THÈSE En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Microbiologie
Présentée et soutenue par Sylvain CANTALOUBE Le Mardi 26 Janvier 2010
Architecture et essentialité des complexes de biosynthèse des acides mycoliques de la bactérie pathogène Mycobacterium tuberculosis JURY Dr. Emmanuelle BOUVERET ( LISM-Marseille) Pr. Nicolas BAYAN (Université Paris Sud) Dr. Alain BAULARD (Institut Pasteur Lille)
Rapporteur Rapporteur Rapporteur
Dr. Lionel MOUREY (IPBS-Toulouse)
Examinateur
Pr. Matthieu ARLAT (Université Paul Sabatier-Toulouse)
Président
Dr. Didier ZERBIB (IPBS-Toulouse)
Directeur de Thèse
Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologies de Toulouse Unité de recherche : Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale du CNRS (UMR 5089 UPS-CNRS) Directeur de Thèse : Dr. Didier ZERBIB
1
Remerciements Je souhaite tout d’abord remercier le Dr. Emmanuelle BOUVERET (LISM-Marseille), le Pr. Nicolas BAYAN (Université Paris Sud) et le Dr. Alain BAULARD (Institut Pasteur-Lille) d’avoir accepté d’être les rapporteurs de ce travail de thèse ainsi que le Dr. Lionel MOUREY (IPBS-Toulouse) et le Pr. Matthieu ARLAT (Université Paul Sabatier-Toulouse) d’avoir examiné mon travail. Je tiens à remercier Didier ZERBIB qui a dirigé ma thèse durant quatre années. Il a été enthousiasmant, tant humainement que scientifiquement, de travailler avec une personne audacieuse, brillante et désintéressée. Didier a tenté de m’apprendre l’obstination et la patiente mais également la rigueur dans la recherche scientifique. Je lui en suis reconnaissant. Merci également à tous ceux qui ont contribué à ce travail et qui ont partagé leur paillasse avec la mienne : Romain, Sandrine, Géraldine, Maxime, Marina, Annie, Mitko, Nabila, Cheikh, Julien, Clément, Mélanie, merci à vous. Enfin, mes sincères remerciements à tous ceux avec qui j’ai pu collaborer scientifiquement : Valérie et Lionel pour les structures de protéines, Jean-Yves et Jérome pour la microscopie, Wladimir pour la chromatographie d’affinité et Renaud pour les petis problèmes informatiques du quotidien. Je salue chaleureusement l’ensemble de l’équipe de Mamadou DAFFE pour m’avoir acueilli au sein de leur équipe : Fabienne, Kaymeuang, Nathalie, Anne, Marielle, Mamadou, Gilles, Sabine, Mathieu, Julien, Annaîk, Hédia, Emilie, Nawel, Françoise, Patricia,… De même, mes sincères salutations à Odile, Clara, Isabelle, Nana avec qui j’ai partagé mon bureau.
2
1.
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE................................................................................................ 8 1.1.
LA TUBERCULOSE................................................................................................................................ 9
1.1.1.
Le genre Mycobacterium.............................................................................................................. 10
1.1.2.
Données immunologiques de la tuberculose ............................................................................... 11
1.1.2.1.
Cycle infectieux de Mycobacterium tuberculosis................................................................................. 11
1.1.2.2.
Interaction hôte/pathogène : la phagocytose...................................................................................... 15
1.1.2.3.
Granulome : formation et rôle............................................................................................................. 16
1.1.2.4.
Contournement de l’activité bactéricide.............................................................................................. 19
1.1.3.
Traitements et prévention............................................................................................................. 24
1.1.3.1.
La vaccination : le BCG ...................................................................................................................... 24
1.1.3.2.
Traitement de la tuberculose ............................................................................................................... 25
1.2.
STRUCTURE DE L’ENVELOPPE MYCOBACTERIENNE ........................................................................ 30
1.2.1.
Organisation générale .................................................................................................................. 30
1.2.2.
La membrane plasmique .............................................................................................................. 33
1.2.3.
La paroi......................................................................................................................................... 33
1.2.3.1.
Le peptidoglycane................................................................................................................................ 34
1.2.3.2.
L’arabinogalactane ............................................................................................................................. 34
1.2.3.3.
La membrane externe ou mycomembrane ........................................................................................... 34
1.2.4. 1.3.
La capsule ou couche externe...................................................................................................... 37 BIOSYNTHESE DES ACIDES MYCOLIQUES ......................................................................................... 38
1.3.1.
Organisation générale .................................................................................................................. 38
1.3.2.
FAS-I ............................................................................................................................................ 40
1.3.3.
FAS-II........................................................................................................................................... 41
1.3.3.1.
Initiation du cycle FAS-II .................................................................................................................... 43
1.3.3.2.
Les condensases .................................................................................................................................. 45
1.3.3.3.
Les réductases ..................................................................................................................................... 47
1.3.3.4.
Les déshydratases................................................................................................................................ 50
1.3.4.
Modifications de la chaîne méromycolique ................................................................................. 51
1.3.4.1.
Généralités sur les modifications de la chaîne méromycolique........................................................... 51
1.3.4.2.
Formation des doubles liaisons cis...................................................................................................... 54
1.3.4.3.
Introduction de fonctions cyclopropanes et méthyles .......................................................................... 54
1.3.4.4.
Introduction de fonctions oxygénées.................................................................................................... 56
1.3.5.
Etape de condensation (figure 18) ............................................................................................... 56
1.3.5.1.
Activation de la chaîne méromycolique............................................................................................... 56
1.3.5.2.
Carboxylation de la chaîne α ............................................................................................................. 58
1.3.5.3.
Condensation mycolique par Pks13 (figure 18).................................................................................. 62
1.3.5.4.
Réduction finale et transfert ................................................................................................................ 62
1.3.6. 1.4.
Les antibiotiques ciblant spécifiquement la biosynthèse des acides mycoliques ........................ 63 FAS-II, UNE ORGANISATION COMPLEXE : STRUCTURE ET REGULATION........................................ 66
1.4.1.
Interactions protéine-protéine au sein de la voie de biosynthèse des acides mycoliques. .......... 66
1.4.2.
Régulation du système FAS-II..................................................................................................... 68
3
1.4.3.
Des interactions essentielles, cibles privilégiées dans la recherche de nouveaux
antituberculeux ? ........................................................................................................................................ 70 1.5. 2.
HYPOTHESES DE TRAVAIL................................................................................................................. 72
DETERMINATION DE L’INTERACTOME DE LA BIOSYNTHESE DES ACIDES
MYCOLIQUES................................................................................................................................................... 74 2.1.
METHODE EXPERIMENTALE : LE DOUBLE HYBRIDE CHEZ LA LEVURE .......................................... 77
2.2.
LES PROTEINES RESPONSABLES DE L’ACTIVATION DES SUBSTRATS DE PKS13............................... 81
2.2.1.
Etude en double hybride chez la levure ....................................................................................... 81
2.2.2.
Détermination des interactions en Co-IP .................................................................................... 86
2.3.
LES METHYLTRANSFERASES ............................................................................................................. 94
2.3.1.
Etude en double hybride chez la levure ....................................................................................... 94
2.3.2.
Détermination des interactions en Co-IP .................................................................................... 97
2.4.
LES DESHYDRATASES ...................................................................................................................... 101
2.4.2.
Etude en triple hybride des interactions protéine-protéine entre les complexes déshydratases et
les enzymes de FAS-II .............................................................................................................................. 104 2.4.3.
Etude en triple hybride des interactions entre les complexes déshydratases et les huit
méthyltransférases .................................................................................................................................... 106 2.5.
MODELISATION DU COMPLEXE FAS-II BASEE SUR LA STRUCTURE DE LA MEGA-ENZYME MFAS-I 111
2.5.1.
Méthodes et choix d’analyse ...................................................................................................... 111
2.5.2.
Modélisation des structures inconnues...................................................................................... 114
2.5.3.
Alignements structuraux des enzymes de la biosynthèse des acides mycoliques sur la structure
de mFAS-I................................................................................................................................................. 116 2.5.4.
Validation et amélioration du modèle d’interactome de la biosynthèse des acides mycoliques
chez Mtu.................................................................................................................................................... 121 3.
ETUDE DES INTERACTIONS HOMOTYPIQUES ESSENTIELLES DES REDUCTASES MABA
ET INHA............................................................................................................................................................ 125 3.1.
STRUCTURES ET CONSTRUCTIONS DE MUTANTS DES REDUCTASES MABA ET INHA .................... 127
3.1.1.
Caractéristiques structurales de MabA et InhA ........................................................................ 127
3.1.2.
Mutations aux interfaces d’interaction de MabA (Veyron-Churlet et al., 2004) ...................... 129
3.1.3.
Mutations aux interfaces d’interaction d’InhA......................................................................... 129
3.2.
RESULTATS PRELIMINAIRES ET OBJECTIFS .................................................................................... 131
3.2.1.
Résultats préliminaires et objectifs pour MabA ........................................................................ 131
3.2.2.
Résultats préliminaires et objectifs pour InhA .......................................................................... 132
3.3.
ETUDE DE LA PROTEINE MABA ...................................................................................................... 135
3.3.1.
Purification................................................................................................................................. 135
3.3.1.1.
Surexpression .................................................................................................................................... 135
3.3.1.2.
Purification........................................................................................................................................ 135
3.3.2.
Activité des protéines MabA sauvage et mutantes..................................................................... 137
4
3.3.2.1.
Cinétique de la protéine MabAWT ...................................................................................................... 137
3.3.2.2.
Tests d’activité (figure 46, tableau 14)............................................................................................. 139
3.3.3.
3.3.3.1.
Calibrations....................................................................................................................................... 140
3.3.3.2.
Gel filtration...................................................................................................................................... 142
3.3.4.
Structure du mutant MabA G162L ............................................................................................ 145
3.3.5.
Conclusions ................................................................................................................................ 146
3.4.
ETUDE DE LA PROTEINE INHA ........................................................................................................ 150
3.4.1.
Construction du mutant A252R ................................................................................................. 150
3.4.2.
Dominance négative ................................................................................................................... 150
3.4.3.
Etude des interactions homotypiques en double hybride chez la levure................................... 151
3.4.4.
Purification................................................................................................................................. 152
3.4.4.1.
Surexpression .................................................................................................................................... 153
3.4.4.2.
Extraction .......................................................................................................................................... 153
3.4.4.3.
Purification........................................................................................................................................ 153
3.4.5.
Chromatographie d’exclusion.................................................................................................... 155
3.4.6.
Conclusions ................................................................................................................................ 155
3.5.
ETUDE IN VIVO DES PROTEINES TRONQUEES ET DES DOMAINES DE MABA ET D’INHA ................ 158
3.5.1.
Protéines tronquées et domaines de MabA................................................................................ 159
3.5.1.1.
Stabilisation des protéines tronquées en C-terminal de MabA et dominance négative ..................... 159
3.5.1.2.
Stabilisation des domaines internes de MabA et dominance négative............................................... 161
3.5.2. 4.
Chromatographie d’exclusion.................................................................................................... 140
Protéines tronquées d’InhA ....................................................................................................... 163
CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES ....................................................................... 166 4.1.
ARCHITECTURE DE L’INTERACTOME DE LA BIOSYNTHESE DES ACIDES MYCOLIQUES................. 167
4.2.
VERS DE NOUVEAUX ANTITUBERCULEUX INHIBITEURS D’INTERACTIONS ESSENTIELLES............ 171
4.2.1.
Essentialité de l’interface d’homomultimérisation α4α5 des réductases MabA et InhA ......... 171
4.2.2.
De nouvelles interfaces d’interactions hétérotypiques essentielles ?........................................ 172
4.3.
VERS LA LOCALISATION CELLULAIRE DE L’INTERACTOME DE LA BIOSYNTHESE DES ACIDES
MYCOLIQUES.................................................................................................................................................. 174
5.
MATERIEL ET METHODES ............................................................................................................... 180 5.1.
MATERIEL UTILISE.......................................................................................................................... 181
5.1.1.
Souches utilisées......................................................................................................................... 181
5.1.2.
Plasmides utilisés et construits................................................................................................... 181
5.1.3.
Milieux et conditions de culture................................................................................................. 185
5.1.3.1.
Cultures d’E. coli .............................................................................................................................. 185
5.1.3.2.
Cultures de S.cerevisiae AH109 et S.cerevisieae MAV203 .............................................................. 185
5.1.3.3.
Cultures de M.smegmatis mc²155...................................................................................................... 186
5.2.
CONSTRUCTION DE VECTEURS ET TRANSFORMATION ................................................................... 187
5.2.1.
Construction de vecteurs ............................................................................................................ 187
5.2.1.1.
Analyse de l’ADN .............................................................................................................................. 187
5
5.2.1.2.
Digestion de l’ADN ........................................................................................................................... 187
5.2.1.3.
Purification de l’ADN........................................................................................................................ 187
5.2.1.4.
Déphosphorylation de l’ADN linéaire............................................................................................... 188
5.2.1.5.
Ligation de l’ADN ............................................................................................................................. 188
5.2.1.6.
Extraction d’ADN plasmidique.......................................................................................................... 188
5.2.1.7.
Constructions des vecteurs dérivés de pGAD-T7, pGBK-T7 et pBridge pour étude dans les systèmes
double et triple hybride chez la levure.................................................................................................................... 188 5.2.1.8.
5.2.2.
PCR et mutagenèse dirigée................................................................................................................ 189
Transformation d’E.coli............................................................................................................. 190
5.2.2.1.
Préparation de cellules compétentes ................................................................................................. 190
5.2.2.2.
Transformation.................................................................................................................................. 190
5.2.3.
Electrotransformation de M. smegmatis.................................................................................... 191
5.2.3.1.
Préparation de cellules compétentes ................................................................................................. 191
5.2.3.2.
Transformation.................................................................................................................................. 191
5.3.
SUREXPRESSION ET ANALYSE DES PROTEINES ............................................................................... 193
5.3.1.
Analyse des protéines sur gel SDS-PAGE ................................................................................. 193
5.3.2.
Test de surexpression des protéines chez E.coli ........................................................................ 193
5.3.3.
Surexpression et préparation d’extraits protéiques des réductases MabA et InhA.................. 194
5.3.3.1.
Surexpression chez E.coli.................................................................................................................. 194
5.3.3.2.
Préparation des extraits protéiques................................................................................................... 194
5.3.4.
Purification des protéines MabA et InhA sur colonne NiNTA................................................. 195
5.3.4.1.
Préparation de la colonne ................................................................................................................. 195
5.3.4.2.
Purification avec le système ACKTA-FPLC ...................................................................................... 196
5.3.4.3.
Concentration des protéines sur colonne Vivaspin............................................................................ 197
5.3.5.
Analyse des protéines en gel filtration ....................................................................................... 197
5.3.5.1.
Gel filtration avec la colonne Superdex S75...................................................................................... 197
5.3.5.2.
Gel filtration avec la colonne Superdex S200.................................................................................... 197
5.3.6.
Test d’activité de MabA.............................................................................................................. 197
5.3.7.
Cristallographie de MabAG162L................................................................................................... 198
5.4.
MESURE DES INTERACTIONS PROTEINE-PROTEINE ....................................................................... 199
5.4.1.
Double hybride et triple hybride chez la levure ......................................................................... 199
5.4.1.1.
Préparation des cellules compétentes................................................................................................ 199
5.4.1.2.
Transformation par électroporation.................................................................................................. 199
5.4.2.
Détermination de la force des interactions en double et triple hybride chez la levure............. 200
5.4.2.1.
Tests qualitatifs : stries...................................................................................................................... 200
5.4.2.2.
Tests quantitatifs : dilutions spots ..................................................................................................... 201
5.4.2.3.
Evaluation de la force des interactions ............................................................................................. 201
5.4.3.
Tests biochimiques en Co-Immunoprécipitation (Co-IP) ......................................................... 202
5.4.3.1.
Transcription/traduction in vitro....................................................................................................... 202
5.4.3.2.
Fixation de l’anticorps anti-HA sur les billes.................................................................................... 202
5.4.3.3.
Co-immunoprécipitation.................................................................................................................... 202
5.5. 5.5.1.
MODELISATION ET ALIGNEMENTS STRUCTURAUX ........................................................................ 204 Modélisation de structures de protéines .................................................................................... 204
6
5.5.2.
Alignements structuraux ............................................................................................................ 204
5.5.3.
Représentation 3D ...................................................................................................................... 204
5.6.
6.
MICROSCOPIE.................................................................................................................................. 205
5.6.1.
Préparation des échantillons...................................................................................................... 205
5.6.2.
Observations au microscope....................................................................................................... 205
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .............................................................................................. 206
7
1.
Introduction bibliographique
8
1.1. La tuberculose La tuberculose, maladie infectieuse provoquée par l’agent Mycobacterium tuberculosis (Mtu), est l’un des principaux problèmes de santé mondial. Avec près d’un tiers de la population mondiale infectée (porteurs sains) et 1.7 millions de décès chaque année, la tuberculose est la première cause de mortalité due à un agent étiologique unique (Bloom and Murray, 1992). On a estimé à 9,2 millions le nombre de nouveaux cas de tuberculose en 2006. En 2007, l’Afrique, l’Asie du Sud Est et le Pacifique occidental, totalisaient 83% des cas notifiés (Rapport mondial sur la lutte contre la tuberculose, OMS, 2008) (figure 1). Cette situation alarmante amène l’OMS à en faire une priorité en terme de santé mondiale.
Figure 1 : Taux d’incidence estimé de tuberculoses, 2007, OMS
La vaccination par le BCG, (Calmette et Guérin, 1921), la découverte d’antituberculeux majeurs comme l’isoniazide (INH) en 1952, mais aussi l’amélioration de l’hygiène et des conditions de vie (l’accès à l’eau potable, la construction de logements sains…) ont permis de faire reculer la pandémie dans les pays industrialisés. On assiste cependant à une certaine recrudescence de la tuberculose depuis plusieurs années dans les milieux défavorisés ou sous forme de maladies nosocomiales en milieu hospitalier chez des patients immunodéprimés.
Dans les pays en voie de développement, la situation ne s’est jamais résorbée. Les conditions de vie misérables, le faible accès aux traitements et la coïnfection tuberculose/VIH expliquent
9
la progression de la maladie. La prise partielle des traitements entraîne l’apparition de nouvelles formes résistantes, multi-résistantes (MDR) ou ultra-résistantes (XDR) aux antibiotiques les plus efficaces. On estime à 0.5 million le nombre de tuberculoses MDR, essentiellement en Afrique mais aussi en Europe de l’Est.
L’apparition de ces souches résistantes rend urgente la découverte de nouveaux traitements antituberculeux en se focalisant si possible sur des voies pouvant amener vers des composés rendant l’émergence de résistances plus difficile.
1.1.1. Le genre Mycobacterium
Mycobacterium tuberculosis appartient au genre Mycobacterium qui comprend plusieurs espèces faisant toutes parties de l’ordre des Actinomycetales. Les mycobactéries sont des bacilles qui mesurent de 2 à 5µM de longueur et de 0.2 à 0.5µM de largeur. Elles sont nonmotiles. Elles ont longtemps été considérées comme non-sporulantes mais une étude récente effectuée sur M.marinum suggère le contraire. En effet, les mycobactéries formeraient des endospores et des gènes majeurs responsables de la sporulation chez Bacillus subtilis ont été retrouvés dans différents génomes de mycobactéries (Ghosh et al., 2009). Leur ADN est à haut pourcentage en GC (61 à 71 %). Elles survivent en milieu aérobie ou micro-aérobie (mais pas anaérobie). Les mycobactéries sont des bacilles dits acido-alcoolo-résistants (BAAR) car ils sont mis en évidence par la coloration à la fuschine de Ziehl-Neelsen, où ils apparaissent rouges sur fond bleu (figure 2). Elles sont mal colorées par la coloration de Gram mais elles ont été classées dans les bactéries Gram-positives.
Figure 2 : Mycobacterium tuberculosis (Mtu) colorées à la fuschine de Ziehl-Neelsen
10
On peut classer les différentes mycobactéries en fonction de leur pouvoir pathogène. On distingue les pathogènes stricts comme Mtu (découvert par Koch en 1882), M.Leprae (agent de la lèpre – découvert par Hansen en 1873), M.ulcerans ou M.marinum (par exemple) ; les pathogènes opportunistes (M.avium, M.marinum, M.Kansasii,…) ; les non pathogènes et saprophytes (M.smegmatis, M.phlei, M.gastri, M.gordonae,…).
Un classement peut aussi être réalisé en fonction de leur vitesse de croissance. Les mycobactéries à croissance rapide comme M.smegmatis (2 à 3 heures de temps de génération). Celles à croissance lente comme Mtu ou M.bovis (de 24h à 2 semaines de temps de génération).
De nombreuses séquences complètes du génome d’espèces de mycobactéries ont été déterminées dans les dix dernières années. Les séquençages complets des génomes de mycobactéries pathogènes et non-pathogènes ont été réalisés : à titre d’exemples, nous pouvons citer : Mtu H37Rv (Cole et al., 1998), Mtu CDC1551 (Fleischmann et al., 2002), Mtu F11 and Mtu C (www.broad.mit.edu/seq/msc/), M.leprae (Cole et al., 2001), M.smegmatis mc²155 (www.tigr.org), M.bovis AF2122/97 (Garnier et al., 2003), M.avium subspecies paratuberculosis K-10 (Li et al., 2005) et M.marinum (www.sanger.ac.uk). Ces séquençages ouvrent la voie à de nouvelles avancées vers la découverte de nouveaux antituberculeux ou de nouveaux vaccins plus performants. Le séquençage du génome de M.leprae a montré que ce pathogène intracellulaire strict a perdu plus de 2000 gènes au cours de l’évolution. Les gènes conservés sont retrouvés chez les autres mycobactéries pathogènes, notamment ceux qui codent pour la biosynthèse de l’enveloppe. Ainsi, le génome de M.leprae peut être considéré comme le génome minimal mycobactérien (Cole et al., 2001; Vissa and Brennan, 2001).
1.1.2. Données immunologiques de la tuberculose
1.1.2.1.
Cycle infectieux de Mycobacterium tuberculosis
Mtu, parasite intracellulaire facultatif, infecte l’homme par voie aérienne. Mtu peut rester en vie plusieurs heures dans l’atmosphère. L’infection se fait par inhalation de gouttelettes contenant un faible nombre de bacilles (Kaufmann, 2001) qui vont atteindre les alvéoles 11
pulmonaires (figure 3). Les bacilles sont phagocytés par les macrophages alvéolaires via l’interaction entre différents ligands de la bactérie et récepteurs du macrophage. Dans 70% des cas, les bactéries sont lysées par les défenses immunitaires. Cependant, la mise en place de différentes stratégies pour contrer l’activité bactéricide de l’hôte va permettre à Mtu de persister dans 30% des cas.
Maladie active (immunodépression)
70%
Guérison spontanée
30%
Phase de latence (> 90%)
Réactivation (< 10%) Dissémination
Granulome
Figure 3 : Infection, latence, réactivation et dissémination. Le devenir de l’infection après l’inhalation de Mycobacterium tuberculosis (d’après Kaufmann, 2001). Dans 70% des cas, Mtu est lysée par les défenses immunitaires de l’hôte. Dans 30% des cas, Mtu persiste dans l’organisme. Dans 90% des cas de persistance, l’infection reste à l’état latent dans des granulomes. La maladie se développe dans 10% des cas de persistance, immédiatement ou après une phase de latence.
Dans 90% des cas de persistance (Kaufmann, 2001), l’infection reste à l’état latent dans l’organisme jusqu’à la mort naturelle du porteur (figure 3). Les bacilles vont se développer rapidement dans les macrophages, conduisant au recrutement de cellules dendritiques puis de Lymphocytes T. Des structures appelées granulomes vont alors se mettre en place. Elles sont formées de macrophages infectés entourés de cellules géantes poly-nucléées puis de Lymphocytes T (figure 4). À ce moment-là, un équilibre se crée entre les défenses immunitaires et le développement du bacille. Une fois cet équilibre atteint, l’hôte n’est pas contagieux, le processus pathologique peut s’arrêter et les bactéries peuvent rester à l’état
12
quiescent pendant de nombreuses années. À ce stade, il n’y a pas d’expression clinique de la maladie même si le virage des tests tuberculiniques permet de détecter la primo-infection.
Vaisseau sanguin Macrophages alvéolaires infectés
Voies respiratoires Macrophage alvéolaire Mycobacterium
Cellules mononucléaires
Macrophage infecté
Foamy macrophage Foamy macrophage
Lymphocyte
Lymphocyte
Macrophage Vaisseau sanguin
Gaine fibreuse
Macrophage
Mycobactéries libres Voies respiratoires
Centre du granulome nécrotique et caséeux
Granulome
Figure 4 : Pathologie du granulome (d’après Russell, 2007). Le bacille tuberculeux infecte son hôte via des gouttelettes en suspension dans l’atmosphère. Dans le poumon, Mtu est phagocytée par les macrophages alvéolaires et induit une réponse pro-inflammatoire qui conduit au recrutement de cellules phagocytaires mononucléaires présentes dans les vaisseaux sanguins adjacents. Ces cellules sont la base du granulome qui est constitué d’un noyau de macrophages infectés, entourés de foamy macrophages et d’autres phagocytes mononucléaires, puis de lymphocytes associés à une gaine fibreuse de collagène qui délimitent la périphérie de la structure. A ce stade l’infection est contenue, l’hôte ne présente aucun signe de maladie et n’est pas contagieux. Suite à une immunodépression, le granulome se caséifie puis se rompt libérant ainsi dans l’organisme et dans l’atmosphère de nombreux bacilles tuberculeux.
13
C’est dans 10% des cas d’infection que les patients développent une tuberculose (figure 3). La phase de latence peut être rompue au moment, par exemple, d’un changement de statut immunologique de l’hôte (personnes âgées, malnutrition, immunodépression, co-infection avec le VIH). Il y a alors multiplication intense des bacilles, une réaction immunitaire importante et une réponse inflammatoire localisée qui conduit au recrutement des cellules du système immunitaire (monocytes, cellules dendritiques et Lymphocytes T) par l’intermédiaire des interleukines IL-10 et IL-12 (Sadek et al., 1998) sécrétées par les macrophages. Ces cellules vont sécréter des cytokines pro-inflammatoires comme l’interféron-γ qui vont conduire à l’activation des macrophages (Gordon, 2003). La réactivation de la maladie entraîne une caséification des lésions (caséum : lésion spécifique de la tuberculose) qui entraîne la nécrose totale des cellules. Les lésions caséeuses solides (nodules) peuvent évoluer vers la liquéfaction et se vider, le plus souvent dans les bronches, avec formation de cavernes. Les cavernes sont les lésions les plus riches en bacilles (de l’ordre de 108 bacilles/caverne). Le malade devient très contagieux pour son entourage (15 contaminations par an en moyenne). À cette étape de l’infection, si aucun traitement n’est adopté, la maladie entraîne la mort du patient.
Les symptômes de la tuberculose pulmonaires sont la toux prolongée (plus de 15 jours) avec fièvre, les hémoptysies et les douleurs thoraciques. Symptômes généralement associés à un ensemble de signes non spécifiques comme l’asthénie, l’amaigrissement, l’anorexie ou encore la fièvre vespérale.
Dans moins de 10% des cas de tuberculose, on peut observer des formes extra-pulmonaires provoquées par une dissémination hématogène des bacilles. Ces formes de tuberculose entraînent généralement des lésions fermées et peu riches en bacilles. Quand la tuberculose pulmonaire est accompagnée d’une atteinte hématogène et hépatique, on parle de tuberculose miliaire. Finalement, la forme de tuberculose la plus dangereuse est méningée (méningite à liquide clair). Elle est due à la présence de Mtu dans le liquide céphalo-rachidien.
Les associations du VIH (Virus d’Immunodéficience Humaine) avec Mtu, M.avium, ou certaines mycobactéries opportunistes à croissance rapide forment des combinaisons extrêmement mortelles (Corti et al., 2009). En affaiblissant les défenses immunitaires, le VIH multiplie par 30 le risque de développer la tuberculose (Goletti et al., 1996; Murray, 1996).
14
Chez les patients co-infectés, les localisations extra pulmonaires de la maladie sont plus fréquentes. La tuberculose reste la première cause de décès chez les patients atteints du VIH.
1.1.2.2.
Interaction hôte/pathogène : la phagocytose
La phagocytose de Mtu par les macrophages correspond à l’enchaînement d’invagination de la membrane, de protrusion et d’évènements de fusion qui aboutissent à la formation d’un phagosome (Aderem and Underhill, 1999). Les phagosomes sont de petites vésicules qui permettent à la cellule d’internaliser des fluides (pouvant contenir des bactéries) provenant de l’environnement extérieur (Schmid, 1997). Le matériel phagocyté dans le phagosome peutêtre distribué à l’intérieur de la cellule ou délivré au Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe II (CMH-II) afin d’induire une réponse immunitaire adaptative par présentation d’antigènes aux lymphocytes T. La destination finale du phagosome est le lysosome dans lequel les agents extérieurs seront dégradés via, entre autre, l’intervention de protéines antimicrobiennes ou l’abaissement du pH du milieu. On parle de fusion du phagosome et du lysosome aboutissant à la formation du phagolysosome.
La surface de Mtu est d’une grande complexité (Brennan and Nikaido, 1995; Daffe and Draper, 1998; Dover et al., 2004a), ce qui lui permet de « pénétrer » dans les cellules phagocytaires via de nombreux récepteurs (Cambi and Figdor, 2005; Ernst, 1998). On distingue l’entrée par voie opsonique ou par voie non opsonique.
La phagocytose non opsonique correspond aux cas où le ligand est reconnu directement par un récepteur du phagocyte. On distingue principalement le récepteur au mannose et le récepteur DC-SIGN (Tailleux et al., 2003). Le récepteur DC-SIGN semble être l’unique récepteur permettant aux cellules dendritiques de se lier au bacille tuberculeux. Le récepteur au mannose est présent à la surface des macrophages. Pour la phagocytose opsonique, l’entrée dans les macrophages se fait par l’intermédiaire des récepteurs spécifiques du fragment Fc des immunoglobulines et les récepteurs du complément dont notamment le récepteur au complément de type 3 (CR3).
Le type de récepteurs par lequel Mtu pénètre dans le macrophage a des conséquences importantes sur la survie du bacille. Par exemple, l’internalisation dans les macrophages humains via le récepteur au mannose ne déclenche ni la production de réactifs oxygénés, ni la 15
maturation du phagosome (Astarie-Dequeker et al., 1999). C’est donc une voie d’entrée relativement sûre pour le bacille tuberculeux. En ce qui concerne la phagocytose opsonique, l’entrée par le récepteur Fc implique une réaction oxydative et une réponse inflammatoire du macrophage. A contrario, l’internalisation via CR3 prévient l’activation des macrophages (Caron and Hall, 1998). De plus, l’entrée CR3-dépendante nécessite la présence de cholestérol sur la paroi de l’hôte (Gatfield and Pieters, 2000), (Peyron et al., 2000). Dans le même ordre d’idée, la présence de cholestérol dans la phagosome contenant Mtu est nécessaire pour l’inhibition de la fusion du phagosome et du lysosome (Gatfield and Pieters, 2000).
1.1.2.3.
Granulome : formation et rôle
Le granulome est aussi appelé tubercule. C’est cette appellation qui a donné son nom à la tuberculose. Jusqu’à présent, la formation du granulome était interprétée uniquement comme une réponse de l’hôte et décrite comme suit : la phagocytose du bacille par les macrophages alvéolaires entraîne une réponse pro-inflammatoire forte avec stimulation des Toll Like Receptors (TLR) par des agonistes des TLR de l’hôte très abondants à la surface des mycobactéries. S’en suit une production importante de Tumor Necrosis Factor α (TNF- α) et de différentes chémokines qui vont conduire au recrutement de cellules mononuclées (neutrophiles) à partir des vaisseaux sanguins les plus proches. Ces cellules mononuclées forment la base du granulome (Russell, 2007). Différentes cellules immunitaires sont ensuite recrutées par vagues successives : les natural killer (NK), CD4+ T Cell, CD8+ T Cell. Chacune d’entre elles produisent leurs propres chémokines et cytokines qui vont amplifier le recrutement cellulaire. La cascade cellulaire est régulée par l’interféron-γ (IFN- γ) et remplacée par une réponse immunitaire spécifique. À cette étape, le granulome est stable et peut être décrit comme un noyau de macrophages infectés (au centre) entouré de foamy macrophages et d’autres cellules mononucléaires de phagocytose. Le tout est enveloppé d’un manteau de lymphocytes T mobiles autour du granulome afin d’explorer la matrice formée par les macrophages infectés immobiles au centre. Le TNF-α joue un rôle important dans le recrutement de ces lymphocytes T (Egen et al., 2008). Les macrophages et les Lymphocytes T CD4+ produisent du TNF-α et de la lymphotoxine α3 (Roach et al., 2001) qui assurent le recrutement de fibroblastes responsables de la formation d’une couche fibreuse périphérique composée de collagène et de composants de la matrice extracellulaire. Cette couche maintient l’intégrité du granulome. À ce stade, l’infection est confinée. Le centre du granulome est 16
hypoxique. Dans une phase plus tardive, le centre se nécrose et on observe une perte de la vascularisation (Russell, 2007) (figure 4). Les foamy macrophages constitueraient un réservoir lipidique utilisé par le bacille tuberculeux dans la persistance à l’intérieur de l’hôte. Les acides mycoliques oxygénés de l’enveloppe mycobactérienne joueraient un rôle important dans la différenciation des macrophages en foamy macrophages (Peyron et al., 2008).
Des études récentes ont permis d’avancer dans la compréhension de la structuration du granulome. Jusqu’à récemment, le TNF-α était donné comme responsable du recrutement des cellules phagocytaires qui forment la base du granulome. Cependant, des expériences de microscopie intra-vitale chez le poisson zèbre (zebrafish, Danio rerio) infecté par M. marinum (Mm) – un système qui permet d’étudier les étapes précoces du développement de la tuberculose - montrent qu’en l’absence de sécrétion de TNF-α par le système immunitaire du zébrafish la mortalité de l’hôte augmente, la croissance des mycobactéries est plus rapide et la formation du granulome ainsi que la nécrose et la décomposition de celui-ci est accélérée (Clay et al., 2008). Ces travaux laissent donc penser que le TNF-α n’est pas nécessaire à la formation du granulome mais permet le maintien de son intégrité en limitant la croissance bactérienne et en prévenant la nécrose des macrophages infectés.
On a longtemps considéré que le granulome correspondait à une réponse de l’hôte pour contenir la maladie (Ulrichs and Kaufmann, 2006). L’intérêt pour Mtu dans la formation et l’évolution du granulome a été sous-estimé. Tout d’abord, la formation du granulome coïncide avec une accélération de la croissance du bacille (Volkman et al., 2004). Par ailleurs, il a été récemment montré, toujours par des techniques de microscopie intra-vitale chez le poisson zèbre infecté par Mm, que les bactéries qui ne possédaient pas le locus de virulence RD1 (Région de différence 1) codant pour le système de sécrétion ESX-1 provoquaient des infections atténuées (DiGiuseppe Champion and Cox, 2007) avec un diminution de la formation de granulomes (Volkman et al., 2004). Ces résultats suggèrent que la formation du granulome est utilisée par les mycobactéries pour accroître l’infection. La comparaison de souches de Mm sauvages et Mm sans le locus RD1 (∆RD1 Mm) a permis de déterminer l’impact de RD1 sur les différentes étapes de la pathogénie (Davis and Ramakrishnan, 2009). Les mycobactéries pathogènes intracellulaires utilisent le locus de virulence ESX-1/RD1 pour induire le recrutement de nouveaux macrophages et augmenter la motilité de ceux-ci dans le granulome naissant. L’augmentation de la motilité permet l’arrivée de multiples macrophages qui vont phagocyter les débris de macrophages infectés ayant subit une apoptose. Le nombre 17
de macrophages infectés est ainsi fortement augmenté et par conséquent le nombre de bacilles croit considérablement. Nous voyons ainsi comment la mycobactérie peut se servir de la réponse immunitaire de l’hôte pour se propager et infecter un grand nombre de cellules pendant la réponse immunitaire innée (figure 5). C’est le recrutement des Lymphocytes T qui va conduire à la stabilisation du granulome et à la phase d’équilibre entre les mycobactéries virulentes et la réponse immunitaire de l’hôte (Egen et al., 2008).
Expansion bactérienne
Contrôle immunitaire
Équilibre
Mycobactérie Mycobacérie Macrophage Corps apoptotiques Signal chémotactique
Lymphocyte T
Figure 5 : Stades de la formation du granulome (d’après Bold, 2009). La première étape correspond à l’expansion bactérienne en l’absence de réponse immunitaire adaptative. La croissance et la dissémination des bacilles est facilitée durant la formation du granulome précoce. Les macrophages infectés subissent l’apoptose et recrutent ainsi des macrophages non infectés qui vont phagocyter les débris des cellules lysées ainsi que les bacilles libérés lors de l’apoptose. Lorsque la réponse immunitaire adaptative se met en place, les Lymphocytes T arrivent sur le site de l’infection et vont limiter la croissance bactérienne. Même si elle est essentielle pour le contrôle de l’infection, la réponse adaptative ne peut l’éradiquer. Le granulome mature représente un état d’équilibre entre l’infection mycobactérienne et la réponse immunitaire de l’hôte.
18
1.1.2.4.
Contournement de l’activité bactéricide
La survie de Mtu dans le macrophage est due à plusieurs facteurs. Les bacilles mettent en œuvre une série de mécanismes et nous présenterons ici les plus importants sachant qu’il en existe d’autres.
- Inhibition de la fusion du phagosome avec le lysosome
L‘enveloppe des mycobactéries a une structure unique en terme de lipides et de glycolipides (Brennan and Nikaido, 1995; Daffe and Draper, 1998; Daffe and Etienne, 1999) (voir paragraphe 1.2) et sa composition a une importance cruciale dans la virulence de Mtu. En effet, la perte de l’un de ses composants entraîne souvent une perte de virulence (Glickman et al., 2000), (Makinoshima and Glickman, 2005). Par exemple, certains glycolipides jouent un rôle dans l’inhibition de la synthèse du phagolysosome. Le phosphatidylinositol 3-phosphate (PI3P) est un composant de la membrane de l’hôte essentiel à la fusion du phagosome et du lysosome (Roth, 2004). Mtu prévient l’accumulation de PI3P dans la membrane du phagosome (Fratti et al., 2003) via deux mécanismes. Tout d’abord les lipoarabinomannanes (LAM) inhibent la phosphatidylinositol 3-kinase, enzyme de biosynthèse du PI3P (Vergne et al., 2003). De plus, Mtu sécrète une phosphatase, SapM (Rv 3310), qui hydrolyse le PI3P (Vergne et al., 2005) (figure 6).
Mtu possède 11 sérine/thréonine protéines kinases « eucaryotic-like » (Cole et al., 1998). Les sérine/thréonine kinases interviennent dans la modulation des cascades de transduction de signaux. La majorité d’entre elles sont des protéines transmembranaires et deux sont solubles : PknG (Rv0410c) et PknK (Rv3080c). PknG est la seule kinase maintenue dans toutes les mycobactéries pathogènes. PknG est impliquée dans le métabolisme de la glutamine (Niebisch et al., 2006). Il a été montré que les mutants « knock out » pour le gène pknG de Mtu perdent leur virulence car la fusion du phagosome et du lysosome est restaurée (Majlessi et al., 2007), (Walburger et al., 2004), (Cowley et al., 2004). PknG est relarguée dans le cytosol du macrophage et son action demeure inconnue mais son essentialité dans l’inhibition de la fusion du phagosome et du lysosome a été démontrée (Walburger et al., 2004) (figure 6). De plus, la présence de PknG dans le cytosol la rend facilement accessible aux antibiotiques et un inhibiteur spécifique a été mis en évidence (Scherr et al., 2007).
19
Figure 6 : Inhibition de la fusion du phagosome et du lysosome par Mtu (d’après Pieters, 2008). Mtu sécrète la phosphatase SapM qui hydrolyse le PI3P, composant de la membrane du phagosome essentiel à la fusion. Par ailleurs, les LAM de la surface de Mtu inhibent la biosynthèse de PI3P. Mtu sécrète également la sérine/thréonine kinase PknG qui est essentielle à l’inhibition de la fusion du phagosome et du lysosome. Enfin, la Coronin 1 est recrutée et retenue à la surface du phagosome par Mtu. Elle active la calcineurine qui, une fois activée, participe à l’inhibition de la fusion du phagosome et du lysosome.
Enfin, Mtu recrute activement la Coronin 1 (aussi connu sous les noms P57 ou TACO pour « Tryptophan Aspartate Containing coat protein ») à la surface du phagosome. Il s’agit d’une protéine qui lie le cytosquelette à la membrane plasmique des leucocytes (Gatfield et al., 2005). La Coronin 1 s’accumule sur la membrane des phagosomes (Ferrari et al., 1999; Itoh et al., 2002) et y est retenue activement par les mycobactéries qui résident dans le phagosome. Ceci suggère que la rétention de la Coronin 1 sur les phagosomes contenant la mycobactérie
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joue un rôle dans l’inhibition de la fusion du phagosome et du lysosome (Ferrari et al., 1999; Nguyen and Pieters, 2005). Elle est relarguée lorsque le bacille est dégradé dans le macrophage (Ferrari et al., 1999), (Gatfield et al., 2005). De plus, la Coronin 1 est essentielle à l’activation de la Ca2+-dependante phosphatase, la calcineurine qui une fois activée inhibe la fusion du phagosome et du lysosome (Jayachandran et al., 2007). En absence de Coronin 1, la calcineurine n’est pas activée, il y a fusion du phagosome et du lysosome et le bacille est éliminé. La Coronin 1 est donc un facteur essentiel de survie pour les mycobactéries dans le macrophage à travers l’activation de la calcineurine (figure 6).
- Résistance au stress oxydatif
La capacité de Mtu à bloquer la fusion du phagosome avec le lysosome est vraie uniquement dans les macrophages non-activés. L’activation des macrophages conduit au déclenchement d’une réponse oxydative. Les macrophages sont activés par le Tumor Necrosis Factor α (TNF- α) et l’interféron-γ (Adams and Hamilton, 1984), (Bogdan and Schleicher, 2006). L’interféron-γ induit la génération de réactif oxygénés (ROI) et nitrogénés (RNI) responsables de l’activité bactéricide de l’hôte (MacMicking et al., 1997). Mtu peut persister dans cet environnement grâce à plusieurs mécanismes qui agissent conjointement. La structure particulière de sa paroi est fortement responsable de la survie et de la réplication du bacille dans le macrophage : par exemple, il a été montré que les acides mycoliques α, acides mycoliques cyclopropanés, jouaient un rôle important dans l’adaptation de Mtu au stress oxydatif (Yuan et al., 1995). Ce n’est pas la seule explication. Mtu produit la protéine KatG (Rv 1908c) qui peut inactiver, dans le phagosome, les dérivés oxygénés (Li et al., 1998). De plus, le protéasome de Mtu joue un rôle dans l’adaptation au stress des oxydes nitriques. Il a été montré qu’une souche de Mtu déficiente pour une adénosine triphosphatase du protéasome était atténuée chez la souris et que l’exposition à des inhibiteurs des protéases du protéasome rendait très sensible Mtu sauvage aux RNI. (Darwin et al., 2003).
- Inhibition de l’apoptose
Lorsqu’une cellule hôte est confrontée à un pathogène qui utilise ses ressources propres pour survivre et se développer, l’une des stratégies de défense est d’activer l’apoptose. L’apoptose, ou mort cellulaire programmée, est un type de mort cellulaire qui laisse la membrane de la cellule intacte. C’est un mode de défense classique de l’hôte contre les virus intracellulaires 21
d’une part et contre certaines bactéries pathogènes d’autre part. L’apoptose permet de limiter la multiplication bactérienne et facilite la présentation d’antigènes. L’apoptose est un processus hautement régulé de déconstruction cellulaire qui confine les constituants cytoplasmiques dans des vésicules appelées « corps apoptotiques ». Ces vésicules seront ensuite reconnues et engouffrées par des phagocytes via de multiples récepteurs de surface. L’activation des caspases (aspartate-specific cysteine protease) permet le déclenchement de l’apoptose. Elle peut se faire par deux voies principales. La voie extrinsèque met en jeu la liaison de ligands, le TNF-α ou FasL par exemple, à leurs récepteurs (Fas ou TNFR1) (Oddo et al., 1998). La voie intrinsèque, impliquant la translocation du cytochrome c des mitochondries dans le cytosol.
Les souches atténuées de Mtu (H37Ra) et de Mycobacterium bovis (Mycobacterium bovis BCG) induisent l’apoptose naturelle des macrophages à un faible niveau d’infection. À l’inverse, Mtu supprime la réponse apoptotique des macrophages via l’induction de la production d’IL-10. Cette cytokine bloque la synthèse de TNF-α par les macrophages et induit le décrochage du récepteur soluble au TNF, inhibant ainsi la voie extrinsèque de mise en place de l’apoptose (Balcewicz-Sablinska et al., 1998; Koul et al., 2004). Par ailleurs, les lipoarabinomannanes à coiffes mannosyles (ManLAM), lipoglycannes de l’enveloppe des mycobactéries à croissance lente, stimulent la phosphorylation de la protéine apoptotique Bad du macrophage, ce qui l’empêche de se lier aux protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-X. La protéine Bcl-2, libérée de son inhibiteur, bloque le cytochrome c dans les mitochondries et inhibe l’activité des caspases (Koul et al., 2004; Maiti et al., 2001). Pour finir, Gan et coll. ont récemment montré que Mtu bloquait la formation de l’enveloppe apoptotique, ce qui conduit à la nécrose et donc à la dissémination de l’agent pathogène dans les poumons (Gan et al., 2008).
- Échappement du bacille du phagosome vers le cytosol
Il a été montré que les mycobactéries pathogènes pouvaient passer du phagosome au cytosol dans les cellules non apoptotiques (McDonough et al., 1993; van der Wel et al., 2007). Par ailleurs, des expériences de microscopie intravitale chez le zébrafish infecté par Mm montrent que le bacille est capable de s’échapper du phagosome vers le cytosol, d’activer des facteurs qui induisent la polymérisation de l’actine, et ainsi de conduire à sa dissémination de cellule en cellule (Stamm et al., 2003). 22
Il semblerait que le système spécialisé de sécrétion de protéines ESX-1 joue un rôle dans cette faculté de dissémination des mycobactéries. Les protéines qui constituent ESX-1 sont codées par la région RD1 (Hsu et al., 2003; Stanley et al., 2003) qui comporte neuf gènes dans Mtu qui ne sont pas présents chez le vaccin atténué Mycobacterium bovis BCG (Behr et al., 1999). La restauration de ces gènes chez BCG entraîne une restauration partielle de la virulence (Pym et al., 2002). Mtu et M.marinum utilisent ESX-1 pour exporter des protéines de virulence (Gao et al., 2004; Stanley et al., 2003; Xu et al., 2007). La région RD1 comporte 15 gènes impliqués dans la sécrétion de facteurs de virulence via le système de sécrétion ESX-1 chez Mtu. Les principales protéines sécrétées, dont les gènes sont présents dans la région RD-1, sont ESAT-6 (Early secretory antigenic target-6) (Rv3875) et CFP-10 (Culture filtrate protein-10) (Rv3874). Ces deux protéines sont co-sécrétées sous forme d’hétérodimère (Renshaw et al., 2002). De nombreuses fonctions sont proposées pour CFP-10 et ESAT-6. Les protéines codées par RD1, dont CFP-10 et ESAT-6, joueraient un rôle dans le recrutement de macrophages non infectés et la propagation du bacille dans ceux-ci lors de la formation du granulome (voir chapitre 1.1.2.3). Il semblerait également que le complexe stable CFP-10/ESAT-6 se lierait aux cellules de l’hôte (Renshaw et al., 2005) et entraînerait une régulation négative des mécanismes de défense de l’hôte ainsi que de la réponse immunitaire (Ganguly et al., 2008).
Enfin, et c’est l’objet de ce chapitre, il a aussi été montré qu’ESAT-6 interagit avec les biomembranes après s’être séparé de CFP-10, sa chaperone potentielle, dans l’environnement acide du phagolysosome (de Jonge et al., 2007). Cette interaction permettrait au bacille pathogène de s’échapper de l’environnement hostile du phagolysosome. Cette hypothèse est confirmée par une étude en microscopie à fluorescence sur des macrophages murins infectés par Mm (Smith et al., 2008). Ces travaux suggèrent qu’ESAT-6, sécrétée par ESX-1, joue un rôle direct dans la formation de pores dans la membrane des vacuoles qui contiennent la mycobactérie. Ces pores permettraient alors au bacille de s’échapper et de se disséminer dans d’autres cellules.
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1.1.3. Traitements et prévention
1.1.3.1.
La vaccination : le BCG
En 1921, Calmette et Guérin ont fini de mettre au point un vaccin vivant à partir d’une souche atténuée de M.bovis non virulente qui porte leur nom (Calmette A, 1927 La vaccination préventive contre la tuberculose, Masson, Paris) : le Bacille de Calmette et Guérin (BCG). L’utilisation de ce vaccin au niveau international s’est généralisée à partir de 1940. À travers le monde, on compte 3 Milliards de personnes vaccinées. Cependant, en France, compte tenu du faible taux d’incidence et d’un accès aisé aux traitements antituberculeux les plus efficaces, la vaccination BCG obligatoire a été suspendue en 2007. Il n’y a jamais eu aucun exemple de réversion de cette souche vers une forme virulente (Orme, 1995).
De façon surprenante, le degré de protection varie selon les souches, les populations, le mode d’administration de 0 à 80% (une protection moyenne de 50% est admise). Cependant, la protection est plus importante en ce qui concerne les formes méningées de la tuberculose chez les jeunes enfants (70 à 80%). Plusieurs raisons peuvent expliquer l’efficacité variable de la vaccination BCG. Tout d’abord, il se pourrait que la souche vaccinale ait muté de façon différente selon les différents pays producteurs du vaccin (Oettinger et al., 1999). Par ailleurs, certaines populations sont en contact régulier avec des mycobactéries non pathogènes possédant des motifs antigéniques communs avec la souche vaccinale. La vaccination est ainsi amenée à échouer car la souche BCG est éliminée rapidement sans mise en place d’une réponse immunitaire mémoire. De nombreuses études sont en cours pour trouver un nouveau vaccin plus efficace (Kaufmann, 2005). Deux types d’approches sont développées : la mise en place d’une nouvelle souche vaccinante (BCG modifié ou Mtu atténuée) ou la mise en place d’un rappel de vaccination avec un vaccin sous-unitaire composé d’un nombre restreint de motifs anti-géniques.
24
1.1.3.2.
Traitement de la tuberculose
- La stratégie « Halte à la tuberculose » de l’OMS
En 1995, l’OMS met en place la stratégie DOTS (Directly Observed Treatment, Short-course) qui implique un engagement politique, des services d’examens microscopiques, un approvisionnement en médicaments, des systèmes de surveillance et l’utilisation de schémas thérapeutiques hautement efficaces sous surveillance directe. Cette stratégie vise à enrayer l’épidémie et à prévenir l’apparition de nouvelles souches résistantes aux traitements connus. Elle est adoptée par 155 pays et a pour objectif de détecter 70% des nouveaux cas dans le monde et d’en guérir 85%. Bien qu’en deçà des objectifs fixés (61% des cas détectés en 2006), cette stratégie est néanmoins un succès avec 84,7% des cas détectés soignés en 2005.
En 2006, l’OMS lance une nouvelle stratégie « Halte à la tuberculose ». Cette stratégie repose essentiellement sur le DOTS, en intégrant les difficultés essentielles que posent la coinfection tuberculose/VIH et l’émergence des souches multi-résistantes. De plus, cette méthode préconise de donner les moyens d’agir aux personnes et aux communautés touchées, de renforcer les systèmes de santé et de promouvoir la recherche.
- Traitements classiques (figure 7)
Le diagnostic de la tuberculose se fait par détection du bacille soit à l'examen direct d'un échantillon (expectoration) au microscope, soit après mise en culture de ce même échantillon. Cette dernière procédure est cependant longue (plusieurs semaines), ce qui retarde d'autant le diagnostic. Le premier antibiotique actif contre la tuberculose a été découvert par Waksman en 1943. Il s’agit de la streptomycine. Ensuite, l’acide para-amino-salicylique est découvert en 1949. Dans les 20 années qui suivent, les antituberculeux les plus courants seront découverts : l’Isoniazide, la Rifampicine (antibiotique à large spectre), l’Ethambutol et la Pyrazinamide sont les antibiotiques de première ligne les plus utilisés. La stratégie DOTS prévoit deux phases pour le traitement de la tuberculose. La première repose sur la prise de quatre médicaments pendant deux mois (Isoniazide, Rifampicine, Ethambutol et Pyrazinamide). La seconde phase dure quatre à six mois avec prise de deux médicaments (Isoniazide et Rifampicine). Durant chaque étape, un contrôle médical est nécessaire et l’analyse des expectorations permet d’évaluer l’efficacité du traitement. 25
Figure 7 : Structures, cibles et mutations associées aux résistances des principaux antibiotiques antituberculeux (d’après Sacchettini et al., 2008)
La streptomycine est un antibiotique qui appartient à la classe des aminosides (ou aminoglycosides). Il a été isolé à partir d'une souche d'actinobactérie Streptomyces griseus. Les antibiotiques de cette classe agissent en se fixant sur le ribosome. Une fois l'antibiotique fixé sur le ribosome, la bactérie produit des protéines non fonctionnelles et meurt rapidement. Plus précisément, la streptomycine inhibe l’initiation de la traduction des ARN messagers, facilite les erreurs du code de lecture et diminue l’activité « proofreading » du ribosome (Hash, 1972). Il a été montré que Mtu devenait résistant à la streptomycine (Blanchard, 1996) après mutation dans le gène codant pour une sous-unité du ribosome. La mutation de situe sur le gène rpsL (Rv0682) qui code pour la protéine ribosomale S12 (Finken et al., 1993). Cet antibiotique n’est aujourd’hui plus utilisé en raison de sa toxicité en dehors de rares situations (résistances, insuffisance hépatocellulaire ne permettant pas l’utilisation de la pyrazinamide, forte contagiosité).
26
La rifampicine est un antibactérien à large spectre qui diffuse à travers la paroi hydrophobe de la bactérie. Il appartient à la famille des ansamycines lipophiles. La rifampicine interfère avec la synthèse des ARN messagers en se fixant sur l’ARN polymérase ADN-dépendante de la bactérie (Hash, 1972). Il est très efficace contre le bacille tuberculeux et a une toxicité faible car il est inefficace sur l’ARN polymérase humaine. Mtu développe des résistances à la rifampicine notamment par des mutations localisées dans une région précise du gène de la sous-unité β de l’ARN polymérase (rpoB-Rv0667) (Telenti et al., 1993).
La pyrazinamide (PZA), un analogue du nicotinamide, est une pro-drogue qui requiert l’hydrolyse de la fonction amide par une pyrazinamidase mycobactérienne pour donner un acide pyrazinoïque (Konno et al., 1967). La PZA a la capacité d’inhiber une population de bacilles en « semi-dormance » dans un environnement acide (Mitchison, 1985) (par exemple durant la phase active de l’inflammation), une propriété qui n’est pas présente chez les autres antituberculeux. L’utilisation de la PZA a permis de réduire fortement la durée de traitement des patients atteints de tuberculose. La pyrazinamidase est codée par le gène pncA (Rv2043c) et la résistance à la PZA est généralement due a des mutations dans pncA qui abolie l’activité amidase (Scorpio and Zhang, 1996) (Scorpio et al., 1997). Il a été montré que FAS-I était l’une des cibles de la PZA (Zimhony et al., 2000).
L’éthambutol inhibe spécifiquement la biosynthèse de l’arabinogalactane, polysaccharide majeur de la paroi, et celle du lipoarabinomannane. Ceci est la conséquence de l’inhibition des activités arabinosyl-transférases. Les phénomènes de résistance sont associés avec des mutations dans les gènes de la famille emb (Sreevatsan et al., 1997; Telenti et al., 1997). D’autres gènes doivent cependant également rentrer en compte (Alcaide et al., 1997).
Le mécanisme d’action de l’INH, antituberculeux majeur dans le traitement des patients atteints de la tuberculose, sera décrit dans le paragraphe 1.3.6.
- Développement de nouvelles molécules
Les années 90 ont vu l’apparition des premières souches résistantes (MDR-TB, multidrugresistant TB). Les MDR-TB sont résistantes, au moins à la rifampicine et à l’isoniazide et on les trouve essentiellement en Afrique, en Asie et dans les états de l’ex-URSS. De plus, de nouvelles souches, extrêmement résistantes (XDR-TB), ont fait leur apparition chez des 27
patients HIV positifs en Afrique du Sud. Les XDR-TB sont résistantes à tous les antituberculeux de la stratégie DOTS et à plusieurs traitements de seconde ligne. Le spectre des souches que l’on n’arrive pas à traiter n’a jamais été aussi large. Les raisons qui expliquent l’apparition de ses souches résistantes sont multiples : traitements inadéquats, antituberculeux de mauvaise qualité ou inefficaces, durée de la prise d’antibiotiques trop courte. En effet, la disparition des symptômes est rapide mais l’élimination du bacille nécessite plusieurs mois de traitements. Ceci conduit, chez beaucoup de patients démunis, à un arrêt du traitement de façon prématurée. Le second facteur qui rend difficile le traitement de la tuberculose est le phénomène de dormance du bacille qui peut faire échouer le traitement chez des souches qui ne présentent pas de résistance. Ce phénomène de persistance est complexe. Les bacilles sont « protégés » des antituberculeux dans les tissus à l’intérieur du granulome. Ils pourraient alors modifier leur métabolisme et adopter un état physiologique qui les rend insensibles aux traitements. En effet, le développement cellulaire pourrait être ralenti et les antibiotiques qui agissent sur la croissance ou la division cellulaire être inefficaces (Stewart et al., 2003). L’état de dormance est la principale raison qui rend nécessaire des traitements de plusieurs mois. Un antituberculeux actif contre les bacilles en dormance permettrait de diminuer considérablement la durée de la thérapie. Cependant, un tel antibiotique semble difficile à mettre au point si le bacille est réellement en dormance.
Les propriétés désirables pour de nouvelles molécules, la méthode d’investigation ainsi que les principaux candidats pour de nouveaux traitement ont récemment fait l’objet de revues (Cole and Alzari, 2007) (Sacchettini et al., 2008). Les antituberculeux recherchés devront répondre à un certains nombre des critères suivants : être actif contre les MDR-TB, tuer les bacilles tuberculeux latents, être compatibles avec les antituberculeux existants, ne pas interagir ou montrer d’antagonisme avec les agents anti-rétroviraux, être suffisamment « petits » pour accéder à leur cible in vivo. De nombreuses approches existent pour la découverte de nouveaux agents antituberculeux. La principale est l’identification de cibles, le plus souvent des enzymes, essentielles à la survie de Mtu. Ce travail a été rendu possible par les progrès en génomique (Cole et al., 1998) et l’obtention de données sur l’essentialité de gènes par des approches de mutants conditionnels de et de mutagenèse à haut débit (Sassetti et al., 2001, 2003). Les cibles peuvent ensuite être testées contre des librairies d’agents chimiques, inhibiteurs potentiels, d’une part. D’autre part, les progrès en biologie structurale pourraient permettre de déterminer la structure des cibles potentielles et ensuite de prédire des inhibiteurs potentiels. D’autres approches essayent d’améliorer des antituberculeux déjà 28
existants comme par exemple la thiolactomycine ou l’éthambutol. On peut noter aussi des tentatives de tester des composés antimicrobiens à large spectre comme les fluoroquinolones ou d’étendre des classes d’antibiotiques comme les dérivés nitroimidazoles. Enfin, une étude a révélé, in vitro et in vivo dans un modèle murin, une nouvelle molécule capable de tuer Mtu in vitro, ex vivo et dans la souris avec une efficacité supérieure à l’INH : Les benzothiazinones (BTZ) (Makarov et al., 2009). Les BTZ ciblent la décaprénylphosphoryl-b-D-ribose 2’épimérase, enzyme responsable de la formation du décaprénylphosphoryl arabinose qui est un précurseur de l’arabinane de la paroi. Cet antibiotique cible donc la biosynthèse de l’arabinogalactane de la paroi mycobactérienne. Toutes ces approches sont cependant limitées car les tests d’inhibitions in vitro s’avèrent souvent infructueux in vivo. Il a récemment été mis au point un test de criblage à haut débit pour déterminer, in vivo, l’activité antituberculeuse de molécules qui viendraient tuer Mtu à l’intérieur du macrophage sans avoir de toxicité pour l’hôte (Christophe et al., 2009). Cette technique, rapide et prometteuse, a déjà permis d’identifier plusieurs molécules, actives contre les mycobactéries et non toxiques pour le macrophage, candidates à l’élaboration d’une nouvelle génération d’antibiotiques antituberculeux.
29
1.2. Structure de l’enveloppe mycobactérienne Les premiers travaux sur l’enveloppe mycobactérienne ont eu lieu dans les années 60 et 70 à l’université d’Osaka (Japon) et au CNRS (France) par Yamamura, Kato, Azuma, Lederer… Les développements des techniques analytiques (RMN, Spectrométrie de masse…) et le séquençage complet du génome de Mtu ont permis d’avancer dans la connaissance précise de la structure et de l’architecture de l’enveloppe du bacille. Pourtant, il a été difficile d’arriver à un modèle cohérent qui rende correctement compte de l’organisation des nombreuses molécules complexes de l’enveloppe des mycobactéries.
L’étude de la membrane mycobactérienne est une priorité dans la lutte contre la tuberculose car elle constitue la première barrière de perméabilité conférant à Mtu une résistance à de nombreux antibiotiques hydrophiles (Jarlier and Nikaido, 1994). De plus, elle est aussi impliquée dans l’adhésion, l’internalisation et la survie intra-macrophagique. Beaucoup de ces composantes sont des facteurs de virulence. Au-delà de l’aspect fondamental, comprendre la biosynthèse, la structure et le rôle de l’enveloppe mycobactérienne, est primordial dans l’optique de découvrir de nouveaux traitements antituberculeux ou de nouveaux vaccins.
Les mycobactéries, considérées comme appartenant à la famille des GRAM+ à haut GC% (~70%), sont plus spécifiquement classées dans le groupe des CMN (Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Gordona, Dietzia, Tsukamurella) qui se caractérisent par une enveloppe complexe et riche en lipides.
1.2.1.
Organisation générale
L’enveloppe mycobactérienne est classiquement décrite, du cytoplasme vers le milieu extracellulaire de la façon suivante (figure 8) : une membrane plasmique, suivie de la paroi et enfin de la couche externe, ou capsule, qui forme la dernière strate de l’enveloppe. La description de la structure de la paroi des mycobactéries provient essentiellement d’un modèle proposé par Minnikin (Minnikin et al., 1982). Dans ce modèle, le peptidoglycane est lié de façon covalente à l’hétéropolysaccharide arabinogalactane, lui-même estérifié par des acides mycoliques. Ces acides mycoliques s’orientent parallèlement les uns aux autres et
30
perpendiculairement à l’enveloppe (Nikaido et al., 1993). Ils formeraient la partie interne d’une bicouche asymétrique. D’autres lipides extractibles par des solvants organiques constitueraient la partie externe de cette bicouche asymétrique. Cependant, cette structure asymétrique n’a jamais été réellement démontrée directement que ce soit par microscopie ou par d’autres moyens.
Couche externe
Mycomembrane
AG/PG
Couche Granulaire
7.5 nm
PG
PERIPLASME
7.1 nm
Membrane plasmique
Cytosol
Figure 8 : Schéma de l’enveloppe mycobactérienne (d’après J. Vaubourgeix, thèse de l’Université Paul Sabatier, 2009). La membrane plasmique est composée d’une bicouche de phospholipides (bleu) et de protéines (vert). La couche granulaire (bleu clair) est accolée à la membrane plasmique dans le périplasme. Le peptidoglycane (rectangles noirs) et lié à l’arabinogalactane, lui-même lié à la mycomembrane (rouge). La couche externe est essentiellement composée de polysaccharides et de protéines.
Des études récentes, chez M.smegmatis, M.bovis BCG et C.glutamicum, ont permis de visualiser directement une membrane externe analogue à celle des bactéries GRAM négatives formée d’une bicouche lipidique (Hoffmann et al., 2008; Zuber et al., 2008). Ces données ont été obtenues par la technique de CEMOVIS (Cryo-Electron Microscopy of Vitreous Section). Cette technique a l’avantage de permettre l’observation de l’enveloppe dans un état proche de l’état natif contrairement aux autres techniques de microscopie classiques dont les traitements préalables aux observations altèrent la structure de l’enveloppe. Les travaux de Zuber et coll.
31
et de Hoffmann et coll. aboutissent aux conclusions suivantes : l’enveloppe des mycobactéries comprend une membrane plasmique sur laquelle est accolée une couche granulaire, communément observée chez les bactéries GRAM positives, qui se situerait dans l’espace périplasmique dont l’existence était jusque là controversée. De plus, cette technique a permis d’observer directement une membrane externe, ou mycomembrane, composée probablement d’une bicouche lipidique qui comprendrait les acides mycoliques.
A
B
Figure 9 : Modèles d’organisation des acides mycoliques dans l’enveloppe des mycobactéries. A : modèle en W (d’après Zuber et al., 2008). Noir : acides mycoliques ; Bleu foncé : phospholipides ; Bleu clair : Glycophospholipides (GPL) ; Gris clair : Porine ; Orange : Tréhaloses dimycolates (TDM) ; Rouge : Tréhaloses monomycolates (TMM). B : modèle de Hoffmann (d’après Hoffmann et al., 2008). Rouge : acides mycoliques ; Noir et blancs : autres lipides ; Gris : Porine.
32
Si les deux études présentées ici convergent sur l’existence d’une membrane externe, deux modèles sont proposés quant à l’organisation de cette membrane. La longueur de chaîne des acides mycoliques est incompatible avec l’épaisseur mesurée de la mycomembrane. C’est pourquoi Zuber et coll. proposent un modèle en bicouche asymétrique avec des acides mycoliques repliés en W, U ou Z (suivant le type d’acides mycoliques) qui constitueraient le feuillet interne et des lipides extractibles comme feuillet externe (figure 9A) (Zuber et al., 2008). Hoffmann et coll. suggèrent eux que les deux feuillets soient similaires dans leur composition et que les acides mycoliques traversent la partie interne et externe de la membrane (figure 9B) (Hoffmann et al., 2008).
Après avoir donné la structure générale de l’enveloppe, nous allons maintenant détailler chacune de ses composantes.
1.2.2. La membrane plasmique
La membrane plasmique a une structure tout à fait classique dans le monde des procaryotes et ne diffère pas d’une espèce de mycobactérie à l’autre (Minnikin et al., 1982). Elle est essentiellement composée de phospholipides et de protéines. Elle forme une bicouche lipidique qui interagit avec des protéines constituant une barrière perméable qui entoure le cytoplasme. A l’extérieur de la membrane plasmique est accolée une couche granulaire (observée chez les bactéries GRAM positives), située dans l’espace périplasmique.
1.2.3. La paroi
La paroi détermine la taille et la forme de la cellule bactérienne. Elle constitue une barrière épaisse chez les mycobactéries qui entraîne, de par sa structure, la possibilité de survivre et de se répliquer dans les macrophages alvéolaires parmi d’autres facteurs ainsi qu’une grande résistance à de nombreux antibiotiques (Brennan and Nikaido, 1995). Plusieurs de ses composés ont un rôle dans la virulence.
La paroi est constituée de lipides extractibles, de protéines formant des pores et d’acides mycoliques à très longue chaîne (jusqu’à 90 atomes de carbone) liés au peptidoglycane de 33
façon covalente via un réseau d’arabinogalactane (Barry et al., 1998; Daffe and Draper, 1998; Niederweis, 2003). 1.2.3.1.
Le peptidoglycane
Le peptidoglycane est responsable de la rigidité du bacille, c’est un hétéropolymère de glycoaminopeptides. Il est composé d’un enchaînement β-14 d’unités alternées de Nacétyl-β-glucosamine (NAGs) et d’acide muramique (NAM) modifiés par N-acétylation ou N-glycolylation spécifique aux Corynebacterineae (Raymond et al., 2005). Des tétrapeptides (L-alanyl-D-iso-glutaminyl-meso-diaminopimelyl-D-alanine) viennent se fixer sur la fonction carbonyle libre des acides muramiques. Des liaisons peptidiques entre deux tétrapeptides peuvent s’effectuer.
1.2.3.2.
L’arabinogalactane
La structure de l’arabinogalactane a été déterminée par Daffe et coll. (Daffe et al., 1990). L’arabinogalactane est composé d’une partie galactane et d’un domaine arabinane complexe.
1.2.3.3.
La membrane externe ou mycomembrane
La mycomembrane est constituée, comme nous l’avons vu, d’acides mycoliques et de lipides extractibles.
1.2.3.3.1. Les acides mycoliques
Les acides mycoliques sont spécifiques du genre Mycobacterium et représentent de 40% à 60% de la masse sèche totale de l’enveloppe. Les acides mycoliques sont des composants majeurs et très spécifiques de l’enveloppe mycobactérienne. Ils jouent un rôle central dans l’architecture et l’imperméabilité du bacille (Daffe and Draper, 1998). Ils sont considérés comme l’une des principales causes de la résistance intrinsèque des mycobactéries à la plupart des antibactériens. Classiquement, les acides mycoliques sont définis pour Mtu comme des acides β-hydroxylés, α-branchés (longue chaîne aliphatique en α du carbonyle), à haut poids moléculaire (Asselineau and Lederer, 1950). Ils ont pour formule brute : R-CHOH-CHR’COOH et ont la propriété d’être clivés à haute température pour donner une chaîne principale 34
« méro » aldéhyde (ou chaîne méromycolique) et un « méroacide » (ou chaîne α) selon une réaction inverse à une condensation de type Claisen. Les avancées technologiques, en particulier la chromatographie sur couche mince (CCM), la chromatographie gazeuse (GC), La chromatographie liquide à haute pression (HPLC), la spectrométrie de masse (MS) et la résonance magnétique nucléaire (RMN), ont permis de définir la structure des acides mycoliques de toutes les mycobactéries ainsi que ceux de certaines Corynebacterineae. La longueur de chaîne varie fortement d’un genre à l’autre : 22 à 38 atomes de carbone pour Corynebacterium (De Briel et al., 1992), 34 à 38C pour Dietzia (Rainey et al., 1995), 34 à 52C pour Rhodococcus, 46 à 60C pour Nocardia (Nishiuchi et al., 1999), 46 à 66C pour Gordonia (Nishiuchi et al., 2000), 64 à 78C pour Tsukamurella et 60 à 90C pour Mycobacterium (Chun et al., 1997). La structure des acides mycoliques des genres autres que les mycobactéries est relativement simple en termes de fonctions chimiques, avec comme seule modification de chaîne la présence de doubles liaisons. En revanche, les acides mycoliques des mycobactéries se caractérisent par une large diversité de longueur de chaîne et de fonctions chimiques qui définissent les différentes classes d’acides mycoliques (Daffe et al., 1983), (Minnikin et al., 1983), (Barry et al., 1998). On distingue principalement, chez Mtu, les acides mycoliques α et les acides mycoliques oxygénés (figure 10).
Acide mycolique α
Acide méthoxymycolique
Acide cétomycolique
Figure 10 : Structures des acides mycoliques de Mycobacterium tuberculosis (acides α-, kéto- et méthoxymycoliques).
35
La majeure partie des acides mycoliques estérifient l’unité penta-arabinofuranosyl de l’arabinogalactane mais on en retrouve sous forme de lipides extractibles, non liés au squelette pariétal dans la partie enfouie de la couche supérieure (Daffe and Draper, 1998). Les acides mycoliques « libres » s’associent au tréhalose pour former les tréhaloses dimycolate (TDM). Les acides mycoliques formeraient une bicouche lipidique asymétrique. Dans certaines espèces, on observe un « feuillage » composé de différents composés lipidiques, comme les PIM (Phosphatidyl Innositom Mannoside) ou les triacylglycérides, qui viennent s’intercaler dans la bicouche entre les acides mycoliques. De récents travaux ont permis de préciser l’existence de cette bicouche et l’organisation des acides mycoliques dans celle-ci par cryo-électron microscopie de sections vitreuses (Hoffmann et al., 2008; Zuber et al., 2008) (voir paragraphe 1.2.1).
1.2.3.3.2. Les lipides libres ou extractibles
Les lipides libres sont extractibles à l’aide d’un mélange de solvants de type chloroforme/méthanol. Ces lipides ont longtemps intrigué la communauté scientifique. Nous commençons à mieux percevoir leur rôle dans la pathogenèse, les évènements de signalisation, la réponse immunitaire…
Les dimycolyltrehaloses (TDM ou cord factor) sont formés de tréhaloses associés à des acides mycoliques. Les TDM interviennent dans le « cording » des mycobactéries. Le « cording » est défini comme l’adhérence des cellules les une aux autres dans leur grand axe lors de la croissance cellulaire. La perte du « cording » est associée à une perte de virulence du bacille (Glickman et al., 2000; Hunter et al., 2006b). À la surface du bacille, les TDM protègent la mycobactérie via des mécanismes tels que l’inhibition de la fusion du phagosome et du lysosome et la limitation de l’acidification du phagosome (Indrigo et al., 2003; Spargo et al., 1991). Quand les TDM sont isolés et s’associent avec une substance hydrophobe ils deviennent hautement toxiques. Ils peuvent induire chez l’hôte des réactions allergiques ou des granulomes (Hunter et al., 2006a; Rao et al., 2005).
Par ailleurs, d’autres lipides extractibles sont impliqués dans la virulence du bacille comme les sulfolipides, les phthiocerol dimycoserosates (DIM), ou les phénolic glycolipides (PGL) (Minnikin et al., 2002; Reed et al., 2004). On peut également citer, de façon non exhaustive, 36
les lipides extractibles suivants : sulfolipides, monomycolates de glycérol, lipomannanes (LM),
lipoarabinomannanes
(LAM),
phtiocérol
dimycosérosates
(PDIM),
phosphatidylinositol mannosides (PIM).
1.2.4. La capsule ou couche externe
Enfin, la capsule ou couche externe (Daffe and Etienne, 1999), entoure la paroi mycobactérienne. L’organisation de la capsule est encore mal connue même si plusieurs constituants ont été identifiés. Elle est essentiellement composée d’une matrice de polysaccharides, de protéines et dans une moindre mesure de lipides (Ehlers and Daffe, 1998). Cette couche externe semble jouer un rôle à la fois dans la physiologie du bacille et dans la persistance à l’intérieur de l’hôte. Cependant, le rôle des composés polysaccharidiques de la capsule est encore mal connu même si des études apportent des premiers éléments de réponse. Il est suggéré que le glucane (Dinadayala et al., 2004), (Sambou et al., 2008) puisse jouer un rôle antigénique, moduler la réponse immunitaire et intervenir dans la persistance du bacille chez la souris. Une autre étude montre que la capsule polysaccharidique agirait comme une barrière limitant et contrôlant la phagocytose afin d’entrer dans le macrophage par des voies silencieuses (Stokes et al., 2004).
37
1.3. Biosynthèse des acides mycoliques L’importance de la paroi dans la viabilité de Mtu a amené à chercher à mieux comprendre la voie de biosynthèse des acides mycoliques. Le principal antituberculeux de première ligne, l’isoniazide (INH), cible la biosynthèse des acides mycoliques (Takayama et al., 1972). Par conséquent, cette voie de biosynthèse représente un important réservoir de cibles pour de nouveaux antibiotiques antituberculeux. Les dix dernières années ont vu des progrès considérables dans la compréhension de la biochimie, de la structure, de la génétique et de la régulation de la biosynthèse des acides mycoliques (pour la régulation voir le parapgraphe 1.4.2). Ces différents aspects ont fait l’objet de revues (Daffe and Draper, 1998), (Barry et al., 1998), (Takayama et al., 2005), (Bhatt et al., 2007b). L’utilisation comme modèle de Corynebacterium glutamicum, pour qui la biosynthèse des acides mycoliques n’est pas essentielle, et le séquençage complet de Mycobacterium tuberculosis (Cole et al., 1998) ainsi que de Mycobacterium leprae (Cole et al., 2001) ont permis de franchir un cap dans la connaissance de cette voie de biosynthèse.
1.3.1. Organisation générale
La voie de biosynthèse des acides mycoliques fait intervenir un nombre important de protéines. On distingue au moins deux systèmes d’élongation des acides mycoliques ou « Fatty Acid Synthases » (FAS). L’enzyme multi-domaines FAS-I (spécifique des eucaryotes supérieur, parasites et champignons) assure la synthèse de novo d’acide gras à chaîne courte (Bloch, 1977) alors que le système FAS-II (trouvé chez les procaryotes, les plantes et dans les mitochondries de certains champignons) (Odriozola et al., 1977) est composé de plusieurs enzymes et est incapable de synthèse de novo chez Mycobacterium. Même si les deux systèmes diffèrent dans leur spécificité de substrat, ils possèdent la même séquence de réactions qui consiste à l’ajout répété d’unité de deux carbones (acétate) à une chaîne acyl préexistante. La biosynthèse des acides mycoliques peut, de façon schématique, être représentée par quatre « étapes » essentielles (figure 11) : - Synthèse de la chaîne α par le système FAS-I - Synthèse de la chaîne méromycolique par FAS-II - Modifications de la chaîne méromycolique - Condensation terminale de la chaîne α et de la chaîne méromycolique
38
C2 C24, C26
FAS-I
Malonyl-CoA
mtFabD
Malonyl-ACP
C16, C18 mtFabH
Carboxylation AccA3/AccD4/ AccD5/AccE5
FAS-II MabA, InhA, KasA, KasB, HadA, HadB, HadC
Modifications de la chaîne méromycolique MmaA1-4 CmaA1/CmaA2/ PcaA/UmaA C56
Activation FadD32
Réduction CmrA
Condensation finale Pks13
Acide mycolique mature Figure 21 : Schéma global de la biosynthèse des acides mycoliques. FAS-I synthétise de novo des acides gras en C16, C18, C24 et C26. FAS-II, incapable de synthèse de novo prend en charge un acide gras en C16 ou C18 et assure l’élongation jusqu’à une longueur de chaîne de 56 carbones (Chaîne méromycolique). La chaîne α est carboxylée par différentes ACCases et la chaîne méromycolique est activée par FadD32. A ce stade, la condensase Pks13 assure la condensation entre les deux chaînes avant la réduction finale par CmrA qui donne un acide mycolique mature. Les huit méthyltransférases assurent les modifications de la chaîne méromycolique.
39
1.3.2. FAS-I
L’originalité
des
bactéries
produisant
des
acides
mycoliques
(sous-ordre
des
Corynebacterineae) est l’utilisation de FAS-I, généralement attribuée aux eucaryotes (Schweizer and Hofmann, 2004), plutôt que FAS-II pour synthétiser de novo leurs acides gras (Bloch, 1977; Fernandes and Kolattukudy, 1996; Kolattukudy et al., 1997). Cette enzyme multifonctionnelle est codée par un seul gène, fas (Rv2524c), chez Mtu H37Rv. Elle contient sept domaines qui correspondent aux différentes activités catalytiques nécessaires au cycle de biosynthèse des acides gras : acyl transferase, énoylreductase, β-hydroxyacyl dehydratase, malonyl/palmitoyl transferase, acyl carrier protéine (ACP), β-kétoacyl reductase et β-kétoacyl synthase (figure 12).
FAS-I assure la synthèse de novo des acides gras à partir de l’acétyl-CoA en utilisant le malonyl-CoA (3 carbones) comme unité d’élongation. Le malonyl-CoA est le produit de la carboxylation de l’acétyl-CoA catalysé par une acétyl-CoA carboxylase, AccD6 (Rv2247) (Daniel et al., 2007; Kurth et al., 2009) (voir chapitre 1.3.5.2), une enzyme clef dans la plupart des organismes vivants, qui représente la première étape dans la biosynthèse des acides gras. Chez les mycobactéries, le système FAS-I a une distribution bimodale des substrats synthétisés. Il génère des acides gras en C16-C18 d’une part et en C24-C26 d’autre part. Par exemple, le système FAS-I produit des dérivés d’acyl-CoA en C26 chez M.bovis BCG (Kikuchi et al., 1992) et seulement en C24 chez M.smegmatis (Peterson and Bloch, 1977). Les acyl-CoA en C16-C18 pourraient servir de précurseurs de la biosynthèse de la chaîne méromycolique par le système FAS-II. Ceux en C24-C26 pourraient, eux, servir, après carboxylation, à la condensation terminale et former la chaîne α de l’acide mycolique mature. Cependant, le lien direct entre les produits de FAS-I et les substrats de FAS-II et des carboxylases n’a pas été démontré.
Nous ne connaissons pas la structure de FAS-I chez Mtu. Cependant, la structure cristallographique de FAS-I a été déterminée chez trois organismes eucaryotes. Tout d’abord, la protéine homodimérique FAS-I du cochon (mammifère) (mFAS-I) a été déterminée à 4,5Å (Maier et al., 2006) et plus récemment à 3,2Å (Maier et al., 2008). Elle possède une architecture complexe constituée d’un enchaînement de linkers et de domaines enzymatiques. On distingue une partie supérieure et une partie inférieure (figure 12). Cette enzyme montre 40
une grande flexibilité et peut même effectuer une rotation entre la partie inférieure et la partie supérieure (Brignole et al., 2009). Par ailleurs, la structure de FAS-I de Thermomyces lanuginosus a été déterminée à 3,1Å et révèle une structure hétérododécamérique (Jenni et al., 2007). Enfin, la structure de FAS-I chez la levure, S.cerevisiae, a été obtenue à 3,1 Å et a une structure similaire à FAS-I chez Thermomyces lanuginosus (Leibundgut et al., 2007).
Figure 12 : Structure de la protéine FAS-I du mammifère (Maier et al., 2008). Rouge : sous unité enzymatique Malonyl-acétyl transférase ; Orange : sous unité enzymatique Kétoacyl synthase ; Vert foncé : sous unité enzymatique Enoylréductase ; Vert clair : sous unité enzymatique Déshydratase ; Jaune : sous unité enzymatique Kétoréductase.
1.3.3. FAS-II
FAS-II (Odriozola et al., 1977), incapable de synthèse de novo chez les mycobactéries, est un système multiprotéique où chaque réaction est catalysée par une enzyme monofonctionnelle distincte. Il utilise comme substrat un acyl-CoA d’au moins 16 atomes de carbone. La synthèse de la chaîne méromycolique a alors lieu par élongation successive du substrat avec ajout de deux atomes de carbone à chaque cycle (figure 13) jusqu’à une longueur de chaîne complète en C60. Le malonyl-CoA fait office de sous-unité d’élongation comme pour FAS-I. Une des caractéristiques des enzymes du système FAS-II est d’être dépendante in vivo du
41
couplage de leur substrat avec une Acyl Carrier Protein mycobactérienne (AcpM-Rv2244) spécifique des mycobactéries (Kremer et al., 2001), (Schaeffer et al., 2001a), (Wong et al., 2002).
KasA KasB
HadA HadB HadC
Figure 13 : Schéma du système FAS-II impliqué dans la voie de biosynthèse des acides mycoliques (adapté de Schaeffer et al., 2001).
La figure 13 détaille les étapes principales du cycle FAS-II. L’acétyl-CoA est carboxylé par un complexe ACC (Acétyl CoA Carboxylase), qui a pour sous-unité β l’enzyme AccD6 (Daniel et al., 2007; Kurth et al., 2009), pour donner un malonyl-CoA pris en charge par la malonyl-CoA:ACP transacylase (mtFabD) pour former un malonyl-ACP, sous unité d’élongation du système FAS-II. La β-cétoacyl-ACP synthase III (mtFabH) assure la condensation de type Claisen initiale entre l’acyl-CoA provenant de FAS-I et la malonyl-CoA pour former un β-cétoacyl-ACP. Le précurseur du cycle d’élongation ainsi formé permet d’initier les quatre étapes de FAS-II : il est réduit par une β-cétoacyl-ACP réductase NADPHdépendante (MabA) pour former un intermédiaire β-hydroxyl-ACP lui-même déshydraté par des hétérodimères de β-hydroxyacyl-ACP déshydratases (HadA-B /HadB-C) formant ainsi un 2-trans-énoyl-ACP. Ensuite, le 2-trans-énoyl-ACP est réduit par l’énoyl-ACP réductase NADH-dépendante (InhA) produisant un acyl-ACP condensé avec un malonyl-CoA par les β42
kétoacyl synthases (KasA ou KasB) pour obtenir un β-cétoacyl-ACP de deux carbones supplémentaires à chaque cycle. L’élongation cesse quand l’acyl-ACP a atteint une longueur suffisante (C56 chez Mtu) pour former la chaîne méromycolique.
Les principaux gènes de FAS-II sont organisés dans deux opérons, ou unités de transcription. On distingue, chez Mtu, l’opéron mtfabD-acpM-kasA-kasB-accD6 (opéron kas : Rv2243-47) et l’opéron mabA-inhA (Cole et al., 1998). L’opéron mabA-inhA (Rv1483-Rv1484) est retrouvé également chez M.bovis et M.smegmatis (Banerjee et al., 1998). On sait aussi que l’opéron kas est présent chez M.aurum (Gupta and Singh, 2008).
1.3.3.1.
Initiation du cycle FAS-II
Dans l’étape d’initiation, deux protéines jouent un rôle crucial : mtFabD et AcpM.
L’AcpM, l’Acyl Carrier Protein mycobactérienne, codée par le gène acpM (Rv2244) (Kremer et al., 2001), permet le « transport » d’une enzyme à l’autre, ou d’un site actif à l’autre, de la chaîne lipidique en cours de synthèse dans le système FAS-II. Les précurseurs de la chaîne méromycolique sont liés de façon covalente à l’AcpM, sous forme de thioesters liés à la fonction sulfhydryl du groupe prosthétique 4’-phosphopantéthéine (Rock and Cronan, 1996). Ce groupe prosthétique est lié à la forme inactive de l’AcpM (apo-AcpM) par l’holo-ACP synthase (AcpS-Rv2523c) qui transfère la 4’-phosphopantéthéine de CoA à la Ser41 de l’apoACPm pour donner la forme active de l’AcpM : l’holo-AcpM (Chalut et al., 2006). Les structures de l’AcpM (Wong et al., 2002) et celles de l’AcpS ont été résolues (Dym et al., 2009) (figure 14). Chez Mtu, en plus d’acpM, deux autres gènes codent pour des ACPs potentielles (Rv0033 et Rv1344) (Kremer et al., 2001). Cependant, sur les trois protéines potentielles, seule AcpM possède une protéine homologue chez M. leprae qui contient le « génome minimal mycobactérien ». La biosynthèse des acides mycoliques étant essentielle à la survie des mycobactéries, on peut penser qu’AcpM est bien l’ACP qui intervient dans la biosynthèse des acides mycoliques. De plus, des précurseurs d’acides mycoliques liés à l’AcpM ont été identifiés : des chaînes acyl-ACP en C20 (Yuan et al., 1998a) et des chaînes méromycoliques complètes (Mdluli et al., 1998). Le travail de Yuan montre que les acyl en C20 sont solubles
43
uniquement lorsqu’ils sont liés à l’AcpM. Par ailleurs, le cross-link entre AcpM et KasA a été réalisé (Barry et al., 1998) et acpM fait partie d’un opéron qui contient d’autres gènes de FAS-II chez Mtu (Cole et al., 1998). AcpM reste donc la meilleure candidate pour intervenir dans la voie de biosynthèse des acides mycoliques.
AcpM
AcpS
PDB : 1KLP
PDB : 3hqj
mtFabH
KasA
KasB
PDB : 1M1M
PDB : 2wgd
PDB : 2GP6
mtFabD
MabA
InhA
PDB : 2qj3
PDB : 1UZL
PDB : 1zid
Figure 34 : Structure des protéine de FAS-II cristallisées à ce jour et leur code dans la PDB (Protein Data Bank)
44
Le malonyl-CoA:ACPm transacylase (MCAT) mycobactérien, mtFabD (Rv2243), fourni aux condensases l’unité d’élongation de deux carbones à chaque cycle. MtFabD catalyse la transacylation du malonate du malonyl-CoA vers l’holo-ACP pour former un malonyl-ACP (Kremer et al., 2001). La structure de mtFabD a récemment été déterminée (Ghadbane et al., 2007; Li et al., 2007) (figure 14).
De récents travaux montrent que l’expression ectopique de mtFabD dans une souche de levure mutante, où l’orthologue de mtfabD (∆mctlp) a été inactivé, permet de rétablir le fonctionnement du système FAS-II mitochondrial (Gurvitz, 2009a).
Un autre gène, fabD2 (Rv0649), a une activité MCAT chez Mtu (Huang et al., 2006). Il présente 28% d’identité avec mtfabD. L’absence d’orthologue chez M.leprae (considéré comme ayant le « génome minimal mycobactérien ») nous amène à penser que c’est bien mtFabD et non FabD2 qui interviendrait dans la biosynthèse des acides mycoliques.
1.3.3.2.
Les condensases
La condensation entre l’unité d’élongation (malonyl-ACP) le groupe acyl-ACP (ou acyl-CoA pour l’initiation de l’élongation) est une étape primordiale dans la biosynthèse des acides mycoliques car elle constitue le début de chaque cycle d’élongation. Il se pourrait que cette étape contrôle l’arrêt de l’élongation et par conséquent la longueur de chaîne finale même si cela n’a pas encore été démontré. Cette condensation, de type Claisen, est assurée par les βcétoacyl-ACP synthases (KAS). Trois KAS interviennent dans le système FAS-II : Un appartient à la famille de condensases KASIII (mtFabH) et deux à la famille de condensases KASI (KasA et KasB).
La protéine mtFabH (Rv0533c) fait le lien entre le système FAS-I et le système FAS-II. Elle initie l’élongation de la chaîne méromycolique en condensant un malonyl-ACP délivré par FabD avec un acyl-CoA pour former un β-cétoacyl-ACP (Choi et al., 2000; Scarsdale et al., 2001). Des études montrent que l’enzyme mtFabH purifiée in vitro utilise comme substrat des acyl-CoA en C12 (Choi et al., 2000). Une étude structurale montre que mtFabH peut fixer des acyl-CoA allant jusqu’à 16 atomes de carbone (Scarsdale et al., 2001). L’homodimère mtFabH forme une large poche et le substrat vient se fixer sur le site actif au niveau de la 45
Cys112 (Scarsdale et al., 2001). Il y a alors formation d’un thioesther et dissociation du CoA. Le malonyl-ACP vient remplacer le CoA. MtFabH fixe ses substrats à l’intérieur d’un tunnel (tunnel pantéthéinate). Il a été montré récemment que mtFabH changeait de conformation avec une forme « ouverte » au moment de la fixation et de la libération du substrat et une forme « fermée » pendant la catalyse (Sachdeva et al., 2008) (figure 14).
KasA (Rv2245) et KasB (Rv2246) sont des β-cétoacyl-ACP synthases qui assurent la condensation entre les acyl-ACP et le malonyl-ACP dans le système FAS-II (Kremer et al., 2002; Schaeffer et al., 2001b). Ces deux enzymes ont une spécificité pour des substrats à longue chaîne et ont dix fois plus d’affinité pour les acyl-ACP que pour les acyl-CoA, faisant d’elles des enzymes d’élongation et non pas d’initiation comme mtFabH (Schaeffer et al., 2001b). Elles ont une forte homologie de séquence, mais varient par leur spécificité de substrats (Kremer et al., 2002; Schaeffer et al., 2001b).
Plusieurs études suggèrent que KasA intervient en début d’élongation et KasB en fin d’élongation. La surproduction de KasA et KasB, individuellement et ensemble, dans M. smegmatis et l’analyse in vitro de l’activité de biosynthèse des lysats cellulaires amènent à dire que KasA prendrait en charge l’élongation jusqu’à 40 carbones et que KasB interviendrait en fin d’élongation jusqu’à une longueur de chaîne de 54 carbones (Slayden and Barry, 2002). Des études in vivo tendent à confirmer cette hypothèse. La délétion du gène kasB chez Mtu fait perdre aux bacilles leur viabilité dans le macrophage (Bhatt et al., 2007a; Gao et al., 2003). De plus, ces mutants ont des acides mycoliques plus courts de 2 à 4 carbones dans l’étude de Gao et coll. et des acides céto-mycoliques plus courts de 6 atomes de carbones et une perte des acides mycoliques oxygénés trans-cyclopropanés dans celle de Bhatt et coll. Cependant, il est peu probable que KasB n’intervienne que dans l’élongation de 2 à 6 carbones en fin de cycle. Dans ces travaux, il se pourrait qu’il ait été sélectionné des clones pour lesquels KasA a une affinité pour des chaînes plus longues ou que l’absence de KasB « force » KasA à intervenir dans l’élongation en fin de cycle. Pour finir, kasA et kasB ne sont pas redondants in vivo car la délétion du gène kasB entraîne des acides mycoliques plus courts alors que kasA est essentiel à la survie (Bhatt et al., 2005). Il apparaît donc clair que KasA intervient en début de cycle et KasB en fin d’élongation.
La structure de l’homodimère KasB a été résolue (Sridharan et al., 2007) (figure 14). Cette condensase a un repliement de type thiolase. La structure de KasA (Luckner et al., 2009) 46
(figure 14) révèle une protéine homodimérique. Elle laisse entrevoir un mécanisme similaire à celui de la condensase mtFabH. Les hélices α5 et α6 de chaque unité pivotent permettant ainsi à l’enzyme d’avoir deux conformations différentes correspondant à la fixation du substrat et à la libération du produit par un mécanisme enzymatique de type Ping Pong. Les deux enzymes ont des structures similaires à l’exception de l’entrée de la poche du site actif qui est plus large chez KasA et serait une explication de la plus forte sensibilité de KasA à la thiolactomycine (TLM).
1.3.3.3.
Les réductases
Le génome de Mtu contient cinq gènes codants pour des réductases fabG (β-ketoacyl reductases) identifiés. Une d’entre elles intervient dans la biosynthèse des acides mycoliques. Il s’agit de la réducatse MabA (FabG1, Rv1483). C’est une β-cétoacyl-ACP réductase NADPH-dépendante. Elle intervient comme seconde enzyme du cycle FAS-II après la condensation et réduit un β-cétoacyl-ACP en β-hydroxyacyl-ACP (Marrakchi et al., 2002). Chez M.bovis, il a été montré que FabG1 et FabG4 (codée par Rv0242c) étaient essentielles (Beste et al., 2009). De plus, FabG1 comme FabG4 complémentent un mutant de levure déficient pour son activité β-cétoacyl réductase dans les mitochondries et rétablissent le fonctionnement du système FAS-II mitochondrial (Gurvitz, 2009b). Cependant, le système de complémentation chez la levure semble être très conciliant au niveau de la spécificité de substrat des enzymes de FAS-II. Le rôle de FabG4 dans la biosynthèse des acides mycoliques reste à élucider.
InhA, ou 2-trans-énoyl-ACP réductase NADH-dépendante, intervient dans la quatrième étape du cycle FAS-II après la déshydratation et juste avant la condensation ou l’arrêt de l’élongation (Marrakchi et al., 2000). Elle catalyse la réduction d’un énoyl-ACP en acyl-ACP. InhA a une préférence pour des substrats à longue chaîne et a une affinité bien plus importante (1.102) pour des énoyl-ACP que pour des énoyl-CoA (Quemard et al., 1995). Comme pour FAbG1 et FabG4, Gurvitz et coll. ont réussi à complémenter un mutant de levure déficient pour son activité énoyl-réductase dans le système FAS-II mitochondrial en y exprimant InhA (Gurvitz et al., 2008a).
47
MabA et InhA sont deux protéines qui sont fonctionnellement et structurellement très proches (figure 14). En effet, les structures tertiaires d’InhA (269 résidus) et de MabA (247 résidus) ont un repliement similaire avec un écart quadratique moyen de 1,44Å pour 163 atomes Cα en correspondance. Le repliement de ces deux réductases se compose d’un feuillet β à 7 brins parallèles dont chaque face est flanquée par des hélices α caractéristiques de la superfamille des
« short-chain
dehydrogenase
reductase »
(SDR)
ou
« reductase-epimerase-
dehydrogenase » (RED) (Cohen-Gonsaud et al., 2002; Dessen et al., 1995; Labesse et al., 1994). Par ailleurs, MabA et InhA semblent tétramériques en solution ainsi que dans les différentes formes cristallines obtenues (Cohen-Gonsaud et al., 2002; Rozwarski et al., 1999). Les deux homotétramères sont également très similaires avec un écart quadratique moyen de 2,6Å pour 646 atomes Cα alignés. Les quatre sous-unités identiques des deux enzymes sont identifiées par une lettre A, B, C et D. Ces structures tétramériques possèdent une symétrie interne d’ordre 222, avec 3 axes perpendiculaires qui se coupent en leur centre et deux interfaces protéine-protéine α4α5 entre les sous-unités A et B (ou C et D) et α6β7 entre les sous-unités A et D (ou B et C) (figure 15).
Les gènes des protéines MabA et InhA sont organisés dans un même opéron mabA-inhA chez Mtu (Rv1483-Rv1484) (Cole et al., 1998) mais aussi chez M.bovis et M.smegmatis (Banerjee et al., 1998). Ils sont essentiels à la survie des mycobactéries. Malgré de multiples tentatives, il n’a pas été possible de réaliser des mutants de délétion pour ces deux gènes. Un mutant de délétion de mabA a pu être construit uniquement en complémentant M.smegmatis avec une copie du gène mabA ce qui nous amène à penser que MabA est essentielle à la survie des mycobactéries (Parish et al., 2007). De plus, InhA a été décrite comme étant la principale cible de l’INH (Banerjee et al., 1994; Vilcheze et al., 2000; Vilcheze et al., 2006), antibiotique majeur dans la lutte contre la tuberculose. InhA a été montré comme étant essentielle in vivo chez M.bovis et chez M.smegmatis (Vilcheze et al., 2000). A contrario, mabA et inhA ont tous les deux été prédits comme non-essentiels par une technique de mutagénèse à haute densité (Sassetti et al., 2003; Sassetti and Rubin, 2003). Il ne s’agit que de prédictions et les différentes études in vivo citées précédemment semblent convaincantes pour affirmer que les gènes mabA et inhA sont essentiels à la survie des mycobactéries.
48
MabA
Interface α6-β β7
Interface α5 α4-α
Cohen-Gonsaud et al., 2002
A
α4 α5
α6 β7
D
B α6 β7
α4 α5
C
Figure 15 : Structure homotétramérique de MabA. En haut, structure cristallographique de MabA. En bas, représentation schématique des homotétramères MabA et InhA. On distingue deux types d’interface α4α5 et α6β7.
49
1.3.3.4.
Les déshydratases
La déshydratation de l’intermédiaire β-hydroxyacyl-ACP en énoyl-ACP, entre les deux réductions du cycle FAS-II, qui correspond à la troisième étape de l’élongation, est catalysée par une β-hydroxyacyl-ACP déshydratase. L’identification de l’enzyme responsable de cette étape a fait et fait toujours l’objet d’une polémique. Chez E.coli, l’étape de déshydratation est assurée par FabZ en début d’élongation et par FabA sur les chaînes de longueur intermédiaire (Heath and Rock, 1996). Par ailleurs, FabA possède également une activité trans-isomérase qui lui permet d’introduire des doubles liaisons sur la chaîne carbonée. Aucun homologue à ces deux protéines n’a été identifié dans Mtu (Sacco et al., 2007b). Des études bioinformatiques ont montré que onze (R)-spécifique énoyl hydratases/3-hydroxyacyl déshydratases étaient des candidates potentielles (Castell et al., 2005; Sacco et al., 2007b). La structure ou la modélisation ont été réalisées pour trois d’entre elles suggérant que ces protéines appartiennent à la famille hydratase 2 (Castell et al., 2005; Johansson et al., 2006; Sacco et al., 2007b). De plus, la structure de mFAS-I (Maier et al., 2008) révèle un motif similaire à ceux retrouvés dans les enzymes de la famille hydratase 2 ce qui laisse suggérer que la déshydratase de FAS-II pourrait bien appartenir à cette famille. Sacco et coll. ont été les premiers à décrire la structure de l’une des onze protéines candidates, Rv3389c, et ont décrit une structure en « double hotdog » (Sacco et al., 2007b). Par ailleurs, il a également été montré que deux gènes codants pour des protéines appartenant à cette famille, Rv0636 chez Mtu (Castell et al., 2005) ainsi que MSMEG1341 chez M.smegmatis (Brown et al., 2007), sont essentiels, ce qui en fait des candidats potentiels à l’étape de déshydratation du cycle FAS-II.
Une étude récente de Sacco (Sacco et al., 2007a) a montré que l’étape de déshydratation était réalisée par trois protéines (HadA, HadB et HadC). Ces protéines sont codées par les gènes hadA-hadB-hadC (Rv0635-Rv0636-Rv0637) probablement organisés en opéron. Des études d’interactions protéine-protéine ont montré l’existence de deux hétérodimères HadA-HadB et HadB-HadC. Contrairement à Rv3389c, candidat potentiel à l’étape de déshydratation (Sacco et al., 2007b), les deux hétérodimères ont une spécificité pour des substrats à longue chaîne liés à l’AcpM. Il semblerait que HadA-HadB et HadB-HadC aient des spécificités pour des substrats de longueur de chaînes différentes. HadA-HadB interviendrait en début d’élongation et HadB-HadC en fin d’élongation ce qui est cohérent avec les prédictions d’essentialité (Sassetti et al., 2003) qui montrent que HadA et HadB sont essentiels contrairement à HadC. 50
L’analyse de la séquence de ces trois gènes montre que seule HadB porte un motif hydratase 2, ce qui en ferait la sous-unité catalytique des deux hétérodimères. De plus, il semblerait que chacune des trois protéines ait une structure en « simple hotdog ». Les hétérodimères formant ainsi un « double hotdog » asymétrique. HadB serait responsable de la catalyse alors que HadA et HadC stabiliseraient le substrat à longue chaîne (Sacco et al., 2007a). Nous devons attendre les données cristallographiques pour obtenir une description plus détaillée. Cependant, les modèles structuraux effectués dans ce travail (paragraphe 2.5.2) confirment ces hypothèses.
Gurvitz et coll. propose trois déshydratases supplémentaires comme candidates à l’étape de déshydratation : HtdZ (Gurvitz et al., 2008b), HtdX et HtdY (Gurvitz et al., 2009). Il a montré que ces trois déshydratases potentielles, lorsqu’elles étaient exprimées dans une souche de levure déficiente pour l’activité déshydratases du système FAS-II mitochondrial, rétablissaient l’activité déshydratase du système d’élongation d’acides gras. Cependant, ces résultats ne suffisent pas à démontrer la participation de ces trois enzymes au système FAS-II mycobactérien.
1.3.4. Modifications de la chaîne méromycolique
1.3.4.1.
Généralités sur les modifications de la chaîne méromycolique
Les modifications sur la chaîne méromycolique définissent les différentes classes d’acides mycoliques qui se distinguent par la présence de fonctions oxygénées (méthoxy-, céto-, époxy- ou hydroxy-) et/ou de cycles propaniques ou de doubles liaisons à deux positions distinctes, distale et proximale, en rapport avec la fonction hydroxyle de la chaîne méromycolique (figure 16). Les modifications de la chaîne méromycolique jouent un rôle dans la pathogénicité, la virulence du bacille et la fluidité de l’enveloppe. Il semblerait que les acides mycoliques oxygénés (céto- et méthoxy-) soient impliqués dans la modulation de la fluidité de l’enveloppe et l’adaptation aux conditions de croissance (Yuan et al., 1998b). De plus, la participation des acides mycoliques oxygénés et cyclopropanés dans la virulence de Mtu chez la souris à été démontrée (Dubnau et al., 2000; Glickman et al., 2000)
51
Figure 16 : Les différentes classes d’acides mycoliques chez Mtu et la position (distale ou proximale) d’intervention des différentes méthyltransférases.
En fonction des espèces de mycobactéries, différentes combinaisons d’acides mycoliques sont produites (Daffe et al., 1981; Minnikin et al., 1982). Mtu possède des acides mycoliques α ainsi que des acides céto- et méthoxy-mycoliques alors que M.smegmatis synthétise trois classes d’acides mycoliques α ainsi que des acides époxy-mycoliques.
Il est suggéré dans la littérature que les modifications de la chaîne méromycolique pourraient avoir lieu au cours de l’élongation (Veyron-Churlet et al., 2005; Yuan et al., 1998a). Ces études vont dans le sens d’observations antérieures. Des composés insaturés ou cyclopropanés de Mtu plus court que les acides mycoliques matures ont été isolés (Qureshi et al., 1980). De plus, Qureshi et coll., à partir d’un extrait cellulaire de Mtu H37Ra, ont réussi à mettre en évidence la présence de composés saturés et mono-insaturés semblables aux précurseurs des acides mycoliques matures. Cette observation laisse supposer que les modifications de la chaîne méromycolique auraient lieu avant l’étape de condensation (Qureshi et al., 1984).
Grâce aux différences structurales des acides mycoliques entre Mtu et M.smegmatis, l’expression hétérologue des gènes de Mtu dans M.smegmatis ainsi que le séquençage complet du génome de Mtu et la construction de mutants de délétion pour certains gènes ont permis de
52
découvrir les enzymes responsables des modifications de la chaîne méromycolique. On distingue huit enzymes appartenant toutes à la famille des méthyltransférases S-AdénosylMéthionine (SAM)-dépendantes. Quatre d’entre elles sont codées par quatre gènes qui font partie d’un même opéron mmaA1 à mmaA4 (Rv0645c-Rv0644c-Rv0643c-Rv0642c) (Yuan and Barry, 1996). Quatre autres ne sont pas dans cet opéron : CmaA1 (Rv3392c), CmaA2 (Rv0503c), PcaA (Rv0470c) et UmaA (Rv0469).
CmaA1
CmaA2
PcaA
PDB : 1KP9
PDB : 1KPI
PDB : 1L1E
MmaA2 PDB : 1TPY
apoMmaA4
SAMMmaA4
PDB : 2FK7
PDB : 2FK8
Figure 17 : Structures connues des méthyltransférases intervenant dans les modifications de la chaîne méromycolique chez Mtu et leur code dans la PDB (Protein Data Bank).
La structure des trois cyclopropanes synthases CmaA1, CmaA2 et PcaA a été résolue (Huang et al., 2002) (figure 17). Elles possèdent, de façon similaire aux autres SAM-dépendantes méthyltransférases, un repliement de type α/β avec un feuillet β à 7 brins conservé (zone d’interaction avec la S-Adénosyl-Méthionine (SAM) en position N-terminale) et une zone plus variable formée d’hélices α de fixation du substrat en position C-terminale. À partir de ces structures, nous pouvons penser que ces trois enzymes catalysent le transfert d’un groupement méthyle via la formation d’un carbocation. La structure de MmaA2 a été réalisée
53
mais n’a pas encore été publiée (réf. pdb : 1TPY ; Smith and Sacchettini) (figure 17). Par ailleurs, la structure tridimensionnelle de MmaA4 (Hma), dans sa forme apo et en complexe avec la SAM, a été déterminée (Boissier et al., 2006) (figure 17). MmaA4 lie son substrat dans un tunnel hydrophobe qui existe dans une forme ouverte et une forme fermée. De plus, la structure de cette protéine montre certaines différences avec les autres méthyltransférases. Notamment, le motif structurel α2α3, qui délimite le tunnel hydrophobique dans lequel vient se fixer le substrat, joue un rôle de pivot. Il est émit l’hypothèse que la conformation de ce motif pourrait jouer sur la spécificité de substrat.
1.3.4.2.
Formation des doubles liaisons cis
Chez les mycobactéries, l’introduction des différentes fonctions sur la chaîne méromycolique par les méthyltransférases nécessite la formation d’une double liaison cis en position distale et proximale. Chez certains procaryotes, on trouve des déshydratases capables d’assurer l’isomérisation, notamment FabA chez E.coli (Heath and Rock, 1996). Ces enzymes appartiennent à la superfamille « hydratase/isomérase » (pfam00378) (Bateman et al., 2000). L’introduction des doubles liaisons cis sur la chaîne méromycolique pourrait être réalisée par une enzyme de cette famille qui aurait une double activité : déshydratation du β-hydroxyacylACP et isomérisation du 2-trans-enoyl-ACP formé en 3-cis-enoyl-ACP. La réduction par InhA de cet intermédiaire n’aurait pas lieu, l’élongation se poursuivant alors avec conservation d’une double liaison cis sur la chaîne. Cependant, il n’y a pas d’activité isomérase connue pour les déshydratases candidates au système FAS-II, notamment en ce qui concerne les deux hétérodimères HadA-B et HadB-C. Il se pourrait également qu’une isomérase intervienne à un moment donné de l’élongation afin d’introduire la double liaison. Cette étape reste à élucider.
1.3.4.3.
Introduction de fonctions cyclopropanes et méthyles
Sur les huit méthyltransférases identifiées, quatre (CmaA1, CmaA2, PcaA et MmaA2) ont une importante similarité avec la Cyclopropane Fatty Acid Synthase (CFAS) d’E.coli faisant d’elles des candidates potentielles à la cyclopropanation de la chaîne méromycolique.
54
Une première étude de surproduction dans M.smegmatis a suggéré que CmaA2 serait impliqué dans l’introduction d’un cis-cyclopropane en position proximale des acides mycoliques α (George et al., 1995). Par la suite, une étude d’inactivation du gène umaA2 chez Mtu a montré que la cis-cyclopropanation en position proximale des acides mycoliques α était assurée par le produit de ce gène (Glickman et al., 2000). UmaA2 a été renommé pcaA pour proximal cyclopropanation of alpha-mycolate. L’ambigüité sur la redondance de ces deux gènes a été levée en inactivant cmaA2 dans Mtu. Le mutant de délétion montre des modifications uniquement sur les acides mycoliques oxygénés. CmaA2 est donc décrite comme responsable de la trans-cyclopropanation en position proximale des acides céto- et méthoxy-mycoliques (Glickman et al., 2001).
CmaA1 a été décrite, à la suite d’expériences de surproduction dans M.smegmatis, comme responsable de la cis-cyclopropanation en position distale des acides mycoliques α (Yuan et al., 1995) et MmaA2 comme intervenant dans la cis-cyclopropanation en position proximale des acides méthoxy-mycoliques (Yuan and Barry, 1996). Plus récemment, Glickman a construit deux mutants de délétion pour les gènes cmaA1 et mmaA2 et a montré, par des expériences d’inactivation de gènes chez Mtu, que MmaA2 était essentiel pour la ciscyclopropanation en position distale des acides mycoliques α contrairement à CmaA1, invalidant ainsi les premiers résultats de Yuan (Glickman, 2003). Dans cette même étude, il est montré que MmaA2 interviendrait dans la cis-cyclopropanation en position proximale des acides céto- et méthoxy-mycoliques. Le rôle de CmaA1 dans Mtu reste à élucider.
Chez Mtu, les groupes méthyles sont adjacents du trans-cyclopropane en position proximale des acides mycoliques oxygénés. MmaA1 a été proposé comme intervenant dans l’introduction d’un groupe méthyle sur la chaîne méromycolique en position distale mais son rôle exact reste à déterminer (Takayama et al., 2005; Yuan et al., 1997). Des travaux récents ont montré, en mutant le gène umaA dans Mtu et M.smegmatis, que UmaA était responsable des méthylations des acides mycoliques α ainsi que des acides époxy-mycoliques chez M.smegmatis. Par contre, aucun effet n’a été observé chez Mtu sur la structure des acides mycoliques suite à la mutation d’umaA (Laval et al., 2008). Il semblerait que les deux gènes étudiés chez ces deux espèces n’aient pas la même fonction. Le rôle d’umaA chez Mtu reste à élucider. En effet, il ne semble pas qu’il s’agisse d’un pseudogène car il a été observé une augmentation de la virulence d’un mutant de Mtu H37Rv, dans la souris, suite à la mutation du gène umaA par transposition. Il se pourrait que les travaux de Laval et coll. n’aient pas 55
permis de déterminer l’effet de la délétion de umaA chez Mtb dans des conditions de culture artificielle. Le rôle d’umaA pourrait dépendre de facteurs environnementaux qui interviendraient in vivo.
1.3.4.4.
Introduction de fonctions oxygénées
La biosynthèse des acides mycoliques oxygénés (céto- et méthoxy-) nécessite la formation d’un précurseur appelé acide hydroxy-mycolique. Ce précurseur est le produit de la catalyse de la chaîne méromycolique par l’enzyme MmaA4 (Dinadayala et al., 2003; Dubnau et al., 2000; Yuan and Barry, 1996). En présence d’une molécule d’eau, MmaA4, en position distale, est capable de méthyler la double liaison cis tout en réalisant de façon concertée une hydroxylation. À ce stade, le précurseur cis des acides mycoliques oxygénés est synthétisé. MmaA1 pourrait être responsable de la méthylation en position proximale conduisant au précurseur trans des acides mycoliques oxygénés (Yuan et al., 1997).
Les acides hydroxy-mycoliques peuvent soit être transformés en acides céto-mycoliques par une réaction rédox en position distale qui réduit la fonction hydroxyle en fonction cétone, soit en acides méthoxy-mycoliques par l’action d’une O-méthyl-transferase, MmaA3, qui méthyle l’alcool secondaire de la position distale (Yuan and Barry, 1996; Yuan et al., 1998b).
1.3.5. Etape de condensation (figure 18)
La condensation « finale » de la chaîne α avec la chaîne méromycolique implique plusieurs enzymes, en plus de Pks13, qui interviennent dans l’activation de la chaîne méromycolique et la carboxylation de la chaîne α.
1.3.5.1.
Activation de la chaîne méromycolique
La chaîne méromycolique est activée par une acyl-AMP-ligase, FadD32. Le gène fadD32 (Rv3801c) est adjacent à pks13 (Rv3800c) et cette organisation génétique fadD32-pks13 est conservée chez Mtu et M.leprae. 56
Figure 18 : Schéma de l’étape de condensation entre la chaîne α et la chaîne méromycolique des acides mycoliques (Gavalda et al., 2009).
57
FadD32 catalyse la production, à partir d’acides gras liés à l’ACPm et issus de FAS-II, d’acyladénylates (acyl-AMP) qui seraient les substrats « activé » de Pks13 (Trivedi et al., 2004). 35 gènes fadD ont été recensés dans le génome de Mtu. Ils ont des homologies avec les fatty acyl-CoA synthetase. Comme fadD32, plusieurs de ces gènes sont adjacents à pks13 et présentent une activité fatty acyl-AMP (FAAL) ligase plutôt qu’une activité fatty acyl-CoA ligase (FACL).
L’acyl-adénylate synthétisé par FadD32 est transféré à la condensase Pks13 (Gavalda et al., 2009; Leger et al., 2009). L’implication de FadD32 dans la biosynthèse des acides mycoliques a été démontrée par inactivation du gène fadD32 dans C.glutamicum (Portevin et al., 2005). Comme Pks13 (Portevin et al., 2004), FadD32 (Portevin et al., 2005) a été décrite comme essentielle à la biosynthèse des acides mycoliques et à la survie des mycobactéries.
1.3.5.2.
Carboxylation de la chaîne α
La carboxylation des acyl-CoA procède généralement en deux étapes et est dépendante du groupe prosthétique biotine. La première étape fait intervenir une biotine carboxylase (BC) qui catalyse la carboxylation de la biotine en utilisant du bicarbonate comme source de dioxyde de carbone pour former un carboxy-biotine (étape 1). La seconde partie de la réaction fait intervenir une carboxyltransferase (CT) qui transfère le groupe carboxyle de la biotine vers l’acyl-(acétyl)-CoA pour former un acyl-(malonyl)-CoA (étape 2).
1 Formation du carboxy-biotine (BC+BCCP) HCO3- +Mg-ATP + BCCP-biotin ↔ BCCP-biotin-CO2- + Mg-ADP + Pi 2 Transfert du carboxyl vers l’acyl-CoA (CT) BCCP-biotin- CO2- + acyl-(acétyl)-CoA ↔ BCCP-biotin + acyl-(malonyl)-CoA Les enzymes qui catalysent cette réaction sont appelées acyl-CoA carboxylases (ACCases). Chez les procaryotes, les ACCases sont constituées de plusieurs sous unités qui forment un complexe alors que chez les eucaryotes on trouve des enzymes qui comprennent plusieurs domaines catalytiques (Cronan and Waldrop, 2002; Tong, 2005). Ces enzymes, pour être actives, doivent comprendre les trois domaines catalytiques BC, CT et biotine carboxyl carrier protein (BCCP). Chez les mycobactéries on distingue une organisation intermédiaire. Les 58
domaines BC et BCCP forment la sous-unité α et le domaine CT forme la sous-unité β (Diacovich et al., 2002; Tong, 2005). La sous-unité β contrôlerait la spécificité de substrat (Diacovich et al., 2004).
Mtu comprend dans son génome plusieurs ACCases avec 3 gènes pour les sous-unités α (accA1-3) et six gènes pour les sous-unités β (accD1-6). Plusieurs travaux ont étudié le rôle des différentes protéines présentes chez Mtu et chez Corynebacterium glutamicum.
Note : Il existe une différence entre la numérotation des sous-unités β chez Mtu et chez Corynebacterium glutamicum. Par la suite, lorsque l’on citera un gène ou une protéine de Corynebacterium glutamicum, nous préciserons entre parenthèses le gène ou la protéine correspondante chez Mtu.
Une étude chez Corynebacterium glutamicum, où les gènes accD2 et accD3 (accD5 et accD4 chez Mtu respectivement) ont été inactivés un à un, montre qu’AccD2 et AccD3 (AccD5 et AccD4 chez Mtu) interviendraient dans la biosynthèse des acides mycoliques car les deux mutants ∆accD2 et ∆accD3 ne synthétisent plus d’acides mycoliques (Gande et al., 2004). Toujours chez Corynebacterium glutamicum, Portevin et coll. ont montré, par une approche de mutants de délétion/insertion, qu’AccD3 (AccD4 chez Mtu) serait essentiel à la carboxylation de la chaîne α, étape précédant la condensation mycolique (Portevin et al., 2005). De plus, cette même étude montre qu’AccD4 est essentielle à la survie chez M.smegmatis en utilisant des plasmides réplicatifs conditionnels exprimant la protéine AccD4 dans un mutant où le gène accD4 a été inactivé.
Par ailleurs, la seule sous-unité α présente chez M.leprae est l’homologue d’AccA3 (Rv3285 chez Mtu) (Cole et al., 1998) et la biosynthèse des acides mycoliques est essentielle pour M.leprae. De plus, l’existence d’un complexe AccA3-AccD4-AccD5 a été établie par Coimmunoprécipitation in vitro sur un extrait cellulaire de M.smegmatis (Portevin et al., 2005). Un complexe AccA3-AccD5-AccE5 a également été observé in vitro en chromatographie d’exclusion (Gago et al., 2006). Il semblerait donc qu’AccA3 intervienne en tant que sousunité α dans la carboxylation de la chaîne α.
59
Si l’implication d’AccA3 et d’AccD4 dans la carboxylation de la chaîne α est largement acceptée, il existe une polémique quant à l’implication d’AccD5 dans cette étape de la biosynthèse des acides mycoliques.
Partant du fait que la sous-unité β est responsable de la spécificité de substrat, plusieurs études ont cherché à étudier cette spécificité. Des études biochimiques montrent, in vitro, qu’AccD5 associé à ses partenaires (AccA3 et AccE5) a une spécificité de substrat pour le propionylCoA et non pas pour des acides gras à longue chaîne caractéristiques de la chaîne α des acides mycoliques (Gago et al., 2006; Oh et al., 2006). Le propionyl-CoA est carboxylé pour donner un méthylmalonyl-CoA, un précurseur de la biosynthèse d’acides gras à ramifications méthyles multiples. Ces études sont appuyées par des données structurales. En effet, la structure cristallographique d’AccD5 montre une poche à substrat spécifique pour le propionyl-CoA (Lin et al., 2006). Par contre, les études biochimiques sur le complexe AccD4AccA3 montrent une spécificité de substrat pour les acides gras à longue chaîne (C16) ce qui est compatible avec la fonction de carboxylation de la chaîne α (Oh et al., 2006). Ces résultats tendraient vers l’hypothèse que AccD4, et pas AccD5, interviendrait dans la biosynthèse des acides mycoliques.
Cependant, ces résultats n’expliquent pas l’existence du complexe AccA3-AccD4-AccD5 obtenu chez M.smegmatis (Portevin et al., 2005) même si Gago et coll. n’ont pas réussi à mettre en évidence, in vitro, une interaction AccD4-AccD5 (Gago et al., 2006). Ils sont également contradictoires avec les études génétiques chez Corynebacterium glutamicum (Gande et al., 2004) qui montrent qu’AccD4 et AccD5 sont essentiels à la biosynthèse des acides mycoliques. Des travaux plus récents ont permis de co-purifier, chez Corynebacterium glutamicum, un complexe AccD2/AccD3/AccBC/AccE (équivalent à AccD5-AccD4-AccA3AccE5 chez Mtu) qui utilise préférentiellement comme substrat, in vivo, des acides gras à longue chaîne (C16) (Gande et al., 2007). Ces travaux relancent l’idée qu’AccD5 pourrait intervenir dans la carboxylation de la chaîne α.
L’ambiguïté sur le rôle d’AccD5 reste. En effet, la spécificité de substrat d’AccD5 pour le propionyl-CoA a été déterminée en absence d’AccD4. Ce dernier semble former un complexe in vivo avec AccD5 (même si cette interaction n’a pas été retrouvée in vitro par Gago et coll.). On peut donc envisager que la spécificité de substrat d’AccD5 pourrait changer en présence d’AccD4. À contrario, l’essentialité d’AccD5 dans la biosynthèse des acides mycoliques est 60
avérée chez Corynebacterium glutamicum et pas chez Mtu même si la tentative infructueuse de délétion du gène accD5 chez Mtu peut nous laisser penser que ce gène est également essentiel à la survie des mycobactéries (Holton et al., 2006). Des études supplémentaires sont donc nécessaires pour lever toutes ces ambiguïtés. Cela pourrait passer par montrer l’existence d’interactions protéine-protéine spécifiques entre les différents partenaires potentiels du complexe. La structure cristallographique d’AccD5 est connue (Holton et al., 2006; Lin et al., 2006). Cette enzyme formerait un complexe homo-hexamérique. Les sous-unités s’associeraient deux à deux pour former trois dimères qui par leur interaction formeraient trois poches catalytiques identiques. De plus, la modélisation d’AccD1, AccD3, AccD3, AccD4 et AccD6 a été réalisée à partir de la structure connue d’AccD5 (Holton et al., 2006). Ces modèles structuraux révèlent une organisation quaternaire identique à AccD5. Par ailleurs, AccD4 et AccD5 possèdent des surfaces électronégatives similaires qui pourraient leur conférer une spécificité d’interaction avec AccA3 pour former l’holo-enzyme active (figure 19). Enfin, des expériences de chromatographie d’exclusion ont montré, in vitro, qu’un mélange AccA3/AccD5 formait un complexe dodécamérique avec AccD5 et AccA3 sous forme homohexamérique (Gago et al., 2006).
Figure 19 : Structures des différentes ACCases de Mtu. La surface de chaque protéine est colorée en fonction des charges électrostatiques relatives (Holton et al., 2006).
61
La présence d’une troisième sous-unité, la sous-unité ε, AccE5 (Rv3281), a été signalée. L’activité, in vitro, du mélange AccA3-AccD5 augmente fortement en présence d’AccE5 (Gago et al., 2006; Oh et al., 2006). Des expériences in vitro montrent que la sous-unité ε, AccE5, augmente l’activité du complexe AccA3-AccD5 mais pas celle du complexe AccA3AccD4 (Oh et al., 2006).
1.3.5.3.
Condensation mycolique par Pks13 (figure 18)
Au moins 18 pks de type I ont été identifiées dans le génome de Mtu (Cole et al., 1998). Pks13 (Rv3800c) est essentielle à la biosynthèse des acides mycoliques. C’est l’enzyme qui intervient dans la condensation finale des acides mycoliques. Pks13 est une protéine de haut poids moléculaire (186 kDa) qui comprend cinq domaines catalytiques : 2 PPB (Phosphopantethéine-binding domain), KS (Kétoacyl Synthase), AT (Acyl Transférase) et TE (Thioestérase). L’activation de Pks13 nécessite une modification post-transcriptionnelle catalysée par la 4’-phosphopantetheinyl transférase (PptT) essentielle à l’activation des domaines PPB (Chalut et al., 2006).
Une fois les chaînes α et méromycoliques activées en 2-carboxyl-C26-CoA et méromycolylAMP, elles viennent se fixer respectivement sur les domaines PPB C-terminal et PPB Nterminal de Pks13 comme thioesters (Takayama et al., 2005). La seconde réaction entraîne le transfert du groupe méromycolyl depuis le domaine PPB N-terminal vers le domaine KS, probablement catalysé par l’acyl-transférase du domaine AT. La troisième réaction est une condensation de type Claisen des deux chaînes acyles caractérisée par une attaque nucléophile sur le groupe carbonyle du méromycolyl-S-KS par le carboxylate du 2-carboxyl-C26-S-PPB. On obtient ainsi la formation d’un 3-oxo-C78-mycolate lié au PPB C-terminal avec libération d’une molécule de CO2.
1.3.5.4.
Réduction finale et transfert
Le produit de Pks13 est un β-cétoester et doit être réduit pour obtenir un acide mycolique mature. La réductase CmrA responsable de cette étape a été récemment identifiée chez Corynebacterium glutamicum (Lea-Smith et al., 2007) (figure 18). Le gène cmrA est 62
l’orthologue d’Rv2509 chez M.tuberculosis. La réduction aurait lieu avant le transfert des acides mycoliques vers l’arabinane ou le tréhalose extra-cytoplasmique par l’intermédiaire des mycolyltransférases. C’est l’antigène 85 (Ag85) qui permettrait ce transfert chez Mtu. (Belisle et al., 1997; De Sousa-D'Auria et al., 2003; Kacem et al., 2004).
1.3.6. Les antibiotiques ciblant spécifiquement la biosynthèse des acides mycoliques
La biosynthèse des acides mycoliques est essentielle à la survie de mycobactéries. Le cycle FAS-II est la cible de nombreux antibiotiques connus pour êtres efficaces contre la tuberculose ce qui en fait une cible majeure dans la recherche de nouveaux antituberculeux (Heath and Rock, 2004).
L’isoniazide (INH) reste, depuis 50 ans, l’antibiotique majeur de première ligne dans le traitement de la tuberculose. L’INH entre dans la mycobactérie par diffusion passive (Bardou et al., 1998). La concentration minimale d’inhibition (CMI) de Mtu est de 0,05µg/mL. L’INH tel quel est non toxique pour le bacille. Il agit comme une prodrogue et est activé par une catalase-péroxydase présente dans la mycobactérie (KatG, Rv1908c) (Collins, 1996; Zhang et al., 1992). Il avait été montré au début des années 70 que l’INH cible la biosynthèse des acides mycoliques (Takayama et al., 1972; Winder and Collins, 1970). 20 ans plus tard, il a été démontré qu’InhA est la cible de l’INH (Banerjee et al., 1994). Après cristallisation d’InhA en présence d’INH, de NADH et de Mn2+, Rozwarski a montré que l’INH se liait de façon covalente au NAD pour former l’adduit INH-NAD (Rozwarski et al., 1998). C’est cet adduit qui inhiberait InhA (Rawat et al., 2003). Le mécanisme d’action de l’INH proposé par Vilchèze et Jacobs est que l’INH est activé par la catalase péroxydase KatG pour former un hypothétique radical isonicotinoyl qui se lie au NAD. L’adduit INH-NAD inhibe alors InhA. L’inhibition conduit à l’accumulation d’acides gras à longue chaîne, l’inhibition de la biosynthèse des acides mycoliques et finalement à la mort du bacille (Vilcheze and Jacobs, 2007) (figure 20). Par ailleurs, il a été montré que l’adduit INH-NAD inhibait fortement la protéine MabA in vitro (Ducasse-Cabanot et al., 2004). Cependant, l’INH n’inhibe pas MabA in vivo. Il est intéressant de souligner que l’activation de l’INH génère toute une gamme de radicaux oxygénés qui vont attaquer différentes cibles. Ils peuvent notamment causer des dommages à l’ADN (Ito et al., 1992), aux sucres et aux lipides. Enfin, les souches résistantes 63
à l’INH le sont le plus souvent à cause d’une mutation dans le gène katG (Middlebrook, 1954). Il existe également des résistances dues à des mutations dans le promoteur de l’opéron mabA-inhA (Musser et al., 1996) et dans le gène inhA (Basso et al., 1998). Dans 20% des cas, le mécanisme de résistance reste inconnu.
Figure 20 : Mécanisme d’action de l’INH (Vilcheze and Jacobs, 2007)
L’éthionamide (ETH) cible également la biosynthèse des acides mycoliques. Elle est proche structurellement de l’INH et des mutations dans le gène inhA pourraient conférer la résistance du bacille à l’éthionamide (Banerjee et al., 1994). Ces données suggèrent que ces deux antibiotiques auraient un mode d’action similaire même si très peu de résistances croisées ont pu être observées chez des isolats cliniques. Il a été montré, chez Mtu, que l’ETH était une prodrogue activée par EthA (Rv3854c). La production d’EthA est régulée chez le bacille par EthR (Rv3855) qui est un homologue des répresseurs de transcription de la famille TetR/CamR (Baulard et al., 2000). Dans cette étude, la surproduction d’EthR conduit à une résistance du bacille à l’ETH. Cette résistance est liée à une sous-expression d’EthA (Engohang-Ndong et al., 2004). Deux structures cristallographiques d’EthR ont été déterminées. La première avec un ligand présent de façon fortuite (Frenois et al., 2004), et la
64
seconde dans une conformation apo (Dover et al., 2004b). Ces deux structures sont incompatibles avec la fonction de répresseur d’EthR (Frenois et al., 2006) ce qui rend la souche plus sensible à l’ETH. Les ligands mis en jeu peuvent servir de base à la conception de molécules qui permettraient d’abolir la fonction de répression d’EthR, d’augmenter la sensibilité du bacille à l’ETH et donc de rendre le traitement plus efficace. De récents résultats ont validé cette approche. L’utilisation de l’inhibiteur d’EthR, BDM31342, chez la souris infectée par Mtu, permet de réduire de dix fois la dose d’ETH utilisée pour traiter l’infection (Willand et al., 2009). L’ETH couplé à ce type de molécule pourrait ainsi devenir un antibiotique de première ligne dans le traitement de la tuberculose.
Le triclosan est un agent antimicrobien qui cible, comme l’INH, la protéine InhA (Kuo et al., 2003; McMurry et al., 1999; Parikh et al., 2000). La cérulénine, produite par Cephalosporium caerulens, inhibe à la fois l’activité de KasA et de KasB (Kremer et al., 2002; Schaeffer et al., 2001b) tout comme la thiolactomycine (TLM) (Kremer et al., 2000; Slayden et al., 1996). Des inhibiteurs sont également à l’étude pour les enzymes mtFabH (Alhamadsheh et al., 2008), HadB (Bhowruth et al., 2008) ou encore MmaA4 qui semble être inhibée par le thiacétazone (Alahari et al., 2007; Alahari et al., 2009).
65
1.4. FAS-II, une organisation complexe : structure et régulation 1.4.1. Interactions protéine-protéine au sein de la voie de biosynthèse des acides mycoliques.
La capacité des protéines à interagir entre elles est au cœur des systèmes biologiques. Les machineries cellulaires ont besoin de ces phénomènes de reconnaissance précis entre protéines. L’interaction de ces protéines entre elles peut se produire avec des affinités variables. Cependant, ces interactions protéiques ne se produisent pas d'une manière aléatoire et désorganisée. Elles recoupent des fonctions biologiques précises et sont strictement définies pour réaliser des fonctions spécifiques. Les interactions protéine-protéine peuvent être identifiées dans tous les aspects de la biologie de la cellule (Toogood, 2002). La Protéomique seule ne suffit plus à la compréhension des grandes fonctions cellulaires. C’est la PostProtéomique qui nous fournit les outils d’études et de compréhension (Piehler, 2005). Le projet du laboratoire, qui vise à l’identification des interactions protéine-protéine au sein de la biosynthèse des acides mycoliques, se situe dans cette perspective de compréhension.
Avant la démonstration au laboratoire du fait que les protéines du système FAS-II interagissaient entre elles, quelques éléments dans la littérature suggéraient cette hypothèse. Tout d’abord, une fraction protéique de haut poids moléculaire, possédant l’activité FAS-II, a été isolée à partir de M.smegmatis (Odriozola et al., 1977). De plus, il a été montré que les deux réductases de FAS-II, MabA et InhA, appartenaient à cette fraction complexe et y étaient actives (Marrakchi et al., 2000; Marrakchi et al., 2002). Enfin, une étude de Rawat et col., qui suggère que l’INH agirait sur un complexe multi-enzymatique contenant InhA et KasA, va dans le sens de l’existence d’interactions protéine-protéine sans pour autant les démontrer (Rawat et al., 2003). Ces données, ainsi que l’homologie fonctionnelle avec les FAS de type I, ont permis d’émettre l’hypothèse que les différentes enzymes du système FASII étaient en contact direct, pouvant permettre de faire passer le substrat d’un site catalytique à l’autre par un phénomène de « metabolic channeling » (Ovadi and Srere, 2000; Srere, 1987). Cette hypothèse a été avérée au laboratoire par Veyron-Churlet (Veyron-Churlet et al., 2004; Veyron-Churlet et al., 2005). Par des expériences de double-hybride chez la levure et de co-immunoprécipitation in vitro, il a été montré que les protéines du système FAS-II interagissaient spécifiquement entre elles.
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Les études de R. Veyron-Churlet suggèrent l’existence d’au moins trois complexes multiprotéiques spécialisés pour la biosynthèse des acides mycoliques (figure 21). Un premier complexe d’initiation (I-FAS-II) comprendrait les protéines du « core » de FAS-II (MabA, InhA, mtFabD et probablement la déshydratase) et la condensase mtFabH. Ce complexe aurait pour fonction le lien entre FAS-I et FAS-II. Un second complexe, responsable du début de l’élongation (E1-FAS-II), serait constitué du « core » et de la condensase KasA. Enfin, un troisième complexe constitué du « core » et de KasB assurerait la fin de l’élongation (E2FAS-II).
Methyltransferases MmaA1 à MmaA4
E2-FAS-II
Acides mycoliques Pks13 KasB
Methyltransferases MmaA1 à MmaA4
MabA
Core KasA
InhA
Core
mtFabD
Core mtFabH E1-FAS-II
Acyl-coA I-FAS-II
Figure 21 : Interactome de la voie de biosynthèse des acides mycoliques (Veyron-Churlet et al., 2004, 2005)
Il a aussi été montré l’existence d’une interaction spécifique entre la condensase KasB et Pks13, enzyme responsable de la condensation entre la chaîne α et la chaîne méromycolique. Cette interaction est cohérente car KasB est la dernière condensase à intervenir dans le cycle FAS-II, juste avant la condensation finale réalisée par Pks13. Enfin, les méthyltransférases, MmaA1-4, interagiraient avec les condensases KasA et KasB, ce qui laisse à penser que les modifications de la chaîne méromycolique auraient bien lieu au cours de l’élongation.
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Cette étude suggère également que les trois complexes sont interconnectés par des interactions protéine-protéine qui pourraient être des interactions d’homo-multimérisation des réductases MabA et InhA. Par ailleurs, les déshydratases récemment identifiées ont été décrites comme hétérodimériques et les interactions hétérotypiques HadA-HadB et HadBHadC ont été démontrées (Sacco et al., 2007a). Les interactions avec les autres partenaires de FAS-II restent à démontrer.
Dans la littérature, des interactions entre des protéines du système FAS-II et d’autres protéines mycobactériennes ont été décrites au cours ou à la fin de nos travaux. Par exemple, KasA interagirait avec les protéines PpsB (Rv2932) et PpsD (Rv2934), deux protéines impliquées dans la biosynthèse des Phtiocérols Dimycosérosates (PDIM) qui sont des lipides impliqués dans la virulence de Mtu (Kruh et al., 2008). KasA interagit avec le domaine « acyl carrier » de chaque protéine, ce qui laisse à penser que les substrats de ces enzymes pourraient passer d’une voie de biosynthèse à l’autre. Cependant, cette interaction est critiquable car les domaines « acyl carrier » sont homologues à l’AcpM qui doit interagir avec KasA qui utilise des substrats couplés à l’ACP. Il pourrait donc s’agir d’une interaction non spécifique. Une autre étude révèle une interaction probable entre Pks13 et Cfp-10, protéine impliquée dans la virulence des mycobactéries (Singh et al., 2006).
1.4.2. Régulation du système FAS-II
Des études récentes ont montré que le système FAS-II était régulé par la phosphorylation réversible de mtFabD et de ses condensases KasA, KasB et mtFabH (Molle et al., 2006; Veyron-Churlet et al., 2009). La phosphorylation réversible est un mécanisme clef qui permet, suite à un signal de l’environnement, de modifier l’expression ou l’activité d’une protéine donnée. La phosphorylation permet de transformer un signal extracellulaire en réponse cellulaire. Ce mécanisme de phosphorylation réversible est assuré chez les procaryotes par des enzymes appelées Serine/Thréonine protein kinases (STPKs) qui sont souvent transmembranaires. Les STPK étaient, jusqu’à récemment, uniquement décrites chez les organismes eucaryotes. Plusieurs travaux montrent qu’elles sont présentes chez plusieurs procaryotes. Elles interviennent au moins dans trois mécanismes différents : dans la régulation du développement, dans les réponses aux stress et dans la pathogénicité. Nous pouvons citer les bactéries capables de différenciation comme Streptomyces (Matsumoto et al., 1994; 68
Nadvornik et al., 1999; Urabe and Ogawara, 1995), Anabaena (Zhang et al., 1998; Zhang and Libs, 1998) ou Myxococcus xanthus (Hanlon et al., 1997) qui ont de nombreux gènes qui codent pour des STPK. On trouve également des STPK chez des pathogènes humains qui sont responsables de la survie de ces bactéries à l’intérieur de l’hôte. C’est le cas pour Yersinia pseudotuberculosis (Hakansson et al., 1996) ou pour Pseudomonas aeruginosa (Wang et al., 1998). Chez Corynebacterium glutamicum, quatre STPK ont été caractérisées (Fiuza et al., 2008). Chez les différentes espèces de mycobactéries on trouve de quatre à vingt-quatre STPK différentes (Narayan et al., 2007). L’analyse de la séquence du génome de Mtu révèle la présence de 11 STPK (Av-Gay and Everett, 2000; Cole et al., 1998). L’étude de ces mécanismes de régulation pourrait ètre centrale pour la compréhension de la survie de Mtu dans le phagosome et l’entrée du bacille en dormance.
Figure 22 : Rôle de la régulation des condensases par phosphorylation dans l’initiation, l’élongation et la terminaison de la biosynthèse des acides mycoliques (Veyron-Churlet et al., 2009).
69
Une première étude a montré que les enzymes mtFabD, KasA et KasB étaient phosphorylées in vitro par différentes STPKs de Mtu ce qui suggère un réseau complexe d’interactions entre ces différentes STPKs et ces trois enzymes de la biosynthèse des acides mycoliques (Molle et al., 2006). De plus, il a été montré in vivo chez M.bovis BCG que KasA et KasB étaient phosphorylées à différents sites et déphosphorylées par l’enzyme PstP (Rv0018c). De plus, la condensase mtFabH est elle aussi phosphorylée, sur un site unique, in vitro par différentes STPKs, particulièrement PknA (Rv0015c) et PknF (Rv1746), et in vivo chez M.bovis BCG (Veyron-Churlet et al., 2009). La diversité de STPKs qui phosphorylent mtFabH suggère que cette enzyme est régulée par plusieurs signaux environnementaux. Les études enzymatiques révèlent que la phosphorylation diminue l’activité de KasA, augmente celle de KasB (Molle et al., 2006) et inhibe l’activité de mtFabH (Veyron-Churlet et al., 2009) (figure 22).
Ces
études
mettent
en
évidence
la
régulation
du
système
FAS-II
par
la
phosphorylation/déphosphorylation de plusieurs de ses enzymes. Le modèle proposé par Molle et Veyron-Churlet est que la phosphorylation STPK-dépendante pourrait induire des signaux positifs ou négatifs sur le complexe d’initiation (I-FAS-II) et sur les complexes d’élongation (E1-FAS-II et E2-FAS-II). De plus, des résultats non publiés montreraient que la condensase Pks13 serait elle aussi phosphorylée par différentes STPKs. On peut donc penser que la phosphorylation STPK-dépendante module, en fonction d’un stress environnemental, les différents complexes de FAS-II, et donc la biosynthèse des acides mycoliques, à travers l’activation ou l’inhibition des quatre condensases (figure 22). Par exemple, l’activation de KasA conduirait à une production d’acides mycoliques immatures alors que l’activation de KasB assurerait au bacille l’unique production d’acides mycoliques matures qui sont requis pour la virulence et la survie intracellulaire (Bhatt et al., 2007a).
1.4.3. Des interactions essentielles, cibles privilégiées dans la recherche de nouveaux antituberculeux ?
La réductase MabA, protéine homotétramérique, interagit via deux interfaces formées par deux motifs d’interaction : les hélices α4α5 et l’hélice et le feuillet α6β7 (Cohen-Gonsaud et al., 2002). Des mutants ponctuels d’interaction ont été réalisés pour chacune de ces interfaces ainsi qu’un double mutant comprenant les deux mutations ponctuelles. Ainsi, la mutation G162L viendrait rompre l’interaction à l’interface α4α5 et la mutation D228R à l’interface 70
α6β7 (Veyron-Churlet et al., 2004). Il a été montré, par une approche génétique de transdominance dans M.smegmatis et dans Mtu, que le mutant MabAG162L était dominant négatif tout comme le mutant MabAD228R à haute température (42°C). De plus, des expériences d’interactions protéine-protéine ont montré que ce mutant interagit avec MabA sauvage. Il se pourrait que le mutant MabAG162L vienne interagir avec MabA sauvage (MabAWT), déstabilise l’interface d’homomultimérisation α4α5 et rende la protéine inactive inhibant ainsi la biosynthèse des acides mycoliques. L’hypothèse de l’essentialité de l’homomultimérisation de la réductase MabA a été émise au laboratoire (Veyron-Churlet et al., 2004). Le même travail a été réalisé au laboratoire pour la protéine InhA (données non publiées) et les conclusions sont similaires. Ces résultats sont la première démonstration que des interactions au sein du système FAS-II seraient essentielles à la survie des mycobactéries ce qui en ferait des cibles privilégiées pour la découverte de nouveaux antituberculeux par une approche originale d’inhibition d’interaction protéine-protéine. Il s’agirait maintenant de déterminer les plus petites séquences peptidiques qui inhiberaient ces interactions in vivo.
De récents travaux de Gurvitz et coll. remettent en cause les travaux du laboratoire quant à l’essentialité des interactions protéine-protéine au sein du système FAS-II mycobactérien (Gurvitz et al., 2008a; Gurvitz, 2009a, b). Ils ont produit différentes protéines de FAS-II mycobactérien (InhA, MabA et mtFabD) dans des souches de levures où les gènes codant pour les enzymes du système FAS-II mitochondrial correspondantes ont été inactivés au préalable. Le fait que les enzymes du système FAS-II mycobactérien complémentent la levure et rétablissent l’activité du système FAS-II mitochondrial les amènent à remettre en cause la nécessité, pour ces enzymes, d’interagir avec leurs partenaires du système d’élongation des acides mycoliques. Ces conclusions sont très critiquables. Gurvitz et coll. ont uniquement montré que ces enzymes peuvent, dans la levure et dans des conditions d’expression données, apporter une activité minimale nécessaire au fonctionnement du système FAS-II mitochondrial. Il est difficile de voir comment, à partir de leurs résultats, Gurvitz et coll. peuvent tirer de telles conclusions.
71
1.5. Hypothèses de travail L’enveloppe des mycobactéries a une structure originale de par son épaisseur, sa structure et sa composition. La compréhension de la structure et de la biosynthèse de cette enveloppe est capitale dans la lutte contre la tuberculose car elle se situe à l’interface entre l’hôte et le pathogène et qu’elle joue un rôle important dans la physiologie et la virulence du bacille. La paroi se distingue par la présence des acides gras spécifiques des Corynebacterineae, les acides mycoliques, qui confèrent aux mycobactéries une résistance face aux défenses immunitaires de l’hôte ainsi qu’à de nombreux antibiotiques classiques. L’étude de la voie de biosynthèse des acides mycoliques et des différentes enzymes qui la composent, est devenue un enjeu majeur dans la perspective de découvrir de nouveaux antibiotiques antituberculeux. En effet, la biosynthèse des acides mycoliques est indispensable à la survie des mycobactéries et plusieurs enzymes qui la composent sont essentielles à la survie du bacille.
Le travail original réalisé précédemment au laboratoire a montré, pour la première fois dans une voie de biosynthèse d’acides gras, que plusieurs enzymes qui interviennent dans la voie de biosynthèse des acides mycoliques interagissent entre elles. Un interactome, ou réseau d’interactions protéine-protéine, de la voie de biosynthèse des acides mycoliques a ainsi été défini. Ce réseau peut-être décomposé en trois complexes, un complexe d’initiation et deux complexes d’élongation.
De façon classique, la recherche d’antituberculeux passe par l’identification de cibles catalytiques essentielles et par la recherche d’inhibiteurs d’activité de ces cibles. Nous avons une approche différente au laboratoire : l’identification d’interactions protéine-protéine essentielles pouvant servir de base à la détermination d’inhibiteurs d’interaction qui viendraient déstructurer des complexes multiprotéiques essentiels. Les travaux initiaux suggèrent que l’homomultimérisation des réductases MabA et InhA à l’interface α4α5 serait essentielle à l’activité de ces enzymes et donc à la survie du bacille tuberculeux.
Dans une première partie, l’élargissement de l’interactome de la biosynthèse des acides mycoliques sera décrit. En effet, différentes enzymes qui interviennent dans cette voie restaient à intégrer au modèle du laboratoire et un modèle plus exhaustif a été réalisé. Nous avons intégré à l’interactome les déshydratases récemment identifiées (HadA, HadB et HadC)
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les méthyltransférases non étudiées dans le modèle précédent (CmaA1, CmaA2, UmaA et PcaA) et les différentes ACCases qui pourraient potentiellement intervenir dans la voie de biosynthèse. Pour cela, nous avons utilisé les approches bien maîtrisées et bien contrôlées du laboratoire lors des études d’interactions protéine-protéine. In vivo, un système de double hybride chez la levure et un système triple hybride ont été utilisés. In vitro les interactions ont été analysées par des tests biochimiques (Co-immunoprécipitation).
La voie de biosynthèse des acides mycoliques fait intervenir, entre autre, un système d’élongation d’acide gras de type II (FAS-II). FAS-II est un système multi-protéique. Il est généralement attribué aux organismes procaryotes. Il existe un autre système d’élongation d’acide gras de type I (FAS-I) constitué d’une enzyme homodimérique qui comprend tous les domaines catalytiques nécessaires à l’élongation d’acides gras. FAS-I est présent chez les mycobactéries mais est classiquement trouvé chez les organismes eucaryotes. La plupart des structures des enzymes de FAS-II sont connues et la structure d’un FAS-I mammifère (mFAS-I) a récemment été identifiée (Maier et al., 2008). Nous avons réalisé les alignements des structures tridimensionnelles des principales enzymes de FAS-II sur la structure de mFAS-I. Certaines structures de méthyltransférases et celles des deux hétéreodimères de déshydratases HasA-B et HadB-C ne sont pas connues. Nous avons modélisé ces structures et les avons également alignées sur la structure de mFAS-I. L’arrangement spatial des différentes enzymes de FAS-II entre elles ainsi obtenu valide et affine notre modèle d’interactome.
Un autre aspect de mon travail, présenté dans une seconde partie, a consisté en l’étude d’interactions protéine-protéine essentielles au sein de la voie de biosynthèse des acides mycoliques. Les travaux sur les interactions homotypiques des réductases MabA et InhA ont été poursuivis. Nous avons regardé, dans un premier temps, si la rupture de certaines interactions était létale pour le bacille. Il s’agit pour nous de comprendre le lien, pour les réductases MabA et InhA, entre le degré de multimérisation, l’activité enzymatique in vitro et l’essentialité in vivo. Ces études ont pour but, à plus long terme, d’aller vers la définition de peptides, ou de peptidomimétiques, qui viendraient rompre les interactions protéine-protéine essentielles une fois délivrés dans un contexte infectieux. Nous avons commencé, par une approche de protéines tronquées et de domaines peptidiques, à déterminer la plus petite séquence peptidique inhibitrice des interactions homotypiques essentielles des réductases MabA et InhA. 73
2. Détermination de l’interactome de la biosynthèse des acides mycoliques
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Les précédentes études au laboratoire ont permis de définir un réseau d’interactions pour les différentes protéines du cycle FAS-II (mtFabH, MabA, InhA, KasA et KasB), une protéine en amont du cycle (mtFabD), la protéine responsable de la condensation entre la chaîne α et la chaîne méromycolique (Pks13) ainsi que quatre des huit méthyltransférases connues (MmaA1-4) (chapitre 1.4.1.1) (Veyron-Churlet et al., 2004; Veyron-Churlet et al., 2005). Ce réseau d’interaction, ou interactome, a été décomposé en trois systèmes : un système d’initiation (I-FAS-II), et deux systèmes d’élongation (E1-FAS-II et E2-FAS-II). Ces différents systèmes FAS-II possèdent un « core » similaire (MabA, InhA, FabD) et se distinguent, notamment par la présence de condensases différentes : mtFabH à l’initiation (IFAS-II), KasA en début d’élongation (E1-FAS-II) et KasB en fin d’élongation (E2-FAS-II). De plus, Pks13 interagirait avec KasB et les méthyltransférases (MmaA1-4) avec KasA et KasB ce qui laisse supposer des modifications de la chaîne méromycolique au cours de l’élongation (figure 21).
Dans cette partie, nous allons compléter ce réseau d’interactions en y intégrant les ACCases responsables de l’activation de la chaîne α (AccA3, AccD4, AccD5, AccE5) et de la chaîne méromycolique (FadD32). De même, la protéine impliquée dans la carboxylation de l’acétylCoA en malonyl-CoA (AccD6), les quatre méthyltransférases potentielles manquantes (CmaA1, CmaA2, UmaA et PcaA) ainsi que les déshydratases (HadA, HadB et HadC) récemment identifiées seront intégrées à l’interactome de la biosynthèse des acides mycoliques.
L’hypothèse émise d’un phénomène de « metabolic channeling », où les enzymes de la biosynthèse des acides mycoliques échangeraient les substrats d’un site catalytique à l’autre par interactions protéine-protéine directes, justifie le choix de l’intégration de ces différentes enzymes dans notre réseau global d’interactions. En effet, les différentes enzymes qui activent la chaîne α ainsi que FadD32 pourraient interagir spécifiquement avec la condensase Pks13. AccD6, l’acétyl-CoA carboxylase (Daniel et al., 2007), permet de fournir au cycle d’élongation du malonyl-CoA et ne devrait pas avoir le même profil d’interaction que les autres ACCases. Les méthyltransférases pourraient se comporter comme MmaA1-4 (VeyronChurlet et al., 2005) qui interagiraient spécifiquement avec E1-FAS-I et E2-FASII. Enfin, les déshydratases forment deux complexes : HadA-B et HadB-C qui ont des spécificités de longueur de chaîne de substrats différentes (Sacco et al., 2007a). Le profil d’interaction de ces
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deux complexes pourrait avoir des points communs avec les condensases KasA et KasB de telle sorte qu’HadA-B appartiendrait au complexe E1-FAS-I et HadB-C à E2-FAS-II
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2.1. Méthode expérimentale : Le double hybride chez la levure Le système du double hybride chez la levure (S.cerevisiae AH109) a l’avantage, contrairement au double hybride bactérien, de permettre l’expression hétérologue des protéines mycobactériennes chez un eucaryote où les interactions avec des protéines endogènes sont moins probables. Notre système de double hybride chez la levure est basé sur l’utilisation de l’activateur de transcription GAL4. C’est un outil puissant qui permet la détection d’interactions protéine-protéine dans un contexte in vivo, dans le noyau de la levure (Brent and Finley, 1997; Chien et al., 1991; Van Criekinge and Beyaert, 1999). Ce système permet de détecter des interactions entre deux protéines qui ont une constante de dissociation supérieure à environ 70µM (Yang et al., 1995). Le système que nous utilisons (Matchmaker Two-Hybrid System 3, Clontech®) a largement été utilisé au laboratoire et nous maîtrisons parfaitement cette technique en terme de réalisation et d’interprétation des résultats. Il repose sur l’utilisation de deux vecteurs pGADT7 et pGBK-T7 (figure 23). Le vecteur pGAD-T7 comprend un gène de résistance à l’ampicilline et un gène d’auxotrophie chez la levure, LEU2, qui permet à la levure de pousser sur des milieux dépourvus de leucine. Le vecteur pGBK-T7 comprend, lui, un gène de résistance à la kanamycine et un gène d’auxotrophie chez la levure, TRP1, permettant à la levure de pousser sur des milieux sans tryptophane. Ces vecteurs permettent le clonage du gène d’intérêt en fusion C-terminale avec le domaine activateur de la polymérase (« fusion AD » pour Activator Domain) ou le domaine de liaison de GAL4 à l’ADN (« fusion BD » pour Binding Domain) selon que l’on utilise respectivement pGAD-T7 ou PGBK-T7. GAL4 est un activateur de transcription dans AH109. S’il y a interaction entre deux protéines (une en fusion avec AD, l’autre avec BD), GAL4 est reconstitué et la transcription de gènes rapporteurs est induite. Les gènes rapporteurs utilisés sont HIS3 et ADE2 qui permettent à la levure de pousser sur des milieux dépourvus d’Histidine ou d’Adénine. Le gène rapporteur HIS3 permet de détecter de faibles interactions car il est sous la dépendance d’une forte UAS (Upstream Activating Sequence) de GAL4. ADE2 permet de détecter des interactions fortes car il est sous la dépendance d’une faible UAS de GAL4.
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PGAD 8000 pb
Y
7300 pb
Tag HA
D N Abd
X PGBK
AD
Tag Cmyc
TRP
LEU Y
AD
RN A pol
DNAbd
X
UAS Gal4
Promoteur
Gènes Rapporteurs HIS3 ADE2
pGAD-T7
pGBK-T7 Figure 23 : Le double hybride chez la levure (S.cerevisieae AH109 – Système Clontech©). En haut, les gènes des deux protéines pour lesquelles nous voulons tester l’interaction sont clonés soit en fusion de l’ « activator domain » (AD - vecteur pGAD-T7), soit en fusion du « binding domain » (BD – vecteur pGBK-T7). Le domaine activateur interagit avec l’ARN polymérase et le domaine BD interagit avec l’UAS (Upstream Activation Sequence) de GAL4. Si il y a interaction, l’activateur de GAL4 est reconstitué et les gènes HIS3 et ADE2 sont transcrits. Le produit de ces gènes permet à la levure de se développer sur des milieux sans Histidine ou sans Adénine. La croissance est donc synonyme d’interaction entre les deux protéines. Par ailleurs, les deux vecteurs pGAD-T7 et pGBK-T7, mélangés au kit de transcription/traduction, permettent de produire in vitro des protéines fusionnées respectivement avec une étiquette HA et une étiquette c-myc afin de réaliser les tests biochimiques de co-immunoprécipitation. En bas, les cartes génétiques des vecteurs pGAD-T7 et pGBK-T7 (Clontech©).
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Afin d’éviter la détection de faux positifs, nous avons utilisé plusieurs contrôles négatifs : les vecteurs « vides » pGAD-T7 et pGBK-T7 ainsi que le vecteur pGBK-T7::lam en fusion avec le domaine BD de GAL4. La lamine (lam) est une protéine humaine faiblement interactive qui est utilisée couramment comme contrôle négatif dans le système de double hybride chez la levure (Ye and Worman, 1995). Pour chaque expérience, nous utilisons également deux contrôles positifs d’interaction afin d’éviter les faux négatifs : pGAD-T7::AgT7 / pGBKT7::p53 (contrôle du système Matchmaker) et pGAD-T7::inhA / pGBK-T7::inhA (contrôle interne au système FAS-II).
A
B
a b c d e f
pGADT7/pGBKT7 T7/Lam KasA/Lam KasA/KasB KasA/KasA KasA/InhA KasA/MabA
Interactions + + +/-
dilutions -LT -LTH -LTA
a
b
d
c
e
f
Figure 24 : Un exemple de résultats du test de double hybride chez la levure (S.cerevisiae AH109). A : résultats de stries (extrait de Veyron-Churlet et al., 2004) sur milieux sélectifs (DOBA-LT : milieu sélectif des levures possédant les deux plasmides pGAD-T7 et pGBK-T7 ; DOBA-LTH et DOBA-LTA : milieux sélectifs pour des interactions entre les deux protéines dont les séquences ont été clonées une à une dans pGAD-T7 et pGBK-T7) dans notre système de test d’interaction protéine-protéine chez la levure entre KasA et les protéines du système FAS-II. B :. les résultats de dilutions/spots pour les six levures testées. Les dilutions vont d’un spot de culture (5µL en phase stationnaire) pure à une dilution à 10-7. La série de dilutions est effectuée sur les différents milieux sélectifs. Les couples de plasmides correspondants aux six stries et le résultat de la lecture des stries et des dilutions/spots en terme d’interactions sont notés dans le tableau.
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Nous avons cloné l’ensemble des gènes que nous souhaitons étudier dans les vecteurs pGADT7 et pGBK-T7. Les levures ont ensuite été transformées deux fois successivement par les différentes combinaisons possibles de vecteurs pGAD-T7 et pGBK-T7. Les doubles transformants sont ensuite striés sur milieux sélectifs sans Histidine, sans Adénine et sans les deux acides aminés. Pour finir, nous réalisons des dilutions/spots des souches transformées afin d’obtenir un résultat quantitatif (figure 24). Un exemple pour des interactions déjà connues est présenté figure 24.
Note : Tout au long de nos études d’interactions protéine-protéine nous parlerons d’interactions homotypiques lorsqu’une protéine interagit avec elle-même pour former une structure quaternaire multimérique où les différentes sous-unités sont identiques. Lorsque deux protéines différentes interagissent entre elles, nous parlerons d’interactions hétérotypiques.
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2.2. Les protéines responsables de l’activation des substrats de Pks13 2.2.1. Etude en double hybride chez la levure
Nous avons cloné dans les vecteurs pGAD-T7 et pGBK-T7 les différents gènes potentiellement activateurs de la chaîne α (accA3/Rv3285, accD4/Rv3799c, accD5/Rv3280, accD6/Rv2247 et accE5/Rv3281) et de la chaîne méromycolique (fadD32/Rv3801c). Nous savons cependant qu’AccD6 interviendrait plutôt dans la carboxylation de l’acétyl-CoA en malonyl-CoA. Ces vecteurs, ainsi que les vecteurs pGAD-T7 et pGBK-T7 comportant les gènes des principales protéines de la biosynthèse des acides mycoliques, ont été transformés deux à deux dans la souche de levure AH109 afin d’obtenir toutes les combinaisons possibles dans les deux « sens » (en fusion AD et BD). Les levures ainsi obtenues ont alors été striées sur milieux sélectif (DOBA-LTH, DOBA-LTA et DOBA-LTHA) puis analysées en dilutions/spots sur les mêmes milieux (figure 24).
Tout d’abord, nous pouvons constater que nous n’obtenons pas d’interaction entre les différentes protéines fusionnées avec l’ « activator domain » et la lamine (témoin négatif). De plus, lorsque l’on co-transforme les différents vecteurs pGBK-T7 avec le vecteur pGAD-T7 « vide », nous n’observons pas de repousse de la levure sur les différents milieux sélectifs. Les contrôles négatifs sont donc corrects (tableau 1).
Tableau 1 : Analyse en double hybride chez la levure des interactions protéine-protéine entre les différentes protéines « partenaires » de Pks13.
BD fusions
AD fusions Ø accA3 accD4 accD5 accD6 accE5 fadD32
lam
accA3
accD4
accD5
accD6
accE5
fadD32
-
+ + +/+ -
+ + + + + +
+ + +/-
+ +/-
+ +/-
+/-
Nous obtenons des interactions fortes (+), intermédiaires (+/-) ou nulles (-) (suivant la méthodologie décrite dans le paragraphe 2.1). Les cellules grisées correspondent aux interactions homotypiques. La colonne « AD fusions » correspond aux gènes clonés dans le vecteur pGAD-T7 et la ligne « BD fusions » aux gènes clonés dans le vecteur pGBK-T7. La ligne « Ø » correspond au vecteur pGAD-T7 « vide » sans aucun gène cloné. Ces résultats ont été obtenus en collaboration avec M. Dimitrov.
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Les résultats obtenus ont permis de révéler une série d’interactions homotypiques potentielles pour les protéines AccD4, AccD5 et AccD6 (tableau 1). Les données structurales révèlent, pour la protéine AccD5, un complexe homo-hexamérique de 356kDa (Holton et al., 2006; Lin et al., 2006). À partir des données cristallographiques d’AccD5, les structures des protéines AccD1-6 ont été prédites par modélisation (Holton et al., 2006). Les modèles montrent que les protéines AccD1-6 seraient elles aussi homo-hexamériques.
Les interactions
homotypiques pour les protéines AccD4, AccD5 et AccD6 sont donc en accord avec les études structurales.
L’enzyme AccA3, sous unité α du complexe, semble interagir de façon homotypique d’après les résultats obtenus en double hybride chez la levure (tableau 1). Nous ne connaissons pas la structure d’AccA3 mais Gago et coll., par chromatographie d’exclusion, ont observé un mélange de deux degrés d’homomultimérisation pour cette protéine : homotétramérique et homohexamérique (Gago et al., 2006). Là encore, nos résultats vont dans le même sens que ces données biochimiques et confirment l’homomultimérisation d’AccA3.
Les protéines AccE5 et FadD32 ne révèlent pas d’interaction homotypique, elles pourraient être monomériques. Effectivement, il a été montré, par chromatographie d’exclusion, que la forme active de FadD32 était monomérique en solution (Leger et al., 2009). L’absence d’interaction homotypique pour FadD32 dans notre système de double hybride va dans le même sens que les données biochimiques obtenues par Léger et coll. Nous ne disposons d’aucune donnée biochimique ou structurale quant au degré de multimérisation de la protéine AccE5 et supposons que celle-ci est monomérique en solution.
Plusieurs interactions hétérotypiques ont été détectées lors des expériences de double hybride chez la levure lorsque l’on a testé les différentes ACCases, potentiellement impliquées dans la carboxylation de la chaîne α, entre elles (tableau 1). La protéine AccA3, sous-unité α du complexe ACC, interagirait avec les protéines AccD4 et AccD5, mais pas avec AccD6, et ceci quelque soit le « sens » du test de double hybride. Ces interactions avaient été suggérées par Holton et coll. qui avaient prédit, à partir de la comparaison des charges électrostatiques de surface des enzymes AccD1-6, une spécificité d’interaction des enzymes AccD4 et AccD5 avec l’enzyme AccA3 pour former l’hétérodimère actif (Holton et al., 2006) (figure 19). Nos résultats sont une preuve expérimentale de l’existence des complexes AccA3-AccD5 et AccA3-AccD4. 82
Le profil d’interaction de la protéine AccD4 est contradictoire selon que les tests soient réalisés en fusion avec l’activator domain ou en fusion avec le binding domain de GAL4. La protéine AccD4 interagirait avec l’ensemble des ACCases et FadD32 lorsqu’elle est en fusion avec le binding domain dans notre système de double hybride chez la levure (tableau 1). Les résultats obtenus lorsqu’AccD4 est en fusion avec l’activator domain laissent supposer une interaction entre les protéines AccD4 et AccD5 mais pas entre les protéines AccD4 et AccD6. L’interaction spécifique AccD4-AccD5 avait déjà été observée lorsque Portevin et coll. ont Co-immunoprécipité un complexe AccA3-AccD4-AccD5 in vitro dans un extrait cellulaire de M.smegmatis (Portevin et al., 2005). Les interactions entre AccD4 et toutes les autres protéines dans un seul « sens » semblent donc artéfactuelles. La structure d’AccD5 (Lin et al., 2006) ainsi que des tests biochimiques d’affinité pour un substrat (Gago et al., 2006) tendent vers l’hypothèse que cette enzyme serait spécifique de la carboxylation du propionyl-CoA en méthylmalonyl-CoA. Ces données sont contradictoires avec l’essentialité d’AccD5 dans la biosynthèse des acides mycoliques (substrats à longue chaîne) et l’existence d’un complexe AccA3-AccD4-AccD5 qui serait responsable de la carboxylation de la chaîne α (Gande et al., 2004; Portevin et al., 2005). La preuve d’interactions directes entre ces trois enzymes, apportée par notre travail en double hybride chez la levure, renforce l’hypothèse de l’existence de ce complexe. Nous savons que ces trois protéines sont hexamériques (Gago et al., 2006; Holton et al., 2006; Lin et al., 2006) et que la sous-unité α et la sous-unité β pourraient former une structure dodécamérique comme cela a été montré in vitro en chromatographie d’exclusion (Gago et al., 2006). Par ailleurs, AccD4 et AccD5 partagent 48% d’identité (Cole et al., 1998). Il se pourrait qu’AccD4 et AccD5 forment un complexe hétéro-hexamérique, avec trois sous-unités AccD4 et trois sous-unités AccD5, donnant lieu à des poches catalytiques (aux trois interfaces AccD4-AccD5) qui ont une affinité pour des substrats à longue chaîne. Ceci expliquerait qu’Acc3-AccD5 seul ne puisse intervenir dans la carboxylation de la chaîne α mais que le complexe AccA3-AccD4-AccD5 réaliserait cette étape.
Par ailleurs, d’après nos résultats, les protéines AccA3 et AccD5 n’interagiraient pas avec la protéine AccD6. Donc, les protéines AccA3, AccD4 et AccD5 interviendraient peut-être dans l’activation de la chaîne α mais pas la protéine AccD6. De plus, le complexe AccA3-AccD6, actif in vitro, est prédit pour intervenir en amont du cycle FAS-II pour fournir du malonylCoA après carboxylation de l’acétyl-CoA (Daniel et al., 2007; Kurth et al., 2009). L’absence d’interactions entre AccA3 et AccD6 pourrait suggérer que ce complexe, pourrait avoir une 83
activité acétyl-CoA carboxylase in vitro, mais ne serait pas un complexe présent in vivo. Une autre enzyme, AccA1 ou AccA2, présente chez Mtb, pourrait jouer le rôle de sous-unité α associée à la sous-unité β AccD6 dans l’étape de carboxylation de l’acétyl-CoA en malonylCoA.
La sous-unité ε (AccE5) interagirait dans les deux « sens » avec la protéine AccA3 (tableau 1). Elle interagit également dans un « sens » (fusion BD) avec AccD6 et dans l’autre « sens » (fusion AD) avec AccD4. Les tests biochimiques (Co-IP) sont nécessaires pour tirer une conclusion quant à l’existence de ces interactions. AccE5 est décrite comme un catalyseur du complexe AccA3-AccD5 (Gago et al., 2006; Oh et al., 2006). Nos résultats montrent qu’AccE5 pourrait réguler l’activité de ce complexe par interaction directe avec la protéine AccA3. Par ailleurs, il a été montré que l’activité in vitro du mélange des enzymes AccA3 et AccD6 chuterait en présence d’AccE5 (Daniel et al., 2007) ce que pourrait expliquer un effet inhibiteur de l’interaction entre les protéines AccD6 et AccE5. Nous proposons un modèle à partir des premiers résultats obtenus en double hybride chez la levure (figure 25).
AccE5
AccE5
AccA3
AccD4
AccD5
AccD6
Figure 25 : Résumé des interactions protéines observées en double hybride chez la levure pour les ACCases entre elles. Les flèches rouges correspondent aux différentes interactions hétérotypiques. Les flèches jaunes correspondent aux interactions homotypiques.
84
La seconde partie de cette étude concerne les interactions hétérotypiques entre les différentes ACCases et les protéines du système FAS-II (MabA, InhA, mtFabD, KasA, KasB, mtFabH, Pks13) (tableau 2).
La réductase MabA interagirait uniquement avec la protéine AccD4 lorsqu’elle est fusionnée avec l’actvator domain. Une interaction plus faible d’InhA avec AccD4 a également été détectée dans ce même « sens » (fusion AD). InhA n’interagirait avec aucune autre ACCase. La condensase KasA interagirait avec les protéines AccD4, AccD5 et AccE5. De même, la condensase KasB interagirait avec AccD5 et AccE5 et plus faiblement avec AccD4 (uniquement en fusion avec l’activator domain). La condensase mtFabH interagirait avec la protéine AccD4 et avec les protéines AccA3 et AccD6 uniquement en fusion avec le binding domain. mtFabD interagirait avec AccD5 dans les deux sens et faiblement avec AccA3 et AccD6 uniquement en fusion avec l’activator domain.
On aurait pu s’attendre à des interactions entre les ACCases et la condensase finale Pks13. Il n’en est rien. Pks13 est une protéine à haut poids moléculaire ce qui peut poser des problèmes à sa nucléarisation dans la levure et entraîner des résultats « faux négatifs ». Cependant, les études précédentes (Veyron-Churlet et al., 2005) ont permis de détecter une interaction entre Pks13 et KasB ce qui permet d’affirmer que Pks13 peut être nucléarisée. L’absence d’interaction observée ici est donc un résultat per se.
Les résultats obtenus montrent que FadD32 (enzyme responsable de l’activation de la chaîne méromycolique) interagirait uniquement avec mtFabD lorsqu’elle est en fusion avec le binding domain et avec KasA, mtFabH et Pks13 lorsqu’elle est en fusion avec l’activator domain (tableau 2). Les expériences de double hybride chez la levure ne nous permettent pas de conclure quant à l’existence d’interactions entre FadD32 et les enzymes de FAS-II, les tests biochimiques (Co-IP) sont nécessaires pour déterminer ces interactions. Par ailleurs, FadD32 semble interagir avec AccD4 dans les deux « sens » et avec AccD6 faiblement et uniquement en fusion avec l’activator domain (tableau 1). Il se pourrait que l’interaction AccD4-FadD32 soit le lien entre l’activation de la chaîne α et celle de la chaîne méromycolique, et permette une concertation afin de délivrer les deux substrats activés à la condensase Pks13.
85
Tableau 2 : Analyse en double hybride chez la levure des interactions protéine-protéine des différentes protéines « partenaires » de Pks13 avec les protéines du système FAS-II.
BD fusions
AD fusions Ø mabA inhA kasA kasB mtfabH mtfabD pks13
Lam
accA3
accD4
accD5
accD6
accE5
fadD32
-
+/-
+ +/+ +/+ -
+ + + -
+/-
+ +/-
+/-
BD fusions
AD fusions Ø accA3 accD4 accD5 accD6 accE5 fadD32
lam
mabA
inhA
kasA
kasB
mtfabH
mtfabD
pks13
-
-
-
+/+/+/+/-
+/+/-
+ + +/+/-
+/-
+
Nous obtenons des interactions fortes (+), intermédiaires (+/-) ou nulles (-) (suivant la méthodologie décrite dans le paragraphe 2.1). La colonne « AD fusions » correspond aux gènes clonés dans le vecteur pGAD-T7 et la ligne « BD fusions » aux gènes clonés dans le vecteur pGBK-T7. La ligne « Ø » correspond au vecteur pGAD-T7 « vide » sans aucun gène cloné. Ces résultats ont été obtenus en collaboration avec M. Dimitrov.
Tous ces résultats doivent être confrontés avec les tests biochimiques de coimmunoprécipitation afin de pouvoir tirer des conclusions vis-à-vis des interactions entre les ACCases, FadD32 et les enzymes du cycle d’élongation des acides mycoliques.
2.2.2. Détermination des interactions en Co-IP
Les vecteurs pGAD-T7 et pGBK-T7 sont construits de telle sorte que les allèles clonés peuvent être transcrits et traduits in vitro sans inclure les domaines AD et BD de GAL4 grâce à un promoteur T7 interne. Les protéines ainsi obtenues sont étiquetées : hémagglutinine (HA) dans le cas de pGAD-T7 et c-myc dans le cas de pGBK-T7 (figure 23). 86
Note : Nous parlerons de h-enzyme pour les protéines marquées avec l’étiquette HA et de c-enzyme pour les protéines marquées avec l’étiquette c-myc.
Les protéines marquées ainsi produites nous permettent de réaliser des tests d’interactions protéine-protéine in vitro par co-immunoprécipitation (Co-IP). Les protéines sont radiomarquées spécifiquement à la méthionine-S35 lors de la transcription/traduction ce qui permet de les détecter par autoradiographie de gel SDS-PAGE. Les h-protéines sont fixées sur des billes magnétiques couvertes d’anticorps anti-HA qui permettent, s’il y a interaction avec une c-protéine marquée, de détecter les deux interactants sur gel. S’il n’y a pas interaction, seulement la protéine fusionnée à l’étiquette HA est détectée. Pour chaque h-protéine testée en Co-IP, nous réalisons un contrôle négatif d’interaction avec la Lamine.
Note : Par ailleurs, les contrôles de fixation non spécifique ont été réalisés précédemment au laboratoire (R. Veyron-Churlet ; thèse de l’UPS, 2005). Ces contrôles avaient été réalisés avec différentes protéines en grande quantité et aucune protéine fixée n’a été détectée.
L’ensemble des h-protéines sont testées en Co-IP contre la lamine (c-lam) (figure 26). La lamine est une protéine humaine qui n’a pas d’interactant connu dans ce test (Clontech). Aucune des protéines partenaires de Pks13 n’interagit en Co-IP avec la lamine. Les interactions homotypiques obtenues précédemment sont confirmées pour les protéines AccD4 et AccD5 mais pas pour les protéines AccA3 et AccD6. AccD6 a pourtant été décrite comme étant homo-hexamérique (Holton et al., 2006). Des tests biochimiques en chromatographie d’exclusion avait également montré un mélange de formes trimériques et hexamériques pour AccA3 (Gago et al., 2006). Une interaction homotypique faible a également été détectée pour la protéine FadD32. AccE5 ne semble pas multimériser (figure 26). Il est possible que les étiquettes (HA ou c-myc) gênent ces multimérisations. En effet, les interfaces engagées dans les interactions homotypiques sont souvent très importantes et le tag a plus de probabilité d’interférence.
87
Figure 26 : Analyse en Co-IP des différentes ACCases et FadD32 entre elles. Les h-protéines seules : première colonne. Les c-protéines seules : colonnes (-). Les Co-IP : colonne (IP). Quand la taille des protéines est similaire, les réactions ont eu lieu avec une h-protéine froide et une c-protéine radio-marquée. Ces Co-IP sont signalées par un (*).
88
En ce qui concerne les interactions des ACCases entre elles (figure 26), le profil obtenu en double hybride chez la levure est confirmé par les expériences de Co-IP. Comme pour les expériences de double hybride, h-AccD4 interagit avec l’ensemble des protéines partenaires de Pks13. Nous pouvons penser que les tests réalisés dans ce sens d’interaction correspondraient à des « faux positifs ». En effet, à cause des arguments présentés plus haut, il semble peu probable qu’AccD4 interagissent avec l’ensemble des autres ACCases et la forte homologie structurale d’AccD4 avec les autres ACCases pourrait entraîner la détection de ces « faux positifs ».
Nous obtenons donc la confirmation de l’existence probable des interactions AccA3-AccD4 et AccA3-AccD5. Et de plus, AccD4 et AccD5 interagissent entre elles. Nos résultats vont donc bien dans le sens de l’existence d’un complexe AccA3-AccD4-AccD5 (Gande et al., 2007; Portevin et al., 2005) qui interviendrait dans l’activation de la chaîne α. La spécificité de substrat d’AccD5 pour le propionyl-CoA a été montrée en l’absence d’AccD4 (Gago et al., 2006; Lin et al., 2006). La formation du complexe à trois partenaires pourrait, par exemple, modifier la spécificité de substrat d’AccD5 en formant une sous-unité β avec trois unités AccD4 et trois unités AccD5, ce qui permettrait de prendre en charge des acides gras à longue chaîne. On obtiendrait ainsi un compexe hétéro-dodécamérique avec une sous-unité α (AccA3) homo-héxamérique et une sous-unité β (AccD4-AccD5) hétéro-hexamérique (figure 27).
AccD6 n’interagirait avec aucune des trois ACCases citées précédemment (AccA3, AccD4 et AccD5) (figure 26). Il se pourrait que l’activité acétyl-CoA carboxylase observée in vitro en présence d’AccA3 (Daniel et al., 2007; Kurth et al., 2009) ne corresponde pas à la réalité biologique et qu’une autre carboxylase α (AccA1 ou AccA2) intervienne en complexe avec AccD6. La sous-unité ε (AccE5) interagit avec AccA3 dans les deux « sens » et avec AccD6 lorsqu’elle est fusionnée au tag c-myc. Ce profil lui donne la possibilité de jouer son rôle de modulateur en activant les complexes comprenant AccA3 et en inhibant celui qui contient AccD6 (figure 27) (Gago et al., 2006; Kurth et al., 2009).
L’interprétation des données d’interactions entre les différentes ACCases et les principales protéines du cycle FAS-II (MabA, InhA, mtFabD, KasA, KasB, mtFabH, Pks13) s’avère plus délicate (figure 28 et S1).
89
Synthèse du malonyl-CoA
α?
α? α? α?
+
α?
Activation de la chaîne α
α?
α3
α3 α3 α3
α3
ε5
? β6 β6 β6 β6 β6
α3
-
β6
β4 β5 β4 β5
β4
FadD32
Activation de la chaîne méromycolique
β5
FAS-II Figure 27 : Modélisation des interactions des différentes ACCases et de FadD32 entre elles et avec le système FAS-II. Les flèches rouges représentent les interactions protéine-protéine déduites de nos expériences de double hybride chez la levure et de Co-IP. Les flèches vertes représentent, en plus de l’interaction protéineprotéine, l’effet activateur ou inhibiteur d’AccE5 sur les deux complexes d’ACCases. Les sous-unités α, correspondent à AccA3 (α 3) ou une autre sous-unité α potentielles (α?). Les sous unités β représentent AccD4 (β4), AccD5 (β5) et AccD6 (β6). La sous unité ε5 correspond à AccE5.
Les protéines InhA, KasA, KasB et mtFabH interagissent avec l’ensemble des protéines partenaires de Pks13 lorsque ces dernières sont en fusion avec l’étiquette HA (figure 28). Il est difficile d’interpréter ce résultat qui suggère plutôt un comportement de « faux positif ».
Il se révèle que la protéine AccA3 n’interagit avec aucune des protéines de FAS-II. AccD4 interagirait fortement avec mtFabH, un peu moins avec KasA et MabA et faiblement avec KasB. D’autre part, AccD5 interagirait fortement avec KasA et de façon plus faible avec KasB et mtFabD (figure 28). On peut émettre l’hypothèse que les protéines AccD4 et AccD5 font le « lien » entre l’activation de la chaîne α et les autres enzymes de la voie de biosynthèse des acides mycoliques (figure 27).
La sous-unité ε (AccE5) semble interagir faiblement avec les deux condensases KasA et KasB.
90
Figure 28 : Analyse en Co-IP des différentes ACCases et FadD32 contre les protéines du système FAS-II. Les h-protéines seules : première colonne. Les c-protéines seules : colonnes (-). Les Co-IP : colonne (IP). Quand la taille des protéines est similaire, les réactions ont eu lieu avec une h-protéine froide et une c-protéine radiomarquée. Ces Co-IP sont signalées par un (*).
91
De façon étonnante, aucune interaction entre les différentes ACCases et Pks13 n’a pu être détectée. Cependant, le haut poids moléculaire de Pks13 peut poser des problèmes de nucléarisation dans les tests de double hybride chez la levure et réduire la sensibilité du test. Il se pourrait aussi que ce type d’interaction nécessite la mise en complexe des ACCases entre elles.
L’interprétation globale des résultats nous laisse supposer que l’enzyme AccD6 n’interagit avec aucune des protéines de FAS-II, la plaçant ainsi en dehors de l’interactome de la voie de biosynthèse des acides mycoliques, ce qui est cohérent avec sa fonction d’acétyl-CoA carboxylase décrite dans la littérature (Daniel et al., 2007; Kurth et al., 2009).
Finalement, l’étude des interactions de FadD32 avec les autres protéines de la voie de biosynthèse des acides mycoliques en Co-IP nous permet de tirer plusieurs conclusions. L’interaction forte entre FadD32 et AccD4 est confirmée faisant de cette dernière protéine le « lien » entre l’activation de la chaîne α et celle de la chaîne méromycolique (figure 27). On constate une interaction faible entre FadD32 et AccD6. De plus, FadD32 interagit faiblement, en Co-IP uniquement, avec AccD5 et AccE5. Ces trois interactions semblent secondaires et pourrait être dues à l’homologie structurale existant entre les diverses carboxylases. Nous n’avons pas trouvé d’interaction entre FadD32 et les autres enzymes du cycle FAS-II. Un schéma simple aurait pu être l’existence d’une interaction directe entre FadD32 et Pks13. Ce n’est pas le cas et on peut envisager l’existence d’interactions indirectes pour expliquer les interactions fonctionnelles entre ces deux enzymes. On peut aussi envisager une interaction avec un sous-domaine de Pks13. Afin de vérifier cette hypothèse, quatre protéines tronquées de Pks13 ont été construites par mutagenèse dirigée en introduisant des STOP dans la séquence du gène au niveau des différents domaines de la protéine (S. Bricchi, non publié) (figure 29). Nous avons tout d’abord testé les trois condensases KasA, KasB et mtFabH contre les différentes protéines tronquées de Pks13 en Co-immunoprécipitation in vitro. Les condensases KasA et KasB - et pas mtFabH - interagissent avec l’ensemble des protéines tronquées de Pks13 (figure S2). Ce résultat montre que cette interaction a lieu avec le domaine ACP1 de Pks13 (plus petite protéine tronquée de Pks13 – figure 29). Enfin, aucune interaction n’a été détectée entre les protéines tronquées de Pks13 et les différentes enzymes qui interviennent dans l’activation de la chaîne méromycolique et la carboxylation de la chaîne α (figure S2). Il se pourrait que ces interactions, si elles existent, nécessitent soit la
92
mise en complexe des différentes ACCases, soit le chargement des substrats sur les différentes enzymes.
Stop
HA ACP1
Stop
KS
Stop
AT
Stop
ACP2
TE
T1 T2 T3 T4 Pks13 WT Figure 29 : Cartographie des protéines tronquées de Pks13. Les différents fragments (T1, T2, T3 et T4) sont clonés dans le vecteur pGAD-T7.
93
2.3. Les méthyltransférases 2.3.1. Etude en double hybride chez la levure
Les quatre méthyltransférases MmaA1-4 interagissent entre elles et également avec KasA et KasB de façon spécifique mais pas avec mtFabH (Veyron-Churlet et al., 2005). Nous présenterons ici les résultats des interactions des quatre autres méthyltransférases qui interviennent dans la biosynthèse des acides mycoliques (CmaA1, CmaA2, UmaA et PcaA) avec les autres protéines de la voie de biosynthèse. Nous avons cloné les gènes de ces quatre protéines (Rv3292c, Rv0503c, Rv0469, Rv0470c) dans les vecteurs pGAD-T7 et pGBK-T7. Nous avons ensuite transformé la souche de levure AH109 avec ces vecteurs et ceux comprenant les principaux gènes de la voie de biosynthèse étudiée afin d’obtenir l’ensemble des combinaisons de gènes possibles deux par deux. Les levures ainsi obtenues ont ensuite été analysées en stries et dilutions/spots sur milieux sélectifs (DOBA-LTH, DOBA-LTA et DOBA-LTHA) (figure 24).
Les tests de témoin négatif n’ont révélé aucune interaction entre les protéines fusionnées avec l’ « activator domain » seul ou la lamine. Aucune repousse de la levure sur milieux sélectifs n’a été observée pour les souches transformées par les vecteurs pGBK-T7 comprenant les gènes des quatre méthyltransférases et le vecteur pGAD-T7 « vide » (tableau 3).
Nous pouvons observer des interactions homotypiques pour les méthyltransférases CmaA1, CmaA2, UmaA et MmaA1. À l’inverse, PcaA, MmaA2, MmaA3 et MmaA4 n’interagissent pas avec elles mêmes (tableau 3). Lors de la cristallisation des protéines PcaA, CmaA1 et CmaA2 (Huang et al., 2002), de la protéine MmA4 (Boissier et al., 2006) ainsi que de la protéine MmaA2 (données non publiées) il n’a pas été détecté de forme multimérique dans les cristaux. Donc, si ce résultat est cohérent pour les protéines MmaA4 et PcaA qui ne manifestent pas d’interaction homotypique conformément aux données structurales, il ne l’est pas pour CmaA1 et CmaA2. Nous n’avons pour l’instant aucune donnée biochimique ou structurale quand au degré de multimérisation d’UmaA et nous supposerons qu’elle est également monomérique.
94
Tableau 3 : Analyse en double hybride chez la levure des interactions protéine-protéine entre les différentes méthyltransférases.
BD fusions
AD fusions Ø cmaA1 cmaA2 umaA pcaA mmaA1 mmaA2 mmaA3 mmaA4
lam
cmaA1
cmaA2
umaA
pcaA
mmaA1
mmaA2
mmaA3
mmaA4
-
+ +/+/+/+/-
+/+ +/+/+/+/+/-
+ + + + + + + +
+/+/+/+/+/-
+ + + +/+ + + +
+/+/+/-
+/+/-
+/+ + -
Nous obtenons des interactions fortes (+), intermédiaires (+/-) ou nulles (-) (suivant la méthodologie décrite dans le paragraphe 2.1). Les cellules grisées correspondent aux interactions homotypiques. Les cellules jaunes correspondent aux tests publiés précédemment (Veyron-Churlet et al., 2005). La colonne « AD fusions » correspond aux gènes clonés dans le vecteur pGAD-T7 et la ligne « BD fusions » aux gènes clonés dans le vecteur pGBK-T7. La ligne « Ø » correspond au vecteur pGAD-T7 « vide » sans aucun gène cloné.
Le profil d’interactions hétérotypiques des huit méthyltransférases entre elles, donné par les expériences de double hybride chez la levure, est très complexe (tableau 3). Il est difficile d’établir un lien direct entre le réseau d’interaction et le rôle précis de chaque protéine. Les homologies de séquence et de structure de ces enzymes sont certainement la cause de ces résultats difficiles à interpréter. Certaines protéines, comme MmaA1, MmaA4, UmaA ou CmaA1, semblent très interactives avec la plupart des autres méthyltransférases. D’autres, comme MmaA3, MmaA2 ou PcaA révèlent peu d’interactions avec les sept autres protéines potentiellement impliquées dans l’introduction des décorations des acides mycoliques. CmaA2 aurait un profil intermédiaire. Une étude in vitro est vraiment indispensable pour pouvoir interpréter l’ensemble de ces résultats.
Les interactions hétérotypiques obtenues par la technique de double hybride chez la levure entre les huit méthyltransférases et les protéines de FAS-II montrent un profil d’interactions plus facile à interpréter (tableau 4). Les réductases MabA et InhA n’interagiraient avec aucune des huit méthyltransférases à l’exception d’InhA qui interagirait faiblement avec CmaA2 lorsqu’elle est en fusion avec le binding domain. Que se soit en fusion avec le binding domain ou avec l’activator domain, les huit méthyltransférases interagiraient avec les condensases KasA et KasB à l’exception de MmaA1 en fusion avec l’activator domain. De même, toutes les méthyltransférases interagiraient dans les deux « sens » avec mtFabD sauf 95
MmaA3 qui n’interagirait dans aucun des deux « sens ». MtFabH semble interagir dans les deux « sens » avec UmaA. Il semblerait également qu’elle interagisse, en fusion avec le binding domain, avec MmaA4 et de façon relativement faible avec les protéines CmaA1, CmaA2, MmaA2 et MmaA3. Pks13 révèle, uniquement en fusion avec le binding domain, une interaction avec CmaA1 et des interactions plus faibles avec MmaA3 et MmaA4. Le profil d’interactions des condensases en amont (mtFabH) et en aval (Pks13) du cycle d’élongation avec les différentes méthyltransférases ne peut être tranché uniquement avec les résultats de double hybride. Les études in vitro de Co-IP doivent être réalisées pour confirmer ou infirmer les interactions potentielles.
Tableau 4 : Analyse en double hybride chez la levure des interactions protéine-protéine des différentes méthyltransférases avec les protéines du systèmeFAS-II.
BD fusions
AD fusions Lam
cmaA1
cmaA2
umaA
pcaA
mmaA1
mmaA2
mmaA3
mmaA4
-
+ +/+/-
+ +/+/-
+ +/+ + -
+ +/+ -
+ + + -
+ +/+ -
+ + -
+ + + -
Ø mabA inhA kasA kasB mtfabH mtfabD pks13
BD fusions
AD fusions Ø cmaA1 cmaA2 umaA pcaA mmaA1 mmaA2 mmaA3 mmaA4
lam
mabA
inhA
kasA
kasB
mtfabH
mtfabD
pks13
-
-
+/-
+ + + + + + +
+/+ +/+/+ + +
+/+/+/+/+/+
+ + + +/+ + +
+ +/+/-
Nous obtenons des interactions fortes (+), intermédiaires (+/-) ou nulles (-) (suivant la méthodologie décrite dans le paragraphe 2.1). Les cellules jaunes correspondent aux tests publiés précédemment (Veyron-Churlet et al., 2005). La colonne « AD fusions » correspond aux gènes clonés dans le vecteur pGAD-T7 et la ligne « BD fusions » aux gènes clonés dans le vecteur pGBK-T7. La ligne « Ø » correspond au vecteur pGAD-T7 « vide » sans aucun gène cloné.
96
2.3.2. Détermination des interactions en Co-IP
L’ensemble des h-protéines ont été testées en Co-IP contre la lamine (c-Lam ; résultats non montrés) et aucune des quatre méthyltransférases étudiées n’interagit avec elle.
Figure 30 : Analyse en Co-IP des méthyltransférases entre elles. Les h-protéines seules : première colonne. Les c-protéines seules : colonnes (-). Les Co-IP : colonne (IP). Quand la taille des protéines est similaire, les réactions ont eu lieu avec une h-protéine froide et une c-protéine radio-marquée. Ces Co-IP sont signalées par un (*).
Les interactions homotypiques en Co-IP ont été réalisées pour les protéines CmaA1, CmaA2, UmaA et PcaA (figure 30) et pour les protéines MmaA1-4 (Veyron-Churlet et al., 2005). Nous pouvons observer des interactions homotypiques pour les méthyltransférases CmaA1, CmaA2, UmaA, PcaA et MmaA1. À l’inverse MmaA2, MmaA3 et MmaA4 n’interagissent pas avec elles mêmes. Le profil d’interactions semble le même que suite aux expériences de 97
double hybride chez les levures effectuées précédemment pour les protéines CmaA1, CmaA2, UmaA et MmaA1 qui semblent interagir contre elles-mêmes et pour MmaA3 et MmaA4 qui n’interagiraient pas de façon homotypique. À l’inverse, les Co-IP révèlent des interactions homotypiques pour les protéines PcaA et MmaA3 contrairement aux précédentes expériences de double hybride chez la levure.
Figure 31 : Analyse en Co-IP des méthyltransférases contre les enzymes de FAS-II. Les h-protéines seules : première colonne. Les c-protéines seules : colonnes (-). Les Co-IP : colonne (IP). Quand la taille des protéines est similaire, les réactions ont eu lieu avec une h-protéine froide et une c-protéine radio-marquée. Ces Co-IP sont signalées par un (*).
98
Pour ce qui concerne les interactions hétérotypiques des méthyltransférases entre elles, le profil global d’interactions semble toujours très difficile à interpréter (figure 30). En effet, les protéines se révèlent très interactives à l’exception de PcaA en fusion avec le tag HA et de MmaA3 et MmaA4 en fusion avec le tag c-myc. In vivo, il est fort probable que des méthyltransférases interagissent entre elles afin d’assurer les modifications de la chaîne méromycolique. Cependant, le grand nombre d’interactions hétérotypiques observées semble être difficile à calquer sur la réalité biologique de la biosynthèse des acides mycoliques. Le degré d’homologie structural important de l’ensemble des méthyltransférases (figure 17) pourrait entraîner, dans notre système expérimental, de nombreux faux positifs qui dissimuleraient les interactions réelles. Ces artefacts expliqueraient dans le même temps les interactions homotypiques que nous pouvons observer et qui sont contradictoires avec les études cristallographiques présentes dans la littérature (Huang et al., 2002). En revanche, les résultats obtenus en Co-IP entre les différentes méthyltransférases et les enzymes du système FAS-II confirment les tendances révélées pas le double hybride et nous permettent de trancher parmi les ambiguïtés (figure 31 et S3). Les quatre méthyltransférases MmaA1-4 interagissent fortement avec les condensases KasA et KasB. Par ailleurs, MmaA1-4 interagissent avec mtFabD à l’exception de MmaA3. Enfin, ces quatre méthyltransférases n’interagissent pas ou peu avec la condensase mtFabH et les protéines MabA, InhA et Pks13 (Veyron-Churlet et al., 2005).
Les protéines CmaA1, CmaA2, UmaA et PcaA interagiraient fortement avec KasA et KasB. Ces quatre méthyltransférases interagiraient également avec mtFabD. À l’inverse, et comme pour MmaA1-4, elles n’interagiraient ni avec Pks13, ni avec MabA. Les interactions spécifiques entre nos quatre protéines étudiées ici et les condensases KasA et KasB semblent aller dans le même sens que pour MmaA1-4.
Par ailleurs en analysant globalement les résultats de Co-IP et de double hybride, il semblerait que la protéine UmaA interagirait avec mtFabH tout comme, mais de façon plus faible, les protéines CmaA1 et CmaA2. Cependant, il avait été montré auparavant au laboratoire, que la fixation limitée de h-MmaA4 sur c-mtFabH en Co-IP se réalisait de façon non spécifique contrairement à la fixation sur les protéines c-KasA et c-KasB (Veyron-Churlet et al., 2005). Nous pouvons émettre l’hypothèse que les huit méthyltransférases se comportent peut-être de la même façon et qu’elles interagissent préférentiellement avec les condensases KasA et KasB et peu avec mtFabH (figure 32). L’interaction des méthyltransférases avec KasA et KasB 99
suggère qu’il existerait un site de fixation spécifique de ses protéines sur les deux condensases.
Um
4 2M 3 aA 1M aA M2 Cm Cm caA 1 P M aA
E2-FAS-II
Acides mycoliques Pks13
KasB CmaA2M4 CmaA1M3 PcaA M2 UmaA M1
MabA
Core KasA
InhA
Core
mtFabD
Core mtFabH
E1-FAS-II
Acyl-coA I-FAS-II
Figure 32 : Interactome de la voie de biosynthèse des acides mycoliques avec intégration au modèle des quatre méthyltransférases supplémentaires CmaA1, CmaA2, UmaA et PcaA.
De façon surprenante, les résultats de Co-IP montrent que la réductase InhA interagirait avec les quatre méthyltransférases dans les deux sens rentrant ainsi en contradiction avec les expériences de double hybride. Ce type de contradictions a déjà été observé pour les tests mettant en jeu la réductase InhA. En effet, cette protéine n’interagit pas ou peu dans la levure et, a contrario, interagit avec divers partenaires de FAS-II in vivo. L’hypothèse émise au laboratoire est que la tétramérisation d’InhA pourrait masquer les interactions avec d’autres partenaires chez la levure où la reconstitution d’un activateur GAL4 fonctionnel est nécessaire.
100
2.4. Les déshydratases Les interactions HadA-HadB et HadB-HadC ont été démontrées, dans l’équipe, par une technique de Split-Trp chez M.smegmatis (Sacco et al., 2007a). La différence de spécificité de substrat (HadA-B préfère des substrats plus courts qu’HadB-C), l’absence d’HadC chez les autres genres produisant des acides mycoliques plus courts (Nocardia, Rhodococcus) ou encore le fait qu’HadA et HadB soient essentiels à la survie des mycobactéries contrairement à HadC, laissent supposer qu’HadA-B interviendrait au début de l’élongation des acides mycoliques alors que le complexe HadB-C assurerait la déshydratation en fin d’élongation. A partir de ces éléments, nous avons fait le choix d’étudier le réseau d’interactions des déshydratases avec les autres enzymes de la biosynthèse des acides mycoliques dans un contexte à trois partenaires permettant de tester les hétérodimères de déshydratases contre les protéines du système FAS-II.
C’est pourquoi nous avons utilisé une technique de triple hybride chez la levure. Le principe de triple hybride chez la levure (mis au point au laboratoire par Nabila Haddache, 2007) repose fondamentalement sur celui du double hybride. Un premier gène est cloné dans un vecteur (pGAD-T7) en fusion avec l’« activator domain » de GAL4. Les deux autres gènes sont clonés dans un second vecteur appelé pBridge : l’un est cloné en fusion avec le « binding domain », l’autre est cloné sous le contrôle d’un promoteur inductible pMet (réprimé en présence de méthionine). Nous testerons les interactions en triple hybride dans les deux « sens » de clonage dans le vecteur pBridge (A-B, A-C, B-A, B-C, C-A et C-B). Dans le système de triple hybride chez la levure, la souche utilisée est S.cerevisiae MAV203. Les gènes rapporteurs sont HIS3 et URA3. S’il y a interaction entre la protéine fusionnée au domaine de liaison à l’ADN et celle fusionnée au domaine activateur de l’ARN polymérase, les gènes rapporteurs sont transcrits et le produit de ces gènes permet à la levure de pousser sur des milieux sans Histidine ou sans Uracile. L’absence ou la présence de méthionine active ou réprime la transcription du troisième gène sous le contrôle du promoteur pMet. Nous pourrons donc déterminer si l’interaction entre l’AD-protéine et la BD-protéine est dépendante ou non de la présence de la protéine dont la séquence est sous le contrôle de pMet (figure 33).
101
AD
DNAbd
A
Gènes Rapporteurs URA3 ADE2
pBridge
B
Figure 33 : Le système triple hybride chez la levure (S.cerevisiae MAV203 - Matchmaker©). A : S’il y a interaction directe, ou par l’intermédiaire de la protéine dont le gène est sous le contrôle du promoteur pMet (Z), entre la protéine fusionnée à l’ « activator domain » (Y) et celle fusionnée au « binding domain » (Z), les gènes URA3 et HIS2 sont transcrits. B : Carte génétique du plasmide pMet (Clontech®).
Dans cette partie, nous avons dans un premier temps testé les interactions des trois déshydratases entre elles avec notre système de double hybride chez la levure. Ensuite, nous avons testé les interactions entre les principales protéines de la biosynthèse des acides mycoliques (MabA, InhA, KasA, KasB, mtFabH, mtFabD, Pks13) et les déshydratases (HadA-HadB et HadC-HadB). Pour ce faire, nous avons cloné les différents gènes dans le vecteur pGAD-T7 ainsi que les trois déshydratases, deux à deux, dans le vecteur pBridge. La 102
dernière partie de notre étude détermine les interactions entre les huit méthyltransférases, clonées dans le vecteur pGAD-T7, et les différents couples de déshydratases clonés dans le vecteur pBridge.
Nous nous intéressons plus particulièrement aux interactions entre les méthyltransférases et les deux dimères HadA-B et HadB-C pour plusieurs raisons. Tout d’abord, nous avons vu que le profil d’interactions protéine-protéine des méthyltransférases avec les enzymes de FAS-II était difficile à interpréter. Il se pourrait que les deux complexes HadA-B et HadB-C interagissent spécifiquement avec les différentes méthyltransférases de telle sorte que ces interactions régulent l’intervention de ces enzymes en termes de modifications de la chaîne méromycolique aux deux positions distale et proximale. Enfin, nous savons que les méthyltransférases modifient la chaîne méromycolique aux deux positions car y sont présentes des insaturations. L’enzyme responsable de l’isomérisation n’est pas connue mais cette étape est assurée chez d’autres organismes par une déshydratase/isomérase et doit avoir lieu à ce moment du cycle.
2.4.1. Détermination des interactions homotypiques en double hybride
Nous avons cloné les différents gènes des déshydratases dans les vecteurs du double hybride (pGADT-7 et pGBK-T7) et avons introduit ces vecteurs deux à deux dans la souche de levure AH109 en générant toutes les combinaisons possibles. Aucune des trois déshydratases n’interagit avec le contrôle négatif (lamine) et nous n’avons pas observé de repousse sur milieux sélectifs lorsque nous avons co-transformé les trois vecteurs pGBK-T7::hadA, B et C avec le vecteur pGAD-T7 « vide » (tableau 5).
Les résultats obtenus révèlent des interactions homotypiques faibles pour les protéines HadA et HadB et aucune avec HadC. On retrouve la formation des hétérodimères HadA-B et HadBC et l’absence d’hétérodimère HadA-C comme observé précédemment dans le système bactérien (Sacco et al., 2007a) (tableau 5).
103
Tableau 5 : Analyse en double hybride chez la levure des interactions protéine-protéine entre les différentes déshydratases.
BD fusions
AD fusions Ø hadA hadB hadC
lam
hadA
hadB
hadC
-
+/+ -
+/-
+ -
Nous obtenons des interactions fortes (+), intermédiaires (+/-) ou nulles (-) (suivant la méthodologie décrite dans le paragraphe 2.1). Les cellules grisées correspondent aux interactions homotypiques. La colonne « AD fusions » correspond aux gènes clonés dans le vecteur pGAD-T7 et la ligne « BD fusions » aux gènes clonés dans le vecteur pGBK-T7. La ligne « Ø » correspond au vecteur pGAD-T7 « vide » sans aucun gène cloné. Ces résultats ont été obtenus en collaboration avec N. Haddache.
Des études de co-purification in vitro et de DLS (Dynamic Ligh Scattering) ont en fait montré que les deux complexes étaient hétérotétramériques (deux hétérodimères identiques) à 8°C et hétérodimériques à 20°C (Sacco et al., 2007a). Nous savons que ces hétérodimères peuvent former un repliement en simple hot dog. Le motif hydratase 2 est porté par HadB ce qui en fait la sous unité catalytique. HadA ou HadC viendraient stabiliser le substrat à longue chaîne et seraient responsables de la spécificité de substrat. Les interactions homotypiques HadAHadA et HadB-HadB vont dans le sens de l’existence de complexes tétramériques avec deux sous-unités identiques (HadA-B/HadA-B ou HadB-C/HadB-C).
2.4.2. Etude en triple hybride des interactions protéine-protéine entre les complexes déshydratases et les enzymes de FAS-II
Il semblerait que la protéine MabA interagisse avec le complexe HadA-B uniquement lorsque HadB est en fusion avec le « binding domain ». La condensase KasA interagirait avec HadA et le complexe HadA-B. La condensase mtFabH interagirait, elle, avec le complexe HadA-B lorsque HadA est en fusion avec le « binding domain ». De plus, la condensase KasB interagirait avec la déshydratase HadC et les deux complexes HadA-B et HadB-C (tableau 6).
Nous avons détecté très peu d’interactions entre les principales protéines de la biosynthèse des mycoliques et les déshydratases.
HadA-B pourrait interagir avec le « core » de FAS-II par contact direct avec MabA.
104
Tableau 6 : Analyse en triple hybride chez la levure des interactions protéine-protéine entre les différents couples de déshydratases et les enzymes du système FAS-II.
AD fusions Ø mabA inhA kasA kasB mtfabH mtfabD
BDlam
-
BD-A / Met-B + Met Met
+/-
+ +/+/-
BD-A / Met-C + Met Met
-
-
BD-B / Met-A + Met Met
-
+/-
BD-B / Met-C + Met Met
-
-
BD-C / Met-A + Met Met
-
-
BD-C / Met-B + Met Met
+/-
+/-
Nous obtenons des interactions fortes (+), intermédiaires (+/-) ou nulles (-) (suivant la méthodologie décrite dans le paragraphe 2.1). Les colonnes roses correspondent au couple HadA/HadB. Les colonnes vertes correspondent au couple HadA/HadC. Les colonnes jaunes correspondent au couple HadB/HadC. Dans chaque colonne les résultats sont donnés en présence (+ Met, répression du promoteur pMet) ou en absence (- Met, activation du promoteur pMet) de méthionine. BD-A/Met-B : vecteur pBridge avec HadA fusionnée avec le binding domain et HadB sous le contrôle du promoteur pMet. Idem pour les autres vecteurs. Ces résultats ont été obtenus en collaboration avec N. Hadache.
Les résultats concernant les interactions entre les déshydratases et les condensases sont cohérents avec l’hypothèse d’un premier complexe HadA-B qui interviendrait comme déshydratase en début de cycle FAS-II tout comme les condensases mtFabH (initiation) et KasA (début d’élongation). Ce complexe interagirait directement avec KasA. Ils sont aussi en accord avec un complexe HadB-C qui participerait à la fin de l’élongation aux côtés de la condensase KasB par interaction protéine-protéine.
Nos résultats d’interactions protéine-protéine dans notre système de triple hybride chez la levure vont dans le même sens que les travaux de Sacco et coll. En effet, HadA-B a une spécificité de substrat pour des longueurs de chaînes plus courtes qu’HadB-C. De plus, hadC ne semble pas être essentiel à la biosynthèse des acides mycoliques, tout comme kasB, et contrairement à hadA et hadB (Sacco et al., 2007a). HadA-B pourrait donc intervenir dans les complexes I-FAS-II et E1-FAS-II. HadB-C pourrait, lui, être intégré, dans notre modèle, dans le complexe E2-FAS-II (figure 34).
105
E1-FAS-II PcaA
MmaA4 MmaA3 MmaA1 MmaA2
E2-FAS-II
CmaA2
KasB
KasA HadA-B
Core
MmaA2 MmaA4
Acides mycoliques
HadB-C
Core Core
mtFabH MabA InhA
Acyl-CoA
mtFabD
I-FAS-II
Figure 34 : Interactome de la biosynthèse des acides mycoliques avec ajout au modèle des déshydratases et des méthyltransférases.
2.4.3. Etude en triple hybride des interactions entre les complexes déshydratases et les huit méthyltransférases
Les méthyltransférases assurent les modifications de la chaîne méromycolique à des positions bien déterminées (distale et proximale). Ces positions se caractérisent, avant modification, par l’introduction d’insaturations. L’enzyme (ou les enzymes) responsable(s) de l’introduction de ces double liaisons n’est (ne sont) pas connue(s). Chez E.coli, cette étape est assurée par une déshydratase/isomérase (FabA) mais aucun homologue à cette protéine n’a été identifié chez Mtu (Sacco et al., 2007b). L’isomérisation doit cependant avoir lieu à l’étape de déshydratation du cycle FAS-II. Pour ces raisons, nous avons testé dans notre système de triple hybride chez la levure les interactions entre les deux complexes déshydratases HadA-B et HadB-C et les huit méthyltransférases. Ceci afin de déterminer si ces deux complexes ne seraient pas la clé dans le contrôle d’une intervention coordonnée des méthyltransférases aux deux positions (distale et proximale). Il faut noter qu’à chaque cycle FAS-II la chaîne carbonée est allongée de deux carbones au niveau de l’extrémité où se trouve l’ACPm. La synthèse de la position distale a donc lieu dans les cycles précoces de l’élongation et celle de 106
la position proximale dans les cycles tardifs. Les résultats obtenus révèlent un profil d’interactions, avec les complexes déshydratases, différent pour chacune des enzymes responsables des modifications de la chaîne méromycolique (tableau 7).
Tableau 7 : Analyse en triple hybride chez la levure des interactions protéine-protéine entre les différents couples de déshydratases et les huit méthyltransférases.
AD fusions Ø cmaA1 cmaA2 umaA pcaA mmaA1 mmaA2 mmaA3 mmaA4
BDlam
-
BD-A / MetB + Met Met
+/+ +/+/+ +/+/-
+ + + +/+/-
BD-A / MetC + Met Met
+/+ +/+/+
+/+/+/+
BD-B / MetA + Met Met
BD-B / MetC + Met Met
+ +/+/+ + +/-
+ +/+ +/+
+/+ +/+ +/+/+/-
+ + + + +
BD-C / MetA + Met Met
+/+ + +/-
+/+ + +/-
BD-C / MetB + Met Met
+ +/+/+/-
+/+/+/+ +/-
Nous obtenons des interactions fortes (+), intermédiaires (+/-) ou nulles (-) (suivant la méthodologie décrite dans le paragraphe 2.1). Les colonnes roses correspondent au couple HadA/HadB. Les colonnes vertes correspondent au couple HadA/HadC. Les colonnes jaunes correspondent au couple HadB/HadC.
La protéine CmaA2, responsable de la trans-cyclopropanation en position proximale des acides mycoliques oxygénés (Glickman et al., 2001), semble interagir avec HadB, et ceci que les protéines HadA et HadC soient réprimées (présence de méthionine, transcription d’hadA ou d’hadC sous le contrôle du promoteur pMet réprimée) ou non (absence de méthionine, transcription activée) (tableau 7 – ligne cmaA2, colonnes BD-B/Met-A et BD-B/Met-C). De plus, CmaA2, en fusion avec l’ « activator domain », forme un complexe qui active le promoteur GAL4 avec HadC, en fusion avec le « binding domain », uniquement lorsque la protéine HadB est induite (tableau 7 – ligne cmaA2, colonne BD-C/Met-B). Par ailleurs, CmaA2, en fusion avec l’ « activator domain », n’interagit pas avec HadA, en fusion avec le « binding domain », et n’interagit pas non plus avec HadB lorsqu’elle est induite en présence d’HadA (tableau 7 – ligne cmaA2, colonnes BD-A/Met-B et BD-A/Met-C). On peut donc émettre l’hypothèse que l’interaction HadA-HadB inhibe l’interaction HadB-CmaA2 contrairement à l’interaction HadB-HadC. On en conclut que la méthyltransférase CmaA2, qui intervient en position proximale (en fin d’élongation), interagirait de façon spécifique
107
avec HadB uniquement lorsqu ‘elle serait complexe avec HadC. Ce complexe est sensé intervenir en fin d’élongation. Il y a donc une convergence entre l’intervention en position proximale de CmaA2 et l’interaction de cette enzyme avec HadB-C qui intervient en fin d’élongation.
La protéine PcaA intervient dans la cis-cyclopropanation des acides mycoliques α en position proximale (Glickman et al., 2000). PcaA semble interagir avec HadB et HadC et ceci que les protéines HadA, HadB ou HadC soient induites ou non (tableau 7 – ligne pcaA, colonnes BD-B/Met-A, BD-B/Met-C, BD-C/Met-A et BD-C/Met-B). Il semblerait aussi que PcaA n’interagisse pas avec HadA malgré une faible interaction lorsque HadB est réprimée. De plus, PcaA ne forme pas de complexe avec HadA lorsque la protéine HadB – qui interagit avec HadA – est induite (tableau 7 – ligne pcaA, colonnes BD-A/Met-B et BD-A/Met-C). Ce résultat pourrait signifier une inhibition de l’interaction PcaA-HadB par l’interaction HadA lorsqu’il est en hétérodimère avec HadB. On peut donc envisager une interaction spécifique entre PcaA et le complexe HadB-C qui interviennent tous les deux en fin d’élongation.
MmaA1 est une méthyltransférase qui interviendrait dans l’introduction d’un groupe méthyle en position distale (Yuan et al., 1997). Dans nos expériences de triple hybride chez la levure, MmaA1 interagirait faiblement avec HadA lorsque HadB est réprimé. L’interaction semble plus forte après induction (tableau 7 – ligne mmaA1, colonne BD-A/Met-B). De plus, on détecte la formation d’un complexe qui mime l’activateur de GAL4 entre MmaA1 et HadB uniquement lorsque HadA est induite (tableau 7 – ligne mmaA1, colonne BD-B/Met-A). Il n’y a aucune interaction avec le complexe HadB-C ou l’une de ses composantes. On en déduit une interaction spécifique entre la protéine MmaA1 et le complexe HadA-B qui interviennent tout deux respectivement en position distale et en début d’élongation.
Il a été montré que MmaA2 se chargeait de la cis-cyclopropanation en position distale des acides mycoliques α et aussi de la cis-cyclopropanation en position proximale des acides mycoliques oxygénés (Glickman, 2003). Notre étude montre qu’MmaA2, en fusion avec l’ « activator domain », interagirait avec les trois déshydratases en fusion avec le « binding domain » que le second gène soit induit ou pas. Nous en tirons la conclusion que MmaA2 interagirait avec les deux complexes HadA-HadB et HadB-HadC, ce qui semble aller de pair avec son double rôle en position distale et proximale.
108
L’O-méthyl-transférase MmaA3 méthyle l’alcool secondaire à la position distale de la chaîne méromycolique (Yuan and Barry, 1996; Yuan et al., 1998b). Nous constatons qu’MmaA3 semble interagir avec HadA. Cette interaction semble réprimée lorsque Met-HadC, et pas Met-HadB, est induite (tableau 7 – ligne mmaA3, colonnes BD-A/Met-B et BD-A/Met-C). De plus, MmaA3, en fusion avec l’ « activator domain », formerait un complexe, capable d’activer les gènes sous le contrôle du promoteur GAL4, avec HadB quand HadA est induite. Cette interaction serait inhibée lors de l’induction d’HadC (tableau 7 – ligne mmaA3, colonnes BD-B/Met-A et BD-B/Met-C). On en conclut qu’il y aurait une interaction spécifique entre MmaA3 et le complexe HadA-B qui interviennent respectivement en position distale et dans la première partie de l’élongation.
MmaA4 (Hma) est l’enzyme qui intervient en position distale pour méthyler la double liaison tout en réalisant de façon concertée une hydroxylation. MmaA4, en fusion avec l’ « activator domain », interagit avec les trois déshydratases en fusion avec le binding domain, que le gène sous le contrôle du promoteur pMet soit induit ou non. MmaA4 interagirait donc avec les deux complexes déshydratases HadA-B et HadB-C. Contrairement aux méthyltransférases précédentes, nous ne trouvons pas de corrélation stricte d’une interaction entre MmaA4 qui intervient en position distale et le complexe déshydratase qui serait responsable de la déshydratation dans la première phase de l’élongation.
Le rôle exact de CmaA1 dans la modification de la chaîne méromycolique est encore inconnu. CmaA1 interagit avec HadA, en fusion avec le « binding domain » uniquement. Cette interaction est inhibée lorsque HadB est induite (tableau 7 – ligne cmaA1, colonnes BDA/Met-B et BD-A/Met-C).
De même, la fonction de UmaA reste à élucider. UmaA interagit avec les trois déshydratases en fusion avec le binding domain, que le gène sous le contrôle du promoteur pMet soit induit ou non.
Si l’on fait une synthèse des résultats, pour les méthyltransférases dont le rôle exact dans les modifications de la chaîne méromycolique est connu, nous avons (figure 34) : - MmaA1 et MmaA3 qui interviennent en position distale et qui interagissent avec le complexe HadA-B. - CmaA2 et PcaA qui agissent en position proximale et qui interagissent avec HadB-C. 109
- MmaA2 qui a un double rôle en positions distales et proximales et qui interagit avec les deux complexes HadA-B et HadB-C. - MmaA4 qui intervient en position distale et qui interagit avec les deux complexes également. Comme nous le disions en introduction de ce chapitre, le complexe HadA-B assure potentiellement la déshydratation dans le cycle FAS-II en début d’élongation et HadB-C en fin d’élongation (Sacco et al., 2007a). La position distale est synthétisée dans les premiers cycles de FAS-II et la position proximale a un cycle de FAS-II plus tardif. Nous notons une corrélation forte entre les interactions des différentes méthyltransférases avec les complexes déshydratases HadA-B et HadB-C et l’intervention en position distale et/ou proximale des différentes méthyltransférases (hormis pour MmaA4 qui interagit avec HadB-C alors qu’elle n’intervient qu’en position distale). Les deux complexes HadA-B et HadB-C pourraient avoir des sites de fixation spécifiques de telle ou telle méthyltransférase. Nous pouvons émettre l’hypothèse que les interactions protéine-protéine entre les méthyltransférases et les déshydratases permettent de réguler l’intervention séquentielle des méthyltransférases en position distale et proximale. Des études précédentes suggéraient, sans en apporter la preuve formelle, que, les modifications de la chaîne méromycolique avaient lieu au cours de l’élongation (Veyron-Churlet et al., 2005; Yuan et al., 1995). Les résultats obtenus en triple hybride chez la levure renforcent fortement cette hypothèse et nous permettent d’affiner notre modèle (figure 34).
110
2.5. Modélisation du complexe FAS-II basée sur la structure de la mégaenzyme mFAS-I
2.5.1. Méthodes et choix d’analyse
Chez les eucaryotes et les mycobactéries on trouve des systèmes d’élongation d’acides gras de type I (FAS-I) qui sont des enzymes multi-domaines enzymatiques capables de synthétiser de novo des acides gras (Schweizer and Hofmann, 2004). Ces enzymes possèdent tous les domaines catalytiques nécessaires à l’élongation de la chaîne carbonée. Trois structures FAS-I chez des organismes eucaryotes ont été déterminées : chez le cochon (mFAS-I) (Maier et al., 2008), chez S.cerevisiae (Leibundgut et al., 2007) et chez Thermomyces lanuginosus (Jenni et al., 2007). Ces deux dernières structures sont similaires.
Les systèmes d’élongations d’acides gras de type II sont généralement retrouvés chez les procaryotes ou encore dans les mitochondries ou chloroplastes des organismes eucaryotes. Il s’agit de systèmes où chaque étape catalytique est assurée par une enzyme distincte. Chez Mtu, les structures des principales enzymes de la biosynthèse des acides mycoliques sont connues (figures 14 et 17) : mtFabD, mtFabH, KasA, KasB, MabA, InhA, CmaA1, CmaA2, PcaA, MmaA2 et MmaA4 dans sa forme apo et en complexe avec la SAM. Seules les structures des complexes déshydratases HadA-B et HadB-C et des méthyltransférases UmaA, MmaA1 et MmaA3 ne sont pas connues chez Mtu et nous proposons dans ce chapitre un modèle pour chacune de ces enzymes.
Il existe une importante proximité structurale entre les sites catalytiques de FAS-I et les différentes enzymes des systèmes FAS-II bactériens (Leibundgut et al., 2007; Maier et al., 2008). Dans ce chapitre, nous allons aligner les structures des différentes enzymes de la biosynthèse des acides mycoliques chez Mtu sur la structure de mFAS-I afin d’obtenir une représentation en trois dimensions de notre interactome. Nous allons observer l’arrangement dans l’espace, à partir des alignements structuraux effectués sur mFAS-I, des différentes enzymes entre elles. Nous vérifierons que cet arrangement corresponde avec les interactions protéine-protéine déterminées jusqu’ici. Nous pourrons ainsi proposer un modèle affiné de l’interactome de la biosynthèse des acides mycoliques chez Mtu.
111
Nous avons choisi de réaliser les alignements structuraux de nos enzymes sur la structure de mFAS-I plutôt que sur celles des FAS-I de S.cervisiae ou de Thermomyces lanuginosus. En effet, seulement ~9% de la séquence de mfas-I code pour des polypeptides n’appartenant pas à des domaines enzymatiques (Maier et al., 2008). La structure du dimère est maintenue par ces « linkers » et des repliements dus à des interactions internes à la protéine. Cet arrangement confère à la méga-enzyme une structure flexible qui permet de faire passer le substrat d’une sous-unité catalytique à l’autre (Brignole, 2009). À l’inverse, les structures de FAS-I chez la levure et le champignon sont beaucoup plus rigides et ~50% de la séquence des gènes qui codent pour ces protéines sont impliqués dans la construction d’un échafaudage qui permet notamment l’arrangement des sites catalytiques entre eux (Jenni et al., 2007). Ces régions n’ont pas d’activité catalytique. Nous savons maintenant que les protéines de la biosynthèse des acides mycoliques interagissent entre elles par contact direct. Pour ces raisons, il semble plus judicieux de réaliser nos alignements sur mFAS-I où les sites catalytiques sont proches, ou en contact, dans l’espace, que sur les FAS-I de levure ou de champignon où les sites catalytiques sont séparés par de larges domaines non enzymatiques.
Figure 35 : Organisation multi domaines enzymatiques de la protéine mFAS-I (d’après Maier et al., 2008). Rouge : sous unité enzymatique Malonyl-acétyl transférase ; Orange : sous unité enzymatique Kétoacyl synthase ; Vert foncé : sous unité enzymatique Enoylréductase ; Vert clair : sous unité enzymatique déshydratase ; Jaune : sous unité enzymatique Kétoréductase.
112
La structure de l’enzyme multi-domaines FAS-I de mammifère (mFAS-I) a été résolue à 3,2 Angstrom (Maier et al., 2008). mFAS-I est un homodimère qui comprend l’ensemble des domaines structuraux nécessaires à la biosynthèse d’acides gras (figure 35). On distingue les domaines enzymatiques kétoacyl synthase (KS), malonyl-acétyl transférase (MAT), céto réductase (KR), déshydratase (DH) et énoyl réductase (ER). On observe également un domaine pseudo-méthyltransférase (ΨMT) conservé qui n’a pas d’activité enzymatique mais qui
est
structurellement
proche
des
S-adénosyl-méthinonine
(SAM)-dépendantes
méthyltransférases, en dépit d’une faible homologie de séquence. Les différents domaines de mFAS-I sont reliés par des linkers et des interactions internes à la protéine.
Le domaine KS initie le cycle d’élongation tout comme les condensases mtFabH, KasA et KasB. Le domaine MAT correspond à mtFabD, KR à MabA, DH aux déshydratases HadA, HadB et HadC et ER à InhA. De plus, le domaine ΨMT, même s’il n’a plus d’activité enzymatique, correspond structuralement au site de fixation de la SAM des différentes méthyltransférases. Nous avons donc aligné la structure de chaque enzyme du système FAS-II avec la structure des domaines correspondant de mFAS-I à l’aide du serveur Dali (http://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali_lite/start)
afin
d’observer
l’arrangement
dans
l’espace de nos enzymes et de le confronter à notre réseau d’interactions protéine-protéine ainsi qu’au modèle d’interactome que nous avons établi précédemment.
Le serveur Dali permet de comparer des structures de protéines en trois dimensions deux à deux. Les comparaisons sont effectuées à partir des coordonnées atomiques présentes dans les fichiers PDB (Protein Data Bank - www.pdb.org). Le serveur aligne la structure de deux protéines ou de seulement une partie d’entre elles grâce à différents algorithmes (Holm et al., 2008). Il retient tous les alignements qui ont un Z-score supérieur à 2. Le Z-score traduit le degré de similarité entre deux structures. Pour chaque alignement, le serveur donne l’écart quadratique moyen entre les carbones anomériques Cα (rmsd pour root mean square deviation, en Å), le nombre de résidus alignés et le nombre total de résidus et le pourcentage d’identité des séquences d’acides aminés. Si plusieurs alignements, pour un couple de protéines, ont un Z-score supérieur à 2, nous choisissons l’alignement le plus approprié en fonction de ces différents paramètres.
113
2.5.2. Modélisation des structures inconnues
Les structures cristallographiques des protéines concernées sont décrites dans la littérature pour la plupart d’entre elles (voir introduction bibliographique). Certaines structures n’ont pas encore été résolues, ce qui nous a amené à réaliser des modèles structuraux à partir du serveur SWISS Model (http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1) pour les méthyltransférases MmaA1, MmaA3 et UmaA. Ce serveur va rechercher dans la PDB (Protein Data BAnk - www.pdb.org) des protéines de structures connues qui ont de fortes homologies de séquence avec les protéines dont nous voulons déterminer la structure. À partir de la structure de ces protéines et de la séquence de notre protéine à modéliser, des algorithmes permettent d’établir un modèle structural.
La structure des trois méthyltransférases a ainsi été déterminée (figure S4). Elles possèdent, comme les autres méthyltransférases SAM-dépendantes, un repliement de type α/β avec un feuillet β à 7 brins (domaine conservé de fixation de la S-Adénosyl-Méthionine (SAM) en position N terminale) et un second domaine plus variable de fixation du substrat en position C-terminale (Huang et al., 2002).
En ce qui concerne les déshydratases (HadA, HadB et HadC), le modèle s’est révélé plus compliqué à réaliser. Le serveur n’a pas identifié de structure de protéine connue avec une séquence suffisamment proche pour pouvoir établir un modèle des trois déshydratases prises une à une. Cependant, nous savons que dans les deux complexes HadA-B et HadB-C, le motif catalytique hydratase 2 est porté par HadB. HadB forme un complexe hétérodimérique avec HadA ou HadC. Chaque sous-unité a un repliement en simple hotdog et la formation de l’hétérodimère pourrait amener à la formation d’un complexe avec un repliement en double hotdog asymétrique (Sacco et al., 2007a). Ce repliement est caractéristique de la famille des hydratases de type2. La plupart de ces enzymes sont formées par une seule protéine. Nous avons donc fusionné artificiellement les séquences des couples HadA-HadB et HadC-HadB pour tenter de modéliser la structure non plus des protéines une à une mais dimère par dimère.
114
HadA-B
A HadA-B segment 1
HadA-B segment 2
HadB-C
B HadB-C segment 1
HadB-C segment 2
C
D
Figure 36 : Obtention des modèles structuraux des complexes HadA-B et HadC-B. A et B : Alignements sur la séquence « fusionnée » des complexe HadA-B et HadB-C (en vert) des séquences de protéines de la PDB (en bleu). A partir des séquences trouvées, le serveur SWISS Model à modéliser deux segments pour chaque complexe (segment 1 et segment 2). Les modèles des deux segments 1 ont été établis à partir de la 2-enoyl-CoA hydratase 2 humaine (référence PDB : 1S9C) et ceux des deux segments 2 à partir de la déshydratase potentielle af1124 d’Archaeoglobus fulgidus (référence PDB : 2B3N). Après alignement de ces deux segments sur la structure connue d’Rv3389c (Sacco et al., 2007), nous avons réalisé les modèles structuraux d’HadA-B (C) et d’HadB-C (D).
115
Cette approche s’est avérée fructueuse et le serveur SWISS Model nous donne deux segments alignés en séquence sur notre séquence « fusionnée » pour chacun des deux complexes HadAB et HadB-C. Ces deux segments correspondent à des protéines de la PDB de structure connue qui ont une homologie de séquence avec nos complexes. Ils se superposent sur la séquence initiale tout en la recouvrant entièrement (figure 36 A et B). À partir de la structure de ces segments et de la séquence de nos complexes à modéliser, le serveur établi un modèle structural pour chacun des deux segments (figure 36 A et B). Nous avons ensuite aligné ces deux modèles sur la structure connue de la déshydratase d’Rv3389c (cristallisée au laboratoire par Mourey et coll., non publié) qui présente un repliement caractéristique des déshydratases de type 2 afin de déterminer l’arrangement des deux segments entre eux. Nous avons ainsi réalisé les modèles structuraux pour les complexes déshydratases HadA-B (figure 36 C) et HadB-C (figure 36 D).
2.5.3. Alignements structuraux des enzymes de la biosynthèse des acides mycoliques sur la structure de mFAS-I
Nous avons effectué les alignements structuraux des différentes protéines impliquées dans la biosynthèse des acides mycoliques avec la structure du FAS-I de mammifère (mFAS-I) à l’aide du serveur Dali (http://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali_lite/start) (tableau 8). En première analyse, nous constatons que l’ensemble des protéines s’alignent sur leurs domaines enzymatiques de mFAS-I correspondant, y compris les modèles structuraux élaborés dans cette étude pour les complexes déshydratases HadA-B et HadB-C (tableau 8, figure 37). Les rmsd (root mean square deviation), calculés à partir des carbones anomériques Cα de l’ensemble des résidus alignés, se situent aux alentours de 3Å, ce qui indique, d’après les paramètres des algorithmes, une homologie de structure significative.
116
A
B
Figure 37 : Alignement structural des différentes protéines de la biosynthèse des acides mycoliques avec mFAS-I. A l’aide du serveur DALI (http://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali_lite/start), nous avons aligné les structures des différentes enzymes de la voie de biosynthèse des acides mycoliques sur la structure de mFAS-I (en gris) (d’après Maier et al., 2008). On distingue les structures des protéines suivantes : A et B : MabA (jaune), InhA (vert foncé), mtFabD (rouge) et les méthyltransférases (violet et bleu clair). A : KasA (Orange) et HadA-B (vert clair). B : KasB (bleu foncé) et HadB-C (beige).
117
Tableau 8 : Alignement structural des différentes protéines de la biosynthèse des acides mycoliques contre mFAS-I à l’aide du serveur Dalilite.
Protéine mtFabD mtFabH KasA KasB MabA HadA-HadB HadC-HadB InhA CmaA1 CmaA2 PcaA UmaA MmaA1 MmaA2 MmaA3 Hma
Z-score rmsd (en Å) 31 22.9 46.2 46.1 14.9 3.0 4.9 9.3 8.8 8.0 8.7 8.2 8.3 8.1 8.3 8.2
2,5 3.4 2,0 2.0 2.6 3.9 4.3 3.2 3.3 3.5 3.5 3.4 3.4 3.4 3.4 3.4
Alignement contre mFAS-I résidus alignés résidus totaux 279 269 380 387 189 123 146 137 128 127 127 126 126 127 127 130
314 329 415 415 223 273 280 268 270 292 261 284 284 286 277 277
%id séquence 20 17 25 25 17 9 12 12 13 16 13 17 15 16 17 10
MtFabD s’aligne sur le domaine malonyl-acétyl transférase (MAT) sur chacune des deux chaînes de l’homodimère mFAS-I avec un écart quadratique moyen (Cα rmsd) entre les carbones anomériques Cα de 2,5Å (Cα rmsd).
Les trois condensases dimériques mtFabH, KasA et KasB s’alignent (avec des Cα rmsd respectifs de 3,4, 2 et 2Å) sur les deux sous-unité enzymatiques kétoacyl synthase (KS) présentes sur les deux chaînes de mFAS-I. Pour chaque condensase, les deux monomères s’alignent de telle sorte que l’interface de dimérisation est reconstituée.
En ce qui concerne la réductase MabA, les alignements ont été effectués à partir de la structure tétramérique de cette enzyme mais également dimère par dimère (figure 15). L’alignement qui a eu la meilleure homologie structurale avec le domaine céto réductase (KR) est le dimère A-B qui interagit à l’interface α4α5 (figure 15). Maier et coll. avaient montré que l’interaction à l’interface α4β4 présente chez les cétoréductases bactériennes était reconstituée à l’aide du domaine ΨKR (Maier et al., 2008). Les deux monomères de MabA alignés sur KR et ΨKR sont en contact à cette même interface (figure 38A). De plus, la tyrosine Y153 qui fait partie de la triade catalytique de MabA (S140-Y153-K157), s’aligne de façon remarquable avec la tyrosine de mFAS-I (figure 38B). Cette observation renforce l’homologie structurale entre MabA et le domaine KR de mFAS-I.
118
Interface α4α5
A
B
Figure 38 : Alignement du dimère A-B de MabA sur le domaine enzymatique Kétoréductase (KR). A : Cet alignement structural montre que l’interface α4α5 est conservée entre MabA et KR. B : Les deux tyrosines des sites catalytiques de MabA et du domaine KR de mFAS-I sont alignées.
119
Nous avons pu aligner seulement la structure monomérique d’InhA sur mFAS-I. En effet, le domaine énoyl réductase (ER) a une homologie structurale faible avec son équivalent InhA dans le système FAS-II avec seulement 137 résidus alignés sur 268 et une faible identité de séquence (12%). Ceci correspond aux observations de Maier et coll. qui précisent que ce domaine enzymatique diffère structuralement entre mFAS-I et les enzymes bactériennes (Maier et al., 2008). Le monomère d’InhA s’aligne donc sur chacune des deux chaînes de mFAS-I. Toutefois, l’interface dimérique entre les deux monomères alignés ne correspond pas à l’une des deux formes dimériques d’InhA suggérant que la multimérisation d’InhA peut aussi servir à la multimérisation de plusieurs complexes FAS-II.
Les deux déshydratases HadA-HadB et HadC-HadB présentent des Cα rmsd de 3,9 et 4,3Å respectivement. Comme pour InhA, l’homologie est plus faible que pour les autres enzymes de FAS-II. Les deux complexes déshydratases s’alignent néanmoins sur le domaine déshydratase (DH) correctement sur chacune des deux chaînes de mFAS-I suggérant que notre modèle « d’hétérodimère fusionné » est cohérent. Quelque soit le complexe déshydratase (HadA-B ou HadC-B), une fois ces complexes alignés sur les deux chaînes, ils forment une structure asymétrique en double hotdog. Chaque simple hotdog est formé par un complexe HadA-B (ou HadB-C) identique. Les observations de formes hétérotétramériques des complexes HadA-B et HadB-C par Sacco et coll. en chromatographie d’exclusion et en DLS à 8°C avaient permis d’émettre l’hypothèse de formes hétérotétramériques qui reconstitueraient le site catalytique en double hotdog caractéristique de la famille de déshydratase 2 (Sacco et al., 2007a). Nos résultats d’alignements structuraux renforcent cette hypothèse.
En ce qui concerne les huit méthyltransférases, elles s’alignent avec une partie seulement du domaine ΨMT (figure 39). Les méthyltransférases sont composées de deux sous-domaines. Le premier, le « core », correspond au site de fixation de la SAM et comprend sept feuillets β. Il se situe en position N terminale. Le second, en position C terminale, correspond au site de fixation du substrat et est moins conservé d’une méthyltransférase à l’autre. On voit (figure 39), que les huit méthyltransférases s’alignent sur le « core » presque parfaitement et divergent au niveau du site de fixation du substrat. Ceci correspond aux observations de Maier qui a montré que seul le « core » était conservé dans la structure du domaine ΨMT (Maier et al., 2008).
120
CmaA1
MmaA1
PcaA
CmaA2
MmaA3
MmaA2
UmaA
Hma
Figure 39 : Alignements structuraux des huit méthyltransférases sur le domaine pseudo-méthyltransférase (ΨMT) de mFAS-I (en vert).
2.5.4. Validation et amélioration du modèle d’interactome de la biosynthèse des acides mycoliques chez Mtu
Nous avons aligné les enzymes du système FAS-II chez Mtu sur la structure de mFAS-I. La totalité de ces enzymes s’alignent sur le domaine catalytique de mFAS-I de même activité enzymatique. Deux combinaisons d’enzymes ont été alignées sur mFASI et ont permis d’obtenir un modèle de répartition dans l’espace des différents acteurs de la voie de biosynthèse des acides mycoliques. La première répartition concerne les enzymes qui interviennent dans le complexe E1-FAS-II en début d’élongation (MtFabD, KasA, MabA, InhA, HadA-B et les méthyltransférases qui interviennent en position distale) (figure 37A). La seconde est composée de celles qui interviennent dans le complexe E2-FAS-II en fin d’élongation (MtFabD, KasB, MabA, InhA, HadBC-B et les méthyltransférases qui interviennent en position proximale) (figure 37B). À partir de ces deux résultats, nous pouvons comparer cette répartition avec le réseau d’interactions que nous avons obtenu en double et triple hybride chez la levure et en Co-IP.
121
FabD
FabD
KasB
E2-FAS-II
PcaA HadB HadB HadC HadC
CmaA1 MmaA2 MmaA4 MabA MabA
MabA MabA
InhA
InhA
InhA
InhA
MabA MabA
MabA MabA
MmaA4 HadA HadA HadB HadB
MmaA2 MmaA3
E1-FAS-II
MmaA1 FabD
KasA
FabD
Figure 40 : Modèles d’interactome des enzymes de la voie de biosynthèse des acides mycoliques. On distingue une partie variable : HadA-B/mtFabD/KasA pour E1-FAS-II et HadB-C/mtFabD/KasB pour E2-FASII ; et une partie constante formée par les réductases MabA et InhA. Les méthyltransférases, qui interagiraient spécifiquement avec les complexes déshydratases, se répartissent entre E1-FAS-II et E2-FAS-II. Les flèches fines et noires montre le trajet que pourrait prendre le substrat du cycle FAS-II.
Veyron-Churlet et coll. ont proposé que les deux réductases MabA et InhA ainsi que la malonyl-CoA ACP transacylase mtFabD fassent partie du « core » de notre réseau d’interaction (Veyron-Churlet et al., 2004; Veyron-Churlet et al., 2005). Ce « core » interagirait spécifiquement avec les réductases et les déshydratases spécifiques de E1-FAS-I (KasA, HadA-B) et E2-FAS-II (KasB et HadB-C) qui formeraient la partie variable.
L’arrangement spatial obtenu, pour E1-FAS-I et E2-FAS-II peut se décomposer en deux sous ensembles : une partie constante comprendrait un dimère d’InhA, deux dimères de MabA et un hétérotétramère déshydratase. Une autre partie variable pourrait être composée de la condensase associée à mtFabD. Cependant, le complexe déshydratase se situe au dessus de la
122
condensase est pourrait être relié au second complexe en association avec KasA pour HadA-B et avec KasB pour HadB-C. Cette nouvelle répartition donnerait un complexe variable KasA/HadA-B/mtFabD (ou KasB/HadB-C/mtFabD) et un « core » constitué par les réductases (figure 40).
MtFabD n’est pas positionné dans le « core » comme cela avait été proposé dans le modèle du laboratoire. Ce positionnement dans la partie variable peut être cohérent avec notre réseau d’interactions. En effet, la structure de mFAS-I est flexible (Brignole et al., 2009) ce qui pourrait également être le cas de notre complexe. Le mouvement de la partie variable mettrait en contact mtFabD et les enzymes du « core ».
Les méthyltransférases sont positionnées au niveau de l’extérieur de la structure en contact avec la réductase MabA. La biosynthèse des acides mycoliques fait intervenir au moins six méthyltransférases et peut être huit. Il apparaît peu probable que des interactions permanentes avec les enzymes de FAS-II aient lieu. Les méthyltransférases interviendraient, comme nous l’avons montré, de façon contrôlées grâce à des interactions spécifiques avec HadA-B et HadB-C.
Le modèle de répartition dans l’espace des différentes enzymes de FAS-II que nous proposons présente deux larges « zones catalytiques » par système d’élongation (pour E1-FAS-II et pour E2-FAS-II). Elles comprennent la condensase (KasA ou KasB), le complexe déshydratase (HadA-B ou HadB-C), MabA et InhA. Nous pouvons envisager le chemin que prendrait un substrat entre les différentes enzymes (figure 40). MtFabD fournit du malonyl-ACP par contact direct avec la condensase. Par flexion de la structure, le substrat serait transféré à la réductase MabA puis au complexe déshydratase et enfin à InhA avant de recommencer un cycle. Avec un tel arrangement, nous pouvons imaginer un phénomène de « metabolic channeling » où les différentes enzymes se passent le substrat d’une sous-unité catalytique à l’autre par contact direct.
Les différentes méthyltransférases interviendraient au cours de l’élongation en perturbant le cycle normal de FAS-II et en introduisant la modification en position distale ou proximale après l’étape de déshydratation. Les quatre méthyltransférases MmaA1-4 interviendraient dans le complexe E1-FAS-II et PcaA, CmaA1, MmaA2 et MmaA4 seraient partie prenante de E2-FAS-II (figure 40). 123
Nous savons que les réductases MabA et InhA peuvent former des tétramères (CohenGonsaud et al., 2002; Marrakchi et al., 2002; Rozwarski et al., 1999). Il se pourrait que la tétramérisation de ces deux réductases entraîne la mise en commun de deux complexes d’élongation comme nous l’avons représenté sur la figure 40.
Comme cela est suggéré dans la littérature (Leibundgut et al., 2008), la méga-enzyme mFASI pourrait être le résultat de l’évolution à partir d’un système multi-protéique (FAS-II) à la suite d’évènements de fusion et/ou de duplication de gènes.
En regroupant nos données d’interactions protéine-protéine et le modèle structural de FAS-II obtenu par alignement sur mFAS-I, nous sommes en mesure de proposer un modèle original d’arrangement de notre interactome dans l’espace (figure 40).
124
3. Etude des interactions homotypiques essentielles des réductases MabA et InhA
125
La seconde partie de mes travaux se situe dans un contexte de recherche d’antituberculeux ciblant la biosynthèse des acides mycoliques et plus particulièrement l’interactome du système FAS-II. En effet, nous savons que la biosynthèse des acides mycoliques est essentielle à la survie des mycobactéries. Dans ce but, il est classiquement recherché de nouvelles enzymes cibles dont l’activité pourrait être inhibée par un nouvel antibiotique. Dans notre cas, nous cherchons de nouveaux inhibiteurs pour des protéines cibles déjà connues mais visant à détruire des interactions protéine-protéine essentielles. Il a été montré au laboratoire que la rupture des interactions homotypiques de la réductase MabA est létale pour le bacille (Veyron-Churlet et al., 2004) et des résultats préliminaires suggèrent qu'il en est de même pour la réductase InhA.
Le travail présenté dans ce chapitre vise à déterminer s’il y a corrélation entre la structure oligomérique de chacune de ces protéines, leur activité enzymatique in vitro et leur essentialité in vivo afin de prouver que les interfaces d'homomultimérisation des deux condensases peuvent représenter de nouvelles cibles pour de nouveaux antibiotiques. Dans un deuxième temps, nous nous sommes attachés à aller vers la détermination de la plus petite séquence peptidique dominante négative in vivo chez M.smegmatis qui pourrait servir de base à la conception d’un nouvel antituberculeux.
126
3.1. Structures et constructions de mutants des réductases MabA et InhA 3.1.1. Caractéristiques structurales de MabA et InhA
L’analyse structurale des protéines MabA et InhA a été réalisée en collaboration avec L. Mourey (IPBS-CNRS, Toulouse). MabA avait été cristallisée dans l’équipe avec une résolution de 2,03Å dans un groupe d’espace C2 et avec deux molécules dans l’unité asymétrique (Cohen-Gonsaud et al., 2002) et le structure d’InhA était connue. Elle avait été cristallisée avec une résolution de 2,8Å dans les groupes d’espace hexagonal P6222 et monoclinique C21 avec respectivement une et six molécules par unité asymétrique (Rozwarski et al., 1999). Les structures des deux réductases ont un repliement similaire avec un écart quadratique moyen de 1,44Å pour 163 atomes Cα. On distingue un feuillet β à 7 brins parallèles dont chaque face est flanquée par des hélices α caractéristiques de la famille de protéines SDR (Short chain Déshydrogénase/Réductase).
En solution, il a été suggéré que le degré d’homomultimérisation de MabA (25,7kDA) correspondrait à un équilibre entre une forme dimérique et une forme tétramérique (Marrakchi et al., 2002). Les données structurales obtenues au laboratoire nous montrent que MabA peut cristalliser sous forme tétramérique (quatre sous-unités identiques) (Cohen-Gonsaud et al., 2002). De même, la réductase InhA forme des tétramères en solution ce qui correspond aux données cristallographiques (Rozwarski et al., 1999). Pour ces deux enzymes, on distingue quatre sous-unités identiques (A, B, C et D) qui multimèrisent principalement grâce à des interactions hydrophobes et quelques interactions polaires. On distingue deux types d’interfaces : au niveau des hélices α4 et α5 (interface α4α5) et au niveau de l’helice α6 et du feuillet β7 (interface α6β7) qui représentent les zones de contact entre les deux types de dimères. On distingue les dimères de type A-B ou D-C (dimères équivalents) et les dimères de type A-D ou B-C (dimères équivalents) (Figure 41). Pour MabA, les dimères A-B (ou D-C) sont des dimères cristallographiques et les dimères A-D (ou B-C) sont des dimères noncristallographiques.
L’identification de résidus qui, après mutation, pourraient amener à la perturbation des interfaces d’homomultimérisation sans affecter la structure tertiaire des réductases a été réalisée à partir des coordonnées cristallographiques de MabA (D. Zerbib et L. Mourey)
127
(Veyron-Churlet et al., 2004) et d’InhA (Rozwarski et al., 1999). Ainsi, afin d’étudier la multimérisation de ces protéines, des mutants ont été réalisés au laboratoire par mutagenèse dirigée. Les mutations introduites avaient pour but de rompre l’homomultimérisation au niveau soit de l'interface α4α5, soit de l'interface α6β7, soit des deux.
N N
C
C α5 α5
α4
α5 α5
α4
α4
InhA Interface α4-α5 "dimère" A-B
Surface accessible MabA Interfaceenfouie α4-α5à l’interface
"dimère" A-B cristallographique
A
α4 α5
α6 β7
D
α4
B α6 β7
α4 α5
C
N α6 C
α6 β7
β7 β7
β7
C
α6
α6 N
InhA Interface α6-β7 "dimère" A-D
MabA Interface α6-β7 "dimère" A-D non-cristallographique
Figure 41 : Les interfaces d’interaction des réductases MabA et InhA. Les dimères A-D et B-C interagissent à l’interface α4α5 et les dimères A-B et D-C interagissent à l’interface α6β7.
128
3.1.2. Mutations aux interfaces d’interaction de MabA (Veyron-Churlet et al., 2004)
À l’interface α4α5 de MabA, l’atome Cα de la glycine 162 (hélice α5) est en contact de Van der Waals avec l ‘atome Cβ de l’alanine 158 situé sur l’hélice α5 de l’autre sous-unité. Cette interaction devrait être perturbée par n’importe quel autre acide aminé autre que l’alanine. La glycine 162 a donc été remplacée par une leucine (mutation G162L) pour obtenir le mutant MabAG162L (figure 42).
Au niveau de l’interface α6β7, un pont salin est formé entre le groupe carboxyle de l’acide aspartique 228, présent dans une courte hélice entre α6 et α7, et les atomes NH1 et NH2 de l’arginine 34 sur l’hélice α1 de l’autre sous-unité. La mutation de l’acide aspartique 228 en arginine (D228R) devrait se faire au détriment de la stabilité de cette interface. Le mutant MabAD228R (figure 42) devrait donc ne plus multimériser à cette interface car l’arginine devrait provoquer de fortes incompatibilités stériques.
Un double mutant aux deux interfaces comprenant les deux mutations précédentes a également été construit : MabAG162L-D228R ou MabADM. Pour ce mutant, les interactions aux deux interfaces pourraient être rompues.
3.1.3. Mutations aux interfaces d’interaction d’InhA
La même approche a été adoptée pour InhA. La position de la glycine 162 de MabA est occupée par une sérine (Ser170) à l’interface α4α5 (figure 42). La chaîne latérale de cet acide aminé vient s’insérer dans une poche constituée des chaînes latérales des résidus voisins : Arg173 et Phe174 de la même hélice et Thr162, Val163, Ser166 et Ala197 de l’hélice α correspondante sur l’autre sous-unité. Le remplacement de Ser170 par une lysine a été choisi afin de déstabiliser cette interaction. On obtient le mutant InhAS170K.
Les alanines en position 244 sur les hélices α6 de deux sous-unités d’InhA se font face à l’interface α6β7. La mutation de l’alanine 244 en un résidu plus grand devrait provoquer des conflits stériques importants. Le mutant A244L (remplacement de l’alanine par une Lysine en position 244) a ainsi été construit pour donner le mutant InhAA244L (figure 42). 129
Un double mutant aux deux interfaces a également été réalisé : InhAS170K-A244L ou InhADM. Ce mutant ne devrait plus multimériser aux deux interfaces d’interaction.
α1
β1
α3
α4
β2
β4
β3
α4
β5
α5
β6
A
L
α6
β7
R
MabA
α1
β1
β3
α3
β2
α2
α4
β4
α4
α5
β5
B
K
β6
α6
L
β7
R
InhA
Figure 42 : Structures secondaires et tertiaires des réductases MabA et InhA avec les positions des différentes mutations. A : MabA, B : InhA. En jaune les feuillets β et en marron les hélices α. Les mutations et les acides aminés introduits dans les mutants sont en rouge dans la séquence.
130
3.2. Résultats préliminaires et objectifs 3.2.1. Résultats préliminaires et objectifs pour MabA
Il a été montré en double hybride chez la levure (tableau 9) et co-immunoprécipitation (Veyron-Churlet et al., 2004) que la protéine MabAWT interagissait avec les mutants MabAG162L et MabAD228R et n’interagissait pas avec le double mutant MabADM. De plus, le gène mutant mabAG162L, lorsqu'il est apporté en trans dans une mycobactérie sauvage est dominant négatif, c'est-à-dire que son expression est létale pour la bactérie. Le gène mabAD228R n'est dominant négatif qu'à haute température (42°C). Les gènes sauvages, et le double mutant ne le sont pas (tableau 10). Tableau 9 : Analyse en double hybride des interactions entre la protéine MabA sauvage et les protéines mutantes (Veyron-Churlet et al., 2004).
BD Fusion AD Fusion
mabAWT mabAWT
+++
mabAG162L
+
mabAD228R
+
DM
mabA
-
Nous obtenons des interactions fortes (+) ou nulles (-) (suivant la méthodologie décrite dans le paragraphe 2.1). La colonne « AD fusions » correspond aux gènes clonés dans le vecteur pGAD-T7 et la ligne « BD fusions » aux gènes clonés dans le vecteur pGBK-T7.
Par ailleurs, le même genre d’expériences ont été menées avec l’allèle mabAY185L qui a été montré comme étant très affecté dans son activité (28% de l’activité du sauvage) mais capable de multimérisation (Ducasse-Cabanot et al., 2004). L’allèle mabAY185L n’est pas dominant négatif. L’effet dominant négatif observé pour l’allèle mabAG162L n’est donc pas le résultat d’une déviation du substrat ou du cofacteur NADPH de MabA sauvage qui provoquerait un arrêt de la biosynthèse des acides mycoliques. L'hypothèse émise est que la protéine MabAG162L (théoriquement dimérique) interagirait avec la protéine MabA sauvage endogène et formerait un complexe inactif in vivo.
131
Tableau 10 : Dominance négative (37°C) dans M.tuberculosis et activité des protéines MabA sauvage et mutantes (Veyron-Churlet et al., 2004).
.
Dominance Négative
Activité
MabAWT
Non
+
MabAG162L
Oui
-
MabAD228R
Non (Oui à 42°C)
Résiduelle
Non
-
MabADM
Enfin, une expérience préliminaire effectuée avec des protéines purifiées en faible quantité (de l’ordre du milligramme de protéines par millilitre) suggérait que les protéines mutantes étaient inactives in vitro à l'exception du mutant MabAD228R qui présentait une activité enzymatique résiduelle (tableau 10).
Ces premiers résultats suggèrent que la dimérisation à l’interface α4α5 (théoriquement rompue pas la mutation G162L) est nécessaire pour que la réductase soit active in vitro. De plus, la rupture de la dimérisation à cette interface semble avoir un effet majeur sur la viabilité des mycobactéries. Dans cette partie, nous allons voir, en ce qui concerne la protéine MabA, s’il existe une corrélation entre le degré de multimérisation de MabA, son activité enzymatique et les résultats obtenus dans les tests de dominance négative.
Pour se faire, nous avons : Purifié les différentes protéines (sauvages et mutantes) en grande quantité Réalisé des tests enzymologiques pour contrôler l’activité des protéines sauvages et regarder l’activité des protéines mutantes. Vérifié le degré de multimérisation de chaque protéine en chromatographies d'exclusion analytiques ou par des approches structurales.
3.2.2. Résultats préliminaires et objectifs pour InhA
Des résultats préliminaires à ma thèse ont été obtenus au laboratoire. Les données de dominance négative (tableau 11) nous montrent que l’introduction dans la mycobactérie des protéines InhAS170K et InhADM est létale. Ces deux protéines viendraient interagir avec la protéine sauvage (tableau 12). Ce résultat diffère de celui obtenu avec MabA. Si la protéine 132
InhADM interagit avec InhA sauvage, cela peut signifier que la mutation A244L ne rompt pas la multimérisation à l’interface α6β7. À partir de cette hypothèse, nous avons défini une nouvelle mutation à l’interface α6β7 dans l’objectif de perturber l’interaction plus efficacement qu’avec la mutation A244L. Il s’agit de la mutation A252R. Les résultats obtenus suite à cette mutation seront présentés au chapitre 3.4.
Il faut également noter que, comme pour la protéine MabA, il semblerait que la dimérisation à l’interface α4α5 (théoriquement rompue par la mutation S170K) joue un rôle majeur dans la viabilité des mycobactéries.
Tableau 11 : Dominance négative (37°C) dans M.smegmatis et activité des protéines InhA sauvage et mutantes
.
Dominance Négative
InhAWT
Non
InhAS170K
Oui
InhAA244L
Non
InhADM
Oui
Tableau 12 : Interactions entre la protéine InhA sauvage et les protéines mutantes
BD Fusion AD Fusion
inhAWT inhAWT
+++
inhAS170K
+
inhAA244L
+
inhADM
+
Nous obtenons des interactions fortes (+) ou nulles (-) (suivant la méthodologie décrite dans le paragraphe 2.1). La colonne « AD fusions » correspond aux gènes clonés dans le vecteur pGAD-T7 et la ligne « BD fusions » aux gènes clonés dans le vecteur pGBK-T7.
133
Les objectifs de ce travail, en ce qui concerne la protéine InhA, seront : La construction par mutagenèse dirigée d'une nouvelle protéine mutante à l’interface α6β7. Le test de la dominance négative pour les nouveaux gènes mutants construits. L’analyse des interactions protéine-protéine de ces protéines mutantes contre la protéine sauvage (en double hybride chez la levure). La purification des protéines InhA sauvage et mutantes en grande quantité. L’analyse en chromatographie d'exclusion de leur degré de multimérisation. L’activité enzymatique, in vitro, de la réductase InhA et de ces mutants n’a pas été testée ici. Nous n’avons pas, pour l’instant, effectué ces travaux au laboratoire.
134
3.3. Etude de la protéine MabA 3.3.1. Purification
3.3.1.1.
Surexpression
Les allèles mabAWT, mabAG162L, mabAD228R et mabADM ont été clonés dans le vecteur pET15b, vecteur de surexpression chez E.coli. Les différents gènes sont sous le contrôle du promoteur T7 inductible à l’IPTG. La qualité de la surexpression est évaluée par analyse de lysats totaux de culture avant et après induction sur gel SDS-PAGE. On réalise les extraits protéiques à partir des culots de cultures induites (cf. Matériels et méthodes). Des études préliminaires nous ont permis de voir que seules les protéines MabAWT et MabAG162L sont solubles en absence de détergent. Pour cette raison, nous utiliserons du triton X100 à une concentration finale de 1% dans tous les extraits. Les cellules sont lysées à l’aide de lysozymes en présence de DNAse et de RNAse. Le lysat est clarifié par centrifugation. On analyse le lysat avant et après centrifugation sur gel SDS-PAGE afin d’évaluer la solubilité des protéines. Les deux protéines MabAWT (figure 43) et MabAG162L (résultats non montrés) sont parfaitement solubles après extraction. La solubilité pour les protéines MabAD228R et MabADM (résultats non montrés) est inférieure à celle des deux autres protéines mais reste suffisante pour passer à l’étape de purification.
3.3.1.2.
Purification
Les protéines des différents extraits vont être purifiées sur colonne par chromatographie d’affinité. Les différents allèles (mabAWT, mabAG162L, mabAD228R et mabADM) ont été clonés en fusion avec un "tag" histidine en position N-terminale. Cette fusion entraîne une affinité de la protéine étiquetée pour le Nickel et donc pour la résine Nickel-agarose (NiNTA Pharmacia®). La protéine sera ensuite éluée par un tampon concentré en Imidazole par compétition.
135
NF
Rinçage Elution
A E NF
Rinçage
Elution
B 1
2
3
4
MabADM
C Figure 43 : Purification de la protéine MabAWT sur colonne NiNTA. A : Courbe bleue : suivi de la DO à 280nm, courbe verte : Steps d’Imidazole. B : Analyse SDS-PAGE des fractions en sortie de colonne, on distingue l’extrait (E) que l’on charge sur la colonne, la fraction non fixée (NF), les fractions de rinçage, et les fractions d’élution. C : Ultrafiltration de la protéine MabADM. 1: MabADM avant ultrafiltration ; 2: Prestained Protein Marker© ; 3: MabADM après ultrafiltration ; 4: Filtrat.
136
Tableau 13 : Dosage des protéines MabA sauvage et mutantes par la méthode de Bradford
WT G162L D228R DM
DO (à 595nm)
[éq. BSA] réelle en mg/ml
0,404 0,268 0,348 0,297
12,52 8,31 5,39 4,60
Les protéines sont purifiées sur colonne NiNTA de 20mL couplée au système ÅKTAFPLCTM. La densité optique à 280nm est suivie en temps réel et les fractions obtenues après purification sont analysées sur gel SDS-PAGE. La figure 43 présente les résultats obtenus avec la protéine MabAWT. On a constaté que les protéines MabAWT et MabAG162L (résultats non montrés) sont très concentrées après purification (tableau 13). En ce qui concerne les protéines MabAD228R et MabADM (résultats non montrés), le rendement de purification était moins élevé. Ceci pourrait être la conséquence directe du fait que les extraits de départ soient moins concentrés.
Afin d’obtenir une concentration de l’ordre de la dizaine de milligrammes par millilitre pour MabAD228R et MabADM, nous avons concentré les fractions de protéines obtenues en chromatographie d’affinité grâce au procédé d’ultrafiltration Vivaspin® 3.000mwco (molecular weight cut off). On analyse sur gel SDS-PAGE avant et après concentration (figure 43). La protéine est concentrée 5 à 6 fois. Les concentrations finales obtenues de 5,39g/mL pour MabAD228R et de 4,60 mg/mL pour MabADM sont maintenant suffisantes pour la suite de notre étude (tableau 13).
3.3.2. Activité des protéines MabA sauvage et mutantes
3.3.2.1.
Cinétique de la protéine MabAWT
On réalise les mesures d’activité en présence de la protéine MabAWT à des concentrations allant de 100 à 2000nM, de son substrat C4-CoA et de son cofacteur NADPH. L’activité de MabA est mesurée grâce à son pouvoir de réduction des β-céto-acyls couplée à l’oxydation des NADPH en NADP+. La densité optique (DO) est suivie à 340nm. Le NADPH absorbe à cette longueur d’onde alors que le NADP+ n’absorbe pas à 340nm (figure 44). Ainsi, nous allons observer une décroissance de la DO. Plus la pente sera forte, plus l’activité sera
137
importante. Il est à noter que l'on utilise ici un substrat en C4 alors que, in vivo, MabA utilise des substrats qui sont au moins en C18. En effet, ces substrats ne sont pas disponibles commercialement et nécessitent une synthèse chimique longue et coûteuse. L’activité mesurée est plus faible avec des substrats C4-CoA qu'avec les substrats naturels mais ce test a montré son utilité pour les études comparatives in vitro (Marrakchi et al., 2002). Les vitesses initiales (en µmol de NADPH oxydés/min/mg de MabA) sont déterminées.
NAD(P)H o
NAD(P)+
o
OH
O
MabA S-CoA
S-CoA
β-acetoacyl-CoA
β-Hydroxyacyl-CoA NAD(P)H absorbe à 340nm
Figure 44 : Schéma de la réaction enzymatique de MabA. La DO est suivie à 340nm, longueur d’onde à laquelle le co-facteur NADPH absorbe.
UDO/min = f([WT] 0,12
UDO/min
0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0
500
1000
1500
2000
2500
[MabA WT] en nM
Figure 45 : Activité de MabAWT (en unité de DO/min) en fonction de la concentration en protéines (en nM)
MabAWT a une cinétique de type Michaëlienne (Marrakchi et al., 2002). On étudie la cinétique de l’enzyme MabAWT en déterminant la courbe d’activité (en unité de DO/min) en fonction de la concentration en protéines (en nM) (Figure 45) dans nos conditions d’expériences (cf. Matériels et Méthodes). Dans nos différents tests d’activités, nous nous 138
placerons à une concentration en protéines qui correspond à la concentration minimale de MabA pour laquelle l’activité est maximale. D’après nos résultats, cette concentration est déterminée à 800nM.
3.3.2.2.
Tests d’activité (figure 46, tableau 14)
La protéine MabA sauvage est bien active et les vitesses obtenues sont comparables à celles obtenues précédemment au laboratoire (Marrakchi et al., 2002). La protéine MabADM est inactive et les protéines MabAD228R et MabAG162L présentent une activité résiduelle. Il est à noter que pour les protéines mutantes, nous avons réalisé les tests d’activité à une concentration en protéine de 8µM (au lieu de 800nM pour la protéine sauvage) afin d’observer les activités résiduelles. Contrairement au résultat préliminaire obtenu, une seule fois, avec des protéines purifiées en petite quantité, il n’y a pas de différence d’activité entre les deux simples mutants. L’activité résiduelle est très faible et peut être considérée comme nulle.
MabA WT
0,550
0,500
UDO (à 430nM)
0,500
UDO (à 430nM)
MabA G162L
0,550
0,450 0,400 0,350
0,450 0,400 0,350
0,300
0,300 2,0
1,0
1,0
3,0
MabA D228R
0,550
3,0
2,0
3,0
MabA DM
0,550 0,500
UDO (à 430nM)
0,500
UDO (à 430nM)
2,0 Temps (min)
Temps (min)
0,450 0,400 0,350
0,450 0,400 0,350
0,300
0,300 2,0
1,0
3,0
1,0 Temps (min)
Temps (min)
Figure 46 : Tests d’activité de MabAWT et des trois mutants MabAG162L, MabAD228R et MabADM. On mesure la DO à 340nm en fonction du temps.
139
Tableau 14 : Pentes et vitesses initiales obtenues lors de la mesure d’activité pour MabA sauvage et mutants
WT
MabA G162L MabA D228R MabA DM MabA
Pente (UDO/min) -0,072
Vini (µmol NADPH oxydés/min/mg de MabA)
-0,0078 -0,0058 0,0002
0.0058 0.0043 0,00
0.54
Ces résultats (tableau 14) montrent que les mutants de MabA qui présentent une seule mutation à l’une des deux interfaces ont une activité résiduelle et que le double mutant est inactif. Nous pouvons émettre l’hypothèse que les effets de dominance négative observés pourraient être dus à la formation de complexes sauvage/mutant. Ces complexes seraient inactifs, ce qui inhiberait la voie de biosynthèse des acides mycoliques, rendant impossible la croissance bactérienne.
3.3.3. Chromatographie d’exclusion
Dans le but de déterminer le degré de multimérisation des quatre protéines, nous allons réaliser des chromatographies d'exclusion par filtration sur gel. Dans une colonne de chromatographie d'exclusion, ce sont les protéines de plus haut poids moléculaire qui sont éluées en premier. Nous allons utiliser une colonne Superdex 75 commerciale qui exclue théoriquement les protéines qui ont un poids moléculaire supérieur à 75kDa et une colonne Superdex 200 qui exclue les protéines qui ont un poids moléculaire supérieur à 200kDa.
3.3.3.1.
Calibrations
La colonne S75 a été calibrée avec du dextran (MW : 2.106 kDa, molécule exclue), de l’olvabumine (MW : 43000 kDa), du chymotrypsinogene A (MW : 25 000 kDa) et de la RNAse (MW : 13 700 kDa) (figure 47, graphes non montrés). La colonne S200 a été calibrée avec du dextran (MW : 2.106 kDa, molécule exclue), de la catalase (MW : 232000 kDa), de l’aldolase (MW : 158000 kDa), de la BSA (MW : 67000
140
kDa), de l’olvabumine (MW : 43000 kDa), du chymotrypsinogene A (MW : 25 000 kDa) et de la RNAse (MW : 13 700 kDa) (figure 47, graphes non montrés).
y = -7,3222x + 42,78 R2 = 0,9168
Calibration S75 14 12 log(MW)
10 8 6 4 2 0 4
4,2
4,4
4,6
4,8
Volum e d'élution (em m L)
y = -5,6877x + 45,997 R2 = 0,9839
Calibration S200 Volume d'élution (em mL)
25 20 15 10 5 0 4
4,5
5 log(MW)
Figure 47 : Calibrations des colonnes de gel filtration S75 et S200.
141
5,5
Les calibrations semblent correctes car on observe une relation de linéarité entre le volume d’élution et le logarithme du poids moléculaire. À partir de ces courbes, nous pourrons déterminer approximativement le poids moléculaire des protéines étudiées et par déduction leur degré probable de multimérisation.
3.3.3.2.
-
Gel filtration
Superdex 75
Les premiers résultats obtenus en gel filtration analytique sur la colonne Superdex 75 nous montrent que dans ces conditions les protéines MabAWT et MabAG162L sont éluées au même volume (~8mL, environ 60kDa) et les protéines MabAD228R et MabADM sont éluées à un volume supérieur (~9.5mL, environ 30kDa) (tableau 15, figure 48). On peut en conclure que l’on a deux états d’homomultimérisation différents. MabAWT et MabAG162L seraient sous forme de dimères (poids moléculaire théorique 51.4kDa) et MabAD228R et MabADM sous forme de monomères (poids moléculaire théorique de 25.7kDa). Nous n’observons pas, dans ces conditions in vitro, MabA sauvage sous forme de tétramère. Enfin, MabAD228R semble être monomérique dans ces mêmes conditions ce qui indiquerait que la mutation D228R agit sur les deux interfaces de multimérisation.
Tableau 15 : Volume d’élution et poids moléculaires probables pour les protéines MabA sauvage et mutantes à l’aide de la colonne S75 Protéine
VE (en mL)
MW (en Da)
MabA WT G162L D228R DM
8,02 8,02 9,52 9,79
55873,7 55873,7 34861,9 32024,1
-
Superdex 200
Les résultats obtenus en gel filtration avec la colonne S200 (tableau 16, figure 48) pour les protéines MabA sauvage et mutantes sont différents des résultats obtenus précédemment. La protéine MabAWT semble tétramérique (VE=17,19mL, MW=116kDa) conformément aux données cristallographiques (Cohen-Gonsaud et al., 2002). De façon surprenante, MabAG162L
142
est éluée à un volume correspondant à un poids moléculaire équivalent à une forme tétramérique (VE=17,57mL, MW=100kDa). MabAD228R (VE=19,85mL, MW=40kDa) ainsi que MabADM (VE=20,48mL, MW=30kDa) sont éluées à un volume supérieur. Leur degré d’homomultimérisation est donc inférieur aux deux autres protéines.
A
Gel Filtration S75 MabAWT 8,02mL
MabAG162L 8,02mL
MabAD228R 9,52mL
B
MabADM 9,79mL
Gel Filtration S200
MabAWT 17,19mL
MabAG162L 17,57mL
MabADM 20,48mL
MabAD228R 19,85mL
Figure 48 : Chromatographie d’exclusion des protéines MabA sauvage et mutantes. A : Gel filtration sur colonne Superdex S75. B : Gel filtration sur colonne Superdex S200.
143
Tableau 16 : Volume d’élution et poids moléculaires probables pour les protéines MabA sauvage et mutantes à l’aide de la colonne S200 Protéines MabA WT MabA G162L MabA D228R MabA DM
VE (en mL)
MW (en Da)
17,19 17,57 19,85 20,48
116088,4 99535,5 39547,0 30644,2
Les poids moléculaires obtenus en gel filtration sont approximatifs car le calibrage est donné pour des molécules globulaires. Nous ne pouvons donc en déduire uniquement des ordres de grandeur et dans notre cas des degrés de multimérisation. Contrairement à notre hypothèse de départ, la mutation G162L à l’interface α4α5 ne semble pas rompre la multimérisation.
Nous avons également testé en gel filtration analytique différents mélanges de protéines. Les résultats obtenus (tableau 17, graphes non montrés) nous montrent que le mélange WT/G162L est élué à un même volume (17,9mL) probablement sous forme de tétramères. De façon intéressante, les mélanges MabAWT/MabAD228R et MabAWT/MabADM présentent deux volumes d’élution correspondant à deux états de multimérisation différents.
Tableau 17 : Volume d’élution et poids moléculaires probables pour les mélanges des protéines MabA sauvage et mutantes à l’aide de la colonne S200 Protéines WT + G162L WT + DD28R WT + DM
VE (en mL) 17,9 17,21 + 19,75 17,25 + 20,02
MW1
MW2
87088 87088 115152 41180,8 113303 36916,8
Ces résultats sont intéressants. Le mélange WT/G162L nous montre que le mutant à l’interface α4α5 n’interfère pas sur le degré de multimérisation de la protéine sauvage. L’interaction entre ces deux protéines ne semble pas conduire à des formes agrégées. Il pourrait y avoir formation d’hétérotétramères inactifs qui entraîneraient l’arrêt de la biosynthèse des acides mycoliques et la mort du bacille. Par ailleurs, la protéine sauvage mélangée aux deux autres mutants (D228R et DM) conserve son degré de multimérisation tétramérique. Elle ne semble pas former d’hétéromultimère et donc devrait conserver son activité. L’absence de dominance négative pour ces deux mutants en découlerait.
144
3.3.4. Structure du mutant MabAG162L
Afin de poursuivre notre étude et d’essayer de comprendre l’effet de la mutation G162L à l’interface α4α5 (qui ne semble pas rompre la multimérisation mais qui a un effet dominant négatif) nous avons tenté de résoudre la structure cristallographique de ce mutant. La protéine MabAG162L a cristallisé dans du tampon HEPES 0.1M pH7.4 additionné de citrate de sodium (NaCitrate 0.8M) comme agent précipitant (figure 49A). Les cristaux sont envoyés pour analyse au Synchrotron (ESRF synchrotron, Grenoble). Lors de la diffraction, les cristaux se sont révélés fragiles et nous n’avons pu obtenir une résolution supérieure à 4Å. La fragilité des cristaux est un premier élément quant à l’effet de la mutation sur la structure de la réductase. Nous observons 2 molécules dans l'unité asymétrique. Le groupe d'espace est P6122. Les deux autres molécules du tétramère sont générées par un axe d'ordre 2 cristallographique. À partir de la structure de MabAWT (Cohen-Gonsaud et al., 2002), nous avons pu déterminer les éléments de structure secondaire de MabAG162L (figure 49B). Nous pouvons ainsi voir que nous avons un « décalage » du dimère D-C par rapport au dimère A-B en comparaison avec la structure de la protéine sauvage. Sans pouvoir tirer de conclusions précises quand aux modifications structurales entre la réductase sauvage et la mutante, ces données cristallographiques montrent que la mutation G162L affecte l’interaction homotypique à l’interface α4α5. Ces résultats vont dans le sens de l’importance de la multimérisation à l’interface α4α5. La mutation G162L entraînerait une interaction modifiée à cette interface. Il se pourrait qu’une multimérisation correcte à cette interface soit nécessaire à l’activité de la réductase. La protéine MabAG162L viendrait interagir avec MabAWT endogène lorsqu’on la surproduit dans la mycobactérie. Elle formerait ainsi des complexes sauvage/mutant où l’interface α4α5 serait perturbée sans être rompue.
145
A
Interface α4α5
B Figure 49 : Mutant MabAG162L. A : Cristaux de MabAG162L. B : Alignements des structures tétramériques de MabAWT (jaune) et de MabAG162L (bleu).
3.3.5. Conclusions Mon travail de thèse a permis de purifier en grande quantité les protéines MabAWT, MabAG162L, MabAD228R et MabADM après résolution des problèmes de solubilité pour MabAD228R et MabADM. Les tests d’activité in vitro ont montré que seule la protéine sauvage présentait une activité significative. Les analyses de MabAWT en chromatographie d’exclusion montrent que la protéine sauvage est bien tétramérique comme cela est décrit dans la littérature (Cohen-Gonsaud et al., 2002). Les études cristallographiques de la protéine
146
mutante MabAG162L n’ont pas permis de résoudre la structure du mutant à une définition suffisante mais montrent cependant que celui-ci est tétramérique. Ceci est en accord avec les expériences de gel filtration où ce mutant est élué à un volume qui correspond au poids moléculaire d’une protéine tétramérique comme pour MabAWT. Par ailleurs, les données structurales montrent également que la structure de l’interface α4α5 est altérée par rapport à celle de la protéine sauvage. Nous n’avons pas confirmé notre hypothèse de départ quant au degré de multimérisation de MabAG162L. Nous nous attendions à une forme dimérique suite à la rupture de l’interaction à l’interface α4α5. Cependant, même si la tétramérisation est conservée, une interaction correcte de l’interface α4α5 semble apparaître comme étant essentielle à l’activité de MabA. Ces résultats font de cette interface une cible pour une molécule qui viendrait perturber l’interaction en la désorganisant.
Les analyses en chromatographie d’exclusion révèlent un état monomérique pour le mutant MabAD228R. Nous pouvons penser que cette mutation déstabilise les deux interfaces. En effet, les hélices α6 et α5 sont très proches dans l’espace. Ces résultats sont contradictoires avec les tests d’interactions protéine-protéine qui montrent qu’il y a interaction entre ce mutant et la protéine sauvage. Cependant, le test d’interaction en double hybride chez la levure entre MabAD228R et lui-même avait été réalisé au laboratoire (Romain Veyron-Churlet, Thèse de l’UPS, 2005) et nous montre que MabAD228R n’interagit pas avec lui-même. Ceci est en accord avec l’existence d’une forme monomérique de MabAD228R. On peut donc émettre l’hypothèse que la multimérisation de l’interface α4α5 est rompue entre deux unités de MabAD228R mais est toujours possible entre une unité MabAWT et une unité MabAD228R.
Même si nous n’avons pas démontré que le degré de multimérisation était directement lié à l’activité de la protéine in vitro et aux résultats de dominance négative in vivo, il semblerait que l’interface α4α5 joue un rôle décisif dans la biosynthèse des acides mycoliques. Nous pouvons penser que la protéine MabAG162L vient interagir in vivo avec la protéine sauvage pour former un hétéro-téramère inactif car altéré à l’interface α4α5. Par ailleurs, l’absence d’effet de dominance négative à 37°C pour la protéine MabAD228R pourrait s’expliquer par la formation d’hétéro-dimères (mutant/sauvage) pour lesquels l’interface α4α5 serait conservée. Cet hétéro-dimère serait donc actif in vivo. Quant à MabADM, muté aux deux interfaces, il n’interagirait pas avec MabA in vivo et la protéine sauvage fonctionnerait normalement, d’où la survie en dominance négative (figure 50).
147
+
WT
WT
WT
α4 WT α5 WT α6 β7
α6 β7
Tétramère Actif
+
G162L
WT α4 α5G162L α6 β7 α6 β7 WT α4 G162L α5
WT α4 WT α5
WT
+
Tétramère Inactif
WT
D228R
+
DM
α4 WT α5 WT WT α4 D228R α5
Dimère Actif
α6 β7
α6 β7
+
DM
WT α4 WT α5
Tétramère Actif
Figure 50 : Modélisation des interactions entre MabAWT, MabAG162L, MabAD228R et MabADM ainsi que l’activité probable des complexes ainsi formés. L’interface notée en rouge pour l’hétérotétramère MabAWT/MabAG162L correspond à une interaction entre les deux sous-unités altérée.
148
Nos résultats tendent à démontrer que l’homo-multimérisation de la protéine MabA à l’interface α4α5 joue un rôle important dans l’activité de la réductase et donc dans la survie des mycobactéries. Il semblerait que la multimérisation à l’interface α6β7 ne soit pas essentielle car l’hétéro-dimère MabAWT-MabAD228R semble actif in vivo. Nous savons que MabA appartient à la famille des SDR (Short chain Déhydrogenase/Réductase), or, il a été montré que certaines enzymes appartenant à cette famille cristallisaient sous forme dimérique et que l’interface α4α5 y est conservée (Grimm et al., 2000). Dans le même sens, les alignements structuraux entre MabA et mFAS-I montrent que les motifs de l’interface α4α5 sont conservés chez mFAS-I (Chapitre 1.1.3). De plus, les données du laboratoire suggèrent qu’il y un équilibre dimère/tétramère in vitro (Marrakchi et al., 2002). Nous pouvons donc affirmer que le dimère A-B, pour lequel l’interaction à l’interface α4α5 est conservée, serait le dimère actif in vivo. Ces résultats nous confirment dans l’idée que la perturbation de cette interface à l’aide d’un peptide, ou d’un peptidomimétique, est une voie intéressante dans la conception d’un nouvel antibiotique antituberculeux.
149
3.4. Etude de la protéine InhA
3.4.1. Construction du mutant A252R
Nous avons vu dans l’introduction de ce chapitre que la mutation A244L ne semblait pas rompre l’interaction entre le mutant à l’interface α6β7 (InhAA244L) et la protéine InhA sauvage. Nous avons donc construit une autre mutation à cette intrface d’interaction : La mutation A252R (Arginine remplacée par une Lysine au niveau du codon 252) est introduite dans la séquence des gènes inhA sauvages et mutants (inhAWT, inhAS170K, inhAA244L et inhAS170K-A244L) par mutagenèse dirigée afin d’obtenir les allèles inhAA252R, inhAS170K-A252R, inhAA244L-A252R et InhAS170K-A244L-A252R (inhATM). Le codon 252 se trouve à l’interface α6β7 et la mutation a pour but de rompre la multimérisation au niveau de cette interface car nous suspectons que la mutation A244L est inefficace (figure 42).
Nous avons construit douze vecteurs. Les huit dérivés de pGAD-T7 et pGBK-T7 seront utilisés pour les études en double hybride chez la levure. Les quatre dérivés de pMV261 serviront à l'étude du caractère dominant négatif de ces mutations chez les mycobactéries. Quant au quatre dérivés de pET15b, nécessaires à la surproduction et la purification des variants de InhA, ils ont été construits par Géraldine Ducret au laboratoire.
3.4.2. Dominance négative
Des Minipréparations d’ADN sont réalisées à partir des souches E.coli DZ137 contenant les plasmides pMV261::inhAWT, pMV261::inhAS170K, pMV261::inhAA244L, pMV261::inhAA252R, pMV261::inhAS170K-A244L,
pMV261::inhAS170K-A252R,
pMV261::inhAA244L-A252R
et
pMV261::inhATM. Ces différents vecteurs sont ensuite transformés par électroporation dans des cellules de M.smegmatis compétentes. Une fois transformées, les bactéries sont étalées sur milieu sélectif à 37°C pendant une semaine. La dominance négative est avérée pour l’expression des allèles inhAS170K, inhAS170K-A244L et inhAS170K-A252R. Un effet significatif est observé pour l’expression de l’allèle inhAA244-A252R. Pour les autres allèles, l’expression des protéines in vivo n’est pas létale pour la mycobactérie
150
(tableau 18). Il semblerait que la mutation à l’interface α4α5 ait un effet déterminant sur la viabilité des mycobactéries. La perturbation de l’interface α6β7 ne semble avoir un effet que dans le cas du double mutant InhAA244L-A252R.
Tableau 18 : Dominance négative de l’expression des allèles inhA sauvage et mutants 37°C dans M.smegmatis.
Dominance
cfu/mL InhAWT
Négative
3
40.10
Non
InhAS170K
0
Oui
InhAA244L
20.10
InhAA252R
30.10
3
Non
3
Non
InhAS170K-A244L
0,04.10
InhAS170K-A252R
0,02.10
A244L-A252R
3
Oui
3
Oui
3
InhA
3.10
InhATM
14.10
+/-
3
Non
Cfu : colonies formant unités. Ces tests sont réalisés à 37°C.
3.4.3. Etude des interactions homotypiques en double hybride chez la levure
Afin de déterminer les interactions entre les protéines mutantes et la protéine sauvage, nous allons effectuer des tests d’interaction protéine-protéine dans notre système de double hybride chez la levure. Nous allons tester les différents mutants contre la protéine sauvage. Dans cette expérience l’allèle inhAWT est cloné dans le vecteur pGBK-T7 et les allèles mutants (inhAA252R, inhAS170K-A252R, inhAA244L-A252R et inhATM) sont clonés dans le vecteur pGAD-T7. Les tests d’interactions en double hybride chez la levure montrent qu’InhAWT interagirait avec InhAS170K, InhAA244L, InhAA252R, InhAS170K-A244L et InhAA244L-A252R. En revanche les interactions seraient rompues avec les mutants InhAS170K-A252R et InhATM (tableau 19).
151
Tableau 19 : Analyse en double hybride des interactions entre la protéine InhA sauvage et les protéines mutées A252R
BD Fusion AD Fusion
inhAWT inhAWT
+++
inhAS170K
+
inhAA244L
+
inhAA252R
+
S170K-A244L
+
S170K-A252R
inhA
-
inhAA244L-A252R
+
InhATM
-
inhA
Nous obtenons des interactions fortes (+) ou nulles (-) (suivant la méthodologie décrite dans le paragraphe 2.1). La colonne « AD fusions » correspond aux gènes clonés dans le vecteur pGAD-T7 et la ligne « BD fusions » aux gènes clonés dans le vecteur pGBK-T7.
Nous pouvons conclure que les mutants InhAS170K et InhAS170K-A244L viendraient interagir avec la protéine sauvage et perturber l’interaction à l’interface d’homomultimérisation α4α5, ce qui aurait un effet majeur sur la viabilité des mycobactéries. Par ailleurs, les mutants InhAA244L et InhAA252R interagissent avec la protéine sauvage sans avoir d’effet dominant négatif. Nous pouvons penser que chacune de ces mutations isolées ne suffisent pas à perturber l’interface α6β7. En revanche, l’allèle inhAA244L-A252R qui interagit avec la protéine sauvage et a un effet intermédiaire pourrait avoir un effet sur l’homomultimérisation d’InhA. L'absence d'interaction entre InhATM et la protéine sauvage corrèle bien avec l'absence d'effet dominant négatif de InhATM. En revanche, l'allèle inhAS170K-A252R qui est dominant négatif et qui devrait interagir avec la protéine sauvage in vivo n'a que peu d'interaction en double hybride. Nous ne pouvons expliquer ce résultat avec les données dont nous disposons.
3.4.4. Purification
Afin de déterminer, comme pour la réductase MabA, si les effets observés dans les expériences de dominance négative sont dus à une rupture d’interaction aux interfaces d’homomultimérisation et donc a un changement du degré de multimérisation, nous allons
152
purifier les différentes protéines InhA sauvages et mutantes afin de déterminer leur poids moléculaire en chromatographie d’exclusion.
3.4.4.1.
Surexpression
Les allèles inhAWT, inhAS170K, inhAA244L, inhAA252R, inhAS170K-A244L, inhAS170K-A252R, inhAA244LA252R
, inhATM ont été clonés dans un vecteur de surexpression pET15b. Des cellules d’E.coli
BL21+RP ont été transformées par ces vecteurs. Le lysat total est analysé sur gel SDS-PAGE avant et après l’induction comme indiqué pour l'étude de MabA.
3.4.4.2.
Extraction
L’extraction des protéines est correcte pour InhA sauvage et InhaS170K (résultats non montrés). En revanche, pour les autres mutants, nous avons obtenu une forte précipitation durant l’extraction. En effet, ces protéines se retrouvent, lors de la première centrifugation de clarification dans le culot.
Afin de résoudre ce problème, nous avons réalisé diverses expériences de mise au point de l’extraction. Nous avons extrait les protéines en présence d’un tampon moins concentré en sel, puis en présence d’une plus forte quantité de lysosymes. Nous les avons surproduites à 30°C, puis nous avons changé de souche d’expression (BL21+RIL, BL21+pLysS). Toutes ces mises au point n’ont pas abouti à un résultat concluant.
3.4.4.3.
Purification
Seuls les extraits obtenus à partir des souches transformées avec un vecteur codant pour InhAWT et InhAS170K sont suffisamment riches en protéines pour permettre la purification de ces protéines sur colonne NiNTA. La protéine InhAWT est suffisamment concentrée et pure après purification (figure 51). On constate que la protéine InhAS170K est fortement contaminée après purification et est éluée plus tard que la protéine sauvage (résultats non montrés). Cette fraction est néanmoins suffisamment enrichie pour permettre de poursuivre l'étude. 153
A
Purification InhAWT
Rinçage Élution
NF
B
Gel Filtration S200 Fraction exclue
Fraction exclue
Fraction éluée 16,85mL
Fraction éluée 18,75mL
InhAS170K
InhAWT
Figure 51 : Purification et Chromatographie d’exclusion d’InhAWT et InhAS170K. A : Purification de la protéine InhAWT sur colonne NiNTA. Courbe bleue : suivi de la DO à 280nm, courbe verte : Steps d’Imidazole. B : Gel filtration sur colonne Superdex S200 des protéines InhAWT et InhAS170K.
La protéine InhAS170K a été concentrée, à la suite de la purification, en ultrafiltration (vivaspin 3000 mwco) afin d’obtenir une concentration suffisante pour être analysée en chromatographie d'exclusion.
154
3.4.5. Chromatographie d’exclusion Les protéines InhAWT et InhAS170K purifiées précédemment sont éluées sur la colonne S200 (tableau 20, figure 51). Tableau 20 : Volume d’élution et poids moléculaire probable pour les protéines InhA sauvage et muté S170K à l’aide de la colonne S200 Protéines InhA WT InhA S170K
VE (en mL)
MW (en Da)
16,84 18,75
133759,7 61732,4
Dans les deux cas, on constate la présence d’un pic de protéines exclues. Il s’agit sûrement d’agrégats. La protéine InhAWT, éluée à 16,84mL (ce qui correspond à un poids moléculaire proche de la taille théorique d'un tétramère) est sous forme tétramérique dans ces conditions d’analyses. Pour la protéine InhAS170K, la protéine est très majoritairement agrégée et le pic de protéines éluées à 18.75mL pourrait correspondre à une forme dimérique. Contrairement à la protéine MabA, il semblerait que la mutation S170K à l’interface α4α5 entraîne la rupture de l’interaction à cette interface.
3.4.6. Conclusions
Le résultat de l’analyse de la protéine InhA sauvage en chromatographie d'exclusion nous montre, dans les conditions d’analyse in vitro, qu’elle est tétramérique. La mutation S170K est conçue pour rompre l’homomultimérisation à l’interface α4α5. Elle est éluée, en chromatographie d’exclusion, à un volume correspondant à une forme dimérique. Elle correspond au dimère de type A-D. L’expression de l’allèle inhAS170K est létale in vivo chez M.smegmatis (test de dominance négative). De plus, le résultat de l’analyse de l’interaction InhAS170K-InhAWT en double hybride nous montre que ces deux protéines interagissent. Ainsi nous pouvons envisager, qu’in vivo, InhAS170K viendrait interagir avec InhAWT, rendant impossible une multimérisation correcte ou la formation d’un hétéro-tétarmère inactif ce qui entraînerait la mort de la bactérie. Cette hypothèse serait renforcée, comme dans le cas de MabA, si la protéine S170K était inactive in vitro. Ce test enzymologique qui nécessite la synthèse chimique des substrats de InhA est une perspective directe de notre travail. Comme pour MabA, nous pouvons affirmer que l’interaction homotypique à l’interface α4α5 de la réductase InhA est essentielle à la survie du bacille tuberculeux. Cette interface est donc une 155
cible potentielle pour un nouvel antituberculeux qui viendrait perturber l’interaction homotypique.
En ce qui concerne la seconde interface α6β7, nous pouvons dire que la mutation A244L qui avait été conçue pour rompre la multimérisation à cette l'interface et étudiée précédemment, n'était pas efficace. En effet, l’expression in vivo du mutant InhAS170K-A244L est létale pour la bactérie et la protéine InhAS170K-A244L interagit avec InhAWT. C’est pourquoi nous avons réalisé une nouvelle mutation à cette interface, la mutation A252R. Les tests d’interaction protéine-protéine nous montrent que les deux protéines mutantes InhAS170K et InhAS170K-A244L interagissent avec la protéine sauvage. D’autre part, nous avons montré qu’après l’introduction de la mutation conduisant au remplacement de l’Alanine en Arginine en position 252 dans la séquence qui code pour ces deux protéines, les deux nouvelles protéines mutantes obtenues (InhA S170K-A252R et InhATM) n’interagissent plus avec la protéine sauvage. Ce résultat nous amène à penser que la mutation A252R pourrait, contrairement à la mutation A244L, rompre l’homomultimérisation à l’interface α6β7. Afin de vérifier que les résultats obtenus en double hybride dénotent bien une rupture de l’interaction à l’interface α6β7, il faudra réaliser des analyses des différentes protéines en chromatographie d'exclusion. Nous pourrons ainsi vérifier que cette mutation aboutie bien à la formation d’un dimère dans le cas de InhAA252R.
Si la mutation A252R rompt effectivement la multimérisation, les deux protéines mutantes InhAA252R et InhAA244L-A252R pourraient correspondre à la forme dimérique de type A-B (figure 41). Par analogie avec l’étude menée sur la protéine MabA, nous pouvons émettre l’hypothèse que cette forme dimérique représente la forme active de InhA. Comme elle interagit avec InhA sauvage (test en double hybride) on peut supposer qu'elle interagit aussi avec InhA sauvage dans les mycobactéries lors des tests de dominance négative. Cette interaction pourrait donc aboutir à la formation d’un dimère actif de type A-D (figure 41). Les tests d’activité permettront de vérifier ces hypothèses. Un élément des résultats obtenus reste pour l'instant inexpliqué. InhAS170K-A252R qui devrait être monomérique n’interagit effectivement pas avec la protéine sauvage (en double hybride) mais son expression in vivo est pourtant létale pour la mycobactérie. L'expérience de dominance négative, tout comme les tests d’interaction protéine-protéine, doivent être répétés pour confirmation.
156
La protéine mutante InhATM n’interagit pas avec InhA sauvage (en double hybride). Les résultats en dominance négative montrent que l'allèle inhATM n'est pas dominant négatif. Cette protéine mutante ne viendrait donc pas interagir avec la protéine sauvage
Quoiqu’il en soit, au stade de notre étude, nous ne pouvons pas tirer de conclusions aussi avancées que pour l’étude de la protéine MabA mais les résultats obtenus sont très encourageants. Les autres variants de InhA doivent être purifiés en grande quantité et analysés afin de réaliser les tests d’activité et les analyses en chromatographie d'exclusion.
157
3.5. Etude in vivo des protéines tronquées et des domaines de MabA et d’InhA Cette partie de ma thèse vise à déterminer la plus petite séquence peptidique ayant un effet dominant négatif chez M.smegmatis. En effet, si l’on émet l’hypothèse de l’essentialité de l’homomultimérisation des réductases MabA et InhA, nous pouvons envisager la conception de peptides qui viendraient perturber ces interfaces d’interaction et inhiber la biosynthèse des acides mycoliques.
Des résultats préliminaires ont été obtenus précédemment au laboratoire. Différentes protéines tronquées de MabA et InhA et domaines de MabA ont été clonés dans le vecteur d’expression pMV261. Cependant, ces constructions n’avaient peu ou pas eu d’effet dominant négatif. Il se pourrait que ces peptides soient dégradés in vivo car leur surproduction n’a pas été détectée en Western-Blot (R. Veyron-Churlet, thèse de l’UPS, 2005).
Nous allons vérifier l’expression et/ou tenter de stabiliser les divers fragments de MabA et d’InhA, avec un reporter d’expression en fusion traductionnelle (GFP en position Cterminale). Cette technique permet, d’une part, de contrôler le bon repliement des protéines d’intérêt et, d’autre part, de stabiliser des protéines qui, lors de surproduction chez E.coli, se replient de façon incorrecte (Waldo et al., 1999). La même approche a été mise au point chez Mtu (Cabantous et al., 2005; Cabantous et al., 2008).
L’objectif est de déterminer les fragments minimaux capables de conférer une dominance négative via une interférence, in vivo, avec les interfaces d’interactions homotypiques essentielles de ces réductases. Ces fragments minimaux pourront servir de base à la conception de nouveaux antibiotiques antituberculeux dont la cible serait ces interfaces d’interaction essentielles.
158
3.5.1. Protéines tronquées et domaines de MabA
3.5.1.1.
Stabilisation des protéines tronquées en C-terminal de MabA et
dominance négative
Différentes constructions avaient été précédemment réalisées à partir du gène mabA pleine taille cloné dans le vecteur pMV261. Des codons stop avaient été introduits, par mutagenèse dirigée, à différentes positions afin d’obtenir des protéines tronquées en C-terminal après les feuillets β4, β5, et β6 (figure 52). Les données préliminaires démontrent un effet dominant négatif pour les protéines tronquées MabA β5 et MabA β6 uniquement à haute température (42°C). Il a été également observé un effet intermédiaire pour MabA β4 à 42°C. Il n’a pas été observé d’effet dominant négatif à 37°C ou à 30°C pour les trois constructions.
α1
β1
α3
β2
β4
β3
α4
MabA β4 α4
β5
α5
α1
β1
β6 β2
β3
L
α6
α3
β7
β4
α4 R
α4
β5
α5
β6
MabA β5
L
α6
α1
β1
α3
α4
β7
β2
β4
β5
β3
R
α4
α5
β6
L
α6
β7
MabA β6 R
Figure 52 : Séquence des protéines tronquées de MabA : MabAβ4, MabAβ5 et MabAβ6
159
Nous pensons que l’absence d’effets significatifs pourrait être liée à un défaut de production des constructions ou à un mauvais repliement entraînant la dégradation des protéines tronquées. Notre stratégie repose sur la création de fusions traductionnelles entre ces protéines tronquées et la GFP, qui est alors utilisée comme reporter d’expression. De plus, la GFP, dont la séquence est clonée en fusion de la séquence de nos protéines tronquées, placée position Cterminale, peut permettre de stabiliser le repliement des différentes protéines tronquées (Cabantous et al., 2005; Cabantous et al., 2008; Waldo et al., 1999). L’objectif est de vérifier la production et/ou de stabiliser ces protéines tronquées afin d’observer un effet dominant négatif à plus basse température. Une fois ces constructions réalisées, nous avons transformé M.smegmatis mc²155. Des étalements de dilution sur milieux sélectifs pour le plasmide pMV261 ont alors été incubés à 37°C. Les boîtes sont observées entre 4 et 6 jours après transformation (figure 53).
β1
α1
β2
β3
α3
β4
α4
α4
β5
α5
G162
β4
β6
α’
α"
α6
η"
β7
D228
β5 β6
pMV261 mabA
pMV261 mabA β4 gfp
pMV261 mabA β5 gfp
pMV261 mabA β6 gfp
Figure 53 : Test de dominance négative dans M.smegmatis mc²155 des protéines tronquées MabA β4, MabA β5 et MabA β6. Les colonies sont observées en microscopie à fluorescence afin de vérifier la production de notre protéine tronquée fusionnée avec la GFP en position C-terminale.
Nous observons un effet dominant négatif pour les constructions MabA β5::GFP et MabA β6::GFP à 37°C. On observe tout de même un faible bruit de fond de micro-colonies fluorescentes (figure 53). Ceci prouve que les protéines tronquées sont produites. La GFP semblerait donc permettre la stabilisation et/ou la production de ces deux protéines tronquées à 37°C. Les formes stables de MabA β5 et β6 pourraient alors s’associer avec MabA endogène et former des dimères protéine sauvage/tronquées, incapables à leur tour de former des tétramères actifs nécessaires à la biosynthèse des acides mycoliques.
160
À 37°C, on observe que la construction MabA β4::GFP présente un effet intermédiaire (figure 53). On observe beaucoup de petites colonies (par rapport au contrôle), présentant des fluorescences variables. Il semblerait donc que l’on ait expression de la protéine tronquée fusionnée à la GFP. L’hétérogénéité de taille et la variation de fluorescence des colonies laissent supposer un effet toxique de la protéine de fusion mais non suffisant pour assurer la dominance négative. Ceci est cohérent avec le fait que l’interface d’interaction est décrite comme étant constituée des hélices α4 et α5. Le feuillet β4 se situe en amont de l’hélice α4. La protéine tronquée MabA β4 ne doit donc pas interagir de façon nette avec cette interface et doit donc perturber de façon moindre la multimérisation de la réductase endogène. Ceci pourrait expliquer l’effet intermédiaire observé.
3.5.1.2.
Stabilisation des domaines internes de MabA et dominance négative
Les données préliminaires (R. Veyron-Churlet, thèse, 2005) ne montrent pas d’effet dominant négatif des différents domaines internes de MabA (α4β5, α4β6 et α6β7) produits in vivo chez M.smegmatis. Cependant, des expériences de Western Blot n’ont pas permis de détecter ces domaines dans la mycobactérie. Ces domaines ne sont, soit pas produits, soit dégradés dans le cytoplasme. Pour tenter d’exprimer les différents domaines, nous allons les cloner en fusion traductionnelle avec la GFP dans le but de contrôler la production des domaines et/ou de les stabiliser à l’intérieur bacille. Nous pourrons ainsi déterminer leur effet dominant négatif.
β1
α1
β2
β3
α3
β4
α4
α4
β5
α5
α4β5::GFP
β6
G162
α4β6::GFP
pMV261 mabA
pMV261 mabA α4β5 gfp
pMV261 mabA α4β6 gfp
α’
α"
α6
η"
β7
D228
α6β7::GFP
pMV261 mabA α6β7 gfp
Figure 54 : Test de dominance négative dans M.smegmatis mc²155 des différents domaines construits de la réductase MabA. Les colonies sont observées en microscopie à fluorescence afin de vérifier la production de notre protéine tronquée fusionnée avec la GFP en position C-terminale.
161
Nous possédions au laboratoire les différentes constructions des domaines de MabA dans le vecteur pMV261 (α4β5, α4β6 et α6β7). Nous avons introduit la GFP en fusion traductionnelle de ces domaines et en position C-terminale. Nous avons alors transformé M.smegmatis mc²155 avec les différentes constructions. Des étalements de dilution sur milieux sélectifs pour le plasmide pMV261 ont alors été incubés à 37°C. Les boîtes sont observées entre 4 et 6 jours après transformation (figure 54).
Le domaine α6β7::GFP est produit (fluorescence) mais nous n’observons pas de phénomène de dominance négative. Le domaine α4β5::GFP est lui aussi produit et l’on observe un effet intermédiaire de ce domaine. En effet, le nombre de transformants chute d’un facteur 20 par rapport au contrôle. Enfin, en ce qui concerne le domaine α4β6::GFP, nous n’observons pas d’effet sur la croissance de la mycobactérie, mais la fluorescence est faible. L’absence d’effet pourrait être due à une absence de production du domaine ou à une dégradation de celui-ci dans le cytoplasme.
β1
α1
β2
β3
α3
β4
α4
α4
β5
α5
G162
β4::GFP
β6
α’
α"
α6
η"
β7
D228
β5::GFP β6::GFP
α4β5::GFP pMV261 mabA α3β5 gfp
α4β6::GFP
α6β7::GFP
α3β5::GFP
Figure 55 : Bilan des tests de dominance négative dans M.smegmatis mc²155 des différents domaines construits de la réductase MabA. Les colonies sont observées en microscopie à fluorescence afin de vérifier la production de notre protéine tronquée fusionnée avec la GFP en position C-terminale.
Si l’on fait le bilan de ces différentes expériences de dominance négative, nous n’observons pas d’effet du domaine comprenant l’hélice α6β7. Ce domaine correspond à l’interface où nous avons réalisé la mutation D228R. Il se pourrait que la multimérisation à cette interface d’interaction ne soit pas essentielle à la biosynthèse des acides mycoliques et que l’interaction potentielle de ce domaine avec cette interface n’altère pas l’activité enzymatique de la
162
protéine MabA endogène. Par ailleurs, on observe un effet de dominance négative pour les protéines tronquées après les feuillets β5 et β6. On observe également un effet intermédiaire de la protéine tronquée après le feuillet β4 et du domaine comprenant l’hélice α4 et le feuillet β5. Si l’on fait le bilan de ces données (figure 55), on se rend compte que l’effet maximal de dominance négative pourrait être obtenu pour un peptide qui viendrait interférer dans la région du feuillet β4 et de l’hélice α4. Nous avons donc réalisé une construction d’un nouveau domaine allant du feuillet β3 à l’hélice α5 et cloné en fusion avec la GFP : α3β5::GFP. Les résultats de dominance négative chez M.smegmatis nous montrent que ce domaine a un effet plus important que les autres domaines testés jusqu’alors (figure 55).
Ce résultat nous amène à penser que l’interférence d’un peptide avec le feuillet β4 et/ou l’hélice α4 viendrait perturber l’interaction homotypique. Ce peptide pourrait servir de base à la conception d’un nouvel antituberculeux.
3.5.2. Protéines tronquées d’InhA
Le même type d’approche que pour la réductase MabA a été entamée : l’identification de domaines peptidique nécessaires et suffisants pour avoir un effet dominant négatif dans la mycobactérie suite à une perturbation d’interface d’homomultimérisation essentielle de la réductase. Pour cela, nous avons construit différentes protéines tronquées d’InhA après les feuillets β4, β5 et β6 (figure 56). Nous n’avons pas observé d’effet de dominance négative pour ces constructions chez M.smegmatis. Il se pourrait qu’il y a ait un problème de production ou de repliement comme nous l’avons suggéré précédemment pour les réductases MabA tronquées. Nous avons donc utilisé le même type d’approche de clonage de la GFP, en position Cterminale et en fusion traductionnelle des différentes constructions dans le vecteur d’expression pMV261. Nous avons alors transformé M.smegmatis mc²155 avec les différentes constructions. Des étalements de dilution sur milieux sélectifs pour le plasmide pMV261 ont alors été incubés à 37°C. Les boîtes sont observées entre 4 et 6 jours après transformation (figure 57).
163
α1
β1
β3
α3
β2
α2
α4
β4
InhA β4 α4
α5
β5
α1
β1
β2
α2
K
β6
β3 α6
α3
α4
β4 β7
L
α4R
α5
β5
InhA β5 K
β6 α1
β1 α6
β3
β2
α2
β7
L
R
α3
α4
β4
α4
α5
β5
K
β6
InhA β6 α6
β7
Figure 56 : Séquence des protéines tronquées d’InhA : InhA β4, InhA β5 et InhA β6
164
D’après nos résultats, les protéines InhA tronquées après les feuillets β6 et β5 en fusion traductionnelle avec la GFP ont un effet dominant négatif contrairement à ces mêmes protéines non fusionnées. Les rares colonies observées sur les boîtes des transformants InhA β6-GFP et β5-GFP étaient très petites en comparaison aux témoins positifs et présentaient des phénotypes altérés, avec une grande hétérogénéité de forme. Cependant, la fluorescence observée témoigne d’une certaine production de ces protéines tronquées. Il semble donc que la GFP permet de palier un défaut de production ou de stabiliser les protéines tronquées. En effet, il se peut que la GFP aide au bon repliement des deux formes tronquées β6 et β5 et empêche ainsi leur dégradation. Les formes stables de InhA β6 et β5 pourraient alors s’associer avec InhA endogène et former des dimères protéine sauvage/tronquées, incapables à leur tour de former des tétramères actifs nécessaires à la biosynthèse des acides mycoliques. β1
α1
β2
β3
α3
α4
β4
α4
β5
α5
β6
α’
α"
α6
η"
β7
β4::GFP β5::GFP β6::GFP
pMV261 inbA
pMV261 inhA inbA β4 gfp
inbA pMV261 inhA β5 gfp
inbA pMV261 inhA β6 gfp
Figure 57 : Test de dominance négative dans M.smegmatis mc²155 des protéines tronquées InhA β4, InhA β5 et InhA β6. Les colonies sont observées en microscopie à fluorescence afin de vérifier la production de notre protéine tronquée fusionnée avec la GFP en position C-terminale.
La fusion InhA β4-GFP présente le caractère dominant négatif le plus important. Selon les données cristallographiques, les interfaces de stabilisation du tétramère InhA se trouvent au niveau des hélices α4 et α5, puis au niveau de l’hélice α6 et le feuillet β7. InhA β4-GFP ne devrait donc pas interagir avec InhA endogène, puisqu’elle a perdu les motifs nécessaires à l’interaction. Les résultats obtenus nous font donc penser que la « zone d’interaction α4α5 » ne se limite pas qu’aux hélices α4 et α5, mais qu’il y a des motifs de structure secondaire en amont de l’hélice α4 qui interviennent dans l’interaction homotypique de InhA. Ceci est cohérent avec l’effet de dominance négative, certes intermédiaire, de la protéine tronquée MabA β4-GFP.
165
4. Conclusions générales et perspectives
166
4.1. Architecture de l’interactome de la biosynthèse des acides mycoliques Il a été montré au laboratoire que les protéines du cycle d’élongation des acides mycoliques interagissaient entre elles pour former trois complexes : un complexe d’initiation organisé autour de la condensase mtFabH (I-FAS-II), un premier complexe d’élongation comprenant la condensase KasA (E1-FAS-II) assurant l’élongation des acides gras dans les premiers cycles et, pour finir, un second complexe d’élongation autour de KasB (E2-FAS-II) qui interviendrait dans les derniers cycles. Les trois complexes auraient un « core » commun qui pourrait être composé de MabA, d’InhA et de mtFabD car ces trois enzymes interagissent avec toutes les autres (figure 21). La condensase Pks13 viendrait interagir avec E2-FAS-II via la condensase KasB. Les quatre méthyltransférases MmaA1-4 interagiraient avec les deux complexes d’élongation (Veyron-Churlet et al., 2004; Veyron-Churlet et al., 2005) mais pas avec le complexe d’initiation par le biais d’interactions spécifiques avec KasA et KasB. À l’aide de techniques de Co-IP, de double hybride et de triple hybride chez la levure, nous avons complété le schéma global d’interactions des enzymes de la biosynthèse des acides mycoliques. Nous avons intégré les enzymes responsables de l’activation de la chaîne méromycolique (AccA3, AccD4, AccD5 et AccE5) et de la chaîne α (FadD32), l’enzyme responsable de la synthèse du malonyl-CoA (AccD6), les quatre méthyltransférases encore non étudiées (CmaA1, CmaA2, UmaA et PcaA) et les trois déshydratases récemment identifiées au laboratoire (HadA, HadB et HadC). Nous avons également réalisé des alignements structuraux permettant de corréler l’architecture des complexes FAS-II avec la structure de la méga-enzyme mFAS-I.
- Partenaires de Pks13 (figure 27)
Les expériences d’interactions protéine-protéine nous ont permis de proposer un modèle de complexe ACCases responsable de la carboxylation de la chaîne α avec une sous-unité α du complexe ACCases homo-hexamérique AccA3 et une sous-unité β hétéro-hexamérique AccD4-AccD5 (3 monomères d’AccD4 et 3 monomères d’AccD5). Ce modèle est cohérent avec la co-immunoprécipitation in vitro dans un extrait de M.smegmatis d’un complexe AccA3-AccD4-AccD5 par Portevin et coll. (Portevin et al., 2005). Par ailleurs, une polémique existe sur la participation d’AccD5 à la carboxylation de la chaîne α. Il a été montré, in vitro
167
et par des études structurales qu’AccD5 aurait une spécificité de substrat pour le propionylCoA (Gago et al., 2006; Lin et al., 2006). Ces résultats sont contradictoires avec l’essentialité d’AccD5 dans la biosynthèse des acides mycoliques (Gande et al., 2004) et l’existence d’un complexe AccA3-AccD4-AccD5 (Portevin et al., 2005). Nous émettons l’hypothèse que la formation d’un complexe hétéro-hexamérique AccD4-AccD5, modifierait l’affinité d’AccD5 pour son substrat et permettrait de prendre en charge la chaîne α des acides mycoliques comme substrat. Des tests biochimiques d’affinité pour un substrat, en présence d’AccD5 et d’AccD4, pourraient être mis en œuvre pour confirmer cette hypothèse.
AccE5, sous-unité ε des complexes ACCases, interagit avec AccA3 et AccD6. Elle est décrite comme un catalyseur du complexe AccA3-AccD5 (Gago et al., 2006; Oh et al., 2006) et un inhibiteur, in vitro, du mélange AccA3/AccD6 (Daniel et al., 2007). Nous proposons, dans notre modèle, qu’AccE5 joue le rôle de régulateur de la biosynthèse des acides mycoliques en activant la carboxylation de la chaîne α et en inhibant la synthèse de malonyl-CoA, substrat de FAS-I.
- Déshydratases
Les déshydratases intervenant dans le cycle FAS-II (HadA, HadB et HadC), pièce manquante du schéma d’interaction des enzymes de ce cycle, interagissent en double hybride deux à deux pour former deux hétérodimères : HadA-HadB et HadB-HadC. Ces résultats confirment dans notre système expérimental les données de Sacco et coll. (Sacco et al., 2007a). Nous avons démontré par des expériences de triple hybride chez la levure que nous avons une spécificité d’interaction entre HadA-HadB et KasA d’une part et entre HadB-HadC et KasB d’autre part. Ces résultats confirment l’hypothèse émise par Sacco et coll. : HadA-B interviendrait en début d’élongation (comme la condensase KasA) et HadB-C se situerait en fin d’élongation (comme la condensase KasB). Les déshydratases peuvent ainsi être intégrées à notre modèle d’interactome avec HadA-B qui ferait parti du complexe E1-FAS-II et HadB-C du complexe E2-FAS-II (figure 34).
- Méthyltransférases
Les huit méthyltransférases montrent des interactions spécifiques avec les deux condensases KasA et KasB. Elles semblent donc interagir avec les deux systèmes E1-FAS-II et E2-FAS-II. 168
Les résultats les plus intéressants obtenus dans notre étude, en ce qui concerne les méthyltransférases, sont ceux obtenus en triple hybride chez la levure avec les différentes déshydratases. En effet, le profil d’interaction semble révéler une spécificité d’interaction entre les méthyltransférases qui interviennent en position distale (début d’élongation) et HadA-B d’une part et entre celle qui interviennent en position proximale (fin d’élongation) et HadB-C d’autre part. Nous pouvons donc penser que les modifications de la chaîne méromycolique ont lieu en cours d’élongation et que l’intervention des différentes méthyltransférases est régulée par les deux hétéro-dimères qui assurent la déshydratation à l’intérieur du cycle FAS-II. Il apparaît cohérent que ce soit à cette étape du cycle FAS-II que l’intervention des différentes méthyltransférases soit régulée. En effet, les modifications de la chaîne méromycolique nécessitent la formation de double liaison en position distale et proximale. L’enzyme responsable de l’isomérisation de la chaîne méromycolique n’est pas encore connue. Cependant, Takayama et coll. ont proposé soit la déshydratase, soit une isomérase qui interviendrait juste après la déshydratase, pour assurer cette fonction (Takayama et al., 2005). En effet, chez E.coli, l’étape de déshydratation est prise en charge par FabZ en début d’élongation et par FabA ensuite (Heath and Rock, 1996). FabA possède également une activité trans-isomérase qui lui permet d’introduire des doubles liaisons sur la chaîne carbonée. Aucun homologue à ces deux protéines n’a été identifié dans Mtu (Sacco et al., 2007b) mais il semble tout de même cohérent que ce soit au moment de la déshydratation que l’intervention séquentielle des méthyltransférases soit régulée.
Finalement, les alignements des différentes structures (connues ou modélisées dans ce travail) des enzymes mtFabD, InhA, MabA, HadA-B, HadB-C, mtFabH, KasA, KasB et des différentes méthyltransférases sur la structure de mFAS-I (Maier et al., 2008) nous ont permis, par une approche originale, de confirmer et d’affiner notre modèle d’interactome. Plusieurs systèmes d’élongations pourraient intervenir, concomitamment ou de façon séquentielle : un système FAS-II d’élongation d’acides gras à courte chaîne E1-FAS-II composé de mtFabD, KasA et d’HadA-B et un système FAS-II d’élongation d’acides gras à longue chaîne E2-FAS-II avec mtFabD, KasB et HadB-C. Ces deux systèmes auraient un « core » commun composé des réductases MabA et InhA (figure 40). Les méthyltransférases intervenant en position distale (MmaA1-4) interagiraient spécifiquement avec E1-FAS-II et celles qui interviendraient en position proximale (MmaA1, MmaA4, CmaA1 et PcaA) avec E2-FAS-II. Il a été montré que la flexibilité de mFAS-I permettait à cette méga-enzyme de transférer le substrat d’un site catalytique à l’autre (Brignole et al., 2009). Nous pouvons 169
envisager un fonctionnement dynamique des interactions protéine-protéine des différentes enzymes du système FAS-II. Ceci permettrait de transférer le substrat d’un site catalytique à l’autre au sein de notre voie de biosynthèse par un phénomène de « metabolic channeling ». Nous avons schématisé le trajet du substrat dans notre modèle. Nous pouvons envisager qu’une rotation de la partie variable de notre système (condensases/déshydratase) par rapport à la partie constante (MabA/InhA) permettrait ce transfert de substrat (figure 40).
170
4.2. Vers
de
nouveaux
antituberculeux
inhibiteurs
d’interactions
essentielles 4.2.1. Essentialité de l’interface d’homomultimérisation α4α5 des réductases MabA et InhA
L’étude de l’homomultimérisation des deux réductases MabA et InhA nous montre que l’interaction homotypique à l’interface α4α5 semble primordiale pour la survie des mycobactéries. En effet, les mutations à ces deux interfaces, G162L pour MabA et S170K pour InhA, entraînent un effet dominant négatif in vivo chez M.smegmatis contrairement aux mutations à l’interface α6β7 qui ont un effet moindre et non létal. Les mutants MabAG162L et InhAS17OK interagissent respectivement avec MabA et InhA sauvages et pourraient former des hétéro-dimères inactifs. L’inactivité du mutant MabAG162L in vitro tend vers cette hypothèse. Les études en chromatographies d’exclusion montrent que la mutation S170K rompt l’interaction à l’interface α4α5 car le mutant InhAS170K semble dimérique. Par contre, la mutation G162L ne semble pas rompre l’interaction homotypique à cette interface car le mutant MabAG162L semble tétramérique en chromatographie d’exclusion et a été cristallisé sous forme de tétramère. Cependant, les données cristallographiques montrent que, pour ce mutant, l’interface α4α5 est très perturbée. Elle présente un décalage entre les monomères de MabA à cette interface par rapport à la protéine sauvage. Ces résultats tendent à démontrer qu’une interaction homotypique correcte à l’interface α4α5 est essentielle à la survie des mycobactéries. Il a été montré que la réductase MabA présentait un équilibre dimèrestétramères en solution (Marrakchi et al., 2002). Le dimère actif serait donc le dimère de type A-B (figure 15 et 50). La forme tétramérique pourrait être une forme de stockage in vivo ou servir à une organisation structurale secondaire et non essentielle à la biosynthèse des acides mycoliques.
Dans la littérature, plusieurs éléments vont dans le sens de l’essentialité de la multimérisation des réductases à l’interface α4α5. MabA et InhA appartiennent à la famille des Short-chain Déshydrogénases/Réductases (SDR). Il a été montré que les protéines qui appartiennent à cette famille avaient une structure soit homo-dimérique, soit homo-tétramérique. Les motifs structuraux aux interfaces homotypiques sont conservés : comme pour MabA et InhA, il s’agit des interfaces α4α5 et α6β7. L’interface conservée chez les SDR dimériques est l’interface
171
α4α5 (Labesse et al., 1994). De plus, la structure de mFAS-I (Maier et al., 2008) présente une sous-unité enzymatique kéto-réductase (KR) et une seconde sous-unité pseudo kéto-réductase (ΨKR) non active qui vient interagir avec le domaine KR pour reconstituer l’interface correspondant à l’interface α4α5 de MabA (figure 38A). L’alignement structural de MabA avec mFAS-I montre bien que c’est cette interface qui est conservée.
Plusieurs travaux montrent que la protéine MabA (Cohen-Gonsaud et al., 2002; CohenGonsaud et al., 2005; Poncet-Montange et al., 2007), tout comme son homologue FabG chez E.coli (Price et al., 2001), présentent une forme « ouverte » et une forme « fermée ». En position fermée, les boucles formées par les motifs structuraux α4/β4 et α5/β5 bloquent l’accès du cofacteur (NADPH) à son site de fixation. Un réarrangement de ces motifs structuraux est nécessaire pour obtenir la forme « ouverte » permettant la fixation du cofacteur. Nous pouvons émettre l’hypothèse que la dimérisation à l’interface α4α5 est essentielle au contrôle des changements conformationnels des deux boucles dont les hélices α4 et α5 font parties. La rupture ou la modification de cette interface pourrait bloquer la réductase en position « fermée » et la rendre inactive.
Notre travail valide l’idée que l’interface α4α5 est une cible de choix pour la conception d’une nouvelle génération de molécules antituberculeuses qui viendraient perturber l’interaction à cette interface. Les premiers résultats de dominance négative des protéines tronquées et des domaines de ces réductases que nous avons obtenus confirment notre hypothèse car il semblerait que les séquences peptidiques correspondantes à l’interface α4α5 ont un effet direct sur la viabilité des mycobactéries. Ces séquences peptidiques pourraient servir de base à la conception de peptidomimétiques qui viendraient déstabiliser les interactions protéine-protéine essentielles pour la survie du bacille tuberculeux.
4.2.2. De nouvelles interfaces d’interactions hétérotypiques essentielles ?
Les alignements structuraux des différentes protéines de la biosynthèse des acides mycoliques sur la structure de mFAS-I nous ont permis d’affiner notre modèle d’organisation spatial de l’interactome de la biosynthèse des acides mycoliques (figure 40). L’organisation de ces différentes protéines entre elles dans l’espace donné par notre modèle ouvre la perspective directe de modéliser de façon précise les interfaces d’interactions des différentes protéines 172
deux à deux. Pour cela, deux types d’approches peuvent être explorées. Premièrement, lorsque les protéines de notre système sont en contact, nous pouvons envisager de réaliser des minimisations d’énergie aux interfaces d’interaction hétérotypiques afin de positionner précisément deux à deux les protéines qui interagissent entre elles. Cela peut être envisagé pour les interactions entre InhA (ou KasA, ou KasB) et les complexes déshydratases ou encore entre MabA et les différentes méthyltransférases. Dans un second temps, pour les protéines qui ne sont pas en contact direct (FabD vs Condensases et InhA vs MabA) il semblerait intéressant d’envisager de modéliser les interfaces d’interaction par docking d’une protéine sur l’autre. Le docking est une technique qui permet de déterminer, à partir de la structure de deux protéines connues, la meilleure disposition de ces deux protéines entre elles lors d’un contact direct protéine-protéine. Ce type d’approche a déjà été réalisé pour une polykétide synthase de type II formée de huit protéines (Castaldo et al., 2008). Après avoir défini le réseau d’interactions protéine-protéine, en double hybride chez la levure, Castaldo et coll. ont défini les interfaces d’interaction par une approche de docking à l’aide des logiciels ZDOCK (Chen et al., 2003), Patchdock (Schneidman-Duhovny et al., 2005) et Cluspro (Comeau et al., 2004).
Une fois les interfaces d’interaction hétérotypiques définies, nous pourrons envisager le même type d’approche que pour les interactions homotypiques de MabA et d’InhA. Définir des mutations ponctuelles à ces interfaces d’interactions qui seraient conçues pour rompre ces interactions sans modifier la structure des protéines conservées. Nous pourrions ensuite apporter en trans les allèles mutés dans la mycobactérie et observer les phénomènes de dominance négative, vérifier la rupture de l’interaction (en double hybride chez la levure et en Co-IP) et enfin, aller vers la définition de peptides inhibiteurs de ces interactions essentielles in vivo.
173
4.3. Vers la localisation cellulaire de l’interactome de la biosynthèse des acides mycoliques Nous avons défini un modèle d’interactome de la biosynthèse des acides mycoliques. Cependant, il est difficile de déterminer si ce méga-complexe protéique existe in vivo, s’il représente une seule entité, si les différents complexes (I-FAS-II, E1-FAS-II et E2-FAS-II) agissent simultanément ou de façon séquentielle. Les acides mycoliques sont le constituant majeur de l’enveloppe mycobactérienne. La « machinerie » protéique qui les synthétise pourrait avoir une localisation particulière dans le bacille : cytoplasmique, dans l’enveloppe, aux pôles ou au septum de division ? Il serait intéressant d’observer directement, en microscopie la localisation et la co-localisation potentielle de nos différentes protéines. Des données préliminaires de localisation de protéines de FAS-II ont été obtenues à la fin de mon travail. Nous présentons ici ces premiers résultats qui ouvrent de nouvelles perspectives pour la compréhension de la biosynthèse de l’enveloppe mycobactérienne.
Afin de déterminer la localisation de l’interactome de la biosynthèse des acides mycoliques, nous avons cloné, en fusion avec la gfp en position N-terminale, les gènes mabA, inhA, kasA et kasB. Nous avons transformé ces différents plasmides dans M.smegmatis et les souches ainsi obtenues ont été observées à l’aide d’un microscope confocal inversé (Leica®) à partir de stries de colonies entre lame et lamelle. De façon étonnante, nous avons observé que les bacilles, dans lesquels MabA, InhA, et KasA fusionnées avec la GFP étaient exprimées, présentaient une émission de fluorescence aux pôles. Pour les bacilles exprimant KasB fusionnée à la GFP,
la fluorescence est tantôt aux pôles, tantôt diffuse dans tout le
cytoplasme. MabA, InhA et KasA semblent ainsi être des enzymes localisées aux pôles et KasB pourrait être soit polaire soit diffuse dans la cellule (figure 58).
174
mc² 155 pMV261 H-GFP mabA
mc² 155 pMV261 H-GFP inhA
mc² 155 pMV261 H-GFP kasB
Figure 58 : Observations au microscope à fluorescence des souches M.smegmatis mc²155 dans lesquelles sont exprimées les protéines MabA, InhA et KasB fusionnées à la GFP.
Afin de contrôler qu’il ne s’agit pas d’un artéfact et que la fusion GFP N-terminale n’entraîne pas un mauvais repliement ou une agrégation des réductases, nous avons réalisé un test de résistance à l’INH en condition de surproduction d’InhA et de MabA fusionnées et non fusionnées avec la GFP. Pour cela, nous avons déposé différentes cultures liquides de la souche M.smegmatis mc²155, dans laquelle nos plasmides ont été transformés un à un, sur
175
milieux solides contenant une concentration croissante en INH (figure 59). Nous constatons que la surproduction d’InhA fusionnée à la GFP entraîne une résistance à l’INH comparable à la surproduction d’InhA non fusionnée. Nous pouvons en déduire que InhA fusionnée a gardé sa capacité à fixer l’adduit INH-NAD. Cela nous donne une indication sur le repliement correct de la protéine. Par ailleurs, nous constatons lors de ce test que la surproduction de MabA fusionnée et non fusionnée à la GFP n’entraîne pas de résistance à l’INH contrairement aux données de la littérature in vitro (Ducasse-Cabanot et al., 2004). Nous pouvons tout de même penser que MabA fusionnée à la GFP, qui a une structure très similaire à celle d’InhA, a un repliement correct et n’est pas agrégée comme son homologue structural.
Figure 59 : Test de résistance à l’isoniazide (INH). Les souches de M.smegmatis mc²155 dans lesquelles sont exprimées les protéines MabA et InhA, fusionnées ou non à la GFP, sont déposées (20µL) sur des concentrations croissantes en INH. Les colonies sont ensuite observées au microscope à fluorescence.
Étant donné les résultats obtenus en observation directe de colonies, striées entre lame et lamelle, nous avons poussé notre étude en tentant d’observer la localisation de nos protéines à divers stades de la croissance en culture liquide. La cinétique de croissance des souches M.smegmatis
mc²155
dans
lesquelles
les
vecteurs
d’expressions
pMV261::gfp,
pMV261::mabA, pMV261::inhA, pMV261::kasA et pMV261::kasB ont été transformés est présentée figure 60A. Nous avons observé au microscope confocal les différentes souches en 176
début et fin de phase exponentielle ainsi qu’en phase stationnaire tardive (figure 60B et 60C). Pour MabA, InhA et KasA, quelque soit le stade de croissance, on observe des « spots » soit à un des deux pôles, soit au septum de division, soit aux deux pôles et au septum. On peut penser que la biosynthèse des acides mycoliques a lieu aux pôles du bacille tuberculeux. Au moment de la division ou juste avant, on a relocalisation de FAS-II au septum de division, lieu d’apparition des « nouveaux » pôles après la division. En ce qui concerne KasB, on observe une localisation aux pôles qu’en phase stationnaire. On peut émettre l’hypothèse que la condensase est localisée aux pôles qu’à certains moments. En effet, il est probable que KasB intervienne dans la biosynthèse des acides mycoliques que dans certaines conditions afin d’augmenter la virulence et la survie intracellulaire du bacille (Bhatt et al., 2007a). Elle ne pourrait donc être recrutée aux pôles que dans certaines conditions physiologiques (en phase stationnaire dans nos conditions d’observation). Il se pourrait également que la partie constante (MabA et InhA) de notre interactome soit localisée de façon permanente aux pôles et que les parties variables (KasA/HadA-B/mtFabD et KasB/HadB-C/mtFabD) viennent interagir avec la partie constante (InhA/MabA) de façon alternée.
177
DO=f(t) croissance mc²155 0,5 0,45 0,4
DO (en uDO)
0,35 0,3
GFP MabA
0,25
A
InhA KasB
0,2 0,15 0,1 0,05 0 0
20
40
60
80
100
120
t (en h)
t (en h)
GFP
MabA
InhA
KasB
25,25
Début de phase exponentielle
29,5
B
Fin de phase exponentielle
99,5
Pahse stationnaire
Début phase de exponentielle
Fin de phase exponentielle
Phase stationnaire
KasA
C
Figure 60 : Observation au microscope à fluorescence, à divers stade de la croissance, de souches de M.smegmatis exprimant des protéines MabA, InhA, KasA et KasB fusionnées à la GFP. A : Suivi de la croissance des différentes souches, DO à 640nm en fonction du temps. B et C : Observations au microscope de la localisation des différentes protéines en début de phase exponentielle, en fin de phase exponentielle et en phase stationnaire tardive.
178
Ces résultats préliminaires de localisation du système FAS-II sont très encourageants. Nous savons par ailleurs que l’INH, antituberculeux majeur ayant pour cible InhA, altère les pôles de Mtu (Bardou et al., 1996). Ces résultats laissaient entrevoir une localisation d’InhA aux pôles du bacille.
Par ailleurs la localisation d’autres enzymes a été décrite dans la littérature. C’est le cas de Wag31, une orthologue de la protéine de division cellulaire DivIVA, qui est localisée aux pôles de Mtu. Wag31 intervient dans la division cellulaire et la forme du bacille. Il semblerait qu’elle contrôle la synthèse du peptidoglycane naissant aux pôles (Kang et al., 2008). Les STPKs PknA et PknB régulent l’activité de Wag31 par phosphorylation (Kang et al., 2005). Nous savons également que les protéines de division cellulaire FtsZ et FtsW interagissent entre elles et colocalisent au centre du bacille pour former le septum de division (Rajagopalan et al., 2005). L’activité d’FtsZ est, elle aussi, régulée par phosphorylation par la STPK PknA (Thakur et al., 2006).
Des travaux récents ont montré que les enzymes mtFabD, KasA, KasB et mtFabH, intervenant dans la biosynthèse des acides mycoliques, étaient régulées par phosphorylation. PknA jouerait un rôle majeur dans le contrôle de l’activité de ces différentes protéines (Molle et al., 2006; Veyron-Churlet et al., 2009). Nos premières données de localisation des protéines du système FAS-II ouvrent un axe de recherche original qui viserait à étudier les liens entre la biosynthèse de l’enveloppe, la division cellulaire et la localisation des différentes protéines intervenant dans ces mécanismes. En effet, comme nous l’avons dit, les enzymes contrôlant la division cellulaire (FtsZ, Wag31) et celles intervenant dans la biosynthèse de l’enveloppe (enzymes de FAS-II, Wag31 qui contrôle la synthèse du peptidoglycane) sont régulées par phosphorylation et sont toutes des substrats d’au moins une STPK commune, PknA. Elles ont également toutes une localisation particulière dans le bacille. L’étude des interactions protéine-protéine entre les enzymes de FAS-II et les enzymes intervenant dans la division cellulaire est une perspective directe de notre travail. La compréhension de la relation entre la phosphorylation de ces protéines et les interactions protéine-protéine au sein de FAS-II et entre FAS-II et les enzymes de la division cellulaire est également un nouvel axe d’étude qui permettrait de mieux appréhender les mécanismes de la croissance et de la division des mycobactéries.
179
5. Matériel et méthodes
180
5.1. Matériel utilisé 5.1.1. Souches utilisées
Espèce
Souche
Escherichia coli
DZ137
Escherichia coli
BL21(DE3)+RP
Saccharomyces cerevisiae
AH109
Saccharomyces cerevisiae
MAV203
Mycobacterium smegmatis
mc²155ATCC 700084
Génotype malP ::lacIq, srlC ::TnO, recA1, araD ∆(ara-leu), galE, galK, ∆lacX74, fsdR (rk-mk-), rpsL (StrR) F- ompT, hsdSB (rB- mB-), dcm, gal(DE3) MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4∆, gal80∆, lys2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS- MEL1TATA-lacZ MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, gal80∆, his3-200, gal4∆, lys2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, ura3::SPAL10UAS-SPAL10TATA-URA ept-1
Source Didier Zerbib Stratagene®
(James 1996)
(Vidal 1993)
et
et
pGAD-T7 pGBK-T7 pBridge pET15b pMV261 pGAD-T7::agT pGBK-T7::p53 pGBK-T7::lam pGAD-T7::mabAWT pGAD-T7::inhAWT pGAD-T7::fabD pGAD-T7::fabH pGAD-T7::kasA pGAD-T7::kasB pGAD-T7::pks13 pGAD-T7::T1-pks13
pGAD-T7::T2-pks13
Description
Source R
GAL4(769-881)AD, LEU2, Amp , HA epitope tag GAL4(1-147)BD, TRP1, KanR, c-myc epitope tag GAL4-BD, TRP1, KanR, pMET AmpR, vecteur d’expression, promoteur T7 KanR, vecteur navette E.coli / mycobactéries, gène cloné sous la dépendance du promoteur hsp60 SV40 large T-antigen(84-708) dans pGAD-T7 Murine p53(72-390) dans pGBK-T7 Human lamin C(66-230) dans pGBK-T7 Gène mabA cloné dans pGAD-T7 Gène inhA cloné dans pGAD-T7 Gène mtfabD cloné dans pGAD-T7 Gène mtfabH cloné dans pGAD-T7 Gène kasA cloné dans pGAD-T7 Gène kasB cloné dans pGAD-T7 Gène pks13 cloné dans pGAD-T7 Gène pks13 avec un STOP de transcription introduit après le domaine ACP1 cloné dans pGAD-T7 Gène pks13 avec un STOP de transcription introduit après le domaine KS cloné dans pGADT7
181
al.,
(Snapper et al., 1990)
5.1.2. Plasmides utilisés et construits
Plasmides
al.,
Clontech® Clontech® Clontech® Novagen® (Stover et al., 1991) Clontech® Clontech® Clontech® R.Veyron R.Veyron S.Bigot O. Guerrini R.Veyron R.Veyron W. Malaga S. Bricchi
S. Bricchi
pGAD-T7::T3-pks13
pGAD-T7::T4-pks13 pGAD-T7::mmaA1 pGAD-T7::mmaA2 pGAD-T7::mmaA3 pGAD-T7::mmaA4 pGAD-T7::cmaA1 pGAD-T7::cmaA2 pGAD-T7::umaA pGAD-T7::pcaA pGAD-T7::accA3 pGAD-T7::accD4 pGAD-T7::accD5 pGAD-T7::accD6 pGAD-T7::accE5 pGAD-T7::fadD32 pGAD-T7::hadA pGAD-T7::hadB pGAD-T7::hadC pGBK-T7::mabAWT pGBK-T7::inhAWT pGBK-T7::fabD pGBK-T7::fabH pGBK-T7::kasA pGBK-T7::kasB pGBK-T7::pks13 pGBK-T7::mmaA1 pGBK-T7::mmaA2 pGBK-T7::mmaA3 pGBK-T7::mmaA4 pGBK-T7::cmaA1 pGBK-T7::cmaA2 pGBK-T7::umaA pGBK-T7::pcaA pGBK-T7::accA3 pGBK-T7::accD4 pGBK-T7::accD5 pGBK-T7::accD6 pGBK-T7::accE5 pGBK-T7::fadD32 pGBK-T7::hadA pGBK-T7::hadB pGBK-T7::hadC pBridge::BDHadA/Met-HadB
Gène pks13 avec un STOP de transcription introduit après le domaine AT cloné dans pGAD- S. Bricchi T7 Gène pks13 avec un STOP de transcription introduit après le domaine ACP2 cloné dans S. Bricchi pGAD-T7 Gène mmaA1 cloné dans pGAD-T7 A. Bourgeois O. Guerrini et R. VeyronGène mmaA2 cloné dans pGAD-T7 Churlet Gène mmaA3 cloné dans pGAD-T7 A. Bourgeois S. Verdoux et R. VeyronGène mmaA4 (hma) cloné dans pGAD-T7 Churlet Gène cmaA1 cloné dans pGAD-T7 S. Cantaloube Gène cmaA2 cloné dans pGAD-T7 S. Cantaloube Gène umaA cloné dans pGAD-T7 S. Cantaloube Gène pcaA cloné dans pGAD-T7 S. Cantaloube Gène accA3 cloné dans pGAD-T7 S. Cantaloube Gène accD4 cloné dans pGAD-T7 S. Cantaloube Gène accD5 cloné dans pGAD-T7 S. Cantaloube Gène accD6 cloné dans pGAD-T7 M. Dimitrov et S. Cantaloube Gène accE5 cloné dans pGAD-T7 S. Cantaloube Gène fadD32 cloné dans pGAD-T7 S. Cantaloube Gène hadA cloné dans pGAD-T7 N. Haddache Gène hadB cloné dans pGAD-T7 N. Haddache Gène hadC cloné dans pGAD-T7 N. Haddache Gène mabA cloné dans pGBK-T7 R.Veyron-Churlet Gène inhA cloné dans pGBK-T7 R.Veyron-Churlet Gène mtfabD cloné dans pGBK-T7 S.Bigot Gène mtfabH cloné dans pGBK-T7 O. Guerrini Gène kasA cloné dans pGBK-T7 R.Veyron-Churlet Gène kasB cloné dans pGBK-T7 R.Veyron-Churlet Gène pks13 cloné dans pGBK-T7 W. Malaga Gène mmaA1 cloné dans pGBK-T7 A. Bourgeois Gène mmaA2 cloné dans pGBK-T7 O. Guerrini et R. Veyron Gène mmaA3 cloné dans pGBK-T7 A. Bourgeois Gène mmaA4 (hma) cloné dans pGBK-T7 S. Verdoux et R. Veyron Gène cmaA1 cloné dans pGBK-T7 S. Cantaloube Gène cmaA2 cloné dans pGBK-T7 S. Cantaloube Gène umaA cloné dans pGBK-T7 S. Cantaloube Gène pcaA cloné dans pGBK-T7 S. Cantaloube Gène accA3 cloné dans pGBK-T7 S. Cantaloube Gène accD4 cloné dans pGBK-T7 S. Cantaloube Gène accD5 cloné dans pGBK-T7 S. Cantaloube Gène accD6 cloné dans pGBK-T7 M.Dimitrov et S. Cantaloube Gène accE5 cloné dans pGBK-T7 S. Cantaloube Gène fadD32 cloné dans pGBK-T7 S. Cantaloube Gène hadA cloné dans pGBK-T7 N. Haddache Gène hadB cloné dans pGBK-T7 N. Haddache Gène hadC cloné dans pGBK-T7 N. Haddache
Gène hadA fusionné avec GAL4-BD, Gène hadB sous le contrôle du promoteur pMET N. Haddache clonés dans pBridge
182
pBridge::BDHadA/Met-HadC pBridge::BDHadB/Met-HadA pBridge::BDHadB/Met-HadC pBridge::BDHadC/Met-HadA pBridge::BDHadC/Met-HadB pET15b::mabAWT pET15b::mabAG162L pET15b::mabAD228R pET15b::mabADM WT
pET15b::inhA
S170K
pET15b::inhA
pET15b::inhAA244L pET15b::inhAA252R pET15b::inhAS170KA244L S170K-
pET15b::inhA A252R
pET15b::inhAA244LA252R
pET15b::inhATM pMV261::mabAWT pMV261::mabAG162L pMV261::mabAD228R pMV261::mabADM WT
pMV261::inhA pMV261::inhAS170K pMV261::inhAA244L pMV261::inhAA252R pMV261::inhAS170KA244L
pMV261::inhAS170KA252R A244L-
pMV261::inhA A252R
pMV261::inhATM
Gène hadA fusionné avec GAL4-BD, Gène hadC sous le contrôle du promoteur pMET clonés dans pBridge Gène hadB fusionné avec GAL4-BD, Gène hadA sous le contrôle du promoteur pMET clonés dans pBridge Gène hadB fusionné avec GAL4-BD, Gène hadC sous le contrôle du promoteur pMET clonés dans pBridge Gène hadC fusionné avec GAL4-BD, Gène hadA sous le contrôle du promoteur pMET clonés dans pBridge Gène hadC fusionné avec GAL4-BD, Gène hadB sous le contrôle du promoteur pMET clonés dans pBridge Gène mabA cloné dans pET15b pour surexpression Gène mabA muté G162L cloné dans pET15b pour surexpression Gène mabA muté D228R cloné dans pET15b pour surexpression Gène mabA muté G162L et D228R cloné dans pET15b pour surexpression Gène inhA cloné dans pET15b pour surexpression Gène inhA muté S170K cloné dans pET15b pour surexpression Gène inhA muté A244L cloné dans pET15b pour surexpression Gène inhA muté A252R cloné dans pET15b pour surexpression Gène inhA muté S170K et A244L cloné dans pET15b pour surexpression Gène inhA muté S170K et A252R cloné dans pET15b pour surexpression Gène inhA muté A244L et A252R cloné dans pET15b pour surexpression Gène inhA muté S170K, A244L ET A252R cloné dans pET15b pour surexpression Gène mabA cloné dans pMV261 Gène mabA muté G162L cloné dans pMV261 Gène mabA muté D228R cloné dans pMV261 Gène mabA muté G162L et D228R cloné dans pMV261 Gène inhA cloné dans pMV261 Gène inhA muté S170K cloné dans pMV261 Gène inhA muté A244L cloné dans pMV261 Gène inhA muté A252R cloné dans pMV261 Gène inhA muté S170K et A244L cloné dans pMV261 Gène inhA muté S170K et A252R cloné dans pMV261 Gène inhA muté A244L et A252R cloné dans pMV261 Gène inhA muté S170K, A244L et A252R cloné dans pMV261
183
N. Haddache
N. Haddache
N. Haddache
N. Haddache
N. Haddache D. Zerbib R.Veyron-Churlet R.Veyron-Churlet R.Veyron-Churlet T. Enjalbert T. Enjalbert T. Enjalbert S. Cantaloube T. Enjalbert S. Cantaloube S. Cantaloube S. Cantaloube D. Zerbib R.Veyron-Churlet R.Veyron-Churlet R.Veyron-Churlet T. Enjalbert T. Enjalbert T. Enjalbert S. Cantaloube T. Enjalbert S. Cantaloube S. Cantaloube S. Cantaloube
pMV261::mabAWT β4 pMV261::mabAWT β5 pMV261::mabAWT β6 pMV261::mabAWT α4β5 pMV261::mabAWT α4β6 pMV261::mabAWT α6β7 pMV261::mabAWT β4 gfp pMV261::mabAWT β6 gfp pMV261::mabAWT β6 gfp pMV261::mabAWT α4β5 gfp pMV261::mabAWT α4β6 gfp pMV261::mabAWT α6β7 gfp pMV261::mabAWT α3β5 gfp pMV261::inhAWT β4 pMV261::inhAWT β5 pMV261::inhAWT β6 pMV261::inhAWT gfp
β4
pMV261::inhAWT gfp
β5
pMV261::inhAWT gfp
β6
pMV361::gfp pMV261::gfp mabAWT pMV261::gfp inhAWT
Gène mabA avec un STOP de transcription introduit après le feuillet β4 cloné dans pMV261 Gène mabA avec un STOP de transcription introduit après le feuillet β5 cloné dans pMV261 Gène mabA avec un STOP de transcription introduit après le feuillet β6 cloné dans pMV261 Séquence codant pour les domaines allant de l’hélice α4 ou feuillet β5 de mabA cloné dans pMV261 Séquence codant pour les domaines allant de l’hélice α4 ou feuillet β6 de mabA cloné dans pMV261 Séquence codant pour les domaines allant de l’hélice α6 ou feuillet β7 de mabA cloné dans pMV261 Gène mabA avec un STOP de transcription introduit après le feuillet β4 avec gfp en C-ter cloné dans pMV261 Gène mabA avec un STOP de transcription introduit après le feuillet β5 avec gfp en C-ter cloné dans pMV261 Gène mabA avec un STOP de transcription introduit après le feuillet β6 avec gfp en C-ter cloné dans pMV261 Séquence codant pour les domaines allant de l’hélice α4 ou feuillet β5 de mabA avec gfp en Cter cloné dans pMV261 Séquence codant pour les domaines allant de l’hélice α4 ou feuillet β6 de mabA avec gfp en Cter cloné dans pMV261 Séquence codant pour les domaines allant de l’hélice α6 ou feuillet β7 de mabA avec gfp en Cter cloné dans pMV261 Séquence codant pour les domaines allant de l’hélice α6 ou feuillet β7 de mabA avec gfp en Cter cloné dans pMV261 Gène inhA avec un STOP de transcription introduit après le feuillet β4 cloné dans pMV261 Gène inhA avec un STOP de transcription introduit après le feuillet β5 cloné dans pMV261 Gène inhA avec un STOP de transcription introduit après le feuillet β6 cloné dans pMV261 Gène inhA avec un STOP de transcription introduit après le feuillet β4 avec gfp en C-ter cloné dans pMV261 Gène inhA avec un STOP de transcription introduit après le feuillet β5 avec gfp en C-ter cloné dans pMV261 Gène inhA avec un STOP de transcription introduit après le feuillet β6 avec gfp en C-ter cloné dans pMV261 Gène gfp cloné dans pMV261 Géne mabA avec gfp en N-ter cloné dans pMV261 Géne inhA avec gfp en N-ter cloné dans pMV261
184
R.Veyron-Churlet R.Veyron-Churlet R.Veyron-Churlet R.Veyron-Churlet
R.Veyron-Churlet
R.Veyron-Churlet
M. Gallego
M. Gallego
M. Gallego
M. Gallego
M. Gallego
M. Gallego
A. Turkieh S. Cantaloube et R. VeyronChurlet S. Cantaloube et R. VeyronChurlet S. Cantaloube M. Garcia Jove-Navarro
M. Garcia Jove-Navarro
M. Garcia Jove-Navarro D. Zerbib S. Cantaloube S. Cantaloube
pMV261::gfp kasA pMV261::gfp kasB
Géne kasA avec gfp en N-ter cloné dans pMV261 Géne kasB avec gfp en N-ter cloné dans pMV261
S. Cantaloube S. Cantaloube
5.1.3. Milieux et conditions de culture
5.1.3.1.
Cultures d’E. coli
Les cultures des souches d'E.coli (DZ137, Top10, BL21) sont faites à 37°C en milieu LuriaBroth (LB) additionné d'agar (LA) pour les cultures en milieu solide. Lorsque cela est nécessaire, les antibiotiques sont utilisés à une concentration de 100µg/mL pour l'ampicilline, 50 µg/mL pour la kanamycine et 30µg/mL pour le chloramphénicol.
5.1.3.2.
Cultures de S.cerevisiae AH109 et S.cerevisieae MAV203
Les souches AH109 et MAV203 sont cultivées à 30°C en milieu YEP (BIO 101®) additionné, après autoclave, de glucose à une concentration finale de 2% et d'adénine à une concentration finale de 0,003%. Les milieux sélectifs ont été élaborés avec le milieu synthétique DOB (BIO 101®) pour les cultures en milieux liquides ou DOBA (BIO 101®) pour les cultures sur milieux solides, auxquels sont ajoutés les acides aminés du Complete Supplement Mixture (BIO 101®). Les cultures des simples transformants ont été faites à partir de milieux privés de leucine (DOB-L et DOBA-L) ou de tryptophane (DOB-T ou DOBA-T) et les cultures des doubles transformants sur milieux privés de leucine et de tryptophane (DOB-LT et DOBA-LT). Les tests du double hybride ont été faits sur milieux DOBA-LT privés d'histidine (DOBA-LTH), privés d'adénine (DOBA-LTA) ou privés d'histidine et d'adénine (DOBA-LTHA) pour la souche AH109. Les tests de triple hybride ont été réalisés sur milieux DOBA-LT, en présence et en absence de méthionine, privés d'histidine (DOBA-LTH et DOBA-LTHM), privés d'uracile (DOBA-LTU et DOBA-LTUM) ou privés d'histidine et d'uracile (DOBA-LTHU et DOBA-LTHUM) pour la souche MAV203. De l'adénine était ajoutée aux milieux sélectifs, après autoclavage, à raison d'une concentration finale de 0,003% sauf pour les milieux nécessitant une absence d’adénine. On ajoute aux milieux DOBA-LTH et DOBA-LTHM du 3-AT à 75mM final afin d’éliminer le bruit de fond.
185
5.1.3.3.
Cultures de M.smegmatis mc²155
La souche mc2155 (ATCC 700084) est cultivée à 30, 37 ou 42°C pendant 2 ou 3 jours en milieu Tryptone Soja (TS, Difco ®) additionné d'agar pour les cultures sur milieux solides et complémentés en Tween80 à une concentration finale de 0,05% pour éviter l'agrégation des cellules. L'antibiotique utilisé est la kanamycine à une concentration de 50µg/mL.
186
5.2. Construction de vecteurs et transformation 5.2.1. Construction de vecteurs
5.2.1.1.
Analyse de l’ADN
L'ADN est analysé par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8% (Q-BIOgene®) dans un tampon de migration TAE 1X (10mM Tris, 40mM acide Acétique, 1mM EDTA pH8.0). L'ADN est dilué dans du tampon de charge 6X (10mM EDTA; glycérol 30%; bleu de bromophénol 0,25%; xylène cyanol 0,25%) à une concentration finale de 1X. Le marqueur de taille utilisé est le 1kb ladder (Biolabs®). Après une migration de 30 min dans un dispositif MUPID sous une tension de 100V, le gel est incubé dans du bromure d'éthidium (BET, ~1µg/mL) environ 20 minutes et l'ADN est révélé sous les UV à 254nm grâce à un dispositif alpha Imager.
5.2.1.2.
Digestion de l’ADN
Environ 1µg d'ADN est digéré par restriction enzymatique pendant 2h à 37°C dans un volume final de 100µL. Les enzymes utilisées pour les restrictions enzymatiques sont celles de Biolabs® sauf pour l'enzyme NdeI (Promega®) en présence de leur tampon recommandé par le fournisseur. À la fin de chaque réaction, les enzymes sont inactivées thermiquement en suivant les recommandations du fournisseur.
5.2.1.3.
Purification de l’ADN
Après restriction enzymatique ou PCR, l'ADN est purifié à l'aide du kit QIAquick PCR Purification (Qiagen®). Lorsqu'on veut isoler un fragment d'ADN parmi d'autres, l'ADN est déposé sur gel d'agarose, révélé sous les UV à 365nm et purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen®).
187
5.2.1.4.
Déphosphorylation de l’ADN linéaire
Pour limiter la re-circularisation du vecteur, l'ADN linéaire est déphosphorylé en ajoutant 3µL de Shrimp Alcaline Phosphatase (SAP, Amersham®) directement dans le milieu réactionnel et en incubant la réaction pendant 1h30 à 37°C.
5.2.1.5.
Ligation de l’ADN
La ligation d'un vecteur et d'un insert est réalisée sur environ 1µg d'ADN en respectant un ratio 1:5 pour les quantités respectives de vecteur et d'insert. La réaction est effectuée en présence de 2µL de T4 DNA ligase (Biolabs®) et de 3µL de son tampon d'incubation (10X) dans un volume final de 30µL. L'incubation a lieu sur la nuit à 16°C.
5.2.1.6.
Extraction d’ADN plasmidique
Pour le protocole de micro-extraction d'ADN plasmidique, les colonies sont prélevées à partir de patchs sur boîte puis sont lysées dans 25µL de solution S1 (10mM EDTA; 0,1N NaOH; SDS 2,5%). Après ajout de 16µL de solution S3 de neutralisation (0,25mM Tris-HCl pH8.0; 1M NaCl; tampon de charge 6X ADN; SDS 0,1%; 100µg/mL RNAse), les cellules sont vortexées puis lysées pendant 5 min à 65°C. Le culot protéique est précipité par centrifugation (10min à 13000rpm) et 10 µL du surnageant sont déposés sur gel d'agarose.
Les mini-préparations d'ADN plasmidique « classiques » sont réalisées à partir de 1,5mL d'une culture overnight avec le kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen®).
5.2.1.7.
Constructions des vecteurs dérivés de pGAD-T7, pGBK-T7 et pBridge
pour étude dans les systèmes double et triple hybride chez la levure
Le vecteur pGAD-T7 permet le clonage des gènes d’intérêt en aval de la séquence codante pour le domaine d’activation (AD) de l’activateur de transcription GAL4 chez la levure. Les vecteurs pGBK-T7 et pBridge permettent le clonage des gènes d'intérêt en aval de la séquence 188
codante pour le domaine de liaison à l’ADN (BD) de l'activateur de transcription chez la levure GAL4.
Dans pGAD-T7, la séquence codante pour le domaine AD est suivie par un promoteur T7 et par la séquence codante pour une étiquette HA (hémagglutinine), juste en amont du site multiple de clonage. De plus, pGAD-T7 possède un gène de résistance à l’ampicilline et le marqueur d’auxotrophie LEU2. Après le clonage d'un gène d'intérêt, la protéine résultante sera en fusion C-terminale avec le domaine AD et l'étiquette HA.
Le vecteur pGBK-T7 possède la même organisation génétique mais il contient la séquence codante pour le domaine BD de GAL4, la séquence d'une étiquette c-myc (proto-oncogène de 11 acides aminés), un gène de résistance à la kanamycine et la séquence codante pour le marqueur d'auxotrophie TRP1. Les protéines résultantes de nos gènes d’intérêt seront donc en fusion C-terminale avec le domaine BD et l’étiquette c-myc.
Le vecteur pBridge a une organisation génétique différente. Il permet le clonage de deux gènes d’intérêt dans le même vecteur. Le premier gène est cloné de telle sorte que la protéine qui en découle soit en fusion C-terminale avec le domaine BD. Le second gène est cloné sous le contrôle du promoteur pMet qui est réprimé en présence de méthionine.
Les gènes de Mtu que nous avons étudié ont été amplifiés par PCR, avec pour matrice l'ADN chromosomique de Mtb H37Rv, en utilisant la Pfu DNA Polymérase (Promega®) et un jeu spécifique de primers pour chaque gène ce qui a permis ensuite leur clonage en phase dans le site multiple de clonage des vecteurs pGBK-T7 et pGAD-T7.
5.2.1.8.
PCR et mutagenèse dirigée
L'amplification par PCR est réalisée dans un volume final de 50µL avec 1µL de polymérase Pfu (Amersham ®), son tampon de réaction (1X final), un mélange de dNTP (200µM final), les oligonucléotides (1µM final) et la matrice ADN (~10ng). Le protocole de PCR comporte 30 cycles : une étape de dénaturation à 96°C pendant 30sec, une étape d'hybridation des oligonucléotides à 60°C (température à optimiser selon la teneur en GC des oligonucléotides)
189
pendant 30sec, une étape d'élongation 68°C pendant 1min par kilobase du fragment à amplifier et enfin une étape de fin d'élongation pendant 10min à 72°C.
Les mutagenèses dirigées des gènes de FAS-II ont été réalisées de la façon suivante : on utilise une amplification par PCR inverse et des amorces de 40meres complémentaires entre elles. Les amorces sont choisies de telle façon qu'elles comportent dans leur séquence non seulement la mutation désirée mais aussi un nouveau site de restriction ou la suppression d'un site de restriction déjà existant dans les dérivés des vecteurs à muter. Le protocole de PCR inverse comprend 20 cycles de : 95°C pendant 30sec, 55°C pendant 1min et 68°C pendant 15min et l'enzyme utilisée est la Pfu (Amersham ®). Les produits de PCR sont ensuite digérés avec l'enzyme de restriction DpnI (Biolabs®) pour se débarrasser de la matrice parentale et on utilise le produit de la digestion pour transformer la souche d'E.coli DZ137. Le contenu des transformants est alors analysé par mini-préparation d'ADN plasmidique puis par restriction avec l'enzyme dont le site de coupure a été ajouté ou supprimé par la mutation. Chaque variant contenant une nouvelle mutation a été séquencé afin de s'assurer de l'absence d'une éventuelle mutation secondaire.
5.2.2. Transformation d’E.coli
5.2.2.1.
Préparation de cellules compétentes
Les cellules sont cultivées en milieu LB, en présence d'antibiotiques si nécessaire, jusqu'à une DO comprise entre 0,3 et 0,35 (début de la phase exponentielle de croissance). Les cellules sont concentrées et lavées par centrifugation puis traitées à la méthode du chlorure de calcium (technique de Mandel & Higa). Elles sont ensuite congelées à –75°C en présence de 20% de glycérol.
5.2.2.2.
Transformation
20µL de produit de ligation et 80 µL de solution A (10mM MOPS; 0,1M CaCl 2; 0,5% glucose) sont mis en présence avec 200µL de cellules compétentes. Un contrôle négatif (sans ADN ajouté) et un contrôle positif (avec le vecteur de départ) sont réalisés dans les mêmes 190
conditions afin de s'assurer de l'efficacité de la transformation. Après une incubation d'1h sur glace, les cellules sont soumises à un choc thermique pendant 2 min à 42°C ce qui entraîne une pénétration massive de l'ADN dans les cellules par décondensation de l'enveloppe.
Après ajout de 2,7mL de LB, les cellules sont incubées entre 2 et 3h à 37°C pour permettre une expression phénotypique (réparation de l'enveloppe, début de croissance, réplication et transcription du vecteur). Les cellules sont ensuite étalées sur milieu sélectif solide à raison de 200µL de solution de transformation par boîte. Après une nuit d'incubation à 37°C, les colonies sont sous-clonées sur boîtes sélectives (patchs) pour éliminer d'éventuelles colonies satellites et pour pouvoir procéder à l'étape de micro-extraction d'ADN plasmidique.
5.2.3. Electrotransformation de M. smegmatis
5.2.3.1.
Préparation de cellules compétentes
Une préculture de M.smegmatis mc2155 est réalisée dans 25mL de TS additionné de 125µL de Tween80 (0,05% final). Elle est incubée 2 à 3 jours à 37°C, 240rpm. Une culture de 100mL de TS est ensuite lancée à partir de 1mL de la préculture (dilution 100X) avec du Tween80 (0,05% final). La culture est incubée overnight (~8h) à 37°C, 240rpm. La culture est ensuite incubée 1h00 sur glace puis lavée par centrifugation (10 minutes, 4000rpm, 4°C) et le culot est repris dans 40mL d'eau + Tween80 (0,05% final) stérile. On procède à 3 lavages puis le culot est repris finalement dans 1mL d'eau + glycérol 10% froid et stérile. Les cellules sont aliquotées par 400µL dans des tubes Nunc® et stockées à –75°C.
5.2.3.2.
Transformation
100µL de cellules compétentes sont incubées 1min sur glace en présence de 10µL d'ADN (~1µg) et 100µL de glycérol 10% froid et stérile. Un témoin négatif (sans ADN) et un témoin positif (vecteurs pMV261 ou pMV361 parentaux) sont aussi réalisés suivant les mêmes conditions. L'électrotransformation se fait à l'aide du Biorad® Gene-Pulser à 2,5kV, 25µF et 1000Ω dans des cuvettes de 2mm. Après le choc électrique, les cellules sont reprises dans 1mL de TS et sont ensuite incubées au moins 3h à 30 ou 37°C pour permettre l'expression 191
phénotypique et la croissance des cellules. On étale ensuite 200µL de chaque transformation sur boîtes sélectives lesquelles sont incubées à 30, 37, ou 42°C pendant une semaine.
192
5.3. Surexpression et analyse des protéines 5.3.1. Analyse des protéines sur gel SDS-PAGE
Les protéines sont analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS homogène à 10 ou 12% selon la taille des protéines. La migration se fait à 170V pendant une heure environ dans du tampon Tris-Glycine (50mM Tris; 40mM glycine; SDS 0,1%). Le standard de taille utilisé est le Prestained Protein Marker (Biolabs®). La coloration du gel de protéines se fait dans une solution de bleu de Coomassie (Coomassie 0,25%; méthanol 50%; acide acétique 10%) pendant 1h et la décoloration (méthanol 30%; acide acétique 10%) se fait pendant 2h.
5.3.2. Test de surexpression des protéines chez E.coli
On ensemence 25mL de milieu LB avec 0,5 mL d’une préculture incubée overnight (dilution 50X) de la souche BL21(DE3)+RIL transformée par le dérivé du vecteur pET15b en présence d’ampicilline (100µg/mL). La culture est incubée à 37°C sous agitation (190rpm) jusqu’à une densité optique (DO) à 600nm d’environ 0,5 (phase exponentielle de croissance). On induit l’expression du gène d’intérêt par ajout d’IPTG (IsoPropyl-β-D-ThioGalactopyranoside) à une concentration finale d’1mM. Après 2 heures d’incubation, on collecte 1,5mL de culture induite. Les cellules sont centrifugées 3min à 13000rpm puis reprises dans du tampon de charge de protéines 5X (50mM Tris-HCl pH8.0 ; β-mercaptoéthanol ; SDS 10% ; glycérol 18% ; bleu de bromophénol 0,2%) à une concentration finale de 1X. Les protéines sont alors dénaturées 10min à 100°C avant migration sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE).
193
5.3.3. Surexpression et préparation d’extraits protéiques des réductases MabA et InhA
5.3.3.1.
Surexpression chez E.coli
Le protocole d’induction est le même que pour les tests de surexpression de protéines chez E.coli (chapitre1.3.2) hormis que le volume de culture est de 500mL ensemencé avec une culture overnight à raison d’une dilution 1/50ème. Après induction pendant 2h00 en présence d’IPTG à une concentration finale de 1mM, on centrifuge 400mL de culture (15min, 5000rpm à 4°C – rotor JA10). Le culot est resuspendu dans 100mL de tampon de rinçage (Tampon Phosphate (K+) pH 7.5 10mM), puis centrifugé (5000rpm, 15min, 4°C) et resuspendu dans 20mL de tampon de lyse (Tp Phosphate (K+) pH7.5 50mM, NaCl 0.5M, Imidazole 10mM, Lysosyme 0.5mg/mL, Triton X100 1%). Le triton permet de solubiliser les protéines. Le Lysat ainsi obtenu est aliquoté par fractions de 5mL et stocké à –20°C.
5.3.3.2.
Préparation des extraits protéiques
Les lysats obtenus précédemment sont décongelés sur agitateur (Varimix), 30 min à température ambiante On ajoute dans les lysats de la RNAse A (10µg/mL), de la DNAse I (5µg/mL) et du MgCl2 (10mM), puis on agite 15min sur Varimix en chambre froide (4°C). Une fois l’ADN et l’ARN hydrolysés, on centrifuge (5000rpm, 15min, 4°C – rotor JA25) puis on collecte le surnageant. Cette centrifugation a pour but d’évacuer les débris cellulaires. Le surnageant est de nouveau centrifugé (19000rpm, 15min, 4°C). Cette deuxième centrifugation permet d’évacuer les protéines de masse moléculaire très élevée sans pour autant entraîner la protéine d’intérêt. Un aliquot de 7,5µL est prélevé avant et après centrifugation et analysé en gel SDS-PAGE. L’extrait ainsi obtenu peut être purifié.
194
5.3.4. Purification des protéines MabA et InhA sur colonne NiNTA
Les extraits protéiques préparés au chapitre précédent contiennent la protéine d’intérêt mais également d’autres molécules contaminantes (acides nucléiques, autres protéines…). Le gène de la protéine d’intérêt est cloné dans le vecteur pET15b de telle façon que la protéine est étiquetée en position N-terminale par un "tag" Histidine (His6) qui présente une forte affinité pour le nickel. Nous allons donc utiliser un système de chromatographie comprenant une colonne Nickel-Agarose (NiNTA) couplée au système ÄKTA-FPLC (Pharmacia®) pour purifier la protéine d’intérêt. La purification s’effectue en chambre froide (4°C) afin de ne pas dénaturer la protéine. L’extrait est injecté dans la colonne, les protéines étiquetées sont retenues par affinité avec le nickel puis éluées par une solution d’imidazole en concentration suffisante qui va décrocher la protéine par un phénomène de compétition avec les noyaux d’imidazole de l’étiquette His6.
5.3.4.1.
Préparation de la colonne
Une colonne de 10 mL est remplie de NiNTA (Appligene®). Elle est ensuite montée sur le système ÄCKTA-FPLC. Le volume des solutions injectées correspond à chaque fois à l’équilibration des lignes de base (DO, pression, pH, conductivité). Les solutions sont injectées dans la colonne dans l’ordre suivant à un débit d’1mL/min : - EDTA 50mM ; NaCl 0,5M ; tampon phosphate (Na) pH7,4 20mM (décroche le nickel des expériences précédentes) - NaOH 1M pendant 30min (dégrade les protéines) - H2O - Tampon phosphate (K) 50mM ; NaCl 0,5M ; imidazole 10mM - H2O - NiSO4 0,1M (charge la colonne en nickel) - H2O - Tampon phosphate (K) 50mM ; NaCl 0,5M ; imidazole 10mM La colonne, chargée en nickel, peut être utilisée pour la purification
195
5.3.4.2.
Purification avec le système ACKTA-FPLC
On utilise un débit de 1mL/min et l'absorbance est suivie à 280nm. Les extraits (8*5mL = 40mL) sont injectés à l’aide d’une boucle de charge (superloop) de 50mL. On effectue un rinçage avec 30mL de tampon (Phosphate (K+) 50mM pH7.5, 0.5M NaCl, 50mM Imidazole). La protéine est ensuite éluée avec 30mL de tampon d'élution (Phosphate (K+) 50mM pH 7.5, 0.5M NaCl, 250mM Imidazole) qui sont collectés par fractions de 1mL. Enfin, la colonne est rincée, avant rééquilibrage, par 30mL de tampon (Phosphate (K+) 50mM pH7.5, 0.5M NaCl, 500mM Imidazole). Le système ÄKTA-FPLCTM est contrôlé par le logiciel unicorn. Le programme utilisé est le suivant : - Le débit de 1mL/min est fixé pour toute la durée du programme - Mode Load : 30mL d’équilibration avec le tampon A (Phosphate (K+) 50mM pH7.5, 0.5M NaCl, 10mM Imidazole) - Mode Inject : 50mL de tampon A qui permettent d’injecter dans la colonne 40mL d’extrait protéique contenus dans la boucle d’injection (superloop – 50mL) - Mode Load : 30mL de rinçage avec 91,84% de tampon A (Phosphate (K+) 50mM pH7.5, 0.5M NaCl, 50mM Imidazole) et 8,16% de tampon B (Phosphate (K+) 50mM pH7.5, 0.5M NaCl, 500mM Imidazole). Soit une concentration finale à 50mM en imidazole. - Mode Load Step1 : 30mL de 51% de tampon A et de 49% tampon B. Soit une concentration finale à 250mM en imidazole afin de décrocher la protéine d’intérêt. - Mode Load Step2 : 30mL de tampon B afin de rincer la colonne avant rééquilibrage. - Mode Load : 30mL de tampon A pour rééquilibrage.
Durant toute la durée de la purification, des fractions d’1mL sont collectées en sortie de colonne. On prélève 16µL par fraction d’intérêt que l’on analyse sur gel SDS-PAGE. Les fractions concentrées sont ensuite, soit utilisées directement pour des tests biochimiques, soit conservées à -80°C en présence de glycérol à 20% en volume final.
196
5.3.4.3.
Concentration des protéines sur colonne Vivaspin
Les protéines sont purifiées pour être analysées en chromatographie d'exclusion (perméation de gel). Il faut quelles soient en concentration suffisante (de l’ordre de quelques mg/mL). Lorsque la concentration en protéines (mesurée par la technique de Bradford) n’est pas satisfaisante, les fractions purifiées seront ultrafiltrées à l’aide d’une colonne Vivaspin 3 000 mwco. La technologie utilisée est une filtration tangentielle. On place 2mL de solution protéique à purifier dans le tube à ultrafiltration puis on centrifuge (4°C, 6000rpm) jusqu’à obtenir un volume d’environ 400µL. Une fois les protéines purifiées et concentrées, elles sont stockées en présence de glycérol (20% du volume final) à -20°C.
5.3.5. Analyse des protéines en gel filtration
5.3.5.1.
Gel filtration avec la colonne Superdex S75
On analyse les protéines purifiées par chromatographie d'exclusion. On injecte avec une seringue 200µL de solution de protéines purifiées sur une colonne Superdex 75 analytique (Pharmacia®). A l’aide du système ÄCKTA-FPLC, on élue (mode Load) avec 1.2 volume de colonne (Volume de la colonne = 22.5mL) à 0.5mL/min. Le tampon d’élution à la composition suivante : Phosphate (K+) 50mM pH 7.5, NaCl 0.5M.
5.3.5.2.
Gel filtration avec la colonne Superdex S200
Le fractionnement a lieu sur une résine Superdex 200 dans les mêmes conditions que l'analyse en Superdex 75. Le volume de cette colonne est de 30mL.
5.3.6. Test d’activité de MabA L'activité de MabA est mesurée grâce à son pouvoir de réduction des β-céto-acyls, réaction couplée à l'oxydation du NADPH en NADP+. MabA, à raison d'une concentration de 800nM 197
est mise en présence de son substrat C4-CoA et de son cofacteur NADPH. On suit alors l'évolution de la DO à 340nm, longueur d'ondes à laquelle absorbe le NADPH contrairement au NADP+. La réaction qui est suivie est donc la disparition du NADPH et la diminution de la DO à 340nm suite à son oxydation par MabA. Plus cette diminution de DO est importante, plus l'activité de la protéine est élevée.
Le suivi de DO s'effectue grâce à un spectrophotomètre interfacé avec le logiciel UVK923. Dans une cuve en quartz, on ajoute successivement 500µL de tampon 200mM en phosphate (Na), 300µL de protéine MabA à une concentration finale de 800nM et 100µL de NADPH 1mM. Une première mesure d'activité est réalisée sans substrat afin d'obtenir une ligne de base qui sera considérée comme correcte si la pente = ±0,0005 UDO/min. En effet, s'il n'y a pas de variation de DO, il n'y a pas de réaction d'oxydoréduction parasite qui consomme le NADPH. À ce moment là, on ajoute 100µL d'acéto-acétyl-CoA (le substrat) et on suit la mesure de la DO pendant 3min à raison de 300 points par minute.
Grâce à la formule UDO = ε.L.[NADPH], sachant que ε = 6,22 mM-1.cm-1, L=1cm et connaissant la pente de la courbe en UDO/min, on peut alors retrouver la vitesse initiale en mM de NADPH oxydé/min/mg de MabA.
5.3.7. Cristallographie de MabAG162L.
Les essais de cristallisation sont réalisés selon la méthode par diffusion de vapeur en goutte suspendue. La goutte est composée d’1µL de solution protéique (sortie de colonne NiNTA) auquel est ajouté 1µL de réservoir contenant le tampon de cristallisation et l’agent précipitant. La goutte est ensuite déposée sur une lamelle de verre rendue hydrophobe par silanisation. Cette lamelle est retournée et scellée par un joint de silicone sur un puit de boîte de culture cellulaire contenant un réservoir de 500µL de tampon+agent précipitant. Cette préparation est ensuite placée à 20°C pendant un temps indéfini.
Les cristaux obtenus sont préparés au laboratoire (travail réalisé en collaboration avec V. Guillet et L.Mourey) et amenés au Synchrotron à Grenoble pour diffraction.
198
5.4. Mesure des interactions protéine-protéine 5.4.1. Double hybride et triple hybride chez la levure
5.4.1.1.
Préparation des cellules compétentes
On ensemence 50mL de (YEP + glucose 2% + adénine 0,003%) ou de milieu DOB-L ou DOB-T avec 2,5mL de préculture overnight de la souche AH109 (ou MAV203) dans la même milieu. Après 12h00 d’incubations à 30°C et 250rpm d’agitation, les levures sont comptées sur cellule de Thoma puis resuspendues à raison de 109 cellules/mL dans une solution de resuspension (HEPES 20mM pH8.0 ; DTT 0,25mM dans du YEP + glucose 2% + adénine 0,003%). Pendant 30min, la resuspension est incubée à 30°C et agitée à 250rpm. S’en suit une série de trois lavages qui s’effectuent par centrifugation des cellules (3min, 3000rpm, 4°C) et resuspension dans du tampon d’électroporation (saccharose 270mM ; Tris-HCl 10mM ; MgCl2 1mM). Finalement, le culot est repris à raison de 2.109 cellules/mL. Les cellules compétentes sont prêtes à être utilisées le jour même et ne sont pas congelées.
5.4.1.2.
Transformation par électroporation
L’électroporation s’effectue en présence de 50µL de cellules AH109 (ou MAV203) compétentes et de 10µL d’ADN (~2µg) des vecteurs dérivés de pGAD-T7 ou pGBK-T7 (ou pBridge) à 650V pendant 15msec. Les cellules sont alors reprises dans 500µL de YEP + glucose 2% + adénine 0,003% dans un boîte 24 puits et incubées une heure à 30°C sans agitation (expression phénotypique). Elles sont ensuite centrifugées (2min, 13000rpm) puis resuspendues dans 200µL de YEP + glucose 2% + adénine 0,003% et étalées sur milieux sélectifs DOBA-L + adénine 0,003% pour les cellules transformées par les dérivés de pGADT7, DOBA-T + adénine 0,003% pour celles transformées par les dérivés pGBK-T7 ou pBridge et DOBA-LT + adénine 0,003% pour les doubles transformants. L’incubation s’effectue pendant une semaine à 30°C. Les doubles transformants sont obtenus en deux étapes de transformation.
199
5.4.2. Détermination de la force des interactions en double et triple hybride chez la levure
La souche de levure AH109 utilisée dans le système double hybride Matchmaker Two-Hybrid System 3 (Clontech®) possède deux gènes rapporteurs : HIS3 et ADE2 qui sont sous le contrôle de deux promoteurs différents GAL4-dépendants. Le promoteur contrôlant l’expression du gène HIS3 possède une UAS (Upstream Activation Sequence) de GAL4 forte ce qui permet la détection d’interactions faibles. Celui contrôlant l’expression du gène ADE2 possède une UAS de GAL4 plus faible ce qui permet la détection d’interactions fortes.
En ce qui concerne la souche MAV209 utilisée dans le système triple hybride, les deux gènes rapporteurs sont HIS3 et URA2. Ce dernier à une UAS de GAL4 faible.
Les protéines dont les gènes sont clonés dans pGAD-T7 sont fusionnées avec le domaine activateur (AD, Activator domain) de la polymérase de GAL4 et celles dont le gène est cloné dans pGBK-T7 sont fusionnées avec le domaine de liaison à l’ADN de GAL4 (BD, Binding domain). S’il y a interaction entre les deux protéines, l’activateur de transcription de GAL4 est mimé et les gènes HIS3 et/ou ADE2 sont transcrits. Le produit de ces gènes permet à la levure de se développer sur des milieux sans histidine ou sans adénine.
Pour le système de triple hybride, le principe est le même. De plus, le vecteur pBridge permet le clonage d’un gène supplémentaire, par rapport à pGBK, qui est sous le contrôle du promoteur pMet (réprimé en présence de méthionine et activé en absence de méthionine).
5.4.2.1.
Tests qualitatifs : stries
Les clones de levures AH109 dans lesquels un dérivé de pGAD-T7 et un dérivé de pGBK-T7 ont été transformés sont repiqués et striés sous forme de patchs sur différents milieux sélectifs en partant du milieu le plus sélectif jusqu’au milieu le moins sélectif : DOBA-LTHA, DOBALTA, DOBA-LTH + adénine 0,003% et DOBA-LT + adénine 0,003% (boîte de repousse). Trois
double
transformants
témoins
sont
également
striés
sur
chaque
boîte :
pGAD::agT+pGBK::p53 (témoin positif, Clontech®), pGAD::agT+pGBK::lam (témoin
200
négatif, Clontech®) et pGAD::inhA+pGBK::inhA (témoin positif interne au système FAS-II). Les boîtes sont ensuite incubées 15 jours à 30°C.
Les doubles transformants MAV203 sont également striés sur milieux sélectifs avec et sans méthionine (répression et activation du gène sous le contrôle du promoteur pMet) : DOBALTHU, DOBA-LTHUM, DOBA-LTU, DOBA-LTUM, DOBA-LTH, DOBA-LTHM, DOBALT (boîte de repousse) et DOBA-LTM. De l’adénine à 0,003% final est ajoutée à l’ensemble des milieux. On ajoute également du 3-AT à 75mM final dans les milieux DOBA-LTH et DOBA-LTHM afin d’éliminer le bruit de fond entraînant des faux positifs. Les trois contrôles précédents sont également striés sur les boîtes.
5.4.2.2.
Tests quantitatifs : dilutions spots
Les clones obtenus sur les boîtes de repousse (DOBA-LT) sont mis en culture pendant deux jours dans 2mL de DOB-LT + adénine 0,003%. On effectue ensuite des dilutions 10-1 à 10-7 et 5µL par dilutions sont déposés en spots sur l’ensemble des milieux sélectifs. Les boîtes sont ensuite incubées 15jours à 30°C.
5.4.2.3.
Evaluation de la force des interactions
- Une interaction est jugée positive (+) quand de nombreuses colonies sont visibles en patchs sur l’ensemble des milieux sélectifs et que l’on observe une repousse à des dilutions de 10-4 sur DOBA-LTH et à des dilutions de 10-3 sur DOBA-LTHA ou à des dilutions de 10-2 sur DOBA-LTHU. - Une interaction est jugée intermédiaire (+/-) quand seulement quelques colonies sont visible en patchs sur milieux sélectifs et que l’on observe une repousse à des dilutions de 10-1 sur DOBA-LTHA ou DOBA-LTHU. - Dans les autres cas, l’interaction a été définie comme étant négative.
201
5.4.3. Tests biochimiques en Co-Immunoprécipitation (Co-IP)
5.4.3.1.
Transcription/traduction in vitro
Les réactions de transcription/traduction in vitro sont réalisées en présence des vecteurs dérivés de pGAD-T7 et pGBK-T7 qui servent de matrice. Elles ont lieu dans un volume final de 50µL. On utilise 40µL du système TnT quick Coupled Transcription/Translation System (Promega®) auquel on ajoute environ 1µg d’ADN plasmidique soit en présence de 0,4µCi/µL de L-[35S]-méthionine (1000Ci/mmol ; Amersham®) soit avec 40µM de méthionine froide pour obtenir des protéines non marquées.
Le niveau d’expression des différents gènes étudiés est évalué en analysant 10µL de chaque transcription/traduction sur gel SDS-PAGE. Les gels sont séchés sous vide et les protéines radiomarquées au
35
S sont révélées par un dispositif de Phosphorimager (Storm-Applied
Biosystems®).
5.4.3.2.
Fixation de l’anticorps anti-HA sur les billes
200µL de billes (environ 8.107 billes) Dynabeads M450 Goat anti-Mouse IgG (Dynal®) sont lavées trois fois avec 300µL de PBS stérile. Les lavages s’effectuent en fixant les billes quelques secondes sur un portoir magnétique et en éliminant le surnageant. Les billes sont incubées à 4°C, overnight et sur roue en présence d’1mL de PBS-BSA 0,01% et de 3µL d’anticorps monoclonaux de souris anti-HA (Sigma®). Les billes sont alors lavées 3 fois avec 1mL de PBS-BSA 0,01% et sont finalement reprises dans 100µL de ce même tampon.
5.4.3.3.
Co-immunoprécipitation
On lave 10µL de billes préparées précédemment avec 100µL de PBS-BSA 0,01%. Les billes sont ensuite resuspendues dans 300µL de tampon d’incubation (50mM NaCl, 50mM Tris-HCl pH 7.4, 0.025% Tween 20). On ajoute 10µL de la h-protéine (protéine avec l’étiquette HA) et 10µL de c-protéine (protéine avec l’étiquette c-myc). Le tout est incubé à 4°C pendant deux heures sur roue. Après incubation, les billes sont lavées 3 fois avec 300µL de tampon de 202
rinçage (100mM NaCl, 100mM Tris-HCl pH 7.4, 0.025% Tween 20) puis resuspendues dans 20µL de tampon de migration pour protéines. Les protéines fixées sur les billes sont dénaturées pendant 10 min à 100°C et analysées sur gel SDS-PAGE. La migration a lieu sur des grands gels pendant 3h à 35mA. Les protéines radiomarquées sont révélées comme après la transcription/traduction.
203
5.5. Modélisation et alignements structuraux 5.5.1. Modélisation de structures de protéines
Pour modéliser les structures de protéines inconnues on utilise le serveur suivant : http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1 À partir de la séquence primaire de la protéine d’intérêt, le serveur va chercher des protéines homologues qui ont une structure connue dans la PDB (Protein Data Bank – www.pdb.org). À partir de cette structure connue, le serveur modélise notre protéine d’intérêt.
5.5.2. Alignements structuraux
Les alignements de structure de protéines deux à deux sont effectués sur le serveur Dalilite : http://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali_lite/start à partir des fichiers PDB des deux protéines étudiées.
5.5.3. Représentation 3D
Les représentations de nos protéines et des alignements de structures sont réalisées à l’aide du logiciel PyMol.
204
5.6. Microscopie 5.6.1. Préparation des échantillons
Les observations au microscope des souches M.smegmatis mc²155, dans lesquelles nous avons transformé les vecteurs pMV261 codant pour les gènes inhA-gfp, mabA-gfp, kasA-gfp et kasB-gfp, sont réalisées soit à partir de colonies sur boîte, soit à partir de cultures liquides. On strie une colonie ou on dépose 10µL de culture sur un milieu solide M9 (Sigma®) entre lame et lamelle.
5.6.2. Observations au microscope
Les observations ont été réalisées grâce à un vidéo-microscope à champ large inversé (Leica® DMIRB) équipé d’un objectif à immersion (Leica® X100). Le vidéo-microscope est piloté par le logiciel Metamorph®. L’excitation de la GFP est obtenue grâce à une lampe à Xénon et un filtre d’excitation spécifique à la GFP (470/20 (Omega XF1043)). L’acquisition des images est effectuée à l’aide d’une caméra numérique couleur (CCD Cool Snap HQ) paramétrable par le logiciel Metamorph.
Les images sont traitées à l’aide du logiciel ImageJ®.
205
6. Références bibliographiques
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Figure S1 : Analyse en Co-IP des différentes ACCases et de FadD32 contre les protéines de FAS-II. Les hprotéines seules : première colonne. Les c-protéines seules : colonnes (-). Les Co-IP : colonne (IP). Quand la taille des protéines est similaire, les réactions ont eu lieu avec une h-protéine froide et une c-protéine radiomarquée. Ces Co-IP sont signalées par un (*).
ccccccAccA3 AccD4 AccD5 AccE5 AccD6 FadD32
ccccccAccA3 AccD4 AccD5 AccE5 AccD6 FadD32
h-T3
h-T1 ccccccAccA3 AccD4 AccD5 AccE5 AccD6 FadD32
ccccccAccA3 AccD4 AccD5 AccE5 AccD6 FadD32
h-T4 h-T2
h-T1-T2-T3-T4/KasA h-T1-T2-T3-T4/FabH
c-KasA
h-T1
h-T2
h-T3
h-T4
c-KasB c-FabH
Figure S2 : Analyse en Co-IP des différents domaines de Pks13 contre les ACCases, KasA, KasB et mtFabH.
Figure S3 : Analyse en Co-IP des différentes méthyltransférases contre les protéines de FAS-II. Les hprotéines seules : première colonne. Les c-protéines seules : colonnes (-). Les Co-IP : colonne (IP). Quand la taille des protéines est similaire, les réactions ont eu lieu avec une h-protéine froide et une c-protéine radiomarquée. Ces Co-IP sont signalées par un (*).
Figure S4 : Modèles des méthyltransférases MmaA1, MmaA3 et UmaA (respectivement de droite à gauche)
Architecture and essentiality of the mycolic acids biosynthesis complexes from the pathogenic bacteria Mycobacterium tuberculosis. Mycolic acids are major constituents of mycobacteria envelope. The essential mycolic acids biosynthesis pathway use two fatty acids elongation systems : FAS-II (several enzymes) and FAS-I (mega-enzyme which has all the catalytic domains). It was shown that FAS-II enzymes interact whith themselves to form elongation complexes. This study completes the biosynthesis pathway interactome. New partners were integrated to the interactions network thanks to yeast double and triple hybrid and co-immunoprecipitation. Structural alignments between FAS-II enzymes and mFAS-I allow us to propose an original interactome model of the mycolic acids biosynthesis pathway. Finally, we have studied homotypic interactions of the system reductases (MabA and InhA). We have shown that α4α5 interface homomultimersiation is essential for mycobacteria survival. So, this interface is a new target to find new antituberculous drugs.
Auteur : Sylvain CANTALOUBE
Titre : Architecture et essentialité des complexes de biosynthèse des acides mycoliques de la bactérie pathogène Mycobacterium tuberculosis.
Directeur de thèse : Dr. Didier ZERBIB
Lieu et date de soutenance : Salle de conférence F. Gallais, 205 route de Narbonne, 31077 Toulouse CEDEX 04. Le Mardi 26 Janvier 2010
Résumé : Les acides mycoliques sont des constituants majeurs de l’enveloppe mycobactérienne. La voie essentielle de biosynthèse des acides mycoliques fait intervenir deux systèmes d’élongation d’acides gras : FAS-II (plusieurs enzymes) et FAS-I (méga-enzyme qui possède tous les domaines catalytiques). Il a été montré que des enzymes de FAS-II interagissent entre elles pour former des complexes d’élongation. Ces travaux complètent l’interactome de la voie de biosynthèse en intégrant dans le réseau d’interaction de nouveaux partenaires par des techniques de double et triple hybride chez la levure et de co-immunoprécipitation. Les alignements des structures des enzymes de FAS-II sur celle de mFAS-I nous ont permis de proposer un modèle original de l’interactome de la voie de biosynthèse des acides mycoliques. Enfin, nous avons étudié les interactions homotypiques des réductases du système (MabA et InhA) et montré que l’homomultimérisation à l‘interface α4α5 est essentielle à la survie des mycobactéries, faisant de cette interface une cible dans la recherche d’antituberculeux.
Mots-clés : Mycobacterium tuberculosis, acides mycoliques, FAS-II, FAS-I, interactions protéine-protéine, interactome
Discipline administrative : Microbiologie
Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale du CNRS (UMR 5089 UPS-CNRS)