i e organique appliquée à la Physiologie animale et à la Pathologie - 1 v o l . - Paris - 1842 10 - MAC M A NU S, J . P . and WHITFIELD , J . F . - Exptl. c e l l . r e s . ( 5 8 ) - 1970 11 - MANUEL M OD O LE LL and c o l l s . - Freiburg - Germany and MONIQUE PARENT Institut Pasteur - Paris - Thèse - 1973 12 - MA THE, G . et c o l i s . - R é v . F r a n c . Etudes C l i n , et Biol. , n° 9 - v o l . X1TI 881 - 883 - 1968 13 - M A THE, G . et c o l i s . - R é v . F r a n c . Etudes C l i n , et Biol. - v o l . X I I I 695 - 696 - 1968 14 - MA THE, G . et c o l l s . - The British Journal of Cancer - v o l . X X I I I p . 814 - 1969 15 - MA THE, G . - The Lancet - pp. 697 - 699, A p r i l , 5 - 1969 16 - MATHE, G . - Advances in Cancer R e s e a r c h , v o l . 4 - 1971 17 - MA THE, G . - Ext. V o l . T h é r a p . Entretiens Bichat - p p . 133 - 135 - 1971 18 - MA THE, G . et c o l i s . - La Nouvelle P r e s s e M é d i c a l e - I , n° 26 24 Juin 1972
XXV
REFERENCES
19 - MUNDER, P . G . and c o l l s . - J. Immunol. - 3 - in press - 1973 20 - MUND ER, P . G . and c o l l s . - Non - specific factor influencing host r e s i s t a n c e - Edit, by V . Braun and J. Ungar K a r g e r - Basel - 1973 21 - PARANT, M . and CHEDLD, L . - " In recent resultats in Cancer Research - Investigation and Stimulation of Immunity in Cancer Patients " - Springer V e r l a g , in p r e s s - 1973 22 - PERRIS, A . D . , WEISS, L . A . and WHITFIELD , J . F . - Arn. J. P h y s i o l . 220 - 1971 23 - QUENSEL, O . - Untersuchungen über die Gersten Globuline - Uppsala A l m q u i s t und Wikseils - 1942 24 - RIX O N , R . H . and WHITFIELD, J . F . - J. c e l l , p h y s i o l . 79 - 1972 25 - RIX O N , R . H . and WHITFIELD, J . F . - P r o c . S o c . Exp. Biol. M e d . 141 - 1972 26 - SANDEGREN, E. - P r o c . Eur. B r e w . C o n . - Scheveningen - 1947 27 - SA VERBORN, S . , DANIELSSON, C . E . & SVEDBERG, T . - Svensk Kern Tidskr. 56 - 1944 28 - WHITFIELD, J . F . , R I X O N , R . H . , M A C M A N U S , J . P . and B A L K , S . D . IN VITRO - v o l . 8, n° 4 - 1973 29 - WHITNEY, R. and SUTHERLAND, R. - J. c e l l . P h y s i o l . - 80 - 1972 30 - WREDE, J. , GUNDELACH, M . L . and RUDE, E. - Z . Immun. F o r s c h . 145 - 1973
