Università Politecnica delle Marche Facoltà di Medicina e Chirurgia
Scuola di dottorato di ricerca della Facoltà di Medicina e Chirurgia Direttore della Scuola: Scuola Prof. Antonio Benedetti Curriculum: Alimenti, Nutrizione e Salute, Ciclo XIII
Struttura: Clinica e Laboratorio di Endocrinologia
EFFETTI DEL POLIMORFISMO POLIMORF CAG DEL RECETTORE RE DEGLI ANDROGENI SUI PRINCIPALI OUTCOMES OUTCO DELLA TERAPIA SOSTITUTIVA STITUTIVA CON TESTOSTERONE IN SOGGETTI SOGG AFFETTI DA IPOGONADISMO ONADISMO IPOGONADOTROPO POST-CHIRURGICO. POST
Tesi di Dottorato di:
Tutor:
Dott. Giacomo Tirabassi
Prof. Giancarlo Balercia
Anni 2012, 2013, 2014
1
INDICE Introduzione
pag. 3
Ia parte: outcome sessuale
pag. 5
IIa parte: outcome metabolico
pag. 20
IIIa parte: outcome osseo
pag. 37
IVa parte: outcome composizione corporea
pag. 55
Conclusioni
pag. 71
2
INTRODUZIONE In questo tesi ho analizzato la rilevanza clinica del polimorfismo CAG del recettore degli androgeni nel condizionare diversi outcomes della terapia sostitutiva con testosterone in soggetti ipogonadici di sesso maschile. È infatti noto che l’azione del testosterone sui vari tessuti si espleta attraverso il legame con il recettore degli androgeni. Questo recettore è localizzato sul cromosoma X (q11-q12) ed è composto da otto esoni. L’esone 1 del gene del recettore degli androgeni contiene una sequenza polimorfica di ripetizioni CAG, che varia nel numero tra 10 e 35 e che codifica sequenze di poliglutammine del dominio di trans attivazione del recettore degli androgeni. Svariate evidenze suggeriscono che il numero di CAG è inversamente correlato con l’attività di trascrizione del recettore degli androgeni (1,2). In questa tesi ho preso in considerazione pazienti affetti da ipogonadismo ipogonadotropo susseguente a chirurgia ipofisaria. Nello specifico, abbiamo esaminato soggetti affetti da questa rarissima patologia nei quali sono state studiate le relazioni tra: -il polimorfismo CAG del recettore degli androgeni e gli effetti metabolici della terapia sostitutiva con testosterone; -il polimorfismo CAG del recettore degli androgeni e gli effetti sessuali della terapia sostitutiva con testosterone; -il polimorfismo CAG del recettore degli androgeni e gli effetti ossei della terapia sostitutiva con testosterone sull’outcome osseo; -il polimorfismo CAG del recettore degli androgeni e gli effetti sulla composizione corporea della terapia sostitutiva con testosterone.
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Ia PARTE: OUTCOME SESSUALE
Molte evidenze suggeriscono che AR è coinvolto nelle funzioni sessuali maschili, come la funzione erettile e il desiderio sessuale. Anche se la dipendenza dagli androgeni del tessuto muscolare liscio cavernoso è incerta, i recettori del testosterone sono presenti nei tessuti cavernosi durante tutta la vita, con livelli più elevati durante la pubertà, quando si verifica la crescita del pene [1]. Inoltre diversi studi, anche se prevalentemente condotti su animali, hanno scoperto che AR è ampiamente presente nell’ ipotalamo, nelle aree temporali, prefrontali e nella corteccia cingolata, nell’amigdala, nei nuclei mammillari e nella banda diagonale di Broca, e potrebbe quindi essere anche coinvolto nell’ eccitazione sessuale umana [2]. Sorprendentemente, studi sulla possibile influenza del polimorfismo CAG sulla funzione sessuale sono quasi assenti e particolarmente contraddittori [3,4]. In questa prima parte abbiamo voluto valutare il ruolo del polimorfismo CAG nel condizionare il recupero della funzione sessuale negli uomini affetti da ipogonadismo sottoposti a terapia sostitutiva con testosterone (TRT). Come già anticipato, ci siamo concentrati su l’ipogonadismo ipogonadotropo post-chirurgico, in cui il miglioramento TRT-indotto della funzione sessuale può essere influenzato dalla frequente co-somministrazione di diverse terapie sostitutive della funzione ipofisaria, come l'ormone ricombinante della crescita (GH), la levotiroxina e il cortisone [5 , 6].
Metodi 16 uomini che frequentavano la nostra clinica sono stati studiati in modo retrospettivo. I criteri di selezione sono stati: a) diagnosi di ipogonadismo ipogonadotropo [7, 8] a causa della rimozione di adenoma ipofisario; b) assenza di ipersecrezione o deficit degli ormoni ipofisari prima dell'intervento; c) assenza di ipogonadismo prima della chirurgia; d) disponibilità dei dati per la durata del follow-up; e) assenza di esami e di trattamenti per disfunzione sessuale prima della comparsa di ipogonadismo ipogonadotropo; f) relazione sessuale da almeno 1 anno prima dell’inclusione nello studio e proseguita durante il periodo di studio. 5
Una vasta valutazione ormonale, sulla base delle linee guida internazionali, è stata effettuata nei giorni e nelle settimane dopo l'intervento; tutti i soggetti avevano un deficit sia della funzione somatotropica che gonadotropica [7,8,9]; tra questi, un ulteriore deficit di funzione tireotropica era presente in quattro soggetti [10], un deficit corticotropo in due [11] e un deficit di funzione sia tireotropica che corticotropa in tre casi. A seconda del deficit del rispettivo ormone, glucocorticoidi (cortisone acetato, 37,5-50 mg al giorno), ormone somatotropo (GH umano ricombinante, 0,3-0,6 mg al giorno), ormone tiroideo (levotiroxina, 75-100 mg al giorno) e terapie sostitutive con testosterone venivano somministrate. La terapia sostitutiva con cortisone acetato e levotiroxina veniva iniziata subito dopo l'intervento chirurgico. Al contrario, la terapia sostitutiva con GH ricombinante umano e TRT veniva iniziata tra i 6 e 12 mesi dopo l'intervento chirurgico; al riguardo, si deve notare che TRT veniva sempre iniziata prima della terapia sostitutiva somatotropa. Nessun soggetto affetto da diabete mellito [12] o da malattia coronarica [13] era presente nel nostro campione. Il nostro studio ha esaminato il momento temporale prima dell’inizio di TRT (tempo 0) e prima dell' ottava iniezione con testosterone undecanoato (74-84 settimane dopo la prima iniezione di testosterone) (fase di recupero); valutazioni cliniche, biochimiche e sessuali sono state eseguite nei due punti temporali di valutazione. Testosterone undecanoato (1000 mg per via intramuscolare) è stato somministrato facendo una seconda iniezione 6 settimane dopo la prima (dose di carico) e poi continuando con iniezioni di questo tipo dopo 10-14 settimane a seconda dei livelli di testosterone nel sangue e dei sintomi clinici [14]. L’intervallo di tempo tra l'intervento chirurgico e l'inizio del TRT (tempo 0) è stato definito come il periodo di ipogonadismo. Si tratta di uno studio retrospettivo e i dati esaminati sono stati parte del work-up diagnostico, fatta eccezione per i dati genetici, che sono stati raccolti come parte del protocollo di ricerca.
Valutazione sessuale
6
La valutazione sessuale è stata effettuata attraverso la somministrazione del questionario International Index of Erectile Function-15 (IIEF-15) [15], che prende in considerazione cinque aspetti della vita sessuale maschile: funzione erettile (EF), funzione orgasmica (OF), il desiderio sessuale (SD), la soddisfazione del rapporto sessuale (IS) e la soddisfazione generale (OS). EF (punti del questionario 1, 2, 3, 4, 5 e 15), OF (punti 9 e 10), SD (punti 11 e 12), IS (punti 6, 7 e 8), e OS (punti 13 e 14) sono stati usati per confrontare l'effetto di TRT sulla funzione sessuale. Il punteggio EF può indicare una EF normale (intervallo punteggio 26-30), leggermente alterata (range punteggio 17-25), moderatamente compromessa (range punteggio 11-16) o gravemente compromessa (punteggio inferiore a 11). Per quanto riguarda OF (range punteggio 0-10), SD (range punteggio 2-10), IS (range punteggio 0-15), e OS (range punteggio 2-10) sono interessati, maggiore è il punteggio migliore è il parametro studiato. Il punteggio IIEF-15 totale è stato considerato.
Valutazione ormonale I campioni di sangue sono stati prelevati al mattino. Sono stati considerati i seguenti parametri ormonali: ormone follicolo-stimolante (FSH), ormone luteinizzante (LH), testosterone totale, T3 libera (FT3), T4 libera (FT4), cortisolo, insulin-like growth factor-1 (IGF-1) e prolattina. Tutti i dosaggi ormonali sono stati effettuati utilizzando kit commerciali di immunodosaggio. I valori normali di riferimento per i parametri studiati sono stati i seguenti: FSH, 1,7-6,9 IU / L; LH, 1,610,0 IU / L; testosterone totale, 3-8,5 ng / mL; FT3, 2,3-4,2 pg / mL; FT4, 0,8-1,8 ng / dL; cortisolo (ore 08:00), 7-27,5 mcg / dl; IGF-1, 66-251 ng / mL per i maschi tra i 40 e i 50 anni; 57-221 ng / mL per i maschi tra i 50 e i 60 anni; 46-211 ng / ml per i maschi tra i 60 e i 70 anni; prolattina, 2-15 ng / mL.
Reazione a catena della polimerasi (PCR) amplificazione e sequenziamento La genotipizzazione della tripletta CAG è stata eseguita come precedentemente descritto [16]. Brevemente, il DNA genomico è stato isolato da leucociti periferici. Triplette CAG sono state 7
determinate mediante PCR utilizzando primer che comprendeva la regione di interesse. Amplificazione PCR di circa 100 ng di DNA è stata effettuata utilizzando il sistema GeneAmp PCR 9700 (Applied Biosystems). Le varie lunghezze CAG ripetizione sono state determinate dal sequenziamento diretto su un XL sequencer CEQ 2000 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).
Analisi statistica Test di Shapiro-Wilk è stato applicato per verificare la normale distribuzione delle variabili continue. I dati sono espressi come mediana (range interquartile) quando distribuiti nonnormalmente, e come media ± deviazione standard quando normalmente distribuiti. Parametri sessuali e variazioni ormonali tra le due fasi (Δ-) sono stati calcolati come il valore nella fase di recupero meno il valore al tempo 0; confronto statistico tra le due fasi è stata effettuata utilizzando il test t di Student per dati appaiati o test di Wilcoxon a seconda rispettivamente della distribuzione dei dati normale o non normale. Un approccio in due fasi è stato utilizzato per studiare l'effetto del polimorfismo CAG del gene AR sui parametri sessuali indipendente da quella degli ormoni somministrati. In un primo momento, sono state effettuate correlazioni di Pearson tra le significative variazioni ormonali e il numero di triplette CAG con le variazioni di parametri sessuali. Poi, l'analisi di regressione lineare multipla è stata effettuata inglobando le variazioni dei parametri sessuali una alla volta come variabili dipendenti e, come indipendenti, quelle variazioni che nella correlazione Pearson erano significativamente correlate con quelli dei parametri sessuali. La significatività è stata fissata a P <0,05. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando SPSS 16 package (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Risultati La tabella 1 riporta le caratteristiche generali e i parametri ormonali dei soggetti studiati. Testosterone e IGF-1 erano gli unici parametri biochimici che variavano significativamente (Tabella 1). Al contrario, tutti i parametri sessuali miglioravano significativamente dopo 8
somministrazione di TRT (Tabella 2). In realtà, al tempo 0, EF era gravemente compromessa in quattro soggetti, moderatamente compromessa in sette e leggermente deteriorata in quattro, mentre, in fase di recupero, EF era un po’ compromessa in cinque soggetti e normale in dieci. Tabella 3 mostra le correlazioni di Pearson tra le variazioni ormonali statisticamente significative tra le due fasi, cioè testosterone e IGF-1, e del numero di triplette CAG con le variazioni di parametri sessuali. Il numero di triplette CAG correlava negativamente e significativamente con tutti i miglioramenti dei parametri sessuali (Tabella 3). Al contrario, Δ-testosterone correlava positivamente e significativamente con tutti i cambiamenti di indici sessuali, mentre Δ-IGF-1 non correlava significativamente con nessuno di loro (Tabella 3). L'analisi di regressione lineare multipla è stata effettuata inglobando le variazioni dei parametri sessuali una alla volta come variabili dipendenti e sia il numero di triplette CAG e Δ-testosterone come variabili indipendenti. Dopo correzione per Δtestosterone, la lunghezza del tratto CAG è stata negativamente e significativamente associata con Δ-EF, Δ-SD, Δ-IS, Δ-OS, il punteggio Δ-totale IIEF-15 (Tabella 4); un’ associazione negativa e quasi significativa (p = 0.075) era evidente anche con Δ-OF (Tabella 4). Viceversa, Δ-testosterone non mostrava una significativa associazione con i miglioramenti dei parametri studiati sessuali (dati non mostrati).
Discussione L'importanza di AR nelle funzioni sessuali è mostrata non solo da studi che hanno riportato la presenza di AR nel cervello e nel tessuto penieno [1,2], ma anche dalla diminuzione di EF, funzione orgasmica, SD, rapporti e la soddisfazione generale in soggetti affetti da parziale sindrome di Morris [17]. Date queste premesse e la scarsità di dati sulla questione, in questo studio abbiamo valutato il ruolo del tratto CAG sugli effetti sessuali del TRT nell’ ipogonadismo maschile postchirurgico. Abbiamo scoperto che la lunghezza più corta del gene AR CAG repeat favorisce il miglioramento di quasi tutti i parametri maschili sessuali studiati dopo TRT. A questo proposito, solo due studi trasversali hanno affrontato questo problema, analizzando i soggetti di età simile a 9
quella del nostro studio e con apparentemente normali livelli di testosterone totale [3,4]. I nostri risultati concordano con i dati del’abstract di Pastuszak et al. che ha trovato che, in 85 uomini, il polimorfismo CAG del recettore degli androgeni era inversamente correlato con tutti gli aspetti della funzione sessuale maschile valutabili tramite IIEF-15, (cioè la disfunzione e la funzione orgasmica, il desiderio sessuale, il rapporto e la soddisfazione generale), suggerendo, quindi, che una lunghezza inferiore di AR gene CAG repeat numero potrebbe comportare un miglioramento della funzione sessuale [3]. Si deve tuttavia notare che Andersen e colleghi, in uno studio che ha riguardato 79 uomini con disfunzione erettile (DE) e 340 controlli, non ha trovato associazioni tra la sintomatologia ED e la lunghezza del CAG [4]. Questi autori hanno valutato l’ ED, sulla base di una sola domanda derivante dal National Institutes of Health Consensus Development Panel on Impotenza (1993) [4]. Forse, proprio questa metodologia di valutazione della funzione sessuale potrebbe spiegare la differenza tra i loro riscontri e i nostri. Inoltre, come già detto, nell’ ipopituitarismo i benefici sessuali della somministrazione di TRT [8] devono essere distinti da quelli derivanti dalla somministrazione concomitante di terapie sostitutive della funzione ipofisaria, come GH ricombinante, levotiroxina e cortisone. In realtà, alcune evidenze indicano un ruolo per tutti questi ormoni nel condizionare la risposta sessuale maschile [5,6,18-24]. Nel nostro caso, noi non abbiamo osservato variazioni di tiroide o ormoni surrenalici nella nostra particolare coorte (Tabella 1). IGF-1 invece aumentava, ma la sua variazione non era associata con un miglioramento della funzione sessuale (Tabella 3). Al contrario, l'aumento del testosterone dovuto alla supplementazione è stato associato ad aumento del punteggio totale e dei sottodomini IIEF (tabella 3). È interessante notare che, quando la lunghezza del polimorfismo CAG è stato introdotto in una multivariata con Δ-testosterone, come ulteriore covariata, la lunghezza CAG manteneva un'associazione significativa e indipendente con il miglioramento della funzione sessuale. Ciò indica che il contributo di Δ-IGF-1 per la funzione sessuale migliorata è trascurabile e suggerisce un effetto del polimorfismo CAG sulla sessualità maschile che è indipendente dal livello di testosterone circolante. 10
Anche se tutti i parametri di funzione sessuale miglioravano dopo TRT nei nostri soggetti, studi in letteratura riportano grande variabilità inter-individuale su questo aspetto. Infatti, una meta-analisi di Isidori et al. trovava un livello estremamente variabile (tra il 33 e il 75%) di miglioramento in funzione sessuale in pazienti impotenti ipogonadici sottoposti a testosterone o terapia con clomifene [25]. Inoltre, come alcune evidenze mostrano [26], il recupero può riguardare solo alcuni aspetti del comportamento sessuale ed essere totalmente assente dagli altri. Tuttavia, alla luce dei nostri risultati, il gran numero di soggetti che non sono sessualmente sensibili a TRT potrebbe effettivamente dipendere dall'effetto modulatorio del polimorfismo CAG; quindi, una nuova valutazione degli effetti del TRT sui parametri sessuali, anche in considerazione della lunghezza del polimorfismo CAG, su un ampio numero di casi, potrebbe aiutarci a far luce su questo argomento. Chiaramente, il nostro studio ha alcune limitazioni. In primo luogo, in conseguenza della rarità della condizione considerata e dei nostri rigorosi criteri di inclusione, la dimensione del campione era molto piccola. Questo aspetto ci ha impedito di valutare l'interazione naturale e probabile tra il testosterone e il polimorfismo CAG, che comporta in teoria che i soggetti con un basso numero di triplette CAG possono avere bisogno di un dosaggio inferiore di testosterone per ottenere un significativo miglioramento della funzione sessuale. In secondo luogo, il nostro campione ha un certo grado di eterogeneità nelle terapie sostitutive co-somministrate. Tuttavia, a questo proposito, va sottolineato che i soggetti sottoposti solo a TRT e terapia GH umano ricombinante e soggetti che assumevano anche cortisone acetato e/o levotiroxina non differivano significativamente in alcun parametro ormonale o sessuale considerato (dati non mostrati), suggerendo pertanto una sostanziale omogeneità del nostro campione. Chiaramente, anche se la nostra analisi statistica non esclude definitivamente la sottile influenza degli ormoni cosomministrati sul miglioramento sessuale, aiuta ad escluderlo in grande misura. Una ripetizione del nostro protocollo nell’ ipogonadismo primario permetterà di valutare un maggior numero di soggetti, per escludere gli effetti di base delle terapie somministrate contemporaneamente e per verificare la probabile generalizzabilità dei nostri risultati. 11
In conclusione, il nostro studio ha dimostrato che la minore lunghezza del gene AR numero CAG repeat favorisce il recupero della funzione sessuale negli uomini affetti da ipogonadismo postchirurgica ipogonadotropo sottoposti TRT, indipendentemente dagli effetti concomitanti delle terapie sostitutive della funzione ipofisaria. Se i nostri dati verranno confermati, la valutazione del polimorfismo CAG potrebbe spiegare la grande variabilità inter-individuale di recupero della funzione sessuale dopo TRT. La valutazione del polimorfismo CAG potrebbe rappresentare uno strumento utile per selezionare farmacogeneticamente la dose ottimale di terapia sostituiva dei soggetti affetti da ipogonadismo.
12
Tabella 1. Caratteristiche ormonali e generali del campione.
Caratteristiche generali Età (anni)
56.66 ± 8.54
Durata dell’ipogonadismo
8.86 ± 1.98
(mesi) N° di triplette CAG
18.23 ± 3.61 Caratteristiche ormonali ∆
p+++
Tempo 0
Fase di recupero
FSH (IU/L)
0.80 (0.60-1)
0.60 (0.40-0.80)
LH (IU/L)
0.98 ± 0.45
0.83 ± 0.29
-0.17 ± 0.34
NS
1.58 ± 0.55
3.93 ± 0.39
2.45 ± 0.75
< 0.001
FT3 (pg/mL)
3.26 ± 0.51
3.13 ± 0.49
-0.11 ± 0.72
NS
FT4 (ng/dL)
1.23 ± 0.27
1.35 ± 0.19
0.09 ± 0.45
NS
Cortisolo (mcg/dL)
14.50 (11-18.80)
14.50 (10.40-18.20)
0.80 (-6- 1.9)
NS
IGF-1 (ng/mL)
34.99 ± 7.65
153.33 ± 41.35
119.20 ± 44.73
< 0.001
Prolattina (ng/mL)
6.88 ± 2.98
7.38 ± 3.18
0.55 ± 4.85
NS
Testosterone totale (ng/mL)
-0.45 (-0.65- 0.25)
NS
I valori sono espresso come mediana (range interquartile) o media ± deviazione standard. +++
Confronto statistico tra il tempo 0 e la fase di recupero.
∆ = variazione; AR = recettore androgeni; FSH = follicle-stimulating hormone; LH = luteinizing hormone; FT3 = T3 libero; FT4 = T4 libero; IGF-1 = insulin-like growth factor-1; NS = non significativo.
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Tabella 2. Parametri sessuali prima e dopo TRT. Tempo 0
Fase di recupero
∆
p+++
EF
14.19 ± 4.77
26.76 ± 2.28
12.4 ± 5.10
<0.001
OF
4 (2-5)
9 (8-10)
6 (4-7)
<0.001
SD
5 (3-5)
9 (9-10)
4 (3-5)
<0.001
IS
6.18 ± 1.78
14.01 ± 0.94
7.67 ± 2.25
<0.001
OS
3 (3-5)
9 (8-10)
6 (5-7)
<0.001
Total IIEF-15 score
31.99 ± 8.35
67.87 ± 3.21
35.93 ± 9.91
<0.001
I valori sono espresso come mediana (range interquartile) o media ± deviazione standard. +++
Confronto statistic tra il tempo 0 e la fase di recupero.
∆ = variazione; EF = funzione erettile; OF = funzione orgasmica; SD = desiderio sessuale; IS = soddisfazione rapporto; OS = soddisfazione complessiva; IIEF-15 = International Index of Erectile Function.
14
Tabella 3. Correlazioni di Pearson tra le variazioni statisticamente significative ormonali tra le due fasi e il numero di triplette CAG con le variazioni dei parametri sessuali.
Numero di triplette ∆-Testosterone
∆-IGF-1 CAG
r: 0.761
r: -0.875
∆-EF
NS p: 0.003
p < 0.001
r: 0.798
r: -0.843
∆-OF
NS p: 0.001
p < 0.001
r: 0.671
r: -0.841
∆-SD
NS p: 0.008
p < 0.001
r: 0.755
r: -0.830
∆-IS
NS p: 0.001
p < 0.001
r: 0.631
r: -0.829
∆-OS
NS p: 0.007
Punteggio totale di ∆- IIEF-
p < 0.001
r: 0.782
r: -0.982 NS
15
p < 0.001
p < 0.001
∆=variazione; EF = funzione erettile; OF = funzione orgasmica; SD = desiderio sessuale; IS = soddisfazione del rapporto; OS = soddisfazione complessiva; IIEF-15 = International Index of Erectile Function; IGF-1 = insuline-like growth factor; AR = recettore degli androgeni; NS = non significativo.
15
Tabella 4. Influenza del polimorfismo CAG del recettore degli androgeni sui parametri sessuali. Lunghezza del tratto CAG Coefficiente β non standardizzato (95 % p CI)+++
+++
∆-EF
-1.039 (-2.010- -0.078)
0.039
∆-OF
-0.216 (-0.416- 0.019)
0.069
∆-SD
-0.289 (-0.457- -0.124)
0.003
∆-IS
-0.435 (-0.825- -0.065)
0.039
∆-OS
-0.354 (-0.549- -0.129)
0.005
Punteggio totale di ∆- IIEF-15
-2.299 (-3.620- -0.989)
0.005
= corretto per ∆-Testosterone; AR = recettore degli androgeni; CI = intervallo di confidenza; ∆
= variazione; EF = funzione erettile; OF = funzione orgasmica; SD = desiderio sessuale; IS = soddisfazione del rapporto; OS = soddisfazione complessiva; IIEF-15 = International Index of Erectile Function.
16
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19
IIa PARTE: OUTCOME METABOLICO
Grande incertezza esiste in letteratura per quanto riguarda l'associazione tra il polimorfismo CAG e il profilo metabolico. Infatti, mentre alcuni autori hanno trovato un collegamento tra il basso numero di ripetizioni CAG e bassi livelli di lipoproteine ad alta densità (HDL), livelli di colesterolo [1] e maggiore gravità della malattia coronarica [2], altri hanno riportato una relazione tra l’ alto numero di ripetizioni CAG e un peggioramento dei fattori di rischio cardiovascolare (CVRFs) [3]. Questi risultati derivano da studi trasversali che non hanno esaminato i pazienti affetti da ipogonadismo. In particolare, si sa molto poco circa il ruolo che il polimorfismo CAG gioca nell'influenzare effetti metabolici a lungo termine della terapia sostitutiva con testosterone (TRT). Data questa premessa, abbiamo deciso di valutare l'effetto indipendente del polimorfismo CAG sui cambiamenti metabolici TRT-correlati, concentrandoci sull’ipogonadismo
ipogonadotropo
maschile post-chirurgico, una condizione che è quasi sempre associata a ipopituitarismo e richiede la somministrazione concomitante di terapie sostitutive ormonali metabolicamente attive, come l'ormone ricombinante della crescita (GH), la levotiroxina e il cortisone [4-8].
Materiali e metodi Soggetti 16 maschi trattati nella nostra clinica sono stati valutati retrospettivamente. I criteri di inclusione sono stati: a) ipogonadismo ipogonadotropo [9,10] secondario alla rimozione chirurgica di adenoma ipofisario; b) assenza di ipersecrezione da parte dell’adenoma ipofisario prima dell'intervento; c) assenza di deficit di ormoni ipofisari prima dell'intervento; d) assenza di ipogonadismo prima della chirurgia; e) la presenza di dati di follow-up clinico per tutta la durata dello studio; f) l'assenza di malattie precedenti in grado di condizionare parametri metabolici considerati in questo studio (diabete mellito, dislipidemia, ipertensione arteriosa, ecc).
20
Protocollo di studio I soggetti studiati sono stati sottoposti a valutazione clinica e biochimica all'inizio del TRT (tempo 0) e prima dell’ottava iniezione di testosterone undecanoato (74-84 settimane dopo la prima iniezione di testosterone) (fase di recupero). 1000 mg di testosterone undecanoato è stato somministrato per via intramuscolare dopo 6 settimane dalla prima iniezione (dose di carico), seguito da iniezioni di questo tipo ogni 10-14 settimane, a seconda dei valori di testosterone nel sangue e dei sintomi clinici [11]. Tutti i soggetti hanno presentato entrambi i deficit funzionali somatotropi e gonadotropi [9,10,12]; tra questi, quattro avevano anche deficit tireotropici [13], due anche corticotropi [14] e tre sia deficit della funzione tireotropa e corticotropa. Tutti i pazienti sono stati trattati con dosi appropriate di glucocorticoidi (acetato di cortisone, 37,5-50 mg al giorno), ormone somatotropo (GH umano ricombinante, 0,3-0,6 mg al giorno) e ormone tiroideo (levotiroxina, 75-100 mg al giorno), a seconda dello specifico deficit di ormone. Le terapie con glucocorticoidi e terapia sostitutiva tiroidea venivano iniziate nelle ore / giorni immediatamente successivi l'intervento chirurgico, a seconda della presenza e del grado del deficit specifico. Le terapie sostitutive con ormone somatotropo e TRT sono state avviate tra 6 e 12 mesi dopo l'intervento chirurgico; nessun soggetto veniva trattato con terapia sostitutiva con GH prima dell’inizio della TRT. La durata di ipogonadismo è stata calcolata come il tempo tra la chirurgia e l’inizio di TRT (tempo 0). Si tratta di uno studio retrospettivo e i dati esaminati facevano parte del work-up diagnostico, fatta eccezione per i dati genetici che sono stati raccolti come parte di un protocollo di ricerca.
Valutazione clinica Tra i parametri clinici misurati, peso, circonferenza vita, pressione sistolica (SBP) e diastolica (DBP) sono stati considerati nell'analisi. Peso, circonferenza vita, SBP e DBP sono stati raccolti secondo i metodi standard descritto in precedenza [15,16].
21
La valutazione biochimica e ormonale I campioni di sangue sono stati prelevati al mattino. Sono stati considerati i seguenti parametri biochimici e ormonali: glicemia, emoglobina glicata (HbA1c), colesterolo totale, colesterolo HDL, trigliceridi, insulinemia basale, ormone follicolo-stimolante (FSH), ormone luteinizzante (LH), testosterone totale, estradiolo, T3 libera (FT3), T4 libera (FT4), cortisolo, insulin-like growth factor-1 (IGF-1) e prolattina. La glicemia è stata misurata mediante determinazione fotometrica utilizzando il metodo esochinasi. HbA1c è stata misurata nel sangue intero mediante scambio ionico cromatografia liquida ad alte prestazioni con il Bio-Rad Variant Emoglobina Testing System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Colesterolo totale, colesterolo HDL e trigliceridi sono stati analizzati enzimaticamente con una reazione finale Trinder (ADVIA 2400 SIEMENS, Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY, USA). Tutti i dosaggi ormonali sono stati effettuati utilizzando kit commerciali immunodosaggio. Per quanto riguarda il testosterone totale, la sua analisi è stata effettuata utilizzando ADVIA Centaur XP immunologico, Siemens Medical Solution Diagnostics (concentrazione rilevabile minima: 0,1 ng / mL; coefficienti intra- e inter-saggio di variazione sono stati rispettivamente del 6,2% e del 4,4% ad una concentrazione di testosterone di 0.95 ng / mL e del 4,7% e del 4,7% a 3,65 ng / mL). I valori normali di riferimento per i parametri biochimici studiati sono stati i seguenti: glucosio plasmatico, 70-99 mg / dl; HbA1c, <6,0%; colesterolo totale, <200 mg / dl; Colesterolo HDL,> 40 mg / dl per i maschi; trigliceridi <150 mg / dl; insulinemia basale, 4-23 μU / ml; FSH, 1,7-6,9 IU / L; LH, 1,6-10,0 IU / L; testosterone totale, 3-8,5 ng / mL; estradiolo, 11-47 pg / mL; FT3, 2,3-4,2 pg / mL; FT4, 0,8-1,8 ng / dL; cortisolo (08:00), 7-27,5 mcg / dl; IGF-1, 66-251 ng / mL per i maschi tra i 40 e i 50 anni; 57-221 ng / mL per i maschi tra i 50 e i 60 anni; 46-211 ng / ml per i maschi tra i 60 e i 70 anni; prolattina, 2-15 ng / mL. La sensibilità all'insulina è stata valutata dall’indice HOMA [15], che viene calcolata come: [glicemia a digiuno (mmol / l) × insulina a digiuno (mU / l)] / 22.5. Il colesterolo LDL è stata
22
calcolata in base alla formula di Friedewald [17]: colesterolo LDL = colesterolo totale - colesterolo HDL - trigliceridi / 5.0 (mg / dL).
Reazione a catena della polimerasi (PCR) amplificazione e sequenziamento La genotipizzazione delle triplette CAG è stata eseguita come descritto in precedenza [18]. Brevemente, il DNA genomico è stato isolato da leucociti periferici. PCR è stata eseguita con 150 ng DNA; primer sono stati utilizzati a concentrazione finale di 10 mΜ. La tecnica hot-start è stata utilizzata per impedire l'amplificazione non specifica. I prodotti di PCR sono stati purificati mediante QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilder, Germania) e circa 30 ng dei prodotti purificati sono stati sottoposti ad una reazione di sequenziamento con il BigDye Terminator Kit v3.1 Cycle Sequencing (ABI Prism, Applied Biosystem). I campioni sono stati sequenziati su XL sequencer CEQ 2000 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).
Analisi statistica Il test di Shapiro-Wilk è stato applicato per verificare la normale distribuzione delle variabili continue. I dati sono espressi come mediana (range interquartile) quando non-normalmente distribuiti, e come media ± deviazione standard quando normalmente distribuiti. CVRFs e le variazioni ormonali tra le due fasi (Δ-) sono stati calcolati come il valore in fase di recupero meno il valore al tempo 0; il confronto statistico tra le due fasi è stato effettuato utilizzando il test t di Student per dati appaiati o il test di Wilcoxon a seconda rispettivamente sulla distribuzione dei dati normale o non normale. Per studiare l'effetto del polimorfismo CAG sui parametri metabolici, indipendente da quella degli ormoni somministrati, è stato adottato un approccio in due fasi. In primo luogo, correlazioni di Pearson tra le varie variazioni significative ormonali e il numero di triplette CAG con Δ-CVRFs sono state effettuate. Poi, l'analisi di regressione lineare multipla è stata eseguita ponendo come variabili dipendenti i Δ-CVRFs, uno alla volta, e ponendo come indipendenti, le variabili che, nella correlazione Pearson, erano significativamente correlati con Δ23
CVRFs. La significatività statistica era fissata a P <0,05. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando SPSS 16 package (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Risultati La tabella 1 presenta parametri generali e ormonali dei soggetti studiati. Testosterone, IGF-1 e estradiolo variano in modo significativo tra le due fasi, mentre gli altri ormoni non cambiavano significativamente (Tabella 1). Al contrario, tutte le variabili metaboliche miglioravano significativamente dopo TRT (tabella 2). La tabella 3 mostra le correlazioni di Pearson tra le variazioni ormonali (Δ-) statisticamente significative tra le due fasi, vale a dire il testosterone, l’IGF-1 e l’estradiolo, e del numero di triplette CAG con Δ-CVRFs. Il numero di triplette CAG correlava positivamente e significativamente con tutti i Δ-CVRFs (tranne per la correlazione significativa e negativa con il colesterolo HDL-Δ) (Tabella 3). Al contrario, il Δ-testosterone correlava negativamente e significativamente con tutti i Δ-CVRFs (eccetto la correlazione significativa e positiva con il colesterolo Δ-HDL), mentre Δ-IGF-1 e estradiolo non correlavano significativamente con qualsiasi Δ-CVRFs (Tabella 3). Analisi di regressione lineare multipla è stata effettuata anche ponendo come variabili dipendenti i Δ-CVRFs e come covariate sia il numero di triplette CAG che il Δ-testosterone. Dopo correzione per Δ-testosterone, CAG repeat lunghezza era ancora positivamente e significativamente associata a Δ peso, Δ-glicemia, Δ-HbA1c, Δtrigliceridi, Δ-HOMA-IR, Δ-SBP, Δ-DBP e negativamente con Δ colesterolo -HDL (Tabella 4); un’associazione positiva e quasi significativa veniva riscontrata anche con il colesterolo Δ-LDL (p = 0.06), (Tabella 4).
Discussione In questo lavoro abbiamo valutato l'impatto del polimorfismo CAG sugli effetti metabolici di TRT, concentrandosi sull’ipogonadismo ipogonadotropo maschile post-chirurgico, una condizione in cui questo aspetto non è ancora stato studiato. Come già anticipato, l’ipogonadismo ipogonadotropo 24
maschile post-chirurgico è un particolare tipo di ipogonadismo in cui i cambiamenti metabolici TRT-correlati si sommano a quelli derivanti dalla frequente concomitante somministrazione di ormoni sostitutivi della funzione ipofisaria [4-6,19,20]. Infatti, la somministrazione della terapia sostitutiva con cortisolo in soggetti affetti da insufficienza adrenocorticale aumenta e normalizza la glicemia e la pressione sanguigna e favorisce il recupero di peso [4]. La terapia sostitutiva con GH, invece, induce un miglioramento del profilo lipidico e aumenta la circonferenza della vita, l’indice di massa corporea (BMI) e la glicemia nei pazienti con deficit di GH [5]. Analogamente, la somministrazione di levotiroxina in pazienti ipotiroidei induce una riduzione del colesterolo totale e LDL [6]. Inoltre, TRT nei maschi affetti da ipogonadismo è in grado di influenzare i parametri metabolici causando una riduzione della glicemia a digiuno, HOMA-IR, trigliceridi, circonferenza vita e di solito aumentando il colesterolo HDL [9, 21-24]; inoltre, gli estrogeni, che aumentano dopo TRT a causa della conversione aromatasi mediata [25,26], sono stati trovati essere positivamente associati con la sindrome metabolica [27]. Nei nostri soggetti abbiamo trovato che la lunghezza più corta del polimorfismo CAG favorisce il miglioramento di molte delle CVRFs dopo TRT indipendentemente dagli effetti metabolici delle terapie sostitutive della funzione ipofisaria. I nostri risultati sono in accordo con un ampio studio effettuato su 1.859 uomini di età compresa tra 20 e 79 anni che dimostrano che soggetti con lunghezza della tripletta CAG inferiore a 22 avevano livelli più bassi di BMI, glicemia, SBP e di percentuale di ipertensi [3]. Inoltre, i nostri dati confermano la tendenza, già evidenziata nell’ unico altro studio sullo stesso argomento, che comprendeva 66 uomini affetti da ipogonadismo di varia eziologia (ovvero primaria, secondaria, ipogonadismo late onset), secondo cui la diminuzione di PAS e PAD dopo TRT si verificava soprattutto nei soggetti con più breve lunghezza di CAG [28]. Vale anche la pena ricordare che, nel loro studio, nessun effetto del polimorfismo CAG sul miglioramento del profilo lipidico era evidente [28]; probabilmente l'eterogeneità del campione esaminato da quegli autori e i diversi metodi statistici utilizzati potrebbero spiegare questa discrepanza. 25
Tuttavia, non possiamo non menzionare quegli studi che hanno riscontrato una associazione completamente diversa tra gene AR CAG polimorfismo e profilo metabolico. Infatti, Skjærpe et al. in uno studio su 172 uomini, di età compresa tra 60-80 anni, ha trovato che quelli con una lunghezza di CAG inferiore a 21 avevano valori elevati di glicemia, c-peptide e HbA1c, rispetto a quelli con lunghezza CAG oltre 21 [29]. In linea con questi risultati, in 131 uomini sottoposti ad angiografia coronarica, è stato segnalato che quelli con breve AR avevano una presenza di malattia coronarica significativamente più frequente che negli uomini con lunghi AR [2]. Inoltre, in 110 uomini sani è stato trovato che il numero di ripetizioni CAG era correlato positivamente con i livelli di colesterolo HDL e di flusso vasodilatazione mediato, che è una misura della funzione endoteliale [30]. È interessante notare che, nel nostro campione, TRT comportava un aumento del colesterolo HDL. Questo risultato è in accordo con una recente meta-analisi [31] e con il lavoro già citato da Zitzmann et al. [28], che registrava un significativo aumento del colesterolo HDL da 42,4 ± 11,3 mg / dl a 50,1 ± 8,9 mg / dl (rispettivamente media e deviazione standard). Tuttavia, in contrasto con questo, alcuni elementi dimostrano che TRT può anche avere l'effetto opposto sui livelli di colesterolo HDL in uomini affetti da ipogonadismo [32,33]. Anche se una serie di fattori, come la durata dello studio, la distribuzione del grasso, l'obesità, la dieta, l'età, assunzione di alcol, l'esercizio fisico e il fumo [28,33] sono stati considerati per spiegare questi diversi risultati, a nostro parere più attenzione dovrebbe essere data specificamente alla lunghezza del polimorfismo CAG che potrebbe rappresentare il fattore dominante in grado di condizionare le variazioni di colesterolo HDL dopo TRT. In conclusione, il nostro studio suggerisce che, negli uomini affetti da ipogonadismo ipogonadotropo post-chirurgico, la minor lunghezza di AR gene CAG tratto è associata ad un migliore effetto metabolico di TRT, indipendentemente dagli effetti di altre terapie sostitutive della funzione ipofisaria concomitanti. Se i nostri dati saranno confermati da ulteriori studi, le analisi genetiche del polimorfismo CAG potrebbero essere introdotte nella pratica clinica come fattore 26
aggiuntivo nella valutazione del rischio cardiovascolare in uomini affetti da ipogonadismo sottoposti a TRT.
27
Tabella 1. Caratteristiche generali e ormonali dei soggetti studiati. Caratteristiche generali Età (anni)
56.66 ± 8.54
Durata di ipogonadismo (mesi)
8.86 ± 1.98
N° di triplette CAG
18.23 ± 3.61 Caratteristiche ormonali ∆ -0.45 (-0.65- 0.25)
p+++
0.83 ± 0.29
-0.17 ± 0.34
NS
1.58 ± 0.55
3.93 ± 0.39
2.45 ± 0.75
< 0.001
Estradiolo (pg/mL)
7.86 ± 1.85
33.80 ± 10.91
25.93 ± 12.13
< 0.001
FT3 (pg/mL)
3.26 ± 0.51
3.13 ± 0.49
-0.11 ± 0.72
NS
FT4 (ng/dL)
1.23 ± 0.27
1.35 ± 0.19
0.09 ± 0.45
NS
Cortisolo (mcg/dL)
14.50 (11-18.80)
14.50 (10.40-18.20)
0.80 (-6- 1.9)
NS
IGF-1 (ng/mL)
34.99 ± 7.65
153.33 ± 41.35
119.20 ± 44.73
< 0.001
Prolattina (ng/mL)
6.88 ± 2.98
7.38 ± 3.18
0.55 ± 4.85
NS
Tempo 0
Fase di recupero
FSH (IU/L)
0.80 (0.60-1)
0.60 (0.40-0.80)
LH (IU/L)
0.98 ± 0.45
Testosterone Totale (ng/mL)
NS
I Valori sono espressi come mediana (range interquartile) o media ± deviazione standard. +++
Confronto statistico tra il tempo 0 e la fase di recupero. AR = recettore degli androgeni; ∆ = variazione; FSH = follicle-stimulating hormone; LH = luteinizing hormone; FT3 = T3 libero; FT4 = T4 libero; IGF-1 = insulin-like growth factor-1; NS = non significativo. 28
Tabella 2. Profilo metabolici dei soggetti nelle due fasi.
Tempo 0
Fase di recupero
∆
p+++
Peso (kg)
78.7 ± 11.4
76.7 ± 11.9
-1.8 ± 2.1
0.003
Vita (cm)
96.7 ± 10.3
94.7 ± 9.8
-2.4 ± 1.8
<0.001
Glicemia (mg/dL)
114.5 ± 12.0
106.6 ± 7.4
-7.9 ± 6.9
<0.001
HbA1C (%)
6.1 ± 0.3
5.8 ± 0.3
-0.1 ± 0.1
<0.001
Colesterolo totale (mg/dL)
255.8 ± 39.9
238.6 ± 30.0
-18.4 ± 14.5
<0.001
Colesterolo HDL (mg/dL)
39.9 ± 10.1
45.9 ± 6.4
5.5 ± 7.8
0.019
Colesterolo LDL (mg/dL)
189 (142-229.6)
143 (133.4-184.4)
-16.9 (-33- -7)
0.001
Trigliceridi (mg/dL)
169.9 ± 29.9
159.5 ± 28.7
-10.2 ± 7.12
<0.001
HOMA-IR
9.9 ± 3.6
6.8 ± 1.9
-3.4 ± 1.6
<0.001
SBP (mmHg)
132 (122-142)
122 (113-1307)
-10 (-22- -12)
0.003
DBP (mmHg)
89.8 ± 7.9
83.4 ± 5.8
-6.7 ± 6.6
<0.001
I Valori sono espressi come mediana (range interquartile) o media ± deviazione standard. +++
Confronto statistico tra il tempo 0 e la fase di recupero.
∆ = variazione; HbA1C = emoglobina glicata; HDL= Lipoproteine ad alta densità; LDL= Lipoproteine a bassa densità; HOMA-IR = indice di insulinoresistenza; SBP = pressione arteriosa sistolica; DBP = pressione arteriosa diastolica.
29
Tabella 3. Correlazioni di Pearson tra le variazioni ormonali statisticamente significative tra le due fasi e il numero di triplette CAG con le variazioni dei CVRFs.
∆-Testosterone ∆-Peso ∆-Vita ∆-Glicemia ∆-HbA1c ∆- colesterolo totale ∆- colesterolo HDL ∆- colesterolo LDL ∆-Trigliceridi ∆-HOMA-IR ∆-SBP ∆-DBP
Δ-Estradiolo
∆-IGF-1
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
r: -0.619 p: 0.015 r: -0.653 p: 0.015 r: -0.778 p: 0.001 r: -0.719 p: 0.004 r: -0.758 p: 0.001 r: 0.839 p < 0.001 r: -0.860 p < 0.001 r: -0.747 p: 0.001 r: -0.802 p < 0.001 r: -0.701 p < 0.001 r: -0.798 p < 0.001
N° di triplette CAG r: 0.785 p: 0.001 r: 0.688 p: 0.003 r: 0.968 p < 0.001 r: 0.926 p < 0.001 r: 0.728 p: 0.002 r: -0.953 p < 0.001 r: 0.756 p < 0.001 r: 0.821 p < 0.001 r: 0.737 p < 0.001 r: 0.835 p < 0.001 r: 0.865 p < 0.001
AR = recettore androgeni; CVRFs = fattori di rischio cardiovascolari; ∆ = variazioni; IGF-1 = insulin-like growth factor-1; HbA1C= emoglobina glicata; HDL = Lipoproteine ad alta densità; LDL = Lipoproteine a bassa densità; HOMA-IR = indice di insulinoresistenza; SBP = pressione arteriosa sistolica; DBP = pressione arteriosa diastolica; NS = non significativo.
30
Tabella 4. Influenza del polimorfismo CAG sui parametri metabolici. Lunghezza del tratta CAG
+++
Coefficiente β non standardizzato (95 % CI)+++
P
∆-Peso (kg)
0.459 (0.029-0.785)
0.040
∆-Vita (cm)
0.208 (-0.120- 0.578)
NS
∆-Glicemia (mg/dL)
1.970 (1.195-2.745)
< 0.001
∆-HbA1c (%)
0.038 (0.022-0.053)
< 0.001
∆- colesterolo totale (mg/dL)
1.414 (-1.562-4.390)
NS
∆- colesterolo HDL (mg/dL)
-1.817 (-2.487- -1.147)
< 0.001
∆- colesterolo LDL (mg/dL)
2.845 (-0.005-5.696)
0.060
∆-Trigliceridi (mg/dL)
1.978 (1.003-2.932)
< 0.001
∆-HOMA-IR
0.399 (0.157-0.590)
< 0.001
∆-SBP (mmHg)
2.483 (1.433- 3.594)
< 0.001
∆-DBP (mmHg)
1.871 (1.034-2.409)
< 0.001
= corretto per ∆-Testosterone; AR = recettore degli androgeni; CI = intervallo di confidenza; ∆
= variazione; HbA1C = emoglobina glicata; HDL = Lipoproteine ad alta densità; LDL = Lipoproteine a bassa densità; HOMA-IR= indice di insulinoresistenza; SBP = pressione arteriosa sistolica; DBP = pressione arteriosa diastolica; NS = non significativo. 31
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36
IIIa PARTE: OUTCOME OSSEO
Oltre alle funzioni riproduttive, il testosterone ha anche dimostrato di avere un ruolo positivo nella crescita, maturazione e manutenzione dello scheletro maschile [1] e la sua diminuzione età o malattia correlata porta ad una diminuzione della massa ossea e all'aumento rischio di osteoporosi [2]. Allo stesso modo, la terapia sostitutiva con testosterone (TRT) produce una riduzione dei markers di riassorbimento osseo e un miglioramento della densità minerale ossea a livello della colonna lombare, con minore effetti sul collo del femore [3-5]. Durante la crescita corporea, il testosterone stimola la formazione di osso periostale e contribuisce ad una maggiore dimensione e robustezza delle ossa e dello scheletro nei maschi. Inoltre, anche durante l'età adulta, il testosterone è coinvolto nel mantenere l'integrità della massa ossea [1]. Anche se il suo meccanismo di azione a livello cellulare non è stato ancora completamente compreso, si ritiene che il testosterone influenzi gli osteoblasti diminuendo il loro tasso di apoptosi e stimoli la proliferazione dei progenitori e la differenziazione di osteoblasti maturi. Inoltre, può diminuire la formazione di osteoclasti e il riassorbimento osseo attraverso un aumento della produzione di osteoprogesterina [1]. L’effetto del Testosterone avviene tramite il recettore degli androgeni (AR), sia direttamente che indirettamente, attraverso il suo metabolita, ovvero il diidrotestosterone [6]. Inoltre, sia il testosterone che gli androgeni surrenalici possono essere convertiti dal citocromo P450 enzima aromatasi a 17β-estradiolo ed estrone [6], che hanno un effetto positivo sulle ossa [7]. Sia AR che i recettori degli estrogeni sono espressi in osteoblasti, osteociti e osteoclasti [6]. Il rapporto tra AR CAG polimorfismo e metabolismo osseo negli uomini è estremamente controverso. Anche se diversi studi sono stati condotti sulla questione, i risultati sono in completo disaccordo mostrando associazioni positive, negative o assenti tra la densità minerale ossea (BMD) e la lunghezza del tratto CAG (Tabella 1). Inoltre, la maggior parte degli studi condotti su questo argomento sono trasversali e hanno considerato uomini sani o soggetti affetti da sindrome di
37
Klinefelter (Tabella 1). Nessuno studio ha valutato l'impatto della AR CAG lunghezza del tratto nel condizionare i cambiamenti del metabolismo osseo nei soggetti sottoposti a TRT. Pertanto, date queste premesse, abbiamo effettuato una valutazione longitudinale di uomini affetti da un particolare tipo di ipogonadismo, ovvero ipogonadismo ipogonadotropo post-chirurgico, al fine di valutare la possibile influenza di AR CAG polimorfismo sulle variazioni del metabolismo osseo dopo TRT. In particolare, abbiamo voluto valutare i possibili effetti del polimorfismo CAG sul metabolismo osseo maschile indipendentemente dagli effetti risultanti dalle terapie di sostituzione della funzione pituitaria [i.e. ormone della crescita (GH), levotiroxina e la terapia cortisonica] [8-10], che sono spesso co-somministrate nell’ ipogonadismo ipogonadotropo postchirurgico.
Materiali e metodi Soggetti 16 uomini sono stati valutati retrospettivamente. I criteri di inclusione sono stati: a) ipogonadismo ipogonadotropo [2,11] causato dalla rimozione di adenoma ipofisario; b) la mancanza di uno squilibrio ormonale, compresi quelli relativi al testosterone, prima di un intervento chirurgico; c) presenza di dati di follow-up per tutta la durata dello studio. La valutazione strumentale e biochimica al tempo 0 (inizio di TRT) e nella fase di recupero [prima dell’ottava iniezione di testosterone undecanoato (74-84 settimane dopo la prima)] veniva effettuata. Somministrazione di testosterone undecanoato (1000 mg, im) è stata eseguita 6 settimane dopo la prima (dose di carico), seguita da iniezioni simili dopo 10-14 settimane a seconda delle caratteristiche cliniche e biochimiche [12]. Tutti i pazienti avevano un deficit di funzione sia somatotropa che gonadotropica [2,11,13]; tra questi, quattro avevano anche deficit della funzione tireotropa [14], due anche un deficit corticotropo [15] e tre deficit sia tireotropi e corticotropo. I glucocorticoidi (cortisone acetato, 37,550 mg al giorno), l’ormone somatotropo (GH umano ricombinante, 0,3-0,6 mg al giorno) e la 38
terapia con levotiroxina (levotiroxina, 75-100 mcg al giorno) sono stati iniziati in base al deficit specifico. Terapie sostitutive con acetato di cortisone e levotiroxina sono state iniziate al momento della diagnosi del deficit. La somministrazione di GH ricombinante umano e testosterone è iniziata tra 6 e 12 mesi dopo l'intervento chirurgico; nessun soggetto iniziava la terapia sostitutiva con GH umano ricombinante prima della TRT. Il periodo tra la chirurgia e l'inizio del TRT (tempo 0) è stata considerata come la durata di ipogonadismo. Questo studio è retrospettivo e i dati considerati facevano parte del work-up diagnostico, fatta eccezione per la valutazione del metabolismo genetica e delle ossa, che è stata effettuata nell'ambito di un protocollo di ricerca.
Misurazione BMD BMD è stata misurata mediante dual-energy X-ray assorbimetria a livello della colonna lombare (L2-L4) e dei siti di sinistra del femore (sia il collo che il trocantere sono stati considerati) utilizzando il densitometro Lunar Prodigy® (GE Healthcare, Madison, WI). I valori T-score sono stati presi in considerazione [16]. Il software utilizzato è stato il Lunar Prodigy® Encore 2007 versione 11.4. Tutte le misurazioni sono state eseguite dallo stesso operatore.
La valutazione biochimica e ormonale Il prelievo di sangue è stato effettuato la mattina dopo il digiuno. I seguenti parametri sono stati valutati: l'ormone paratiroideo (PTH), 25-OH vitamina D, calcemia, calcio urinario 24h, telopeptide C-terminale del collagene di tipo I (CTX), fosfatasi alcalina ossea, folliclestimulating hormone (FSH), ormone luteinizzante (LH ), testosterone totale, estradiolo, T3 libera (FT3), T4 libera (FT4), cortisolo, insulin-like growth factor-1 (IGF-1), la prolattina. Marcatori del metabolismo osseo sono stati valutati mediante chemiluminescenza (25-OH vitamina D e fosfatasi alcalina ossea) e elettrochemiluminescenza immunologico (CTX). Il calcio sierico e urinario sono stati misurati con il metodo fotometrico. Tutti i dosaggi ormonali sono stati effettuati utilizzando kit commerciali di 39
immunodosaggio. I range di riferimento di normalità per i parametri biochimici studiati erano: PTH, 10-65 pg / ml; 25-OH vitamina D,> 19 ng / ml; calcemia, 8,5-10,5 mg / dl; calcio urinario delle 24h, 100-300 mg / 24 h; CTX, <700 pg / ml; fosfatasi alcalina ossea, 4-21 mcg / l; FSH, 1,7-6,9 IU / L; LH, 1,6-10,0 IU / L; testosterone totale, 3-8,5 ng / mL; estradiolo, 11-47 pg / mL; FT3, 2,3-4,2 pg / mL; FT4, 0,8-1,8 ng / dL; cortisolo (08:00), 7-27,5 mcg / dl; IGF-1, 66-251 ng / mL per i maschi tra i 40 e i 50 anni; 57-221 ng / mL per i maschi tra i 50 e i 60 anni; 46-211 ng / ml per i maschi tra i 60 e i 70 anni; prolattina, 2-15 ng / mL.
Reazione a catena della polimerasi (PCR) amplificazione e sequenziamento Il DNA è stato estratto dal sangue mentre l'amplificazione del tratto AR CAG è stata effettuata utilizzando protocolli già usati. In breve, l'esone 1 regione di AR, che codifica il tratto di poliglutammine, è stato amplificato mediante PCR. Prodotti amplificati sono stati sequenziati con il metodo di sequenziamento diretto (BigDye Terminator Sequencing Kit, Applied Biosystem, CA, USA) su un XL sequencer CEQ 2000 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).
Analisi statistica Il test di Shapiro-Wilk è stato applicato per verificare la normale distribuzione delle variabili continue. I dati sono presentati come media e deviazione standard. Gli indici di metabolismo osseo e le variazioni ormonali tra le due fasi (Δ-) sono stati calcolati come il valore attuale in fase di recupero meno il valore attuale al tempo 0. Il confronto statistico tra le due fasi è stato realizzato utilizzando il test di Student per dati appaiati. Per studiare l'effetto di AR CAG polimorfismo sul metabolismo osseo, indipendente da quella degli ormoni co-somministrati, è stato eseguito un approccio a due fasi. Innanzitutto, correlazioni di Pearson sono state effettuate tra le significative variazioni ormonali e il numero di triplette CAG AR con le variazioni significative di indici del metabolismo osseo. Poi, l'analisi di regressione lineare multipla è stata eseguita ponendo come variabili indipendenti quei parametri che, alla correlazione di Pearson, risultavano essere 40
significativamente correlate con le significative variazioni degli indici del metabolismo osseo e come variabili dipendenti, una alla volta, le significative variazioni degli indici del metabolismo osseo. La significatività è stata fissata a P <0,05. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando SPSS 16 package (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Risultati La tabella 2 mostra le caratteristiche generali e i parametri ormonali del campione studiato. Variazioni ormonali significative tra le due fasi sono state osservate per il testosterone totale, estradiolo, IGF-1 (aumento di concentrazione) (Tabella 2). Tuttavia, mentre i marcatori sierici non variavano significativamente dopo TRT, BMD e t-score miglioravano leggermente ma significativamente in tutti i siti studiati (Tabella 3). La tabella 4 presenta le correlazioni di Pearson tra le variazioni ormonali statisticamente significative (Δ-), vale a dire testosterone, estradiolo, e IGF-1, e del numero di triplette CAG con Δ-BMD nei siti studiati. Il numero di triplette CAG correlava negativamente e significativamente con tutti i Δ-BMD studiati (Tabella 4). Viceversa, Δtestosterone correlava positivamente e significativamente con tutti i Δ-BMD, mentre estradiolo e ΔIGF-1 non correlavano significativamente con qualsiasi Δ-BMD (Tabella 4). L'analisi di regressione lineare multipla veniva effettuata includendo, come variabili dipendenti, uno alla volta, i vari ΔBMD e, come variabili indipendenti, sia il numero di triplette CAG che il Δ-testosterone. Dopo correzione per Δ-testosterone, la lunghezza del tratto CAG è stata negativamente e significativamente associata con il Δ-BMD lombare, Δ-BMD collo e Δ-BMD trocantere (Tabella 5).
Discussione Data la scarsità e l'incoerenza dei dati di letteratura su questo argomento, abbiamo voluto valutare il ruolo del polimorfismo CAG nel condizionare le variazioni del metabolismo osseo in una popolazione altamente selezionata di uomini affetti da ipogonadismo ipogonadotropo postchirurgico sottoposti TRT. Abbiamo scoperto che la lunghezza più corta del tratto CAG è 41
indipendentemente associata con un più marcato miglioramento della densità ossea dopo TRT. I nostri dati sono, in una certa misura, in accordo con quelli di studi trasversali che hanno trovato un'associazione inversa tra la lunghezza del tratto AR CAG con la densità ossea nei maschi sani e soggetti Klinefelter [17-19], sostenendo in tal modo la teoria che l’attività trascrizionale basale del AR è inversamente correlata con il numero di ripetizioni CAG [20]. Inoltre, va rilevato che, nella nostra popolazione, TRT causava solo un leggero miglioramento dei parametri di densità ossea in soggetti che avevano BMD perfettamente normale e t-score al basale. Questo è probabilmente dovuto al fatto che TRT stimolava il recupero della piccola quantità di mineralizzazione dell'osso che era stato perso durante i mesi di ipogonadismo (vedi Tabella 2). Di conseguenza, dati di letteratura dimostrano che TRT è particolarmente efficace in quei pazienti con deficit basale marcato della densità ossea [17]. Un altro aspetto da considerare è che, in caso di ipogonadismo ipogonadotropo post-chirurgico, la frequente co-somministrazione di ormoni sostitutivi della funzione pituitaria, cioè l'ormone della crescita (GH), la levotiroxina e la terapia cortisonica, potrebbe influenzare il rapporto tra il metabolismo osseo e il polimorfismo CAG. Per quanto riguarda questo aspetto, la terapia sostitutiva con GH migliora la bassa BMD nel deficit di GH esordio adulto [21]. Fisiologicamente, questo ormone, insieme al suo effettore periferico (IGF-1), contribuisce a mantenere la massa ossea anche nello scheletro adulto, agendo direttamente sulla formazione e l'attività [8] degli osteoclasti e agisce sugli osteoblasti, aumentando la loro proliferazione, stimolando un fenotipo differenziato e promuovendo la produzione di matrice [8]. Per quanto riguarda invece gli ormoni tiroidei, questi mediatori svolgono un ruolo omeostatico sulla massa ossea adulta, come dimostrato dal fatto che l'ipotiroidismo e ipertiroidismo sono associati ad un aumentato rischio di frattura [9]. In realtà, sia T3 che l’ormone stimolante la tiroide agiscono direttamente sullo scheletro adulto, esercitando prevalentemente un effetto catabolico [9]. Inoltre, per quanto riguarda il cortisolo, l’ipercortisolismo è associato a perdita di tessuto osseo [10,22-24] e la diminuzione della densità ossea non è infrequente, nei soggetti sottoposti a terapia sostitutiva con glucocorticoidi [e.g. Morbo di Addison 42
[25] o Deficienza isolata di ACTH [26]] [27,28]. In realtà, questo ormone favorisce processi catabolici diminuendo il numero e la funzione degli osteoblasti, aumentando la degradazione della matrice di collagene osseo e anche inducendo osteoclastogenesi [10]. Tuttavia, nonostante queste relazioni teoriche, né GH, né levotiroxina né terapia cortisonica e neppure le variazioni sieriche di testosterone tra le due fasi, sembravano modificare il rapporto fra il polimorfismo CAG e la densità ossea nel nostro campione. Infine, la nostra scoperta di un'associazione indipendente tra polimorfismo CAG e Δ-BMD sottolinea l'importanza del ruolo diretto di AR nel mediare gli effetti ossei di testosterone. In realtà, è stato a lungo ritenuto che molti degli effetti positivi di androgeni sulla mineralizzazione dell'osso erano effettivamente dovuti all'azione degli estrogeni derivata dall’aromatizzazione [3,7]. Tuttavia, nei nostri soggetti, anche se i livelli di estradiolo sono aumentati in modo significativo dopo la somministrazione di TRT (tabella 2), questo non influenzava il miglioramento dei parametri di densità ossea (Tabella 3). Inoltre, va detto che, negli uomini affetti da Sindrome di Morris, una malattia recessiva X-linked causata da mutazioni del AR [29], Bertelloni et al. hanno trovato una diminuita densità ossea a livello della colonna lombare e dell'anca rispetto ai controlli, confrontabili per età e sesso [30]. Analogamente, nella stessa sindrome, Sobel et al. hanno riportato che BMD è stato sostanzialmente ridotto nel gruppo di pazienti rispetto ai valori standard di maschi [31]. Inoltre, il selettivo blocco AR negli uomini con cancro alla prostata provoca perdita significativa di BMD, evidenziando ulteriormente la rilevanza di azione degli androgeni sul tessuto osseo attraverso la via AR [32]. Pertanto l'importanza di un ruolo diretto del testosterone sul tessuto osseo è completamente supportata anche dai risultati precedenti. Va sottolineato che il limite principale di questo lavoro è il piccolo numero di soggetti studiati. Per quanto riguarda questo aspetto, vale la pena ricordare che, anche se le correlazioni tra Δtestosterone e Δ-BMD erano, come previsto, positive e significative (Tabella 4), Δ-testosterone, dopo l’inserimento in regressione lineare con la tripletta CAG, ha mostrato una correlazione positiva con tutte le Δ-BMD, ma senza raggiungere la significatività statistica in qualsiasi di queste 43
(dati non mostrati). In realtà, questo risultato potrebbe essere dovuto al numero limitato di pazienti. Inoltre, si deve ricordare che i nostri risultati derivano da un particolare campione di uomini con normale BMD, nei quali gli effetti TRT erano veramente minimi, senza alcuna rilevanza clinica. Una ripetizione del nostro protocollo su un campione di soggetti affetti da ipogonadismo primario potrebbe consentire, non solo di studiare una popolazione più ampia, ma anche di valutare l'impatto del polimorfismo su alti variazioni della BMD. In conclusione, questa sezione dimostra che la minore lunghezza del tratto CAG è indipendentemente associata ad un maggior miglioramento di BMD in uomini affetti da ipogonadismo ipogonadotropo post-chirurgico che si sottopongono a TRT. La possibile ulteriore conferma su questo argomento potrebbe portare all'introduzione, nella pratica clinica, della valutazione del polimorfismo CAG al fine di predire la risposta del metabolismo osseo nei soggetti sottoposti a TRT e, quindi, alla scelta di una dose di testosterone ottimale su base individuale [33].
44
Tabella 1. Principali studi che hanno considerato l'associazione tra polimorfismi CAG e il metabolismo osseo negli uomini. Nota
Metodologia
Populazione studiata
Zitzmann et al. [17]
Studio trasversale
Uomini sani
Van Pottelbergh et al. [39]
Studio trasversale
Uomini sani
Langdahl et al. [34]
Studio caso controllo
Remes et al. [35]
Studio longitudinale
Zitzmann et al. [18]
Studio trasversale
pazienti Klinefelter
Valimaki et al. [36]
Studio trasversale
uomini sani
Stiger et al. [37]
Studio longitudinale
Campione casuale di uomini svedesi
Uomini normali e affetti da osteoporosi Campione casuale di uomini finlandesi
Guadalupe et al. [19]
Studio trasversale
uomini sani
Ferlin et al. [38]
Studio trasversale
pazienti Klinefelter
AR = recettore androgeni; BMD = densità minerale ossea.
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Riassunto dei risultati Un elevato numero di ripetizioni CAG attenua gli effetti del testosterone sulla densità ossea e sul metabolismo osseo. La lunghezza del tratto CAG non è associata con le misurazioni della BMD. BMD è positivamente correlata con la lunghezza del polimorfismo CAG. Nessuna differenza statisticamente significativa tra il genotipo CAG e le ossa sono evidenti. La densità ossea è inversamente proporzionale alla lunghezza delle ripetizioni CAG. Il polimorfismo CAG non ha un impatto sostanziale sul picco di massa ossea. Un’associazione positiva tra il polimorfismo CAG e il BMD è evidente. Vi è un'associazione inversa tra la lunghezza della ripetizione CAG e il contenuto minerale osseo del triangolo di Ward. Il polimorfismo CAG dell’ AR sembra non contribuire alla diminuzione della massa ossea nei soggetti Klinefelter.
Tabella 2. Caratteristiche ormonali e generali dei soggetti studiati.
Età (anni) Durata di ipogonadismo (mesi) Numero di triplette CAG
Caratteristiche generali 56.66 ± 8.54 8.86 ± 1.98 18.23 ± 3.61 Caratteristiche ormonali p+++
0.83 ± 0.29
∆ -0.45 (-0.65- 0.25) -0.17 ± 0.34
1.58 ± 0.55
3.93 ± 0.39
2.45 ± 0.75
< 0.001
7.86 ± 1.85 3.26 ± 0.51 1.23 ± 0.27 14.50 (1118.80) 34.99 ± 7.65 6.88 ± 2.98
33.80 ± 10.91 3.13 ± 0.49 1.35 ± 0.19 14.50 (10.4018.20) 153.33 ± 41.35 7.38 ± 3.18
25.93 ± 12.13 -0.11 ± 0.72 0.09 ± 0.45
< 0.001 NS NS
0.80 (-6- 1.9)
NS
119.20 ± 44.73 0.55 ± 4.85
< 0.001 NS
Tempo 0
Fase di recupero
FSH (IU/L)
0.80 (0.60-1)
0.60 (0.40-0.80)
LH (IU/L) Testosterone Totale (ng/mL) Estradiolo (pg/mL) FT3 (pg/mL) FT4 (ng/dL)
0.98 ± 0.45
Cortisolo (mcg/dL) IGF-1 (ng/mL) Prolattina (ng/mL)
NS NS
I Valori sono espressi come media ± deviazione standard. +++
Confronto statistico tra il tempo 0 e la fase di recupero.
AR = recettore degli androgeni; ∆ = variazione; FSH = follicle-stimulating hormone; LH = luteinizing hormone; FT3 = T3 libero; FT4 = T4 libero; IGF-1 = insulin-like growth factor-1; NS = non significativo.
46
Tabella 3. Indici del metabolismo osseo dei soggetti studiati nella due fasi. Tempo 0
Fase di recupero
∆
p+++
PTH (pg/ml)
36.83 ± 8.86
41.25 ± 12.84
4.51 ± 9.99
NS
25-OH vitamina D (ng/ml)
32.50 ± 6.20
31 ± 6.02
-1.51 ± 5.87
NS
Calcemia (mg/dl)
8.80 ± 0.28
8.99 ± 0.38
0.18 ± 0.77
NS
calcio Urinario 24h (mg/24h)
214.68 ± 27.20
225 ± 51.55
11.83 ± 47.84
NS
CTX (pg/ml)
493.75 ± 56.68
415.88 ± 115.35
-76.91 ± 120.9
NS
14.97 ± 3.44
13.87 ± 2.90
-1.90 ± 3.32
NS
t-score lombare
0.73 ± 0.54
1.19 ± 0.49
0.44 ± 0.16
< 0.001
t-score collo femore
0.37 ± 0.45
0.49 ± 0.43
0.12 ± 0.04
< 0.001
t-score trocantere
-0.08 ± 0.16
0.16 ± 0.18
0.24 ± 0.07
< 0.001
BMD lombare (g/cm2)
1.12 ± 0.06
1.17 ± 0.06
0.06 ± 0.02
< 0.001
BMD collo femore (g/cm2)
0.94 ± 0.04
0.96 ± 0.04
0.02 ± 0.006
< 0.001
BMD trocantere (g/cm2)
0.79 ± 0.01
0.82 ± 0.03
0.03 ± 0.006
< 0.001
Fosfatasi alcalina ossea (mcg/l)
I valori sono espresso come media e deviazione standard. +++
Confronto statistico tra il tempo 0 e fase di recupero.
Δ = variazione; PTH = ormone paratiroideo; CTX = C-terminal telopeptide; BMD = densità minerale ossea; NS = non significativo.
47
Tabella 4. Correlazioni di Pearson tra le variazioni ormonali statisticamente significative tra le due fasi e il numero delle triplette CAG con le variazioni statisticamente significative del BMD.
Numero di triplette ∆-testosterone
Δ-estradiolo
∆-IGF-1 CAG
r: 0.815
r: -0.890
∆-BMD lombare
NS
NS
p < 0.001
p < 0.001
r: 0.794
r: -0.862
∆-BMD collo femore
NS
NS
p < 0.001
p < 0.001
r: 0.803
r: -0.910
∆-BMD Trocantere
NS p < 0.001
NS p < 0.001
AR = recettore degli androgeni; Δ = variazione; BMD = densità minerale ossea; FSH = folliclestimulating hormone; FT4 = T4 libero; IGF-1 = insulin-like growth factor-1; NS = non significativo.
48
Tabella 5. Effetto della polimorfismo CAG sulla BMD. Lunghezza CAG Coefficiente β non standardizzato (95 % p CI)+++
+++
∆-BMD lombare (g/cm2)
-0.006 (-0.007- -0.004)
< 0.001
∆-BMD collo femore (g/cm2)
-0.001 (-0.003- -0.0002)
0.023
∆-BMD trocantere (g/cm2)
-0.003 (-0.004- -0.002)
0.004
= corretto per Δ-testosterone; AR = recettore androgeni; CI = intervallo di confidenza;
Δ=variazione; BMD = densità minerale ossea.
49
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54
IVa PARTE OUTCOME COMPOSIZIONE CORPOREA
È ben noto che uno dei meccanismi attraverso i quali il testosterone influenza il profilo metabolico è l'effetto sulla composizione corporea (1). Il calo di testosterone legato all’invecchiamento negli uomini è uno dei fattori che provoca l'accumulo di grasso addominale, contribuendo ad un maggiore rischio di sindrome metabolica, diabete di tipo 2 e malattia coronarica (2-5). Allo stesso modo, nei pazienti affetti da ipogonadismo, la terapia sostitutiva di testosterone (TRT) determina una diminuzione di adiposità totale e viscerale (6,7) e un aumento di massa magra (7). I risultati riguardanti l'associazione del polimorfismo CAG con la composizione corporea sono contraddittorie. Negli studi che hanno analizzato soggetti sani, soggetti selezionati residenti in comunità o reclutati in modo casuale, alcuni Autori hanno identificato un rapporto del numero di CAG con varie misure del grasso corporeo (cioè massa grassa totale, del tronco, della coscia) (1,8,9) e la massa magra (totale, coscia, tronco) (1,8,10), mentre altri non hanno trovato alcuna associazione (11,12). In particolare, studi longitudinali sono stati condotti che hanno valutato l'impatto del polimorfismo CAG nel condizionare gli effetti della TRT sulla quantità di composizione corporea in soggetti affetti da ipogonadismo. Date queste premesse, l'obiettivo del nostro lavoro è stato quello di studiare il ruolo del polimorfismo CAG sulle variazioni della composizione corporea in soggetti affetti da ipogonadismo sottoposti a TRT; ci siamo concentrati sull’ipogonadismo ipogonadotropo post-chirurgica, una rara condizione che è di solito associata con ipopituitarismo parziale o totale.
Materiali e metodi Soggetti 16 uomini sono stati retrospettivamente considerati. I criteri di inclusione sono stati: a) ipogonadismo ipogonadotropo (2, 13) a causa della rimozione chirurgica di adenoma ipofisario; b)
55
la mancanza di uno squilibrio ormonale, compreso l’ipogonadismo, prima di un intervento chirurgico; c) la disponibilità dei dati di follow-up.
Protocollo di studio Valutazione strumentale e biochimica all'inizio del TRT (tempo 0) e nella fase di recupero [prima dell'ottava iniezione di testosterone undecanoato (74-84 settimane dopo la prima)] è stata effettuata. Somministrazione di testosterone undecanoato (1000 mg, im) è stata eseguita 6 settimane dopo la prima (dose di carico), seguita da iniezioni simili dopo 10-14 settimane a seconda del profilo clinico e biochimico (14). I deficit della funzione pituitaria erano i seguenti: tutti i pazienti avevano un deficit sia della funzione somatotropa che della funzione gonadotropica (2,13,15), quattro anche un deficit di funzione tireotropica (16), due soggetti anche deficit corticotropo (17) e tre un deficit sia tireotropico che corticotropo. I glucocorticoidi (cortisone acetato, 37,5-50 mg al giorno), le terapie sostitutive con ormone somatotropo [ormone della crescita umana ricombinante (GH), 0,3-0,6 mg al giorno] e tiroideo (levotiroxina, 75-100 mcg al giorno) sono stati avviate in base al deficit specifico. Terapie sostitutive con acetato di cortisone e levotiroxina sono state avviate sulla diagnosi del deficit. Il GH umano ricombinante e il testosterone sono stati somministrati fra 6 e 12 mesi dopo l'intervento chirurgico; in tutti i nostri soggetti, la terapia sostitutiva con GH ricombinante umano è stato avviato prima del TRT. Il periodo tra la chirurgia e l'inizio del TRT (tempo 0) è stato considerato come durata di ipogonadismo. Questo studio è di carattere retrospettivo e i dati considerati erano parte del protocollo diagnostico, con l'eccezione della valutazione genetica e della composizione corporea, che sono state effettuate come parte di un protocollo di ricerca.
Misurazione della composizione corporea
56
La misurazione della composizione corporea è stata effettuata come precedentemente descritto (3). In breve, è stato utilizzato uno scanner dual energy x-ray assorbimetria (DEXA) total body (Lunar Prodigy, GE Medical Systems, Madison, WI, software Encore 2007 versione 11.4.). L'intero corpo è stato scansionato. Le immagini acquisite di tutto il corpo sono stati suddivise in testa, tronco, braccio e gambe sinistra e destra. La zona addominale, che è stato dimostrato avere un contenuto relativamente elevato di grasso viscerale e un basso contenuto di grasso sottocutaneo alla risonanza magnetica (18), è stata anche misurata mediante DEXA tra le vertebre L2 e L4. Tutte le scansioni sono stati ottenute e analizzate dallo stesso medico. Il grasso corporeo e la quantità magra sono state espresse in grammi.
Valutazione ormonale I campioni di sangue sono stati prelevati alle 8 del mattino dopo il digiuno. Sono stati considerati i seguenti parametri: ormone follicolo-stimolante (FSH), ormone luteinizzante (LH), testosterone totale, T3 libera (FT3), T4 libera (FT4), cortisolo, insulin-like growth factor-1 (IGF-1) e prolattina. Tutti i dosaggi ormonali sono stati eseguiti da kit commerciali di immunodosaggio. I valori di riferimento per i parametri ormonali studiati erano: FSH, 1,7-6,9 IU / L; LH, 1,6-10,0 IU / L; testosterone totale, 3-8,5 ng / mL; FT3, 2,3-4,2 pg / mL; FT4, 0,8-1,8 ng / dL; cortisolo (08:00), 727,5 mcg / dl; IGF-1, 66-251 ng / mL per i maschi tra i 40 e i 50 anni; 57-221 ng / mL per i maschi tra i 50 e i 60 anni; 46-211 ng / ml per i maschi tra i 60 e i 70 anni; prolattina, 2-15 ng / mL.
Reazione a catena della polimerasi (PCR) amplificazione e sequenziamento Abbiamo effettuato un protocollo precedentemente descritto per l'amplificazione del tratto CAG (19). Il DNA è stato estratto dal sangue e il polimorfismo del gene AR CAG è stato analizzato utilizzando PCR. Il numero di ripetizioni CAG è stato analizzato sequenziando gli appropriati prodotti PCR, con il metodo di sequenziamento diretto (BigDye Terminator Sequencing Kit,
57
Applied Biosystem, CA, USA) su un XL sequencer CEQ 2000 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).
Analisi statistica Il test di Shapiro-Wilk è stato applicato per verificare la distribuzione normale delle variabili continue. I dati sono espressi come mediana (range interquartile) quando non-normalmente distribuiti, e come media ± deviazione standard quando normalmente distribuiti. Variazioni dei parametri studiati tra le due fasi sono state calcolate come il valore nella fase di recupero meno il valore attuale al tempo 0. Il confronto statistico tra le due fasi è stata effettuata utilizzando il test di Student per dati appaiati. Per studiare l'effetto del polimorfismo CAG sulla composizione corporea, in modo indipendente da quella degli ormoni somministrati, è stato adottato un approccio in due fasi. In primo luogo, correlazioni di Pearson o Spearman di significative variazioni ormonali e del numero di triplette CAG AR con significative variazioni della composizione del corpo sono state effettuate. Poi, l'analisi di regressione lineare multipla è stata eseguita ponendo come variabili indipendenti quei parametri che, alla correlazione bivariata, sono risultati essere significativamente correlati con le significative variazioni degli indici della composizione corporea e come variabili dipendenti le significative variazioni delle misurazioni della composizione corporea. Il livello di significatività è stato fissato a P <0,05. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando SPSS 16 package (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Risultati La tabella 1 mostra le caratteristiche generali ed ormonali dei soggetti studiati. Variazioni ormonali significative tra le due fasi sono state osservate per il testosterone totale e l’IGF-1 (aumento di concentrazione) (Tabella 1). Tra i parametri di composizione antropometrici e del corpo, solo la circonferenza della vita e il grasso addominale diminuivano dopo TRT, mentre nessun’altra variazione significativa delle altre misure era evidente (Tabella 2). Il numero di triplette CAG 58
correlava positivamente e significativamente (r: 0,728; p <0.001) con variazione (Δ-) di grasso addominale, mentre Δ-testosterone mostrava una correlazione inversa con il grasso Δ-addominale (r: -0,590; p: 0.023 ). Δ grasso addominale non correlava significativamente con il Δ-IGF-1. L'analisi di regressione lineare multipla è stata effettuata includendo, come variabile dipendente, il grasso Δ-addominale e, come variabili indipendenti, sia il numero di triplette CAG e il Δtestosterone. Dopo aggiustamento per Δ-testosterone, la lunghezza CAG era positivamente e significativamente associata con Δ-addominale di grasso (tabella 3).
Discussione Il testosterone è uno degli ormoni che più influenza la composizione corporea. È infatti noto che il testosterone inibisce l'accumulo di grasso tramite il suo legame con AR che hanno una densità maggiore nel tessuto viscerale rispetto al tessuto adiposo sottocutaneo (20). Inoltre, il testosterone gioca un ruolo inibitorio sull'attività lipoproteina lipasi e glicerofosfato deidrogenasi, ostacolando l'accumulo di lipidi e favorendo la lipolisi negli adipociti viscerali (21). Viceversa, la diminuzione del livello di testosterone potrebbe essere coinvolta nella mancanza di regolazione negativa sia della differenziazione di preadipociti in adipociti maturi e della differenziazione delle cellule staminali in adipociti, portando dunque a ipogonadismo dovuto a sovrappeso (2). Per quanto riguarda la massa magra, la somministrazione di testosterone stimola la sintesi proteica muscolare, provoca fibre muscolari ipertrofia e aumenta il numero di mionuclei per fibra (22). Inoltre, il testosterone esercita effetti inibitori sulla differenziazione delle cellule multipotenti mesenchimali in cellule adipogeniche e promuove la loro differenziazione in cellule della linea miogenica (22). Questo lavoro ha valutato per la prima volta l'impatto del polimorfismo CAG sugli effetti della TRT sulla composizione corporea in soggetti affetti da ipogonadismo ipogonadotropo post-chirurgico. Abbiamo osservato che la lunghezza più corta di CAG è indipendentemente associata ad una maggiore diminuzione del grasso viscerale dopo TRT. Coerentemente con gli effetti benefici del testosterone sulla massa grassa, la Δ- grasso addominale è risultata essere negativamente e 59
significativamente correlata con Δ-testosterone, un indice indiretto del dosaggio dell'ormone somministrato. Tuttavia, nel nostro campione, il rapporto tra il numero di triplette CAG e la diminuzione di grasso addominale è rimasta significativa anche dopo correzione per Δ-testosterone (Tabella 3), in tal modo rafforzando ulteriormente il ruolo indipendente del polimorfismo nella regolazione massa grassa. A questo proposito, Zitzmann et al. hanno mostrato, in uno studio trasversale che ha valutato 106 maschi sani tra i 20 e i 50 anni, che un basso numero di ripetizioni CAG era indipendentemente associata a bassa massa grassa, valutata mediante bioimpedenza (9). Inoltre, Nielsen et al. ha riportato che, in 393 uomini esaminati con la risonanza magnetica, il numero di CAG correlava positivamente con tessuto adiposo sottocutaneo della coscia e con il grasso degli arti inferiori e totale (8). Inoltre, Lapauw et al., in 159 uomini di età compresa tra 75 e 89 anni, ha trovato che bassi livelli di testosterone portano ad una maggiore quantità di massa grassa in soggetti con lunghezza CAG più lunga rispetto a quelli con una lunghezza inferiore (1) . Tuttavia, si deve anche riconoscere che altri autori non hanno trovato alcuna associazione tra il numero di CAG e il grasso corporeo (11, 12). Inoltre, nei nostri soggetti il TRT induce una diminuzione della quantità di grasso viscerale anche quando non erano presenti variazioni di altri parametri di distribuzione del grasso (Tabella 2). Per quanto riguarda questo aspetto, alcune prove dimostrano che TRT provoca una riduzione del grasso corporeo totale, diversamente associate ad una sua diminuzione nel tronco, addome, gambe e braccia (6,7,23,24). In accordo con i nostri risultati, Kapoor et al. hanno scoperto che TRT ha comportato una riduzione delle adiposità viscerale, come valutato dalla circonferenza vita e dal rapporto vita / fianchi, nonostante la mancanza di significato nella diminuzione della percentuale di grasso corporeo (6). Nei nostri soggetti le variazioni trascurabili dei del parametri del grasso corporeo dopo TRT sono probabilmente dovute al fatto che TRT facilita la perdita della piccola quantità di grasso viscerale accumulato durante i mesi di ipogonadismo (Tabella 1). L'azione selettiva del testosterone sul grasso viscerale comporterebbe quindi una diminuzione della quantità di grasso che, in presenza di un introito di calorie invariato, sarebbe ridistribuita in altre aree del 60
corpo senza variare la quantità totale di grasso corporeo. Al contrario, in contrasto con la letteratura che segnala un aumento di massa magra nei soggetti affetti da ipogonadismo sottoposti a TRT (7), nel nostro campione questo parametro non è cambiato in modo significativo nel suo valore totale o regionale (tabella 2); anche in questo caso, è probabile che la breve durata di ipogonadismo non avrebbe causato variazioni significative della massa magra, impedendo che TRT influisca significativamente su questo parametro. Inoltre, è importante notare che, a causa di parziale o totale ipopituitarismo concomitante, soggetti ipogonadici, oltre a TRT, venivano sottoposti anche a terapie con ormone somatotropo, tiroideo e terapie di sostituzione corticotropa, trattamenti che sono teoricamente in grado di influenzare la composizione corporea. Per quanto riguarda questo aspetto, è noto che adulti e bambini con deficit di GH sono un aumento della massa grassa e la terapia ormonale sostitutiva in particolare diminuisce il grasso viscerale (25). Inoltre, la supplementazione con GH aumenta il volume di organi viscerali e muscolare (26). Invece, per quanto riguarda il cortisolo, questa terapia sostitutiva è in grado di aumentare il peso corporeo, con una ridistribuzione del tessuto adiposo a livello addominale e una riduzione del grasso sottocutaneo agli arti (27-30). Inoltre, questo ormone solitamente agisce sui muscoli inducendo atrofia tramite l'inibizione della sintesi proteica e l'attivazione della proteolisi muscolare (27). Infine, i pazienti ipotiroidei, il cui peso è in media del 15-30% superiore a quello degli eutiroidei, tornano ai valori ponderali normali durante la terapia sostitutiva (31); inoltre, un'influenza degli ormoni tiroidei sulla massa magra è plausibile (32). Nonostante queste considerazioni, nel nostro campione particolare, l'associazione tra la lunghezza CAG e la diminuzione del grasso viscerale legato al TRT legati non era influenzato da concomitanti terapie sostitutive della funzione ipofisaria. In conclusione, questa sezione ha dimostrato che una lunghezza inferiore del tratto CAG nell’ambito del polimorfismo CAG è indipendentemente associata con una diminuzione del grasso viscerale più marcata dopo TRT. In considerazione del ruolo del grasso addominale come fattore di rischio cardiovascolare (33-36), se ulteriori indagini dovessero confermare questa tendenza, lo 61
studio del polimorfismo CAG potrebbe diventare una variabile che deve essere presa in considerazione quando si valuta il profilo metabolico di soggetti sottoposti a TRT.
62
Tabella 1. Caratteristiche ormonali e generali dei soggetti studiati. Caratteristiche generali Età (anni)
56.66 ± 8.54
Durata di ipogonadismo (mesi)
8.86 ± 1.98
Numero di triplette CAG
18.23 ± 3.61 Caratteristiche ormonali Tempo 0
Fase di recupero
∆
pa
FSH (IU/L)
0.80 (0.60-1)
0.60 (0.40-0.80)
-0.45 (-0.65- 0.25)
NS
LH (IU/L)
0.98 ± 0.45
0.83 ± 0.29
-0.17 ± 0.34
NS
Testosterone totale (ng/mL)
1.58 ± 0.55
3.93 ± 0.39
2.45 ± 0.75
< 0.001
FT3 (pg/mL)
3.26 ± 0.51
3.13 ± 0.49
-0.11 ± 0.72
NS
FT4 (ng/dL)
1.23 ± 0.27
1.35 ± 0.19
0.09 ± 0.45
NS
Cortisolo (mcg/dL)
14.50 (11-18.80)
14.50 (10.40-18.20)
0.80 (-6- 1.9)
NS
IGF-1 (ng/mL)
34.99 ± 7.65
153.33 ± 41.35
119.20 ± 44.73
< 0.001
Prolattina (ng/mL)
6.88 ± 2.98
7.38 ± 3.18
0.55 ± 4.85
NS
I Valori sono espressi come media ± deviazione standard o mediana e range interquartile a seconda della normalità della distribuzione. a
Confronto statistico tra il tempo 0 e la fase di recupero.
AR = recettore degli androgeni; ∆ = variazione; FSH = follicle-stimulating hormone; LH = luteinizing hormone; FT3 = T3 libero; FT4 = T4 libero; IGF-1 = insulin-like growth factor-1; NS = non significativo. 63
Tabella 2. Parametri antropometrici e di composizione coroporea prima e dopo terapia sostituiva con testosterone.
Peso (kg) Vita (cm)
Grasso totale (g) Grasso tronco (g) Grasso braccia (g) Grasso gambe (g) Grasso Addominale (g)
Magro totale (g) Magro tronco (g) Magro braccia (g) Magro gambe (g) Magro addominale (g)
Parametri antropometrici Tempo 0 Fase di recupero 78.7 ± 11.4 76.7 ± 11.9 96.7 ± 10.3 94.7 ± 9.8 Grasso corporeo Tempo 0 Fase di recupero 24 172.7 ± 3 494.8 24 086.6 ± 3 142.2 13 694.7 ± 1 653.3 12 312.4 ± 1 997.2 2 694.5 ± 619.6 2 594.1 ± 692.5 7 781.3 ± 1 358.2 7 953.5 ± 1 392.7 3 055 ± 203.7 2 581.6 ± 210 Magro corporeo Tempo 0 Fase di recupero 52 521 ± 6 404.5 52 595 ± 7 406.8 26 105 ± 4 007.7 25 805 ± 4 302.8 6 983.6 ± 692.7 6 992 ± 641.8 16 314.7 ± 1 882 16 597.9 ± 2 977.3 3 654.4 ± 242.7 3 500 ± 232.3
∆ -1.8 ± 2.1 -2.4 ± 1.8
pa 0.003 <0.001
∆ - 99.1 ± 1 194.9 - 192.2 ± 693.1 82.5 ± 297.2 - 69.8 ± 389.4 - 253.3 ± 101.2
pa NS NS NS NS < 0.001
∆ -455.9 ± 1 900 -770.7 ± 1 427.5 18.3 ± 351.8 253 ± 1 523.4 -139.4 ± 286
pa NS NS NS NS NS
I Valori sono espressi come media ± deviazione standard o mediana e range interquartile a seconda della normalità della distribuzione. a
Confronto statistico tra il tempo 0 e la fase di recupero.
∆ = variazione.
64
Tabella 3. Influenza del polirmofismo sul grasso addominale. Lunghezza CAG Coefficiente β non standardizzato (95 % CI)+++
p
38.6 (18.3- 59.7)
0.004
Δ-grasso addominale (g)
a
= corretto per ∆-Testosterone; AR = recettore androgeni; CI = intervallo di confidenza; ∆ =
variazione.
65
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70
CONCLUSIONI FINALI La ricaduta pratica di questi riscontri è molto rilevante in ambito andrologico. È importante intanto premettere che i contributi realizzati sono veramente innovativi perché rappresentano i primissimi studi di carattere longitudinale sull’argomento. Inoltre, se questi risultati dovessero essere confermati da ulteriori studi, la determinazione della lunghezza del tratto CAG di questo polimorfismo potrebbe entrare nella routine clinica allo scopo di predire i miglioramenti di alcuni parametri in seguito a terapia sostitutiva con testosterone. Si potrebbero pertanto individuare quei soggetti più o meno responsivi alla terapia sostitutiva con testosterone e pertanto prescrivere un dosaggio di testosterone adeguato all’inizio della terapia.
71
