THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE (PARIS VI)
Spécialité
Océanologie Biologique Présentée par Flavienne BRUYANT pour obtenir le grade de Docteur de l’Université Pierre et Marie Curie Sujet de la thèse
Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse : Etude dans différentes conditions hydrologiques et trophiques.
Soutenue le 11 Mars 2002 devant le jury composé de : Monsieur Marlon R. LEWIS - Rapporteur Monsieur Warwick F. VINCENT - Rapporteur Monsieur Louis LEGENDRE - Examinateur Monsieur Bernard GENTY - Examinateur Monsieur Paul NIVAL - Examinateur Monsieur Philippe LEBARON - Examinateur Monsieur Marcel BABIN - Directeur de thèse
Laboratoire d’Océanographie
Observatoire Océanologique
de Villefranche sur mer (L.O.V.)
de Villefranche sur mer (O.O.V.)
Remerciements Après ces quatre années passées au Laboratoire d’Océanographie de Villefranche, voici le temps de pouvoir enfin remercier toutes les personnes qui ont permis la réalisation de ce travail de thèse. En tout premier lieu, je tiens à remercier Marcel BABIN, qui durant ces années n’a ménagé ni son temps ni sa peine pour m’aider à mener à bien ces travaux. Avec une disponibilité sans faille il a su me transmettre sa rigueur et ses connaissances, en prodiguant à maints reprises les encouragements nécessaires. J’espère avoir été digne de la chance qu’il m’a donné et de la confiance qu’il a bien voulu m’accorder. Certaines personnes ont bien voulu me faire profiter de leur compétences dans des domaines variés en répondant à mes nombreuses questions sans jamais perdre patience. Ils ont toujours été disponibles et ont ainsi grandement participer à ce travail. Merci à Annick BRICAUD, Hervé CLAUSTRE, Antoine SCIANDRA, Louis PRIEUR et André MOREL. Cette thèse a été réalisée au sein du Laboratoire de Physique et Chimie Marine (L.P.C.M.) devenu par la suite Laboratoire d'océanographie de Villefranche (L.O.V), que je remercie pour l’environnement intellectuel et l’appui humain, matériel et financier qui m’a été donné. Merci aux trois directeurs successifs : Jean-Claude MARTY, Louis PRIEUR et Louis LEGENDRE. En finissant ce manuscrit, je tiens à remercier tous ceux qui ont accepter d’en faire l’évaluation en faisant partie de mon jury : Marlon LEWIS, Warwick VINCENT, Louis LEGENDRE, Bernard GENTY, Paul NIVAL et Philippe LEBARON. Ce travail de thèse a été financé par le programme européen PROMOLEC (contrat n° MAS3-CT97-0128) coordonné par Frederic PARTENSKY de la station biologique de Roscoff. Je veux ici le remercier ainsi que toute l’équipe “phytoplancton océanique” qui a grandement contribuer à la réussite de l’atelier de travail organisé à Roscoff : Daniel VAULOT, Dominique MARIE, Jean BLANCHOT, Stéphan JACQUET. Je tiens à remercier également tout spécialement Sandrine BOULBEN et Florence LEGALL pour l’incroyable qualité des multiples cultures axéniques de Prochlorococcus qu’elles ont su me procurer. L’aide de nombreuses personnes m’a été indispensable au cours de ce travail afin de résoudre les problèmes techniques et informatiques auxquels j’ai été si souvent confrontée : Francis
LOUIS, Marie-Paule TORRE, Bernard GENTILLI, Martine FIORINI, Linda FERE et Ulrike MEYER. D’autres ont accepter de relire ce manuscrit, merci à Cécile GUIEU et Céline RIDAME. Dans cette thèse sont utilisés des résultats scientifiques qui ont été fournis par de nombreux collaborateurs : Dominique MARIE, Laurence GARZARECK, Julia HOLTZENDORF, Dominique TAILLIEZ, Patrick RAIMBAULT, Karine LEBLANC, Stéphane BLAIN, Cécile GUIEU, JeanClaude MARTY, Hervé CLAUSTRE, Joséphine RAS, Bernard GENTY, Ondrej PRASIL, Marcel BABIN, Thierry MOUTIN, Yves GRATTON, Caroline LAFFLEUR, Pascal MORIN, Jean “de Rosette”… Qu’ils trouvent ici mes sincères remerciements. Une grande partie de ce travail a été effectué en mer à bord des navires océanographiques l’Atalante et Thalassa de l’IFREMER. Le dévouement et le professionnalisme des marins GENAVIR : matelots, mécaniciens et officiers, m’a permis de toujours mener à bien mes expériences scientifiques. Je suis heureuse aujourd’hui de les remercier pour leur aide précieuse mais aussi leur bonne humeur et leur gentillesse. Certains sont devenus des amis, mention spéciale à Patrick, Philippe, Christophe, Michel et Laurent. Puisque vient le tour des amis, merci à tous, vous du LPCM/LOV/LOBEPM qui avez su faire de ces années des moments de joie. Aux habitants successifs de la mezzanine, Franck, Grigor, Manu, Joséphine, David. Aux (trop) nombreuses filles, Céline, Valérie, Miléna, Nathalie, Florence, Aurélie, Delphine, Marie, Linda, Emilie, Sophie et aussi à Fred, Eric, Manu, Dominique, Jean (pour celles du matin), Davy, Dom… Merci également à Pénéloppe, à Sophie et à mes chéris Mexico, Usland et Héolde, pour toutes ces heures où il n’existait plus rien d’autre que le bonheur d’être en selle. Sans vous aussi les angoisses et les doutes auraient peut être réussi à prendre le dessus. Enfin et par dessus tout le reste, merci à Papa et Maman d’avoir attendu si longtemps avant de pouvoir dire “ma fille a fini ses études” en me poussant chaque jour un peu plus d’avantage, et merci à Olivier pour son soutient et sa patience à supporter mes humeurs (et les trop nombreuses pizza surgelées).
Résumé Le thème central de cette thèse est l’étude des variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse marine. Cette étude a été menée pour compléter la documentation des données acquises en mer des paramètres photosynthétiques et pour tenter d’identifier les différents facteurs gouvernant les variations de la photosynthèse ainsi que les interactions existant entre ces facteurs. Ceci a été fait dans le but d’envisager une possible amélioration des modèles prédictifs de la production primaire en prenant éventuellement en compte les variations circadiennes de la photosynthèse. Dans un premier temps, les facteurs induisant des variations circadiennes de la photosynthèse chez le procaryote photosynthétique marin Prochlorococcus ont été identifiés en travaillant sur une culture continue. Le rôle couplé de l’irradiance et du cycle cellulaire a ainsi pu être mis en évidence. Le même type d’étude a ensuite été conduit en mer dans un premier temps dans un système hydrologiquement stable. L’influence du régime trophique sur l’efficacité de la photosynthèse a pu être confirmé et le phénomène responsable des variations circadiennes de la fluorescence a pu être identifié. Lors d’une troisième étude menée dans un système hydrologiquement perturbé, la prédominance de l’influence du champ de lumière disponible crée par le mouvement des masses d’eau sur les variations circadiennes de l’éclairement a pu être mise en évidence. Cette étude permettra d’améliorer la prédiction de la production primaire à une échelle globale en incluant à l’avenir les variations circadiennes des paramètres physiologiques pris en compte dans les modèles.
Abstract The central theme of this thesis is the study of the diel and spatial variations in the marine photosynthesis. This study was carried on to complete the in situ data set of photosynthetic parameters and to identifying the different parameters governing the changes in photosynthesis as well as the interactions existing between them. This was done to try to improve the primary production predicting models by taking into account the diel changes in photosynthesis. First of all, the phenomena involved in the diel changes in photosynthesis on the photosynthetic procaryote Prochlorococcus were identified working on a continuous culture. The coupled role of diel irradiance changes and cell cycle was evidenced. The same kind of study was then carried on at sea. In a hydrologically stable system, the influence of trophic conditions on the photosynthesis efficiency was confirmed and the phenomenon responsible of the diel changes in fluorescence was identified. In a hydrologically perturbed area, the predominance of the irradiance field influence was confirmed (induced by the water circulation) if compared to diel changes in irradiance. This study will allow to improve the prediction of primary production at a global scale by taking into account the diel variations of the physiological parameters in the predicting models.
Sommaire général
Liste des figures
vi
Liste des abréviations
xii
Introduction générale
1
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
◊
11
Introduction __________________________________________________________ 14 I.
Pourquoi Prochlorococcus ? _________________________________________________ 15
II.
Le mode de culture ________________________________________________________ 16
III. Organisation du chapitre ___________________________________________________ 18
◊
Mise au point du système de culture original : le turbidostat ___________________ 19 I.
Le matériel du système de culture ____________________________________________ 19
II.
Détermination des conditions optimales de culture ______________________________ 21 A.
Méthodes de mesure _____________________________________________________________ 21
B.
Taux de croissance et capacité maximum du milieu_____________________________________ 22
C.
Conditions à respecter lors de la culture en turbidostat __________________________________ 22
III. Mise en place du turbidostat ________________________________________________ 23 A.
Taux de dilution ________________________________________________________________ 23
B.
Contrôle de l’axenie _____________________________________________________________ 24
C.
Résultats du premier turbidostat ____________________________________________________ 24
IV. Conclusion _______________________________________________________________ 25
◊
Matériel et méthodes ___________________________________________________ 25
i
I.
Le cyclostat_______________________________________________________________ 25 A.
Adaptation aux grands volumes ____________________________________________________ 26
B.
Le système d’éclairement _________________________________________________________ 27
II.
Adaptation de la culture et échantillonnage ____________________________________ 29 A.
Une acclimatation progressive _____________________________________________________ 29
B.
Echantillonnage ________________________________________________________________ 29
C.
Répétition des expériences ________________________________________________________ 30
III. Analyses en cytométrie en flux _______________________________________________ 30 IV. Détermination du contenu cellulaire en carbone ________________________________ 31 V.
Analyses pigmentaires______________________________________________________ 31
VI. Détermination du coefficient d’absorption _____________________________________ 31 VII.
Paramètres de la relation fixation de carbone vs. éclairement ___________________ 32
VIII.
Mesures de la fluorescence ________________________________________________ 35
IX. Transcription des gènes impliqués dans la photosynthèse_________________________ 36
◊
Résultats _____________________________________________________________ 37 I.
Maintien de l’axénie _______________________________________________________ 37
II.
Contenu cellulaire en carbone _______________________________________________ 37
III. Concentrations pigmentaires ________________________________________________ 37 IV. Les paramètres photosynthétiques ___________________________________________ 38 V.
Variations des propriétés fonctionelles du photosystème 2 ________________________ 39
VI. Transcription du gène rbcL _________________________________________________ 41 VII.
◊
Transcription des gènes codant l’appareil photosynthétique ____________________ 41
Discussion ___________________________________________________________ 41 I.
Synchronisme de la division cellulaire_________________________________________ 41
II.
Influence sur la fixation de carbone___________________________________________ 43
III. Quelles variations au niveau du photosystème 2 ? _______________________________ 46 IV. Récupération de la photoinhibition et effets du cycle cellulaire ____________________ 49
◊
Conclusions __________________________________________________________ 51
ii
I.
Le système de culture ______________________________________________________ 51
II.
Une cascade d’événements __________________________________________________ 52
III. Production primaire et modélisation __________________________________________ 54
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : influence du régime trophique.
◊
56
Introduction................................................................................................................... 59 I.
La campagne PROSOPE .....................................................................................................59
II.
Une stratégie d’échantillonnage adaptée............................................................................61
III. Quels axes dans cette étude ?...............................................................................................62 IV. Organisation de ce chapitre.................................................................................................63
◊
Matériels et Méthodes ................................................................................................... 63 I.
Acquisition sur les profils ....................................................................................................63
II.
Echantillons Discrets ............................................................................................................64 A.
Dosage des sels nutritifs ..................................................................................................................64 a. Analyses des Nitrates (NO3-)............................................................................................................64 b. Analyses du Phosphore réactif dissous (PO42-)................................................................................64 c. Analyses de Silicates (Si (OH)4).......................................................................................................64 d. Analyses du Fer ...............................................................................................................................65
III. Détermination des concentrations pigmentaires ...............................................................65 A.
Méthode d’analyse...........................................................................................................................65
B.
Indicateurs des communautés phytoplanctoniques ..........................................................................65
IV. Détermination de l’absorption spécifique ..........................................................................67 V.
Détermination des paramètres de la relation entre le taux de fixation de carbone et
l'éclairement...................................................................................................................................68 VI. Etude de la fluorescence.......................................................................................................70
◊
A.
Etudes des variations circadiennes de la fluorescence : mesures en “configuration pont”. .............70
B.
Echantillons discrets : le Xe-PAM...................................................................................................71
Résultats et Discussion ................................................................................................. 71
iii
I.
Structure hydrologique et trophique ..................................................................................72 A.
Les conditions hydrologiques ..........................................................................................................72
B.
Les sels nutritifs...............................................................................................................................73 a. Nitrates et Phosphates .....................................................................................................................73 b. Fer et Silice......................................................................................................................................73
II.
La répartition du Phytoplancton ........................................................................................74 A.
Biomasse totale................................................................................................................................74
B.
Répartition des communautés phytoplanctoniques..........................................................................74
C.
Biomasse intégrée............................................................................................................................75
III. Quelles conditions trophiques ? ..........................................................................................75 IV. Variations des paramètres photosynthétiques liées aux régimes trophiques..................76 A.
Au site eutrophe UPW .....................................................................................................................76
B.
Au site oligotrophe DYF..................................................................................................................78
C.
Au site ultra-oligotrophe MIO .........................................................................................................79 a. Population de surface ......................................................................................................................80 b. Population profonde ........................................................................................................................80 c. Le rôle des sels nutritifs ...................................................................................................................81
V.
◊
Variations circadiennes........................................................................................................81 A.
Acquisition en configuration “pont” ................................................................................................82
B.
Les profils d’échantillons discrets ...................................................................................................85
Conclusions ................................................................................................................... 86
Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à mésoéchelle dans une zone frontale.
89
◊
Introduction ________________________________________________________91
◊
Matériels et méthodes ________________________________________________93 I.
La stratégie d’échantillonnage ____________________________________________ 94 A.
Leg 1 ______________________________________________________________________ 94
B.
Leg 2 ______________________________________________________________________ 95
iv
II.
Couche de mélange et couche euphotique ___________________________________ 96
III. Mesure des concentrations en sels nutritifs__________________________________ 96 IV. Analyses pigmentaires___________________________________________________ 96 V.
Détermination de l’absorption spécifique ___________________________________ 97
VI. Paramètres de la courbe P vs. E ___________________________________________ 97
◊
Résultats ___________________________________________________________98 I.
Structures hydrologiques et statuts trophiques ______________________________ 98
II.
Répartition des communautés phytoplanctoniques __________________________ 100
III. Répartition des paramètres photosynthétiques _____________________________ 101 IV. Variabilité circadienne des paramètres photosynthétiques____________________ 103
◊
Discussion ________________________________________________________104 I.
Structures et caractéristiques physiques des différentes masses d’eau __________ 104
II.
Effets de la photoacclimatation et de la disponibilité en nitrates sur les paramètres
photosynthétiques dans les eaux méditerranéennes et dans le tourbillon atlantique ___ 106 III. Variations des paramètres photosynthétiques dans la zone frontale et processus physiques associés__________________________________________________________ 109 IV. Variations circadiennes de la photosynthèse________________________________ 112
◊
Conclusion ________________________________________________________113
Conclusions générales
116
Bibliographie générale
123
Annexes
147
v
Liste des figures
Introduction Figure 1 :
Exemple d’une courbe P vs. E. ....................................................................... 3
Figure 2 :
Schéma simplifié de l’appareil photosynthétique........................................... 4
Chapitre I
Figure I-1 :
Schéma du système de culture original tel qu’il a été utilisé lors de la mise au point de l’expérience................................................................................ 20
Figure I-2 :
Spectre de transmission du filtre LEE n° 183 “Moonlight blue”.................. 21
Figure I-3 :
Evolution de l’absorbance à 442 nm en fonction du temps pour la culture en batch mise en place lors de la première expérience (détermination des conditions optimales). Une fonction exponentielle a été ajustée aux données expérimentales dans la fenêtre illustrée sur le graphique par la flèche, afin de déterminer le taux de croissance maximum (µmax)................ 22
Figure I-4 :
Evolution de l’absorbance à 442 nm en fonction du temps durant la première culture en turbidostat. L’absorbance augmente tout d’abord pendant la phase “batch”, puis reste stable pendant la phase “turbidostat”. Au jour 10.75 la dilution a été augmentée, au jour 15.75 elle a été stoppée. ......................................................................................................... 24
Figure I-5 :
PAR comme un fonction du temps durant les expériences cyclostat............ 27
Figure I-6 :
PAR vs. entrée en courant continu, réponse de l’ensemble ballast / tube néon. Les données de deux séries de mesures ont été compilées pour calculer une moyenne lissée par la méthode des moindres carrés. ............... 27
Figure I-7 :
Spectre d’éclairement des tubes néons utilisés durant l’expérience “cyclostat”, mesuré à 3 différents niveaux d’entrée de courant continu (1, 5 et 10 VCC) correspondant à 1, 42 et 100% de l’éclairement maximal des tubes.............................................................................................................. 28
Figure I-8 :
Déroulement schématisé de l’expérience de détermination de la relation entre fixation de carbone et éclairement ....................................................... 32
Figure I-9 :
Déroulement schématisé de l’expérience de détermination des différents taux d’émission de fluorescence par la technique utilisant le fluorimètre à amplitude modulée........................................................................................ 35
Figure I-10 :
Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1, lignes continues) et des concentrations en divinyle-chlorophylle a (µg cellule-1, cercles noirs) et en zeaxanthine (µg cellule-1, cercles blancs) pendant les trois jours d’échantillonnage.......................................................................................... 37
vi
Figure I-11 :
Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1), du rendement quantique maximal de fixation de carbone (φCmax , mol C (mol quanta)-1) et du coefficient d’absorption spécifique moyen ( a * , m2 (mg div-chl a)-1)...... 38
Figure I-12 :
Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1), du taux maximal B spécifique de fixation de carbone ( Pmax , mg C (mg div-chl a)-1h-1) et du paramètre de saturation (EK, µmol quanta m-2s-1). ....................................... 38
Figure I-13 :
Accumulation de carbone dans le cyclostat numéro 1 calculée sur une période de lumière. 12A : taux instantané de fixation de carbone (PB, mg C (mg div-chl a)-1 h-1). Données interpolées toutes les 10 minutes. 12B : Quantité cumulée de carbone fixé sur une période de jour (ΠB, mg C (mg div-chl a)-1). Les symboles blancs correspondent aux calculs tenant compte de la variation de PBmax et de αB au cours de la journée, les symboles gris correspondent aux calculs fait en prenant des paramètres fixes ................... 39
Figure I-14 :
A : Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1) et des rendements quantiques minimum (φFo ) et maximum (φFm ) de la fluorescence mesurés après une adaptation à l’obscurité de 30 minutes à l’aide du fluorimètre à amplitude modulée. B : Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m2 -1 s ), de l’efficacité photochimique du photosystème 2 (Fv/Fm) mesuré par les techniques de fluorescence PAM et de fluorescence FRR, et de la section efficace d’absorption effective du photosystème 2 (σPS2) mesurée par la technique FRR. ................................................................................... 39
Figure I-15 :
Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1), du rendement quantique de fluorescence mesuré à l’état stable (φFs), du rendement quantique minimum de fluorescence mesuré à la transition au noir (φF’o) et du rendement quantique maximum mesurés à la lumière ( φ F′m ). ................ 39
Figure I-16 :
Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1) et du taux de réoxydation de la plastoquinone QA, les données ont été acquises avec la technique de fluorescence DMK. .................................................................. 40
Figure I-17 :
Quantité de transcrit ARNm du gène rbcL (codant la grosse sous-unité de la RubisCO) en fonction du temps.................................................................... 40
Figure I-18 :
Effet du cycle jour-nuit sur la synchronisation de l’expression des gènes photosynthétiques : A : Variations du PAR (µmol quanta m-2s-1). B : Pourcentage de cellules en phase G1 (interphase). C : Quantité de transcrit ARNm du gène psbA. D : Quantité de transcrit ARNm du gène pcbA.. Figure reproduite de Garczarek et al., 2001.................................................. 41
Figure I-19 :
Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1), de la fluorescence de l’ADN cellulaire, ainsi que du NFS (Near Forward Scattering), obtenues lors de l’expérience principale...................................................................... 42
Figure I-20 :
Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1), du pourcentage de cellules en phase G1, ainsi que de la dérivée par rapport au temps de ce pourcentage, indicateur de l’intensité relative du phénomène de division cellulaire. ...................................................................................................... 42
Figure I-21 :
Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1), et du rendement quantique maximal de fluorescence (φFm ) mesuré ou recalculé à l’aide du modèle de Neale. La dérivée du pourcentage de cellules en G1 indique le moment de la division cellulaire................................................................... 50
vii
Chapitre II
Figure II-1 :
Trajet du navire et emplacement des stations d’échantillonnage lors de la campagne PROSOPE. Les points rouges représentent les stations courtes 1 à 9 ; les étoiles représentent les stations longues .......................................... 60
Figure II-2 :
Déroulement schématisé de l’expérience de détermination de la relation “fixation de carbone vs. éclairement”. .......................................................... 68
Figure II-3 :
Schéma simplifié du photosynthétron radial utilisé lors de la campagne PROSOPE, d’après Babin et al., 1994. A : Schéma global vu du dessus. B : Détail en coupe longitudinale d’une chambre d’incubation ......................... 69
Figure II-4 :
Conditions hydrologiques de température A (°C) et excès de densité B (kg m-3) aux 3 stations longues visitées durant la campagne PROSOPE : UPW en vert, MIO en bleu et DYF en rouge ......................................................... 72
Figure II-5 :
Abondance des sels nutritifs aux 3 stations longues visitées lors de la campagne. 4A : NO3 (données fournies par P. Raimbault) 4B : PO4 (données fournies par T. Moutin), 4C : Fer (données fournies par S. Blain et C. Guieu) et 4D : Si(OH)4 (données fournies par B. Quéguiner). ........... 73
Figure II-6 :
Concentration en TChl a (mg m-3) aux 3 stations longues visitées lors de la campagne PROSOPE : UPW en vert, MIO en bleu et DYF en rouge.......... 74
Figure II-7 :
Proportions relatives des trois classes de taille du phytoplancton aux 3 stations longues visitées lors de la campagne ; microphytoplancton en vert, nanophytoplancton en violet et picophytoplancton en bleu.......................... 75
Figure II-8 :
Paramètres photosynthétiques le long de la colonne d’eau aux trois sites visités lors de la campagne, UPW en vert, MIO en bleu et DYF en rouge. B 8A : Pmax le taux maximal de fixation de carbone [mg C (mg chl a)-1h-1], 8B : αB l’efficacité photosynthétique [mg C (mg chl a)-1h-1 (µmol quanta m-2s-1)-1], 8C : φCmax le rendement quantique de fixation de carbone [mol C (mol quanta)-1] et 8D : φ CPSmax , le rendement quantique de fixation de carbone correspondant à la seule absorption des pigments photosynthétiques [mol C (mol quanta)-1]. ................................................... 76
Figure II-9 :
Photoacclimatation aux trois sites visités lors de la campagne, UPW en vert, MIO en bleu et DYF en rouge. 9A :Répartition de l’indice NPP (pigments photoprotectants) et 9B : paramètre de saturation EK (µmol quanta m-2s-1) ................................................................................................ 77
Figure II-10 :
Efficacité photochimique du PS2, Fv/Fm (sans dimensions) aux trois site visités lors de la campagne : UPW en vert, MIO en bleu et DYF en rouge. ............................................................................................................ 77
Figure II-11 :
Absorption au site UPW ; 11A : spectres d’absorption spécifique (m² (mg chl a)-1), à différentes profondeurs 11B : spectres d’absorption du phytoplancton avant normalisation par la quantité de chlorophylle a à différentes profondeurs................................................................................. 78
Figure II-12 :
Contribution des phaeopigments à la chlorophylle a totale au site UPW. Concentration en chlorophylle a totale en vert, et contribution de la phaeophorbide en marron, aux différentes profondeurs ............................... 79
viii
Figure II-13 :
Contribution des Prochlorophytes à la biomasse aux 3 sites visités lors de la campagne : Concentration en div-chl a (mg m-3) à UPW (en vert), à MIO (en bleu) et à DYF (en rouge)....................................................................... 79
Figure II-14 :
Variations circadiennes de la photosynthèse au site DYF. A : PAR (µmol quanta m-2s-1, en jaune) efficacité photochimique du PS2 (Fv/Fm, sans dimensions, en rouge), et efficacité photochimique du PS2 (Fv/Fm, sans dimension, en noir) lissée par une moyenne mobile sur 30 points de mesure. B : : PAR (µmol quanta m-2s-1, en jaune) section efficace du PS2 (σPS2, A², en rouge), et section efficace du PS2 (σPS2, A², en noir) lissée par une moyenne mobile sur 30 points de mesure.............................................. 82
Figure II-15 :
Variations circadiennes de la photosynthèse au site MIO. A : PAR (µmol quanta m-2s-1, en jaune) efficacité photochimique du PS2 (Fv/Fm, sans dimensions, en rouge), et efficacité photochimique du PS2 (Fv/Fm, sans dimension, en noir) lissée par une moyenne mobile sur 30 points de mesure. B : : PAR (µmol quanta m-2s-1, en jaune) section efficace du PS2 (σPS2, A², en rouge), et section efficace du PS2 (σPS2, A², en noir) lissée par une moyenne mobile sur 30 points de mesure.............................................. 83
Figure II-16 :
Variations circadiennes de la photosynthèse au site DYF. PAR (µmol quanta m-2s-1, en jaune), Taux minimum de fluorescence (Fo,, en bleu et lissé par un moyenne mobile sur 40 valeurs), Taux maximal de fluorescence (Fm ; en rouge et lissé par une moyenne mobile sur 40 valeurs). ........................................................................................................ 84
Figure II-17 :
Variations circadiennes de la photosynthèse au site MIO. PAR (µmol quanta m-2s-1, en jaune), Taux minimum de fluorescence (Fo,, en bleu et lissé par un moyenne mobile sur 40 valeurs), Taux maximal de fluorescence (Fm ; en rouge et lissé par une moyenne mobile sur 40 valeurs). ........................................................................................................ 84
Chapitre III
Figure III-1 :
A. Localisation de la zone d’étude couverte lors de la campagne ALMOFRONT II. B. Schéma simplifié de la circulation dans la mer d’Alboran. WAG : Western Anticyclonic Gyre, EAG ; Eastern Anticyclonic Gyre. Figure 1B extraite de Baldacci et al. (2001).................. 94
Figure III-2 :
Localisation des stations CTD effectuées durant la campagne ALMOFRONT II. A : Positionnement des 24 stations de la section transfrontale étudiée durant le Leg 1. B : Situation des 8 sites de longues durée échantillonnés durant le Leg 2. ..................................................................... 95
Figure III-3 :
Détermination de la profondeur de la couche de mélange Zm . Ici, pour la station 269 : les cercles blancs indiquent l’excès de densité en fonction de la profondeur. La ligne continue indique le rapport dσθ/dz. La ligne bleue indique la valeur seuil de 0.01. ..................................................................... 96
ix
Figure III-4 :
Orientation et intensité des courants marins dans la zone étudiée lors de la campagne ALMOFRONT 2, 20 m sous la surface. Les traits noirs indiquent la direction et l’intensité des courants (longueur), le trait rouge rappelle le tracé de la section trans-frontale. Les traits gras indiquent la circulation des différents courants présents dans la zone déduite de nos investigations (données fournies par Y. Graton et C. Lafleur). .................... 98
Figure III-5 :
Répartition de la salinité (g kg-1) le long de la section trans-frontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras continu indique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze. ........................ 99
Figure III-6 :
Répartition de la température (°C) le long de la section trans-frontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras inique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze......................................................... 99
Figure III-7 :
Répartition de la concentration en NO3 (µM) le long de la section transfrontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras inique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze ...................................... 100
Figure III-8 :
Répartition de la concentration en chlorophylle a totale (mg m-3) le long de la section trans-frontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras inique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze .... 100
Figure III-9 :
Répartition des communautés phytoplanctoniques le long de la section trans-frontale effectuée lors du Leg 1. A : proportion de microphytoplancton, B : proportion de nanophytoplancton, C : proportion de picophytoplancton (l’échelle de couleur du graphique C est différente de celles des deux autres graphiques).............................................................. 101
Figure III-10 :
Répartition de l’indice NPP (sans dimensions) le long de la section transfrontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras inique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze ...................................... 101
Figure III-11 :
Répartition du taux maximal spécifique de fixation de carbone [mg C (mg chl a)-1 h-1] le long de la section trans-frontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras inique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze .............................................................................................. 101
Figure III-12 :
Répartition de l’efficacité photosynthétique [mg C (mg chl a)-1 h-1 (µmol quanta m-2s-1)-1] le long de la section trans-frontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras inique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze .................................................................................. 101
Figure III-13 :
Répartition du rendement quantique de fixation de carbone lié à l’absorption par les pigments photosynthétiques [mol C (mol quanta)-1] le long de la section trans-frontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras inique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze .... 102
x
Figure III-14 :
Répartition du paramètre de saturation EK (µmol quanta m-2s-1) le long de la section trans-frontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras inique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze .... 102
Figure III-15 :
Variations de l’indice NPP (sans dimension) à 5 m de profondeur le long de la section trans-frontale en fonction de l’heure...................................... 103
Figure III-16 :
Profils verticaux moyens en noir (et écart-type en grisé) de la chlorophylle a totale (mg m-3) aux 8 sites explorés durant le Leg 2. Les échelles des abscisses sont toutes identiques à celle du site 8 sauf celle du site 7a. Les différents sites ont été replacés ici sur une radiale virtuelle des sites ayant le plus de caractéristiques méditerranéennes à ceux ayant le plus de caractéristiques atlantiques ......................................................................... 103
Figure III-17 :
Schéma conceptuel de la structure hydrologique et de la circulation au niveau d’un front géostrophique. Les 8 sites visités au Leg 2 y sont positionnés .................................................................................................. 103
Figure III-18 :
Schéma conceptuel de la répartition des différentes masses d’eau en présence dans la zone d’étude, ainsi que de la position et du sens d’écoulement des deux courants rencontrés. Les eaux méditerranéennes de surface sont caractérisées par un appauvrissement total en sels nutritifs et par un éclairement moyen journalier de 101 µmol quanta m-2s-1, ainsi que par l’abondance du nanophytoplancton et du picophytoplancton. La zone frontale est caractérisée par un éclairement journalier moyen de 115 µmol quanta m-2s-1 dans la partie située au dessus de sa couche de mélange, la communauté microphytoplanctonique y dominait. .................................... 104
Figure III-19 :
Variations circadiennes de l’indice NPP (sans dimensions) et du rendement quantique de fixation de carbone du à la seule absorption des pigments photosynthétiques φCPSmax [mol C (mol quanta)-1] le long de la section transfrontale réalisée au Leg 1 de la campagne à 5 et à 20 m de profondeur ..... 112
Conclusions Générales
Figure 1 :
EK moyen dans la couche mélangée (µmol quanta m-2s-1) en fonction de l’éclairement moyen dans la couche de mélange (PARZml, µmol quanta m2 -1 s ) pour différentes campagnes ................................................................ 120
xi
Liste des abréviations Zm
Profondeur de la base de la couche de mélange (m)
Ze
Profondeur de la base de la couche euphotique (m)
PARZml
Eclairement moyen dans la couche mélangée (µmol quanta m-2s-1)
σθ
Excès de densité potentielle (kg m-3)
[div-chl a]
Concentration en divinyle-chlorophylle a (mg m-3)
TChl a
Concentration en chlorophylle a totale (mg m-3)
PB
Taux spécifique de fixation de carbone [mg C (mg chl a)-1 h-1]
PoB
Taux spécifique de fixation de carbone à l’origine de la courbe [mg C (mg chl a)-1 h-1]
B Pmax
Taux maximal spécifique de fixation de carbone [mg C (mg chl a)-1 h-1]
τ
Temps minimum pour qu’un électron produit au niveau du centre réactionnel du PS2 soit utilisé pour réduire une molécule de carbone (s)
αB
Coefficient d’efficacité photosynthétique [mg C (mg chl a)-1 h-1 (µmol quanta m-2 s-1)-1]
βB
Coefficient de photoinhibition [mg C (mg chl a)-1h-1 (µmol quanta m-2 s-1)-1]
EK
Paramètre de saturation de la fixation de carbone (µmol quanta m-2 s-1)
φCmax
Rendement quantique de fixation de carbone [mol C (mol quanta)-1]
φ CPSmax
Rendement quantique de fixation de carbone due à la seule absorption des pigments photosynthétiques [mol C (mol quanta)-1]
xii
ΠB (t)
Quantité cumulée de carbone fixé en fonction du temps, par unité de biomasse [mg C (mg chl a)-1]
Emax
Eclairement maximal (µmol quanta m-2 s-1)
Eprobe (λ)
Eclairement spectral du flash sonde dans le fluorimètre à amplitude modulée (µmol quanta m-2 s-1)
NPP
Indice des pigments non photosynthétiques (pour non photosynthetic pigments en anglais). L’indice NPP est calculé en faisant la somme des concentrations de pigments non-photosynthétiques (Zeaxanthine, Diadinoxanthine,
Diatoxanthine,
β-Carotène)
ramenée
à
la
concentration de tous les pigments photosynthétiques ou non (à l’exclusion des phycobiliprotéines) A (λ)
Absorbance à une longueur d’onde donnée
a (λ)
Coefficient d’absorption du phytoplancton à une longueur d’onde donnée (m-1)
a* (λ)
Coefficient d’absorption spécifique du phytoplancton à une longueur d’onde donnée [m² (mg chl a)-1]
a*
Coefficient d’absorption spécifique du phytoplancton moyenné et pondéré par l’éclairement spectral utilisé dans l’incubateur (entre 400 et 700 nm) [m² (mg chl a)-1]
* a PS
Coefficient d’absorption spécifique du phytoplancton moyenné et pondéré par l’éclairement spectral utilisé dans l’incubateur (entre 400 et 700 nm) imputable aux seuls pigments photosynthétiques[m² (mg chl a)-1]
Fx
Taux d’émission de fluorescence par TChl a mesuré après une adaptation des échantillons à l’obscurité. x peut être o (minimal), m (maximal) ou v (variable) (unités relatives)
Fv/Fm
Efficacité photochimique du photosystème 2 (sans dimensions)
xiii
F’o
Taux minimal d’émission de fluorescence par TChl a mesuré juste après la transition des échantillons à l’obscurité (unités relatives)
FS
Taux minimal d’émission de fluorescence par TChl a mesuré sous l’éclairement auquel l’échantillon était précédemment soumis (unités relatives)
F’m
Taux maximal d’émission de fluorescence par TChl a mesuré sous l’éclairement auquel l’échantillon était précédemment soumis (unités relatives)
φ Fx
Rendements quantiques de l’émission de fluorescence par TChl a, obtenus après normalisation des taux d’émission de fluorescence par l’absorption du phytoplancton correspondant à l’éclairement émis par les flashs du fluorimètre (unités relatives)
f
Fraction fonctionnelle des centre réactionnels
nPS2
Nombre de centre réactionnels par unité de chlorophylle a
R
Quotient photosynthétique [mol e- (mol C)-1]
PS2
Photosystème 2
σchl a
Section efficace d’absorption du PS2 (A²)
σPS2
Section efficace d’absorption effective du PS2 (A²)
QA
Plastoquinone,
accepteur
primaire
d’électron
de
la
chaîne
photosynthétique. k QA
Constante de ré-oxydation de la plastoquinone QA (ms-1)
Ki
Constante
de
vitesse
de
l’installation
photochimique de la fluorescence de TChl a (h)
xiv
du
quenching
non-
KD
Constante de vitesse de dé-installation du
quenching non-
photochimique de la fluorescence de TChl a (h)-1 µ
Taux de croissance (jour-1)
µmax
Taux de croissance maximal (jour-1)
r
Taux de dilution (jour-1)
pcbA
Gène codant la protéine D1 du centre réactionnel du photosystème 2
psbA
Gène codant une partie de l’antenne collectrice de lumière photosystème 2
rbcL
Gène codant la grosse sous-unité de la Ribulose 1,5-bisphosphate Carboxylase/Oxygénase
xv
Introduction générale
Introduction générale
« De mon temps, on ne voyait pas des choses comme çà ». Cette petite phrase anodine prononcée par nos anciens à l’occasion d’une tempête plus violente que les autres ou bien d’une sécheresse estivale plus intense se fait entendre toujours davantage depuis quelques années. Est-ce l’influence des médias, toujours croissante, qui force l’opinion de nos doyens, ou bien s’agit-il effectivement d’une évolution des caractéristiques de nos climats perceptible maintenant à l’échelle d’une vie d’Homme ? Il semble aujourd’hui que notre planète se réchauffe, et que les activités humaines apparues depuis la révolution industrielle au milieu du XIXème siècle soient responsables de cette tendance. Ce réchauffement est dû à l’augmentation des rejets dans notre atmosphère des gaz dits “à effet de serre” que sont entre autres la vapeur d’eau et le dioxyde de carbone (CO2). Cet état de fait est devenu ces 20 dernières années, l’une des principales préoccupations d’un grand nombre de scientifiques et en particulier des océanographes, notamment au travers de programmes internationaux tels que JGOFS1. La question n’est plus de savoir si l’on va pouvoir ou non enrayer cette augmentation de la teneur en CO2 de l’atmosphère. L’un des propos actuels de la biogéochimie est de prédire les évolutions futures de la concentration en CO2 de l’atmosphère et d’anticiper leur impact sur la biosphère. Pour ce faire, il convient d’établir à l’échelle de la planète des bilans chiffrés des différents stocks et flux de carbone entre les différents compartiments. Le cadre général de cette thèse est l’étude du cycle du carbone dans l’océan en vue de sa prédiction. La “pompe biologique” de la biosphère découle de la production primaire réalisée par les organismes végétaux. Cette fixation du carbone inorganique dissous dans l’eau de mer est réalisée via la photosynthèse, et conduit à la fabrication de matière organique à partir de l’énergie lumineuse, de l’eau et des éléments minéraux disponibles dans le milieu naturel. Le CO2 est fixé sous forme gazeuse par la biomasse végétale terrestre, ou sous forme dissoute par la biomasse végétale marine. Bien que cette biomasse végétale marine ne représente que 0.2 % de la biomasse végétale totale (marine + terrestre), la production nouvelle2 réalisée par les océans est aussi importante que celle réalisée par les végétaux terrestres (Field et al., 1998). De plus, une partie du carbone fixé par voie photosynthétique peut être piégée à long terme par l’océan, majoritairement dans la fraction réfractaire du 1
JGOFS : Joint Global Ocean Flux Studies La production nouvelle dans l’océan est généralement définie comme étant la part de la production primaire réalisée avec comme source azotée les nitrates. Celle-ci s’oppose à la production régénérée qui est réalisée à partir de sources azotées type ammonium après re-minéralisation par les bactéries hétérotrophes.
2
-2-
Introduction générale
3.0
PBmax
B -1 -1 P [mg C (mg chl a) h ]
2.5
2.0
1.5
1.0
αB EK
0.5
PB mesuré PB ajusté
0.0 0
200
400
600
800
-2 -1 Intensité lumineuse (µmol quanta m s )
Figure Introduction-1. Exemple d’une courbe P vs. E.
1000
1200
Introduction générale
carbone organique dissous. L’intérêt de l’étude de la photosynthèse marine est donc considérable. Cependant, la complexité du phénomène ainsi que l’abondance et les effets multiples des différents facteurs qui l’influencent (lumière, concentration en sels nutritifs, température) rendent sa prédiction délicate (Longhurst, 1991). La production primaire est exprimée ici en quantité de carbone fixée par unité de temps et de volume. De façon à pouvoir comparer différentes zones océaniques entre elles, une normalisation de cette production primaire est réalisée en divisant la quantité de carbone fixée par la biomasse qui la réalise. Le taux de fixation de carbone est fonction en premier lieu de l’intensité de la lumière (PAR3) qui est la source d’énergie de la photosynthèse. La relation qui existe entre ces deux quantités décrit une courbe, la courbe Production vs. Eclairement4, qui peut être représentée par exemple par la fonction mathématique suivante (Jassby et Platt, 1976) : α B PAR B tanh P B = Pmax B Pmax
(1)
B dans laquelle Pmax est le taux maximal spécifique de fixation de carbone (en mg C (mg chl
a)-1 h-1) et αB, l’efficacité photosynthétique [en mg C (mg chl a)-1 h-1 (µmol quanta m-2s-1)1
] (Figure Introduction-1). Cette relation montre clairement que la quantité de carbone
fixée augmente lorsque PAR augmente jusqu’à une certaine limite au delà de laquelle elle sature. Dans cette relation, αB est la pente initiale de la courbe et décrit le fonctionnement de la fixation de carbone aux faibles intensités lumineuses. Elle dépend de l’absorption de la lumière par les pigments algaux (Figure Introduction-2), et du rendement quantique maximum de fixation de carbone [φCmax, mol C (mol quanta)-1] :
α B = a * φ C max
(2)
où a * est le coefficient d’absorption spécifique moyen pondéré par le spectre de l’éclairement [m² (mg chl a)-1]. Le processus photochimique qu’est la photosynthèse est initié par l’absorption de la lumière au niveau “d’unités photosynthétiques” dont le concept a été imaginé par Emerson et Arnold (1932). Depuis les travaux de Kok (1956), on sait que l’unité photosynthétique 3 4
PAR pour Photosynthetic Available Radiation abrégé courbe P vs. E.
-3-
Figure Introduction-2. Schéma simplifié de l’appareil photosynthétique
centre réactionnel du PS2
chaleur
antenne du PS2
chaleur
fluorescence
Chaîne de transport d’électrons
RubisCO
fixation de carbone
section efficace d’absorption effective : σPS2
section efficace d’absorption : σchl a
Introduction générale
se subdivise en deux photosystèmes (1 et 2) distincts travaillant “en série”. Le photosystème 2 (PS2) est celui qui a fait l’objet du plus grand nombre d’études, en particulier parce qu’il est le site de l’oxydation de l’eau (dégagement d’oxygène) mais aussi parce qu’il est le plus facile à analyser par différentes techniques (voir plus bas). La partie du photosystème 2 qui réalise le piégeage de la lumière est son “antenne” collectrice. Elle est constituée de molécules pigmentaires : chlorophylles, caroténoides et, dans
certains
cas,
phycobiliprotéines.
Chacune
de
ces
molécules
absorbe
préférentiellement une longueur d’onde de lumière spécifique, permettant ainsi l’utilisation optimale du spectre solaire visible. La quantité totale de lumière absorbée est donc fonction de la section efficace d’absorption et de surcroît de la probabilité qu’un photon absorbé soit transmis au centre réactionnel et utilisé in fine pour la séparation de charge (c’est à dire pour la transformation de l’énergie lumineuse en énergie chimique au niveau du pool de plastoquinone). En effet, au niveau de l’antenne, une partie de l’énergie lumineuse peut être dissipée en chaleur ou ré-émise sous forme de fluorescence (Figure Introduction-2). En ce sens, la section efficace d’absorption effective du PS2, σPS2 (A²) est inférieure à sa section efficace d’absorption (Dubinsky, 1992). σPS2 peut être déterminée grâce à des mesures de fluorescence ou de dégagement d’oxygène. De la section efficace d’absorption effective du PS2, et donc de la façon dont est absorbée la lumière au niveau de son antenne dépend αB (l’efficacité photosynthétique) (Eq. 2). Si l’énergie lumineuse captée par l’antenne collectrice est transférée (transfert instantané à l’échelle de la picoseconde) jusqu’au centre réactionnel du PS2 (CR2), elle peut y provoquer une séparation de charge. Il est important de noter qu’à ce niveau aussi, une partie de l’énergie peut être dissipée sous forme de chaleur. L’efficacité photochimique du CR2, φp, reflète la probabilité pour le centre réactionnel du PS2 d’utiliser l’énergie disponible pour la photochimie (Falkowski et Raven, 1997). En effet, si le centre réactionnel est fonctionnel, la séparation de charge donnera lieu à la formation d’un électron qui sera transmis à la suite de l’appareil photosynthétique. φp peut être reliée aux changements d’émission de fluorescence par le PS2 : Fv/Fm (voir plus bas sa définition exacte). Elle peut donc être déterminée par les mêmes techniques de fluorescence que σPS2.
φp qui reflète le statut “opérationnel” des CR2 (au sens où ils sont à même de transmettre l’énergie à la suite de l’appareil photosynthétique) influe sur φCmax le rendement quantique
-4-
Introduction générale
maximal de fixation de carbone qui traduit le rendement de l’absorption d’énergie lumineuse utilisée pour la fixation de carbone. L’électron produit au niveau du CR2 est transmis ensuite par oxydo-réduction le long d’une “chaîne de transporteurs” dont le premier accepteur stable est la plastoquinone QA. La molécule de plastoquinone alors réduite (QA-) permet la transmission de l’énergie – sous forme chimique - vers les transporteurs suivants de la chaîne. La ré-oxydation de la plastoquinone QA (nécessaire pour qu’elle soit de nouveau disponible), implique un délais qui peut dans certain cas être le facteur limitant de la photosynthèse. L’électron transmis le long de la chaîne de transporteurs aboutit, suite à un second événement photochimique au niveau du photosystème 1 (PS1), à la réduction d’une molécule de NADP+(5). Ce pouvoir réducteur permet ensuite d’alimenter en énergie les processus de fixation de carbone réalisés au niveau de la phase sombre de la photosynthèse par le cycle de Calvin-Benson dont le stock d’enzyme Ribulose 1,5-bisphosphate B Carboxylase/Oxygénase6 est une composante essentielle. Pmax , l’asymptote de la courbe P
vs. E (Figure Introduction-1), dépend en général du rapport entre les stocks de RubisCO et de chlorophylle (Sukenik et al., 1987). Ce taux maximal spécifique de fixation de carbone décrit le fonctionnement de la photosynthèse à forte lumière et plus particulièrement au delà de l’intensité lumineuse à partir de laquelle la fixation de carbone sature, définie sur la courbe P vs. E par : EK =
B Pmax αB
(3)
où EK a les unités de PAR (µmol quanta m-2s-1). Chacun de ces paramètres décrit une partie du fonctionnement de l’appareil photosynthétique. Ils varient en fonction d’un ou de tous les facteurs suivants du milieu : la lumière, la température et l’abondance en nutriments. Ces facteurs agissent sur les deux phases de la photosynthèse : la phase claire, qui est celle nécessitant la présence de lumière, et la phase sombre qui conduit à la fixation de carbone. Il est aisé d’imaginer l’interaction dans le milieu naturel de tous ces facteurs de variations et ainsi la complexité 5 6
NADP+ : Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate, forme oxydée. Ci-après notée RubisCO.
-5-
Introduction générale
de l’interprétation des données océanographiques disponibles pour comprendre le fonctionnement réel de la photosynthèse dans le milieu marin. Pourtant, dans l’optique de l’étude de l’impact de la production primaire sur la concentration de CO2 dans l’atmosphère, il est indispensable de comprendre comment et pourquoi varient les paramètres photosynthétiques dans l’océan. De plus, la problématique du cycle du carbone implique une étude du phénomène à l’échelle globale. Les moyens techniques disponibles pourtant, ne permettent pas d’appliquer les méthodes classiques d’étude de la photosynthèse à ces échelles. De ce fait, la modélisation mathématique apparaît comme l’unique solution pour prédire l’activité photosynthétique de l’océan. Cette modélisation de la photosynthèse marine s’appuie sur la paramètrisation du phénomène qui vient d’être décrite ici. Pourtant, les paramètres photosynthétiques7, qui sont les paramètres d’entrée pris en compte dans les modèles d’estimation de la production primaire, sont à ce jour le plus souvent considérés comme constants à l’échelle de la journée par exemple (Platt et al., 1980; Kiefer et Mitchell, 1983; Platt et Sathyendranath, 1988; Kiefer et al., 1989; Morel, 1991). Ceci est principalement dû au manque de données disponibles. On connaît déjà bon nombre des effets des facteurs environnementaux sur les paramètres photosynthétiques. En tout premier lieu, le coefficient d’absorption spécifique est influencée par la quantité de lumière : du fait de la présence de pigments nonphotosynthétiques (Allali et al., 1997) ou bien par l’existence d’autres phénomènes de photoacclimatation (Mitchell et Kiefer, 1988; Stramski et Morel, 1990). La section efficace d’absorption effective du PS2 est également influencée par la quantité de lumière : via entre autre le phénomène de photophosphorylation des antennes (Anderson et Andersson, 1988) ou bien le cycle des xanthophylles (Demmig-Adams et Adams, 1992). La fraction fonctionnelle des CR2 peut également être influencée par l’intensité lumineuse (Neale, 1987; Long et al., 1994; Olaizola et Yamamoto, 1994; Vassiliev et al., 1994; Babin et al., 1996). Une forte quantité de lumière induit aussi la réduction du nombre et/ou de la taille des unités photosynthétiques (Falkowski et Owens, 1980; Sukenik, et al., 1987; Escoubas et al., 1995). Le rendement quantique de fixation de carbone, φCmax, quant à lui varie en fonction d’un grand nombre de facteurs environnementaux. Il a été montré qu’une forte quantité de lumière peut induire la diminution de φCmax par rapport à sa valeur maximale 7
Dans ce manuscrit, le terme “paramètres photosynthétiques” désignera l’ensemble des paramètres déduits
des courbes P vs. E :
B PS Pmax , αB, EK, φCmax, et φ C max .
-6-
Introduction générale
Encart n° 1 : adjectif qualificatif “circadien” Malgré la richesse de la langue française, il est difficile de trouver un mot désignant parfaitement l’idée de variation circadienne. Dans le Petit Larousse, le terme circadien est défini comme “rythme biologique dont la périodicité est d’environ 24 heures”. Si l’on se réfère à l’un des articles majeur sur ce sujet : C. Hirschie Johnson and S.S. Golden (1999). Circadian Programs in Cyanobacteria : adaptiveness and mechanism. Annu. Rev. Microbiol. 53 : 389-409, un rythme circadien est un programme biologique endogène qui répond à 3 critères diagnostiques constants. 1/ dans des conditions environnementales constantes, le programme tourne de lui-même selon un rythme de 24 heures, 2/ dans des conditions environnementales cycliques, le programme va prendre la période de variations des conditions environnementales et 3/ la période de ce programme sous des conditions environnementales constantes est toujours la même quelles que soient les conditions de température (en conservant bien sur une température physiologique). L’adjectif circadien tel que traduit de l’anglais “circadian” implique donc une notion de contrôle endogène des variations des différents paramètres considérés, ce qui a priori au départ de ce travail de thèse est incertain. Néanmoins, les autres adjectifs à ma disposition ne sont pas plus adaptés et sont même parfois moins précis comme par exemple “diurne” qui ne tient pas compte de la période de nuit, ou “nycthéméral” qui est parfaitement synonyme de circadien. L’idéal aurait été de pouvoir trouver une traduction française de l’adjectif anglais “diel”, qui n’implique pas de notion de contrôle endogène du rythme biologique considéré, mais seulement une périodicité basée sur la succession du jour et de la nuit. Ceci n’ayant pas été possible, j’emploierai dans ce manuscrit l’adjectif circadien.
Introduction générale
théorique [0.125 mol C (mol quanta)-1] (Bidigare et al., 1989; Demmig-Adams, 1990; Krause et Weis, 1991), du fait de l’influence de l’abondance de pigments nonphotosynthétiques (Babin, et al., 1996) qui captent la lumière mais ne transmettent pas l’énergie photochimique aux réactions de la fixation de carbone. Une limitation en sels nutritifs dans le milieu diminue également le rendement quantique de fixation de carbone. Ceci a été montré pour une limitation en azote (absence de nitrates) (Kolber et al., 1988; Cleveland et al., 1989; Kolber et al., 1990; Babin et al., 1991; Greene et al., 1992; Lindley et al., 1995; Babin et al., 1996) mais aussi en fer (Greene et al., 1992). B Le taux maximal spécifique de fixation de carbone, Pmax , est le plus complexe des
paramètres photosynthétiques du point de vue de son interprétation. En premier lieu, c’est B la température qui influence la fixation de carbone. Pmax est en effet connu pour varier
selon un Q108 (Davison, 1991) d’environ 2 (Eppley, 1972). C’est à dire que pour une B varie d’un facteur 2, l’augmentation de la transition de température de 10 °C, Pmax B température entraînant une augmentation de Pmax . Ceci est lié à l’accélération des réactions B enzymatiques de la phase sombre (Sukenik et al., 1987). Mais, Pmax est également modulé
par l’intensité de la lumière par l’intermédiaire des phénomènes de photoacclimatation (Falkowski, 1980). Malgré les très nombreuses études déjà réalisées sur les facteurs environnementaux influençant le phénomène de la photosynthèse, il reste un certain nombre de questions critiques qui demeurent aujourd’hui sans réponse : 1/ On connaît l’existence de variations circadiennes (voir encart n° 1) des paramètres photosynthétiques depuis plus de 40 ans (Doty et Oguri, 1957; Holmes et Haxo, 1958; Shimada, 1958; McAllister, 1963; Malone, 1971; Sournia, 1974). Elles ont été étudiées sur des cultures phytoplanctoniques (Prézelin et Sweeney, 1977; Harding et al., 1981; Legendre et al., 1988) ainsi que dans le milieu naturel (Taguchi, 1976; Prézelin et al., 1986; Robarts et Howards-Williams, 1989). Pourtant, les causes exactes de ces variations n’ont pas encore été identifiées clairement. On suppose bien sûr un effet de la variation de l’intensité lumineuse, mais aucune étude n’a encore pu identifier les mécanismes sous-jacents, ni identifier d’autres facteurs 8
Le Q10 est selon la loi de Van’t Hoff défini en écologie comme le rapport d’un paramètre physiologique pour un écart de température de 10 °C (Barbault, 1992).
-7-
Introduction générale
éventuels. En effet, la persistance de tels rythmes de variations dans des conditions environnementales constantes suggère l’intervention d’un contrôle endogène. Cependant, si les variations circadiennes des paramètres photosynthétiques sont de forte amplitude, il importe quelles qu’en soient les causes d’en connaître l’impact sur l’estimation de la production primaire. 2/ L’influence de la carence en sels nutritifs sur les paramètres photosynthétiques est bien connue dans le cas d’une carence en azote. Les nitrates sont le plus souvent mis en cause, bien que le débat sur l’impact éventuel des phosphates prenne de plus en plus d’ampleur. En effet, il apparaît actuellement que les phosphates pourraient constituer le sel nutritif limitant dans toute une partie de l’océan mondial oligotrophe : en Méditerranée (Berland et al., 1980; Krom et al., 1991; Vaulot et al., 1996; Zohary et Robarts, 1998) mais aussi parfois dans le Pacifique (Karl et al., 1997. Or, les effets d’une carence en phosphate sur les paramètres photosynthétiques ont pour le moment été étudiés surtout sur des populations en culture et non pas dans le milieu naturel (Ducobu et al., 1998; Geider et al., 1998). 3/ La répartition des paramètres photosynthétiques dans le milieu naturel est relativement bien comprise en fonction de la lumière disponible dans la colonne d’eau (profondeur de la couche de mélange vs. profondeur de la couche euphotique) et de la disponibilité en sels nutritifs (Cleveland et al., 1989; Kolber et Falkowski, 1993; Babin et al., 1996). Par contre, dans des systèmes hydrodynamiquement instables (comme par exemple les zones frontales), quand le facteur déterminant du “passé lumineux du phytoplancton” n’est plus la dynamique de la couche mélangée de surface, la distribution des paramètres photosynthétiques est beaucoup plus complexe (Barber et al., 2001; Johnson et al., sous presse). L’éclaircissement de ces 3 points correspond aux 3 objectifs que je me suis fixés dans le cadre de mon travail de thèse : 1/ identifier les causes des variations circadiennes de la photosynthèse, 2/ étudier l’impact de la carence en phosphates sur les paramètres photosynthétiques et 3/ élucider la répartition des paramètres photosynthétiques dans un système hydrodynamiquement perturbé.
-8-
Introduction générale
Pour réaliser ces études, plusieurs outils ont été utilisés permettant l’investigation de différentes parties de l’appareil photosynthétique. La phase claire de la photosynthèse a été étudiée à l’aide des techniques de mesure de la fluorescence variable de la chlorophylle a (Schreiber, 1983; Krause et Weis, 1984). La fluorescence est étroitement liée à la photosynthèse puisque l’énergie ré-émise sous cette forme est une part de l’énergie lumineuse qui n’a pas été utilisée pour la séparation de charge. Cette méthode d’étude a l’énorme avantage d’être non-intrusive. Elle peut aussi être mise en œuvre rapidement dans le milieu naturel, surtout depuis le développement de profileurs s’adaptant directement sur les rosettes de prélèvements, et donnant instantanément des résultats sur l’ensemble de la colonne d’eau. La phase sombre de la photosynthèse à été étudiée en mesurant le taux de fixation de carbone, résultat final du transfert de l’énergie lumineuse le long de la chaîne photosynthétique. En 1952, le botaniste danois Einard Steeman Nielsen a introduit l’usage d’un radio-traceur pour évaluer cette quantité de carbone fixée. Cette méthode de mesure de la fixation de carbone, est lourde à mettre en œuvre, restreignant les possibilités d’étude dans le milieu naturel à des échelles de temps et d’espace réduites. Néanmoins, les paramètres de la fixation de carbone sont les paramètres d’entrée des modèles estimant la production primaire.
Organisation du manuscrit En suivant les objectifs que je m’étais fixés pour ces études et la méthode expérimentale, le manuscrit sera organisé comme suit : Dans le chapitre I, les variations circadiennes des paramètres photosynthétiques seront décrites en détail suite à l’étude faite en laboratoire sur une culture. Cette étude a été menée dans le cadre du programme européen PROMOLEC9, sur le procaryote photosynthétique marin Prochlorococcus (Chisholm et al., 1988; 1992). La première partie de ce chapitre décrira en détail le système de culture original qui a dû être mis au point spécialement pour cette étude et dont la description a fait l’objet d’une publication : Bruyant et al., 2001 (voir annexe 1). Puis les résultats obtenus seront discutés afin de
9
PROMOLEC : PROchlorococcus MOLecular Ecology
-9-
Introduction générale
déterminer les différents mécanismes impliqués dans les variations circadiennes des paramètres photosynthétiques. En utilisant les résultats obtenus lors de l’étude présentée dans le chapitre I, j’ai choisi d’étudier les variations de la photosynthèse dans le milieu naturel. Plus particulièrement, mon étude s’est focalisée sur l’impact d’une carence en phosphates du milieu sur les variations des paramètres photosynthétiques. Pour réaliser cette étude, j’ai pris part à la campagne océanographique PROSOPE10. Au cours de cette campagne, les différentes stations étudiées présentaient des degrés variables de limitation en phosphates. De plus, la variation spatiale des paramètres de la photosynthèse à l’échelle de la Méditerranée ainsi que les variations circadiennes de la photosynthèse ont pu être étudiées. Cette étude fera l’objet du chapitre II. Après les études menées lors de la campagne PROSOPE à l’échelle de la Méditerranée, les variations de la photosynthèse à plus petite échelle spatiale seront examinées, en présentant les résultats obtenus lors de la campagne ALMOFRONT11 2 qui a eu lieu sur le système frontal de la mer d’Alboran pendant l’hiver 1997/1998. L’étude faite durant cette campagne a permis de définir les facteurs qui régissent les variations de la photosynthèse dans un système hydrologiquement très perturbé. L’influence des processus physiques liés à la circulation spécifique des zones frontales sur la photosynthèse a été étudiée. De plus, la possibilité d’utiliser les paramètres photosynthétiques comme traceurs des mouvements verticaux des masses d’eau (résurgence et enfoncement) a été testée. Cette étude fera l’objet du chapitre III.
10 11
PROSOPE : PROductivité des Systèmes Océaniques PElagiques ALMOFRONT : FRONT ALMéria – Oran
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Chapitre I Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
Sommaire du Chapitre I ◊
Introduction __________________________________________________________ 14 I.
Pourquoi Prochlorococcus ? _________________________________________________ 15
II.
Le mode de culture ________________________________________________________ 16
III. Organisation du chapitre ___________________________________________________ 18
◊
Mise au point du système de culture original : le turbidostat ___________________ 19 I.
Le matériel du système de culture ____________________________________________ 19
II.
Détermination des conditions optimales de culture ______________________________ 21 A.
Méthodes de mesure _____________________________________________________________ 21
B.
Taux de croissance et capacité maximum du milieu_____________________________________ 22
C.
Conditions à respecter lors de la culture en turbidostat __________________________________ 22
III. Mise en place du turbidostat ________________________________________________ 23 A.
Taux de dilution ________________________________________________________________ 23
B.
Contrôle de l’axenie _____________________________________________________________ 24
C.
Résultats du premier turbidostat ____________________________________________________ 24
IV. Conclusion _______________________________________________________________ 25
◊
Matériel et méthodes ___________________________________________________ 25 I.
Le cyclostat_______________________________________________________________ 25 A.
Adaptation aux grands volumes ____________________________________________________ 26
B.
Le système d’éclairement _________________________________________________________ 27
II.
Adaptation de la culture et échantillonnage ____________________________________ 29 A.
Une acclimatation progressive _____________________________________________________ 29
B.
Echantillonnage ________________________________________________________________ 29
C.
Répétition des expériences ________________________________________________________ 30
III. Analyses en cytométrie en flux _______________________________________________ 30 IV. Détermination du contenu cellulaire en carbone ________________________________ 31 V.
Analyses pigmentaires______________________________________________________ 31
VI. Détermination du coefficient d’absorption _____________________________________ 31 VII.
Paramètres de la relation fixation de carbone vs. éclairement ___________________ 32
VIII.
Mesures de la fluorescence ________________________________________________ 35
IX. Transcription des gènes impliqués dans la photosynthèse_________________________ 36
◊
Résultats _____________________________________________________________ 37 I.
Maintien de l’axénie _______________________________________________________ 37
II.
Contenu cellulaire en carbone _______________________________________________ 37
III. Concentrations pigmentaires ________________________________________________ 37 IV. Les paramètres photosynthétiques ___________________________________________ 38 V.
Variations des propriétés fonctionelles du photosystème 2 ________________________ 39
VI. Transcription du gène rbcL _________________________________________________ 41 VII.
◊
Transcription des gènes codant l’appareil photosynthétique ____________________ 41
Discussion ___________________________________________________________ 41 I.
Synchronisme de la division cellulaire_________________________________________ 41
II.
Influence sur la fixation de carbone___________________________________________ 43
III. Quelles variations au niveau du photosystème 2 ? _______________________________ 46 IV. Récupération de la photoinhibition et effets du cycle cellulaire ____________________ 49
◊
Conclusions __________________________________________________________ 51 I.
Le système de culture ______________________________________________________ 51
II.
Une cascade d’événements __________________________________________________ 52
III. Production primaire et modélisation __________________________________________ 54
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
◊ INTRODUCTION Dans ce premier chapitre, mon objectif était de documenter les variations circadiennes des paramètres de la photosynthèse et d’identifier leurs causes. Les variations circadiennes des propriétés photosynthétiques ont été l’objet de nombreuses études depuis plus de 30 ans. Les végétaux supérieurs ont développé des mécanismes variés pour faire face aux changements circadiens des facteurs environnementaux qui influencent les performances de leur appareil photosynthétique. Ces facteurs sont nombreux dans le milieu terrestre, qui concerne la quasi totalité des végétaux supérieurs : ce sont en particulier la température, l’hygrométrie, les échanges gazeux et les variations de l’intensité lumineuse. Les mécanismes d’acclimatation à ces facteurs développés par les végétaux supérieurs peuvent agir à l’échelle de la plante entière, de la feuille ou bien de la seule cellule. Dans le cas des populations phytoplanctoniques marines, le seul facteur environnemental présentant des variations circadiennes importantes et susceptibles d’induire des changements significatifs au niveau de l’appareil photosynthétique, est l’intensité lumineuse. Les mécanismes d’acclimatation pouvant être mis en œuvre ici sont forcément limités à l’échelle de la cellule. Plusieurs études ont déjà identifié des mécanismes d’acclimatation qui semblent répondre directement aux variations de l’intensité lumineuse et être responsables d’une partie des variations circadiennes des propriétés de la photosynthèse (Mori et al., 1996; Somers, 1999; Strasser et al., 1999). En revanche, suite au transfert d’une population phytoplanctonique d’un éclairement cyclique à un mode d’éclairement continu, il a parfois été observé que les changements circadiens des propriétés photosynthétiques persistent pendant plusieurs jours (Chisholm et Brand, 1981; Brand, 1982; Vandevelde et al., 1989; Johnson et Golden, 1999; Strasser et al., 1999). Ces observations suggèrent que certains des processus de photoacclimatation sont régulés par une horloge interne. Chez les algues phytoplanctoniques, cette horloge interne pourrait être étroitement liée au cycle cellulaire puisque ce dernier est souvent héliosynchrone dans le milieu marin (Strasser et al., 1999).
- 14 -
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
Comment
les
propriétés
structurelles
et
fonctionnelles
de
l’appareil
photosynthétique changent-elles sous l’effet de l’intensité lumineuse et du cycle cellulaire ? Comment le cycle cellulaire et la photosynthèse s’articulent-ils dans le milieu marin ? Les travaux récents de Strasser et al. (1999) ont tenté de clarifier les effets respectifs de l’intensité lumineuse et du cycle cellulaire sur les changements apparents des propriétés de l’appareil photosynthétique chez les algues vertes en étudiant les variations de la fluorescence. Dans la présente étude, une approche novatrice a été développée, en utilisant conjointement les outils “classiques” de l’étude de la photosynthèse marine et la biologie moléculaire (plus couramment utilisée dans les études chez les végétaux supérieurs e.g. Somers, 1999; Golden et Strayer, 2001). Les processus directement liés aux changements de lumière ont été distingués de ceux liés au cycle cellulaire ; et l’impact des variations circadiennes de la photosynthèse sur la production primaire a également été examiné.
I.
POURQUOI PROCHLOROCOCCUS ?
Prochlorococcus (Chisholm et al., 1992) est un procaryote autotrophe marin proche des cyanobactéries. Il est le plus petit organisme autotrophe connu à ce jour (Partensky et al., 1999a) et c’est à cause de sa très petite taille (0.5 à 0.7 µm de diamètre Morel et al., 1993) qu’il n’a été découvert que très récemment (Chisholm et al., 1988; Chisholm et al., 1992) après l’introduction de la technique de cytométrie en flux dans la recherche océanographique. Prochlorococcus est particulièrement abondant dans l’océan tropical où les conditions sont très oligotrophes. Il est présent depuis la surface, où la lumière est forte, jusqu’au niveau du 1% de la lumière incidente (Partensky et al., 1999b). Bien que de très petite taille, Prochlorococcus réalise dans l’océan tropical et sub-tropical, la part la plus importante de la production primaire (Partensky et al., 1999b). Son cycle cellulaire est connu pour être héliosynchrone (Vaulot et al., 1995). Jusqu’à récemment, Prochlorococcus était connu pour être une espèce phytoplanctonique très difficile à maintenir en culture (R. Rippka, comm. pers.). Après la mise au point du milieu de culture PCRS11 (Partensky et al., 1999b) des cultures en batch (milieu fermé) et en petits volumes ont pu être - 15 -
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
maintenues. La souche PCC12 9511 avec laquelle l’expérience a été réalisée est actuellement la seule à avoir été axénisée13 (Rippka et al., 2000). Il s’agit d’un souche ayant été isolée en surface. Du fait de son abondance numéraire et de son importance en terme de productivité sous 45° de latitude, Prochlorococcus constitue un modèle représentatif pour l’étude d’un phénomène déjà largement observé chez quasiment tous les types d’espèces phytoplanctoniques.
II.
LE MODE DE CULTURE
• Comment le cycle cellulaire et la photosynthèse s’articulent-ils dans le milieu marin ? Afin de répondre à cette question, Prochlorococcus devait être cultivé dans des conditions aussi proches que possible de celles rencontrées dans le milieu naturel, tout en ayant dans la culture une biomasse suffisante pour pouvoir faire toutes les analyses nécessaires. De plus, afin de pouvoir faire des mesures pendant plusieurs jours successifs, il était indispensable de travailler sur une culture continue (ouverte). Ce mode de culture est en effet plus adapté que les cultures en « batch » (fermées) lorsque des conditions stables sont requises sur une longue période de temps. Dans de tels systèmes, le taux de renouvellement du milieu de culture est fixé ou bien ajusté continuellement en fonction des valeurs requises du taux de croissance (chemostat) ou de la biomasse (turbidostat). Les cultures en chemostat sont particulièrement bien adaptées pour l’étude des effets de la limitation en nutriments sur le phytoplancton (e.g. Herzig et Falkowski, 1989; Sciandra et al., 1997). Les turbidostats qui permettent de maintenir des cultures à leur taux de croissance maximal sont plutôt utilisés pour l’étude des processus physiologiques gouvernés par la lumière (Falkowski et Owens, 1980) ; c’est donc le mode de culture le plus approprié pour la présente étude.
12
PCC : Pasteur Culture Collection. Le terme “axénique”, du grec a : privatif, xenos : étranger, signifie que la culture est vierge de toute contamination par des organismes autre que celui qui est cultivé (bactéries mais aussi autre espèces phytoplanctoniques).
13
- 16 -
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
Une des limitations majeures des cultures continues réside dans la difficulté de maintenir ces cultures axéniques. Ceci est principalement dû au fait que ces systèmes nécessitent de nombreuses connections entre leurs différentes composantes pour l’apport en milieu de renouvellement ainsi que pour les prélèvements ponctuels et les trop pleins. De plus, la vaisselle utilisée n’est pas toujours d’un maniement aisé et n’est pas forcément adaptée aux techniques de stérilisation. Ainsi, bien que Groeneweg et Soeder (1978) aient réussi à maintenir axénique durant 2 mois un turbidostat de petit volume, et cela en utilisant une verrerie sophistiquée et fragile, ceux-ci restent peu utilisés et tout particulièrement pour des espèces phytoplanctoniques comme Prochlorococcus. Ceci est dû à la complexité de telles installations et, a fortiori, à la difficulté de mise en œuvre de ces cultures si elles doivent rester axéniques. Or, la contamination bactérienne doit impérativement être évitée lors d’expériences sur la physiologie de Prochlorococcus car elle a de nombreux inconvénients. En effet, lorsque les cellules phytoplanctoniques ont une taille cellulaire proche de celle des bactéries hétérotrophes (comme c’est le cas pour les petites cyanobactéries et les Prochlorophytes), il devient alors impossible de discriminer les deux organismes en se basant sur un critère de taille (compteurs de particules). Les analyses du contenu en carbone particulaire de la culture sont également biaisées car une partie significative de ce carbone appartient en fait aux bactéries. La respiration mesurée résulte à la fois des autotrophes et des bactéries hétérotrophes. Enfin (et surtout dans le cas présent), les analyses de biologie moléculaire portant sur l’expression des gènes nonphotosynthétiques deviennent trop difficiles du fait du risque d’hybridation croisée des sondes ADN14 ou ARN15 avec des gènes appartenant aux contaminants bactériens. Une autre difficulté majeure des cultures en continue utilisées pour l’étude de forçages environnementaux cycliques est rencontrée avec la lumière. Le spectre de la lumière solaire, ainsi que les lentes variations temporelles de son intensité sont très difficiles à reproduire. Dans notre expérience, cet aspect est critique puisque la division cellulaire de Prochlorococcus dans le milieu naturel est héliosynchrone, c’est-à-dire qu’elle a lieu à la même heure (à deux heures près) pour toutes les cellules d’une population (Vaulot et al., 1995). Ce synchronisme devait donc être reproduit dans la culture et pour cela, il fallait pouvoir reproduire parfaitement le cycle de l’éclairement 14 15
ADN : Acide DesoxiriboNucléique. ARN : Acide RiboNucléique.
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Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
lumineux. Ces dernières années, les turbidostats ont la plupart du temps été maintenus sous des régimes lumineux binaires ou au mieux par paliers successifs. L’introduction du « cyclostat » a été faite par Kroon et al. (1992) qui pour la première fois ont utilisé des stores vénitiens contrôlés par ordinateur, permettant ainsi la simulation fidèle du cycle solaire naturel (voir aussi Kroon et Dijkman, 1996). De nouveaux matériels apparus sur le marché, permettent maintenant la mise au point de nouveaux systèmes de faible coût plus faciles à manipuler.
III.
ORGANISATION DU CHAPITRE
Les résultats qui seront présenter dans ce chapitre ont été obtenus lors d’une expérience menée dans le cadre du projet européen PROMOLEC (contrat n° MAS3-CT970128). 23 scientifiques étaient impliqués dans ce projet qui visait à comprendre le fonctionnement de Prochlorococcus en menant conjointement l’étude par les voies de la biologie moléculaire et de l’écophysiologie. La mise au point du système de culture a entièrement été réalisée par mes soins, ce qui a permis l’organisation d’un atelier de travail au cours duquel tous les participants ont pu travailler ensemble. Au cours de cet atelier, j’ai réalisé les mesures des paramètres photosynthétiques, et une partie des mesures de fluorescence. De nombreuses collaborations m’ont permis de profiter de l’expérience de chaque protagoniste. Elles ont débouché sur plusieurs publications scientifiques : •
F. Bruyant, M. Babin, A. Sciandra, D. Marie, B. Genty, H. Claustre, J. Blanchot, A.
Bricaud, R. Rippka, S. Boulben, F. Louis et F. Partensky. 2001. An axenic cyclostat of Prochlorococcus strain PCC9511 with a simulator of natural light regimes. J. Appl. Phycol., 13 : 135-142, qui décrit le système de culture mis au point pour cette expérience (Annexe 1). •
J. Holtzendorff, F. Partensky, S. Jacquet, F. Bruyant, D. Marie, L. Garczarek, I.
Mary, D. Vaulot et W.R. Hess. 2001. Diel expression of the cell cycle-regulated genes in synchronized cultures of Prochlorococcus sp. strain PCC 9511. J. Bacteriol., 183 (3) : 915920, qui décrit la synchronisation des gènes liés au cycle cellulaire (Annexe 3). Deux autres publications sont soumises ou bien en préparation : •
F. Bruyant, M. Babin, B. Genty, O. Prasil, M.J. Behrenfeld, H. Claustre, A.
Bricaus, J. Holtzendorf, M. Koblizek et F. Partensky. Diel variations in the photosynthetic
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Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
parameters of Prochlorococcus strain PCC 9511: Combined effects of photoacclimation and cell cycle. En préparation pour Limnol. Oceanogr., qui décrit les résultats présentés dans ce chapitre sur les effets de la lumière et du cycle cellulaire sur la photosynthèse (Annexe 2). •
H. Claustre, A. Bricaud, M. Babin, F. Bruyant, L. Guillou et F. Partensky. Diel
variations in Prochlorococcus optical properties. Soumis à Limnol. Oceanogr., qui présente les résultats obtenus lors de cette expérience pour les propriétés de l’absorption et de la diffusion de la lumière. Dans ce chapitre, les différentes étapes de la mise au point du système de culture original seront dans un premier temps expliquées en détail. Ensuite toutes les mesures qui ont été effectuées au cours de cette expérience par les différents protagonistes seront présentées, ainsi que les résultats obtenus. Enfin, les différents mécanismes d’adaptation mis en place par Prochlorococcus pour faire face aux changements de l’intensité lumineuse seront discutés en commençant par ceux prenant place au niveau du photosystème 2, puis en examinant le rôle du cycle cellulaire.
◊ MISE AU POINT DU SYSTEME DE CULTURE ORIGINAL : LE TURBIDOSTAT Une fois déterminés tous les impératifs liés à ce système de culture (grand volume, axénie, lumière régulée etc…), la mise au point n’a pas été immédiate et 7 essais successifs ont été nécessaires pour diverses raisons. Dans un premier temps, il a fallu déterminer les conditions optimales de culture sur un essai en batch puis appliquer ces conditions à une culture en turbidostat. Enfin, une fois le turbidostat au point, le développement du système d’éclairement a permis d’obtenir un cyclostat.
I.
LE MATERIEL DU SYSTEME DE CULTURE
C’est la souche PCC 9511 qui a été utilisée au cours de cette expérience car c’est la seule souche de Prochlorococcus actuellement axénique (Rippka et al., 2000). Il s’agit d’une souche dite « SARG » car ayant été isolée en mer des Sargasses (Chisholm et al., 1988). Elle a été fournie par l’équipe « Phytoplancton Océanique » de la station biologique de Roscoff.
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Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
Figure I-1.
Schéma du système de culture original tel qu’il a été utilisé lors de la mise au point de l’expérience.
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
Les premiers essais ont été faits avec du matériel peu adapté aux techniques de stérilisation qui ont été employées (passage à l’autoclave ou bien au four à micro-onde), ainsi lors de la mise en route des cultures, des fuites dans les circuits ont provoqué des contaminations systématiques dans les cultures. Dans un second temps, il s’est avéré que la souche choisie n’acceptait pas de pousser dans un récipient en verre, alors que d’autres souches similaires sont régulièrement cultivées dans le verre au Massachusetts Institut of Technology par exemple (L. Moore, comm. pers.). Il est à noter qu’à la suite de ces premiers essais infructueux un dosage des silicates a été effectué dans la culture, laissant apparaître une concentration 10 fois supérieure à celle du milieu de culture d’origine. Cette concentration élevée était vraisemblablement due à un relargage d’ions du fait d’une qualité de verre inadaptée. Finalement, une fois ces questions techniques réglées, la principale difficulté a résidé dans le fait de pouvoir maintenir l’axénie suffisamment longtemps pour couvrir la période d’adaptation de la culture à la lumière, la synchronisation de son cycle cellulaire ainsi qu’une période d’échantillonnage suffisamment longue. Un premier montage a été mis au point afin de déterminer la faisabilité d’une telle expérience (Figure I-1). Il était composé d’un flacon de culture cylindrique en polycarbonate (Nalgène) de 2.8 litres rempli à 1.7 litre de milieu de culture. Ce flacon était alimenté en continu en milieu frais par une pompe péristaltique (Gilson, Minipulse 2) via une cartouche de filtration de porosité 0.2 µm (Pal Gelman, Spiralcap). Les échanges d’air avec le milieu extérieur pouvaient se faire au travers de filtres stériles de porosité 0.3 µM (Whatman, Hepa-Vent). Le volume total de la culture était stabilisé à 1.7 litre par pompage de l’excès du volume par une pompe péristaltique. L’échantillonnage se faisait par l’intermédiaire d’une autre canule. La totalité du système de culture (flacon, tubes, connexions, cartouches de filtration) a été autoclavé (20 minutes à 110°C) avant l’introduction du milieu de culture. Ceci implique que les différentes parties de ce système de culture doivent être constituées de matériaux permettant un passage à l’autoclave. Ici, le Téflon, le silicone, le polycarbonate et le polyéthylène ont été employés. L’ensemble du système était placé dans une pièce dont la température était contrôlée et maintenue à 21°C, température proche de l’optimum de croissance de la souche utilisée.
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Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
100
% transmission
80
% transmission
60
40
20
0 400
500
600
longueur d'onde (nm)
Figure I-2.
Spectre de transmission du filtre LEE n° 183 “Moonlight blue”.
700
800
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
Le milieu de culture employé lors de cette expérience est décrit en détail dans Partensky et al. (1999b). Il s’agit du milieu PCR S11. Ce milieu de culture a été préparé à partir d’eau de mer pompée en baie de Morlaix (France) à 5 m de profondeur et préalablement « vieillie » pendant plus d’un mois à la lumière du jour et à température ambiante. Cette eau a ensuite été filtrée sur cartouche Millipore 0.2 µm et autoclavée pendant une heure à 120°C. Les solutions stock du milieu PCR S11 (Partensky et al., 1999a; Rippka et al., 2000) ont été ajoutées à l’eau de mer refroidie après filtration sur filtres stériles 0.2 µm (vitamines et solution de métaux), ou bien après autoclavage (HEPES, Na2-EDTA/FeCl3, (NH4)2-SO4 et tampon Phosphate). Les seuls changements par rapport à la recette originale ont été des modifications des concentrations finales de la vitamine B12 et du Na2-EDTA/FeCl3, qui ont été ajoutés à 0.7 nM et 2 µM respectivement. Lors de cette expérience de mise au point du système de culture, une illumination continue était fournie par trois lampes à vapeur de mercure (OSRAM, HQI-TS) placées à la verticale du système de culture et au dessus d’une plaque de Plexiglas diffusante sur laquelle était collée une feuille de filtre polycarbonate de couleur bleue (Filtre LEE n° 183 : moonlight blue). Le spectre de transmission de ce filtre est représenté sur la Figure I2. L’éclairement photosynthétiquement actif (PAR) délivrée à la culture était mesurée régulièrement grâce à un quantamètre (Biospherical Instrument, QSL 100) et était fixée à 45 ± 5 µmol quanta m-2s-1, une valeur proche de l’optimum de croissance de la souche SS120 proche de PCC 9511 (Moore et al., 1995).
II.
DETERMINATION DES CONDITIONS OPTIMALES DE CULTURE
Afin de déterminer les meilleures conditions permettant la croissance continue de Prochlorococcus, une simple culture en batch a dans un premier temps été réalisée. Elle a permis de déterminer le taux de croissance maximum (croissance exponentielle) de la culture ainsi que la capacité maximum du milieu (ci-après notée MCC pour Maximum Carrying Capacity). A. METHODES DE MESURE Ne disposant pas d’un cytomètre en flux qui aurait permis de déterminer facilement le nombre de cellules dans la culture, l’estimation du taux de croissance a été faite en terme - 21 -
Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
0.100 0.08 0.05
A (442)=0.0021 e-0.6618t R²=0.9995
Absorbance
0.03 0.02 0.010 0.008 0.005 0.003 0.002 0.001 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Temps (jours)
Figure I-3. Evolution de l’absorbance à 442 nm en fonction du temps pour la culture en batch mise en place lors de la première expérience (détermination des conditions optimales). Une fonction exponentielle a été ajustée aux données expérimentales dans la fenêtre illustrée sur le graphique par la flèche, afin de déterminer le taux de croissance maximum (µmax).
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
d’absorbance à la longueur d’onde choisie de 442 nm (A(442)) qui correspond au maximum d’absorption chez Prochlorococcus. L’absorbance spectrale A(λ) a donc été mesurée sur suspension à l’aide d’un spectrophotomètre à double faisceau (Varian, DMS–100) équipé d’une sphère intégrante. L’échantillon était placé dans une cuvette de quartz d’un centimètre de chemin optique et le pas d’acquisition était de 1 nm entre 380 et 750 nm. La culture filtrée (filtre à seringue 0.2 µm, Pal Gelman, Acrodisc) a servi de référence. Afin de corriger de la diffusion résiduelle, l’absorbance à 750 nm (A(750)) a été systématiquement retranchée de la mesure spectrale (voir Stramski et Reynolds, 1993 pour plus de détails). Ces mesures d’absorption ont été systématiquement dupliquées (ainsi que les références) et moyennées. Le taux de croissance, µ, a été calculé selon la formule : A(442) t −1 µ(t ) = ln ∆t A(442) t − ∆t
(1)
où A(442)t et A(442)t-∆t sont les absorbances aux temps t et t-∆t respectivement ; ∆t étant le temps écoulé entre la mesure au temps t et la précédente. B. TAUX DE CROISSANCE ET CAPACITE MAXIMUM DU MILIEU L’absorbance à 442 nm a été mesurée deux fois par jour pendant 8 jours sur la culture en batch, et son évolution en fonction du temps est représentée sur la figure I-3. La croissance de Prochlorococcus est restée exponentielle jusqu’à une valeur de A(442) égale à 0.06. Le taux de croissance maximum (µmax) étant de 0.66 j-1 (une division par jour) tel que calculé par l’ajustement d’une fonction exponentielle sur les données dans la fenêtre indiquée sur la figure I-3. La capacité maximale du milieu a été évaluée à A(442) = 0.09, valeur au delà de laquelle la croissance de Prochlorococcus est devenue négative. C. CONDITIONS A RESPECTER LORS DE LA CULTURE EN TURBIDOSTAT Cette expérience menée en batch a permis de définir les limites applicables à une culture de Prochlorococcus maintenue dans les conditions qui avaient été choisies. Mais, bien que la phase exponentielle de croissance de la culture se soit poursuivie jusqu’à la valeur A(442) = 0.06, une limite de A(442) = 0.04 a été fixée pour les futures cultures en mode turbidostat. En effet, il est probable (et ceci serait dommageable à la
- 22 -
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
qualité des données acquises) qu’à la valeur A(442) = 0.06 les cellules croissent déjà en puisant dans leurs réserves. D’autre part, limiter la biomasse maximum dans la culture permet de prévenir les effets d’une éventuelle variation dans la composition du milieu de culture ce qui pourrait avoir comme conséquence une diminution du taux de croissance. Cela permet aussi de conserver une culture optiquement fine, assurant ainsi l’homogénéité de l’éclairement au sein de la culture.
III.
MISE EN PLACE DU TURBIDOSTAT
Suite à la détermination des conditions à appliquer à la culture pour une croissance optimale, une seconde culture a été démarrée, dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment afin de mettre au point la culture en continu. A. TAUX DE DILUTION La culture a été initiée en batch et le µmax estimé à 0.55 j-1. Cette écart (10%) entre les deux taux de croissance mesurés successivement sur deux cultures réalisées exactement dans les mêmes conditions n’est pas significatif. Il peut être imputé à l’erreur faite lors de la détermination du taux de croissance (qui peut aller jusqu’à 10 %, A. Sciandra, comm. pers.) ainsi qu’à l’emploi de l’absorbance pour la détermination de ce taux. Dès lors que la culture avait atteint la valeur limite fixée lors de la première expérience : A(442) = 0.04, elle a été diluée avec du milieu frais à un taux de 0.5 j-1. Il est à noter que le taux de dilution à appliquer à la culture est en théorie défini par : r=
∆ν V∆t
(2)
où v est le volume renouvelé et V est le volume total de la culture. Ce taux de renouvellement doit être égal au µmax afin de maintenir la biomasse constante dans la culture. Il ne doit en aucun cas dépasser cette valeur afin de prévenir son lessivage. Durant la phase turbidostat, le taux de dilution a été contrôlé deux fois par jour par pesée, et ajusté à une nouvelle valeur si nécessaire, afin de prévenir les variations de A(442).
- 23 -
Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
0.06 Phase Turbidostat
Phase Batch
0.05
Absorbance
0.04 0.03
Augmentation du taux de dilution
0.02 Arrêt de la dilution 0.01 0.00 -5
0
5
10
15
20
Temps (jours) Figure I-4. Evolution de l’absorbance à 442 nm en fonction du temps durant la première culture en turbidostat. L’absorbance augmente tout d’abord pendant la phase “batch”, puis reste stable pendant la phase “turbidostat”. Au jour 10.75 la dilution a été augmentée, au jour 15.75 elle a été stoppée.
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
B. CONTROLE DE L’AXENIE L’un des buts majeurs de cette expérience était d’être capable de maintenir une culture continue de Prochlorococcus vierge de toute contamination bactérienne pour une durée la plus longue possible. De nombreuses précautions ont donc été prises notamment lors des échantillonnages de façon à ne pas risquer de contamination. Ainsi, l’extrémité du tuyau de silicone affecté à l’échantillonnage était en permanence pincé entre deux pinces. A chaque prélèvement, le tuyau était tout simplement coupé avec des ciseaux passée à l’alcool puis à la flamme entre les deux pinces. A l’issu du prélèvement (réalisé à proximité d’un bec bunsen), la première pince était systématiquement replacé en amont de celle restant en place. L’éventuelle présence de bactéries était contrôlée deux fois par jour. Des boites de pétri contenant du milieu PCR S11 avec 8 g L-1 d’agarose et enrichies avec 1 g L-1 de glucose D+ et 0.2 g L-1 d’hydrolysat acide de caséine étaient ensemencées avec deux inoculum de culture (50 et 200 µL). L’absence de colonies bactériennes sur les boites 6 jours après l’inoculation permettait de conclure à l’absence de bactérie dans l’échantillon original. Une comparaison avec une boite de pétri ensemencée par une culture nonaxénique confirmait que le gel d’Agarose utilisé permettait bien la croissance bactérienne. C. RESULTATS DU PREMIER TURBIDOSTAT Après 5 jours en mode « batch », la dilution de la culture a pu être mise en route (Figure I-4). Pendant près de 10 jours et demi A(442) a été maintenu presque constant indiquant ainsi que la biomasse était restée stable (à 10% près) pendant cette période. Le matin du 11ème jour, le taux de dilution a été augmenté jusqu’à 0.6 j-1 afin de voir si la vitesse de croissance de la culture pouvait être augmentée. Dès lors A(442) a décru, indiquant que le taux de croissance de la culture n’avait pas augmenté. Ceci confirmait que la croissance des cellules n’étaient pas limitée par les nutriments. Le 15ème jour, la dilution a été stoppée afin de pouvoir évaluer la capacité du milieu à supporter une plus forte biomasse. Le taux de croissance mesuré alors n’était plus que de 0.51 j-1, et la biomasse dans la culture n’a augmenté que jusqu’à A(442) = 0.06. Ceci met en évidence les possibilités de variations naturelles et expérimentales lors de tests successifs menés dans des conditions a priori similaires, et justifie pleinement a posteriori les précautions prises lors de cette deuxième expérience par rapport aux conditions définies lors du premier test.
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Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
Les résultats des tests de cultures bactériennes pour les inoculum de 200 µL indiquaient pour les boites de pétri correspondant aux prélèvements du 3 décembre au matin et du 8 décembre au soir une contamination positive de la culture. Néanmoins, l’absence de développement significatif de colonies bactériennes pour les trois jours suivants indique qu’il s’agissait d’une erreur commise lors de la manipulation. La culture a donc été maintenue axénique pendant 13 jours consécutifs.
IV.
CONCLUSION
Au cours de ces expériences “test”, la faisabilité d’une culture continue de Prochlorococcus a pu être démontrée. De plus, il a été prouvé que, moyennant certaines précautions, il était possible de maintenir cette culture axénique. Le laps de temps (13 jours) était suffisamment long pour couvrir l’adaptation de la culture aux conditions ambiantes ainsi que le temps de prélèvement. Grâce à ces résultats techniques, ce système de culture a pu ensuite être modifié afin d’être adapté à de grands volumes, mais surtout un système permettant de soumettre la culture à des changements d’éclairement a été ajouté. Ce système de type “cyclostat” (sensu Kroon et al., 1992) est décrit en détail dans la partie suivante.
◊ MATERIEL ET METHODES I.
LE CYCLOSTAT
L’expérience menée sur Prochlorococcus lors de l’atelier de travail PROMOLEC nécessitait de nombreux prélèvements à des heures rapprochées. Le volume à prélever chaque deux heures sur la culture étant relativement élevé (environ 0.5 L). Il a fallu augmenter le volume total de la nouvelle culture en tenant compte du taux de croissance observé lors de la première expérience. Ainsi, le sur-échantillonnage était évité, ce qui aurait immanquablement conduit à la disparition de la population alguale par simple lessivage. Le turbidostat mis au point précédemment a également été modifié par l’ajout d’un système d’éclairement permettant de simuler les changements de lumière au cours de la journée. Ce système de culture est donc devenu un cyclostat.
- 25 -
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
A. ADAPTATION AUX GRANDS VOLUMES Pour réaliser cette adaptation, un ensemble de 12 bidons Nalgène en polycarbonate remplis chacun de 10 L de milieu PCR-S11 a été mis en place. Le milieu a été préparé comme précédemment mais selon la recette d’origine (Partensky et al., 1999b). Tous les bidons étaient reliés par une égale longueur de tube de silicone à une pompe péristaltique (Cole-Parmer instrument Co, Masterflex model 7523-37). Il est important de noter que la quantité totale de milieu de renouvellement doit être préparée à l’avance de façon à éviter au maximum l’impact des éventuels changements de composition du milieu d’un bidon à l’autre. Cette précaution permet de conserver strictement les mêmes conditions tout au long de l’expérience. En aval de la pompe, le milieu de renouvellement était séparé en deux lignes de même longueur, alimentant chacune un jerry-can en polycarbonate de 20 L (Nalgène) après filtration sur deux filtres stériles 0.2 µm Spiralcap montés en série. Le taux de renouvellement moyen était de 8 mL min-1 et la dilution était appliquée en continue. Les deux jerry-can étaient immergés dans un aquarium de verre dans lequel circulait un courant d’eau thermostatée à 21 ± 1°C par un bain circulant (Huber, Minichiller). Tout comme lors de la première expérience, de nombreuses précautions ont été prises de façon à éviter toute contamination bactérienne. Le milieu a été préparé stérilement. Les différentes parties du système de cultures ont été rincées à l’acide chlorhydrique puis à l’eau dé-ionisée (Milli-Q) avant d’être autoclavées. L’assemblage du système a été fait sous la hotte à flux laminaire ou bien à proximité d’un bec bunsen. Le volume excédentaire de la culture était pompé continuellement dans un bidon Nalgène de 10 L et vidé périodiquement par pompage stérile. Il est à noter que lors de cette expérience la culture n’était pas agitée. En effet, une population de Prochlorococcus en bonne santé ne sédimente pas. Cependant si ce système de culture devait être utilisé afin d’étudier une réponse à des conditions de limitation par un quelconque nutriment, l’agitation serait alors indispensable afin de maintenir une homogénéité correcte du milieu.
- 26 -
Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
PAR (unités relatives)
1.20
Calculée Mesurée
1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 3:00
6:00
9:00 12:00 15:00 18:00
T em ps (heure) Figure I-5.
PAR comme un fonction du temps durant les expériences cyclostat.
PAR (unités relatives)
1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0
2
4
6
8
10
12
Tension (unités relatives) Figure I-6. PAR vs. entrée en courant continu, réponse de l’ensemble ballast / tube néon. Les données de deux séries de mesures ont été compilées pour calculer une moyenne lissée par la méthode des moindres carrés.
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
B. LE SYSTEME D’ECLAIREMENT La partie la plus originale de ce montage résidait dans le système d’éclairement qui a permis de transformer ce turbidostat en cyclostat (sensu Kroon et al., 1992). Ce système se composait d’un ensemble de 6 tubes fluorescents en forme de U de 50 cm de longueur (Figure I-1). Ces tubes (OSRAM, Dulux L, 2G11, 55W/12-950, Luminux de luxe, lumière du jour) étaient disposés tête-bêche avec une densité d’environ 20 m-1, sur deux planches de contre-plaqué blanc (6 tubes par planches) placées de part et d’autre des deux jerry-can contenant les cultures. Chaque tube était connecté à un ballast électronique (OSRAM, Quicktronic, QT 1×55/230-240 DIM) alimenté par du courant 220 V alternatif. Ces ballasts comportent une entrée analogique (0-10 VDC16) permettant de moduler l’éclairement fourni par chacun des tubes fluorescents entre 1 et 100% de leur puissance. Les ballasts étaient contrôlés grâce à une carte d’acquisition (ADAC, 5525MF-V, 26330) pilotée depuis un ordinateur personnel équipé du logiciel Labtech Notebook (Laboratory Technologies Corp.) version 10.11. De façon à simuler un cycle naturel d’éclairement deux fonctions ont été successivement appliquées. Une fonction PAR vs. temps et une fonction VDC vs. PAR. La fonction PAR vs. temps a été calculée avec un pas de temps de 300 sec. en utilisant un code de transfert radiatif (Sequoia Scientific Inc., Hydrolight, Version 3). Les conditions choisies correspondaient à la date du 1er juin à l’équateur sous un ciel clair (comme définie dans Morel, 1991) et juste sous la surface océanique (Figure I-5). La fonction sortie VDC vs. PAR typique de l’ensemble tube fluorescent / ballast a été caractérisée à l’aide d’une alimentation électrique couplée à un oscilloscope (LECROY, 9310C) et d’un quantamètre (Biospherical Instr., QSL-100). Un fichier de sortie a été généré avec un incrément de 1×10-5 sur une échelle relative pour le PAR allant de 0 à 1 (Figure I-6). Au début de la période de jour, le passage de 0 à 1% était réalisé par l’allumage alternatif d’un tube sur deux. L’ensemble des tubes était ensuite contrôlé à l’aide des fonctions décrites ci-dessus. La lumière fournie à la culture était diffusée au travers un filtre plastique (Filtre
LEE n° 220, “White frost”) fixé autour de l’aquarium. Le PAR au moment du maximum d’éclairement a été mesuré à la fin de l’expérience à l’intérieur de la culture à l’aide d’un 16
VDC pour Voltage Direct Current.
- 27 -
Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
0.016 1% 42% 100%
E(λ) (unités relatives)
0.014 0.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 350
400
450
500
550
600
650
700
750
longueur d'onde (nm) Figure I-7. Spectre d’éclairement des tubes néons utilisés durant l’expérience “cyclostat”, mesuré à 3 différents niveaux d’entrée de courant continu (1, 5 et 10 VCC) correspondant à 1, 42 et 100% de l’éclairement maximal des tubes.
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
quantamètre (LICOR, LI-100) équipé d’un collecteur 4π. L’irradiance moyenne au midi solaire était de 970 et 912 µmol quanta m-2s-1 dans les cyclostat #1 et #2 respectivement. Les variations temporelles du PAR ont été mesurées en valeurs relatives tout au long de l’expérience à l’aide d’un autre quantamètre (Biospherical Instr., PNF-300) connecté à la sortie analogue de la carte d’acquisition. Lorsque l’on compare les variations temporelles de PAR mesurées aux valeurs calculées (fonction d’entrée), on remarque un léger décalage ainsi qu’une légère asymétrie (Figure I-5). Le décalage pourrait est probablement dû au fait que la fonction PAR vs. VDC a été déterminée avec un seul ensemble tube fluorescent / ballast et non dans la configuration finale (12 ensembles). L’asymétrie, surtout visible à la fin de la journée, suggère que la fonction PAR vs. VDC comporte de l’hystérèse, et pourrait être corrigée en déterminant séparément des fonctions pour le matin et l’après-midi. Le spectre d’éclairement des tubes néons a été mesuré entre 350 et 750 nm avec un incrément de 1 nm à l’aide d’un spectroradiomètre (LICOR, LI-1800UW). Il est représenté sur la figure I-7, normalisé par la surface sous la courbe et mesuré à trois puissances relatives différentes: 1, 42 et 100%. On remarque que le spectre de la lumière délivrée n’est pas modifié significativement lorsque la puissance change. Bien que ce spectre soit très différent de celui de la lumière du soleil, le domaine spectral correspondant à la partie du spectre solaire utilisable pour la photosynthèse (PUR, pour Photosynthetic Usable Radiation) est bien couverte. De plus, il est possible de rajouter entre les tubes et la culture des filtres colorés de façon à mieux représenter le spectre de la lumière disponible sous la surface de l’océan (par exemple Filtre LEE, n° 183 “Moonlight blue”). Signalons ici que ce système de lumière permet de simuler des éclairements pouvant aller jusqu’à 3000 µmol quanta m-2s-1 auprès de la source, ce qui permet d’obtenir des intensités suffisamment fortes même dans le cas de l’utilisation de filtres colorés. A ce stade, il était techniquement possible de maintenir une culture continue axénique de Prochlorococcus pour une durée d’au moins 13 jours. Il était également possible de simuler l’éclairement solaire et de reproduire parfaitement les conditions du milieu naturel.
- 28 -
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
II.
ADAPTATION DE LA CULTURE ET ECHANTILLONNAGE A. UNE ACCLIMATATION PROGRESSIVE
Lors de la préparation de l’atelier de travail, il a fallu procéder à une acclimatation progressive de la culture, de façon à limiter les risques de sénescence. La population de Prochlorococcus a donc été soumise durant 15 jours au cycle de lumière tel que décrit au paragraphe précédent. La culture a tout d’abord été menée en « batch » durant 4 jours, puis de façon à limiter l’importante quantité de milieu PCR-S11 à fabriquer, son volume a été limité à 2 litres pendant les 7 premiers jours du mode cyclostat. Le volume a ensuite été progressivement augmenté jusqu’à 10 litres en une journée et maintenu dans ces conditions pendant les 3 jours précédant la période d’échantillonnage qui a elle-même duré 4 jours. B. ECHANTILLONNAGE Tenant compte du volume de la culture, du taux de renouvellement (10.5 L j-1) et des déchets lors des prélèvements, 6 L de culture à un taux de croissance d’environ 1 division par jour (µ=0.69 j-1) pouvaient être soustraits sans affecter la croissance de la population (mais voir les résultats). L’ajustement du taux de dilution de la culture se faisait une fois par jour en référence aux comptages cellulaires effectués par cytométrie en flux. Ce comptage “référence” se faisait à la transition nuit/jour. Les différents indicateurs de biomasse pouvant être utilisés présentent en général des oscillations circadiennes lorsque les cultures phytoplanctoniques considérées sont soumises à un cycle d’éclairement (Kroon et al., 1992). Ainsi, un suivi en continu du paramètre choisi et l’ajustement continu du taux de dilution en résultant ne peut être conduit sans ambiguïté lors de l’application d’un cycle circadien de l’illumination. En effet, suivant les oscillations du paramètre choisi pour représenter la biomasse, le taux de dilution viendrait à osciller lui aussi pouvant affecter l’évolution de la culture. Le meilleur moyen pour éviter ce biais est de ne pratiquer l’ajustement du taux de dilution qu’une seule fois par jour et toujours au même moment du cycle cellulaire (Bruyant et al., 2001). Les deux cyclostats n’ont pas été échantillonnés avec la même fréquence. Pour le cyclostat #1, les échantillons étaient prélevés toutes les deux heures pour toutes les analyses exception faite de la transcription des gènes (voir détail ci-après). Dans le
- 29 -
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
cyclostat #2, les échantillons étaient collectés toutes les quatre heures seulement pour les comptages en cytométrie en flux, les mesures de fluorescence et l’analyse de la transcription des différents gènes étudiés. Les deux premiers types de mesure cités servaient de comparaison entre les deux cyclostats. Il est important de souligner que pendant la nuit, les prélèvements étaient réalisés sous un éclairement vert de faible intensité. En effet, cette lumière n’est pas absorbée par Prochlorococcus (Morel et al., 1993; Shimada et al., 1996) ce qui permettait de ne pas perturber la croissance des algues. C. REPETITION DES EXPERIENCES Afin de compléter le jeu de données disponible à l’issue de cet atelier de travail, cette expérience a été répétée à l’identique par deux fois sur deux cyclostats de 2 litres. Ces deux expériences ont été réalisées avec succès et les différentes mesures ont pu être corrélées à celles obtenues lors de l’expérience principale en se basant sur les mesures de fluorescence variable (mais voir détails plus bas).
III.
ANALYSES EN CYTOMETRIE EN FLUX
Le nombre de cellules ainsi que le contenu en ADN cellulaire ont été déterminés à l’aide d’un cytomètre en flux FacScan (Becton Dickinson) sur les deux cyclostats. Immédiatement après le prélèvement les cellules étaient empoisonnées par une solution à 1% de paraformaldéhyde et 0.1% de glutaraldéhyde pendant 15 minutes (produits chimiques Sigma). Suite à cette fixation, les échantillons étaient congelés dans l’azote liquide puis stockés à –80 °C en attendant les analyses. Une fois dégelées, les cellules étaient colorées par une dilution 1/10000 du colorant commercial spécifique de l’ADN SYBR-Green I (Molecular Probes Inc.). Les analyses étaient ensuite réalisées comme décrit dans Marie et al. (1999 et 2000). Une même analyse permettait de compter le nombre de Prochlorococcus en détectant la fluorescence rouge de leur divinylechlorophylle a (div-chl a), mais aussi de déterminer leur contenu en ADN cellulaire en détectant la fluorescence verte du colorant SYBR-Green I (erreur globale sur les mesures << 5 % du nombre de cellules comptées). Les analyses en cytométrie en flux ont aussi permis de déterminer tout au long de l’expérience l’éventuelle contamination par des bactéries (particules diffusant la lumière mais n’émettant pas de fluorescence rouge).
- 30 -
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
IV.
DETERMINATION DU CONTENU CELLULAIRE EN CARBONE
Le contenu en carbone de Prochlorococcus a été déterminé sur le cyclostat #1 par analyses CHN17. Toutes les deux heures, des triplicatas de 50 mL était filtrés sur des filtres en fibre de verre Whatman (GF/F) préalablement nettoyés dans un mélange de soxlet au dichlorométhane. Après filtration, les filtres étaient stockés à 50 °C en attendant les analyses (faites dans les trois mois du prélèvement). Les échantillons ont été analysés à l’aide d’un analyseur CHN LECO 900. L’EDTA18 a été utilisé comme standard.
V.
ANALYSES PIGMENTAIRES
Le contenu pigmentaire de Prochlorococcus a été déterminé sur le cyclostat #1 par analyses HPLC19. 40 mL de culture étaient systématiquement filtrés sur des filtres en fibre de verre (Whatman, GF/F), puis congelés dans l’azote liquide. Le protocole HPLC en phase inverse décrit dans Vidussi et al. (1996) a été appliqué. Lors de cette expérience cependant certaines différences sont à souligner : le taux d’élution était de 0.5 mL min-1 et la colonne chromatographique employée était une RP-C8, Hypersil, MOS.3 µm. D’autre part, le gradient entre le solvant A (mélange méthanol / acétate d’ammonium à 70:30) et le solvant B (100 % méthanol) était : (minutes ; % solvant A ; % solvant B) : (0 ;80 ;20), (4 ;50 ;50), (18 ;0 ;100), (22 ;0 ;100) (J. Ras, comm. pers .). L’erreur moyenne commise sur la détermination des concentrations pigmentaires est < 0.7 % (J. Ras, comm. pers.).
VI.
DETERMINATION DU COEFFICIENT D’ABSORPTION
La densité optique de la culture (DO) a été déterminée sur le cyclostat #1 entre 220 et 800 nm avec un incrément de 1 nm. Les mesures ont été faites sur la culture en suspension contenue dans une cuvette de quartz de 1 cm à l’aide d’un spectrophotomètre (Perkin Elmer, Lambda 19) équipé d’une sphère intégrante de 60 mm de diamètre (voir Bricaud et al., 1999 pour plus de détails). La culture filtrée était utilisée en référence. Le coefficient d’absorption a (λ) (m-1) a été calculé selon la formule :
17
CHN : Carbon Hydrogen Nitrogen EDTA : EthyleneDiamineTetraacetic Acid. 19 HPLC : High Performance Liquid Chromatography. 18
- 31 -
Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
50 mL 14
14
C
C
25 mL
25 mL
Fixation carbone
Activité totale
Répliquat : même traitement 20 * 1 mL culture
50 µL éthanolamine + 50 µL culture
20 minutes à 20 intensités lumineuses différentes + 1 mL ∆H2O
+ 20 * 1 mL HCl
+ 10 mL scintillant
1 heure sous la hotte aspirante
+ 20 * 10 mL scintillant COMPTAGE COMPTAGE
Figure I-8. éclairement.
Déroulement schématisé de l’expérience de détermination de la relation entre fixation de carbone et
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
a (λ ) =
ln DO(λ ) l
(3)
dans laquelle l est la longueur du trajet optique (c’est-à-dire la longueur de la cuvette : 0.01 m). L’erreur faite lors de la détermination de la DO par le spectrophotomètre est d’environ 1/1000. Le coefficient d’absorption spécifique moyen a* (λ) [m2 (mg div-chl a)-1] a ensuite été dérivé de la formule : a * (λ ) =
a (λ ) [div − chl a ]
(4)
dans laquelle [div-chl a] est la concentration en divinyle-chlorophylle a (mg m-3) déterminée par les mesures HPLC. Pour la détermination du coefficient d’absorption spécifique moyen, l’erreur faite sur la détermination de la concentration en divinylechlorophylle a s’ajoute donc à celle faite sur la détermination de la DO. Finalement le fiabilité des mesures est supérieure à 97 %.
VII. PARAMETRES
DE LA RELATION FIXATION DE CARBONE VS.
ECLAIREMENT
La relation entre le taux de fixation de carbone et l’éclairement a été déterminée pour le cyclostat #1 toutes les deux heures par la technique des courbes P vs. E selon Lewis et Smith (1983). Un échantillon de 50 mL de culture était systématiquement subdivisé en deux sous-échantillons (répliquats), inoculés avec un traceur radioactif (NaH14CO3, 2 µCi mL-1) (Figure I-8). Afin de déterminer l’activité totale du bicarbonate ajouté en début d’expérience, trois aliquotes de 50 µL étaient immédiatement prélevés et ajoutés à 50 µL d’une base organique : l’éthanolamine (Sigma-Aldrich). 1 mL d’eau distillée et 10 mL du liquide à scintillation (mélange 90% Packard, Aquasol-2 - 10% méthanol) étaient ensuite ajoutés. Immédiatement après, 20 aliquotes de 1 mL chacune étaient réparties dans 20 fioles à scintillation placées dans 20 cellules séparées et thermorégulées à 20 intensités lumineuses différentes pendant 20 minutes. La lumière dans l’incubateur était fournie par une lampe à halogénures métalliques (OSRAM, Powerstar HQI-TS 150 W/NDL UVS) placée en dessous de l’incubateur. Avant d’atteindre les échantillons, la lumière traversait un réservoir d’eau en Plexiglas, une plaque de plastique diffusante et différentes combinaisons de filtres neutres en gélatine (Kodak) permettant d’assigner à chaque - 32 -
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
cellule une intensité lumineuse différente. Le PAR (µmol quanta m-2s-1) disponible dans chacune des alvéoles était mesurée deux fois chaque jour à l’aide d’un quantamètre (Biospherical Instr., QSL-100) équipé d’un collecteur sphérique. L’éclairement maximal lors des incubations correspondait à l’éclairement maximal régnant dans la culture au midi solaire. La température dans l’incubateur était maintenue constante (21 ± 1°C) à l’aide d’une circulation d’eau autour des alvéoles de cuivre (cryo-circulateur Lauda, RMS6). Après l’incubation, les échantillons étaient acidifiés (1 mL d’HCl 1M) et placés sous une hotte aspirante pendant une heure afin d’éliminer l’excédent de carbone inorganique. 10 mL du cocktail à scintillation étaient ensuite ajoutés à chaque échantillon. L’erreur moyenne commise avec cette méthode sur la détermination des paramètres de la courbe P vs. E est inférieure à 7 % (Lewis et Smith, 1983). La concentration totale en carbone inorganique dissous (DIC20) a été suivie lors d’une des expériences effectuées sur un petit volume. Toutes les deux heures, 10 mL de culture était filtrés à l’aide de filtres à seringue (Pal Gelman, Acrodisc 0.2 µm) et empoisonnés avec du chlorure mercurique (HgCl2, concentration finale 1 mM). La concentration en DIC a été mesurée à l’aide d’un analyseur à carbone Shimadzu (TOC5000). Sa variation circadienne a été montrée comme étant inférieure à 30% (± 15 %) autour d’une valeur moyenne de 11 g m-3. Le taux de fixation de carbone a finalement pu être calculé selon Parsons et al. (1984) en tenant compte de la concentration en DIC déterminée expérimentalement. Il a ensuite été normalisé par la concentration en divinylechlorophylle a pour obtenir PB [mg C (mg div-chl a)-1h-1]. La pente initiale de la courbe P vs. E [αB, mg C (mg div-chl a)-1h-1 (µmol quanta m-2s-1)-1] et le taux maximal spécifique de B , mg C (mg div-chl a)-1h-1] ont ensuite été estimés en ajustant aux fixation de carbone [ Pmax
données expérimentales de PB et de PAR la relation proposée par Jassby et Platt (1976) : B
B max
P =P
α B PAR B tanh + P0 B Pmax
(5)
dans laquelle P0B est l’ordonnée à l’origine estimée de la courbe. L’utilisation du modèle mathématique proposé par Jassby et Platt (1976) au cours de cette partie du travail a été préférée par rapport à l’utilisation d’un modèle incluant la paramètrisation du phénomène 20
L’acronyme anglais DIC pour Dissolved Inorganic Carbon sera utilisé ici.
- 33 -
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
de photoinhibition (par exemple Platt et al., 1980) pour deux raisons : 1/ aucune des courbes P vs. E ne présentait de diminution de la quantité de carbone fixée à forte lumière et 2/ ce modèle permettait une meilleure estimation du paramètre αB. Tel que mentionné dans l’introduction, d’autres paramètres photosynthétiques ont été déterminés à partir de cette relation : le paramètre de saturation, EK (µmol quanta m-2s-1) a été déterminé selon : B Pmax αB
EK =
(6)
Le rendement quantique maximal de fixation de carbone [φCmax, mol C (mol quanta)-1] a été dérivé de la relation :
φ C max =
αB a*
(7)
dans laquelle a * est le coefficient d’absorption spécifique moyen pondéré par l’éclairement spectral de la source lumineuse utilisée pendant l’incubation :
a
*
∫ =
700
400
a * ( λ ) E ( λ ) dλ
∫
700
400
E ( λ ) dλ
(8)
La quantité cumulée de carbone fixée [ΠB, mg C (mg div-chl a)-1] dans le cyclostat #1 a été calculée pour chacun des jours suivant la formule : t
Π B (t ) = ∫ P B (t )dt 0
(9)
dans laquelle PB (t) est issu de l’équation 5 sans considérer P0B , et t est le temps écoulé en heure depuis 00:00. Pour tous ces calculs, αB a été modifié comme dans Babin et al. (1996) afin de tenir compte de la différence spectrale des deux éclairements disponibles dans le B cyclostat et dans l’incubateur. Une interpolation linéaire des valeurs mesurées de Pmax et
αB à permis de déterminer ΠB(t) avec un pas de temps de 10 min.
- 34 -
Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
Echantillon
Exposé à la lumière de la culture
Fs
F’m
Immédiatement dans le noir
F’o après 30 minutes dans le noir
flash non-actinique
flash saturant
Fo
Fm
Figure I-9. Déroulement schématisé de l’expérience de détermination des différents taux d’émission de fluorescence par la technique utilisant le fluorimètre à amplitude modulée.
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
VIII. MESURES DE LA FLUORESCENCE L’étude de la fluorescence in vivo de la div-chl a a été faite toutes les deux heures. Un fluorimètre Xe-PAM21 (Heinz Walz GmbH, Allemagne) a été utilisé pour mesurer les rendements de fluorescence selon l’approche “Pump and Probe” (Mauzerall, 1972). Les flashs sonde non-actiniques22 étaient produits par une lampe au xénon et filtrés à travers une combinaison de deux filtres optiques : un BG39 (Schott, 5 mm d’épaisseur) et un filtre passe-bas coupant la lumière au delà de 695 nm (Walz, SP695, 1 mm d’épaisseur). Les flashs saturants étaient également produits par une lampe au xénon combinée avec un filtre BG39 (Schott, 5 mm d’épaisseur). Pour toutes les mesures, le système de détection était équipé d’une combinaison de filtres R65 (1 mm d’épaisseur)/RG645 (3 mm d’épaisseur) (Balzer/Schott) et d’un filtre additionnel RG665 (1 mm d’épaisseur, Schott). Le signal de fluorescence était lu sur un oscilloscope (LECROY, 9310C). Durant ces expériences, les taux minimum et maximum d’émission de fluorescence ont été mesurés après 30 minutes d’adaptation à l’obscurité (Fo et Fm respectivement), ou bien après 3 minutes d’adaptation dans le fluorimètre (lampes halogènes) à la lumière ambiante dans la culture au moment de l’échantillonnage (Fs et F’m respectivement) (Figure I-9). Pour cela, la lumière dans la culture était mesurée juste avant l’échantillonnage avec un quantamètre (Biospherical Ins., QSL-100). Le taux minimum de fluorescence a également été mesuré juste après la transition au noir (F’o). F’o, Fs et Fo ont été obtenus en appliquant aux échantillons des flashs non actiniques, alors que Fm et F’m ont été mesurés à l’aide d’un flash sonde non actinique appliqué 50 µs après un flash saturant. Avec les différentes séries de mesure de Fo et Fm d’une part et Fs et F’m d’autre part, l’efficacité photochimique du PS2, Fv/Fm (ou F’v/F’m) a pu être calculée, avec Fv (ou F’v) étant la part variable de cette fluorescence calculée comme : Fv = Fm – Fo ou F’v = F’m – Fs
21
(10)
PAM pour Pulse Amplitude Modulated. C’est à dire dont l’intensité est suffisamment faible pour ne pas modifier significativement l’état redox de l’appareil photosynthétique.
22
- 35 -
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
Les rendements quantiques relatifs de fluorescence ont ensuite été déterminés selon la formule :
φ Fx =
Fx
∫
700
400
a (λ ) E probe (λ ) dλ
(11)
dans laquelle l’indice x est o, m ou s respectivement, et Eprobe(λ) est l’éclairement spectral du flash sonde du Xe-PAM mesuré en unités relatives à l’aide d’un spectroradiomètre (LICOR, LI-1800UW) équipé d’un collecteur 2π (0.7 mm de diamètre). Un fluorimètre FRR23 (décrit dans Kolber et al., 1998 mais voir aussi Steglich et al., 2001) a également été utilisé durant l’expérience principale pour mesurer Fo et Fm, ainsi que la section efficace d’absorption effective du PS2, σPS2 (A²). Un fluorimètre DMK24 (PSI, Rép. Tchèque, FL-100) a aussi été utilisé durant l’expérience principale selon les méthodes décrites dans Trtilek et al. (1997) (mais voir aussi Dijkman et al., 1999 et Steglich et al., 2001) pour mesurer la constante de ré-oxydation de l’accepteur d’électron QA . Cette constante de ré-oxydation a été déterminée à partir des cinétiques de relaxation de la fluorescence variable dans l’intervalle de temps 100 µs – 10 s suivant le flash. Les échantillons étant maintenus dans l’obscurité avant et durant la mesure, la relaxation du rendement de fluorescence qui suit un flash dit “simple turn-over”25 reflète la ré-oxydation de QA.
IX.
TRANSCRIPTION DES GENES IMPLIQUES DANS LA PHOTOSYNTHESE
Les rythmes de transcription du gène codant le grosse sous-unité de la Ribulose1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase (dénotée par la suite RubisCO) rbcL, ont été étudiés pour le cyclostat #2. Toutes les 4 heures, 800 mL de culture étaient prélevés et les cellules étaient immédiatement isolées par centrifugation (7 min., 4°C, 18 500 g), puis resuspendues dans du tampon ARN et congelées. La quantité de transcrit ARNm26 du gène rbcL, a été déterminé par rtPCR comme décrit dans Holtzendorff et al. (2001).
23
FRR pour Fast Repetition Rate. DMK pour Dual Modulation Kinetic. 25 simple turn-over signifie que le flash de lumière n’induit qu’un seul événement photosynthétique : les photosystèmes ne fonctionnent qu’une seule fois. 26 ARNm : Acide RiboNucléique messager. 24
- 36 -
Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
8e-10 PAR div-chl a/cell zea/cell
1000
6e-10 800
5e-10 4e-10
600
3e-10
400
2e-10
-2 -1 PAR (µmol quanta m s )
div-chl a & zea / cellule (µg cell-1)
7e-10
1200
200
1e-10 0
0 18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
Temps (heure)
Figure I-10. Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1, lignes continues) et des concentrations en divinylechlorophylle a (µg cellule-1, cercles noirs) et en zeaxanthine (µg cellule-1, cercles blancs) pendant les trois jours d’échantillonnage.
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
Les rythmes de transcription de certains gènes codant des protéines de l’appareil photosynthétique ont été déterminés durant l’expérience principale. Des résultats concernant les gènes psbA -codant la protéine D1 du centre réactionnel du PS2- et pcbA – codant une partie de l’antenne du PS2- seront discutés ici. Les quantités de transcrit ARNm de ces deux gènes ont été obtenus comme décrit dans Garczarek et al. (2001).
◊ RESULTATS I.
MAINTIEN DE L’AXENIE
Malgré toutes les précautions prises lors de cette expérience, le nombre de bactéries observées dans le cyclostat #1 est passé de 0 au début de l’expérience à 1.6% de la population de Prochlorococcus à t = 38 h puis à 5.6% à la fin de l’expérience (t = 96 h). Cette contamination a très vraisemblablement été provoquée par l’échantillonnage très intensif pratiqué lors des 4 jours de mesures. Le dernier jour d’échantillonnage n’a donc pas été pris en compte dans les interprétations.
II.
CONTENU CELLULAIRE EN CARBONE
Le contenu cellulaire en carbone a présenté des variations circadiennes marquées (données non représentées) durant cette expérience avec des valeurs augmentant durant la journée et diminuant durant la période de nuit (Claustre et al., soumis), et des valeurs moyennes de 27 ±6 fg C cellule-1.
III.
CONCENTRATIONS PIGMENTAIRES
Le contenu cellulaire en divinyle-chlorophylle a était maximal en début de journée et décroissait ensuite (d’environ 20 %) tout au long du jour et jusqu’au milieu de la nuit. Il ré-augmentait ensuite jusqu’à l’allumage de la lumière (Figure I-10). La concentration cellulaire en zéaxanthine, quant à elle a montré des variations circadiennes claires et bien reproductibles tout au long des trois jours de mesure. Elle diminuait d’environ 40 % durant la nuit et augmentait régulièrement pendant toute la période de jour avec un ralentissement marqué très reproductible chaque jour autour de midi (Figure I-10). Le rapport zéaxanthine/div-chl a est resté élevé durant toute l’expérience (supérieur à 1.5). Il
- 37 -
0.07
0.025
0.06
0.020
0.015
0.010
0.005
φCmax [mol C (mol quanta)-1]
0.030
0.000
1200
PAR φ
Cmax
1000
a*moy
0.05
800
0.04 600 0.03 400
0.02 0.01
200
0.00 18:00
0 06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
PAR (µmol quanta m-2s-1)
a*moy [m2 (mg div-chl a)-1]
Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
18:00
Temps (heure) Figure I-11. Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1), du rendement quantique maximal de fixation de carbone (φCmax , mol C (mol quanta)-1) et du coefficient d’absorption spécifique moyen ( a * , m2 (mg div-chl a)-1).
12
1200 PAR PBmax EK
1000
10
800
8 600 6 400
4
200
2 0 18:00
PAR & EK (µmol quanta m-2s-1)
PBmax [mg C (mg div-chl a)-1h-1]
14
0 06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
Temps (heure)
Figure I-12. Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1), du taux maximal spécifique de fixation de carbone B ( Pmax , mg C (mg div-chl a)-1h-1) et du paramètre de saturation (EK, µmol quanta m-2s-1).
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
augmentait durant le jour et diminuait durant la nuit d’environ un facteur 2 (Claustre, et al., soumis). Le rapport C:div-chl a présentait des valeurs augmentant durant la journée et diminuant durant la période de nuit, avec une valeur moyenne de 70 ±13 (g/g). Les valeurs matinales se situaient autour de 54 présentant une augmentation de 93 % au cours de la période de jour (Claustre et al., soumis).
IV.
LES PARAMETRES PHOTOSYNTHETIQUES
Les variations circadiennes du rendement quantique maximal de fixation de carbone, φCmax, et du coefficient d’absorption spécifique moyen, a * , sont illustrées sur la figure I-11 avec les changements de l’éclairement. φCmax décroissait systématiquement et très rapidement de près d’un facteur 4 dès l’augmentation de l’éclairement au début du jour. Il demeurait ensuite à des valeurs faibles, du midi solaire au milieu de la période nocturne, pour ré-augmenter par la suite durant la seconde partie de la nuit. Les valeurs les plus élevées étaient atteintes de nouveau juste avant le début de la période diurne suivante. Les valeurs maximales de φCmax sont restées durant toute l’expérience inférieures à la moitié de la valeur maximale théorique qui est de 0.125 mol C (mol quanta)-1 (une molécule de carbone fixée pour 8 photons absorbés). Les variations circadiennes de a * ont été de faible amplitude (mais bien reproductibles) avec des valeurs croissant durant le jour et diminuant durant la nuit (Figure I-11). Ainsi les variations de φCmax sont responsables de la majeure partie des variations de αB (cf. Eq. 7, données non représentées). B Pmax a également présenté durant cette expérience des variations circadiennes de
forte amplitude (plus d’un facteur 4, Figure I-12). Le taux maximal spécifique de fixation de carbone chutait systématiquement et de façon très abrupte vers 10:00 (soient environ 4 heures après la chute des valeurs de φCmax). Cette diminution se poursuivait ensuite plus lentement entre 12:00 et 03:00. Durant la fin de la nuit et le début du jour, les valeurs de B Pmax augmentaient fortement jusqu’à leur maximum en l’espace de 7 heures environ. Un
ralentissement
dans
la
ré-augmentation
des
valeurs
était
néanmoins
observé
B systématiquement lors de l’allumage de la lumière. Ce rythme dans les variations de Pmax a
été particulièrement bien reproduit durant les jours 2 et 3. Les valeurs les plus fortes - 38 -
12 10
PAR Jour 1 Jour 2 Jour 3
A
8
1200 1000 800
6
600
4
400
2
200
0 00:00
06:00
12:00
18:00
PAR (µmol quanta m-2s-1)
PB [mg C (mg div-chl a)-1h-1]
Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
0 00:00
Temps (heure)
1200 B
80 60
1000 PAR Jour 1 Jour 2 Jour 3
800 600
40
400
20 0 00:00
200 06:00
12:00
18:00
PAR (µmol quanta m-2s-1)
ΠB [mg C (mg div-chl a)-1]
100
0 00:00
Temps (heure) Figure I-13. Accumulation de carbone dans le cyclostat numéro 1 calculée sur une période de lumière. 13A : taux instantané de fixation de carbone (PB, mg C (mg div-chl a)-1 h-1). Données interpolées toutes les 10 minutes. 13B : Quantité cumulée de carbone fixé sur une période de jour (ΠB, mg C (mg div-chl a)-1). Les symboles blancs correspondent aux calculs tenant compte de la variation de PBmax et de αB au cours de la journée, les symboles gris correspondent aux calculs fait en prenant des paramètres fixes.
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
atteintes par le taux maximal spécifique de fixation de carbone étaient relativement élevées avec environ 10 mg C (mg div-chl a)-1 h-1. Les variations circadiennes du paramètre de saturation EK étaient très étroitement corrélées au cycle de lumière (Figure I-12). Ces variations présentaient une amplitude d’environ un facteur 2. Il faut noter ici que EK était inférieur aux valeurs de PAR 10 heures sur 12. Ceci indique que la fixation de carbone se faisait à saturation la plupart du temps. La figure I-13 montre les variations de PB et de ΠB en fonction du temps, pour les trois jours de mesures. On remarque que la relation PB vs. t est légèrement décalée vers la gauche par rapport au maximum de lumière, et qu’ainsi la valeur maximale de PB est systématiquement atteinte entre 8:00 et 11:00. Ceci est lié aux variations circadiennes du coefficient d’efficacité photosynthétique (αB) et du taux maximal spécifique de fixation de B carbone ( Pmax ). En conséquence, on peut voir sur la figure I-13B que la moitié de la
quantité totale de carbone fixée dans une journée l’est dès 10:40, les 2/3 de cette quantité étant fixés dans la matinée. Ceci doit être relié au fait que la fixation de carbone se fait à saturation pendant la majeure partie de la journée (cf. valeurs de EK inférieures aux valeurs de PAR). Ces résultats diffèrent grandement de ce qui aurait été observé dans le cas de B valeurs de Pmax et de αB constantes au cours de la journée (Figure I-13A et B, symboles
gris).
V.
VARIATIONS DES PROPRIETES FONCTIONELLES DU PHOTOSYSTEME 2
Les variations circadiennes des rendements quantiques (minimum et maximum) de la fluorescence, φ Fo et φ Fm sont représentées sur la figure I-14A. Ces deux paramètres ont montré durant l’expérience des variations circadiennes bien marquées, s’étalant sur un facteur 2. La tendance commune aux changements de φ Fo et de φ Fm , était caractérisée par une brutale chute dès l’allumage de la lumière, les valeurs les plus faibles étant atteintes autour du midi solaire. La récupération vers les valeurs les plus fortes prenait ensuite tout le reste de la période de jour ainsi que toute la nuit. Durant cette récupération, une phase de ralentissement était observé entre 21:00 et minuit. Les valeurs maximales étaient de nouveau atteintes dès l’allumage de la lumière ou bien deux heures après. Ces rythmes de variations ont été assez bien reproduits durant les expériences répétées en petit volume
- 39 -
Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
1200
800 PAR φFo
A 1000
φFm
600 800
500
600
400 300
400
200
PAR (µmol quanta m-2s-1)
φFo et φFm (unités relatives)
700
200
100 0
0 18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
800
0.7
700
0.6
600
0.5
500
0.4
σPSII (A²)
0.8
1200
B
1000
800
600
400
0.3
300
0.2
200
0.1
100
0.0
0
400
PAR (µmol quanta m-2s-1)
Fv / Fm (sans dimensions)
Temps (heure)
200
0 18:00
PAR σ PSII (FRR)
06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
Temps (heure)
F v/F m PAM F v/F m FRR
Figure I-14. A : Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1) et des rendements quantiques minimum (φFo ) et maximum (φFm ) de la fluorescence mesurés après une adaptation à l’obscurité de 30 minutes à l’aide du fluorimètre à amplitude modulée. B : Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1), de l’efficacité photochimique du photosystème 2 (Fv/Fm) mesuré par les techniques de fluorescence PAM et de fluorescence FRR, et de la section efficace d’absorption effective du photosystème 2 (σPS2) mesurée par la technique FRR.
Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
1400
2500
1200
φF'm
2000
φF'o
1000
1500
800 600
1000
400 500
PAR (µmol quanta m-2s-1)
φFs, φF'm et φF'o (unités relatives)
PAR φFs
200 0 18:00
0 06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
Temps (heure) Figure I-15. Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1), du rendement quantique de fluorescence mesuré à l’état stable (φFs), du rendement quantique minimum de fluorescence mesuré à la transition au noir (φF’o) et du rendement quantique maximum mesurés à la lumière ( φ F′ ). m
Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
1200
PAR reoxidation QA
1000
0.4
800 0.3 600 0.2 400 0.1
PAR (µmol quanta m-2s-1)
Taux de ré-oxydation de QA (ms-1)
0.5
200
0.0 18:00
0 06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
Temps (heure) Figure I-16. Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1) et du taux de ré-oxydation de la plastoquinone QA, les données ont été acquises avec la technique de fluorescence DMK.
1200 PAR transcrit rbcL
12
1000
10
800
8 600 6 400
4 2
200
0 16:00
0 20:00
00:00
04:00
08:00
12:00
16:00
PAR (µmol quanta m-2s-1)
Transcrit ARNm (quantité relative)
14
20:00
Temps (heure) Figure I-17. temps.
Quantité de transcrit ARNm du gène rbcL (codant la grosse sous-unité de la RubisCO) en fonction du
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
(Figure I-15) permettant ainsi la comparaison des résultats de ces différentes expériences (mais voir la discussion). La figure I-14B présente les résultats obtenus pour l’efficacité photochimique du photosystème 2, Fv/Fm, déterminée par les protocoles de fluorescence “Pump and Probe” et FRR. On y voit aussi les résultats concernant les variations circadiennes de la section efficace d’absorption effective du photosystème 2, σPS2, déterminée par la technique FRR (données acquises par Mike Behrenfeld). Fv/Fm présente des tendances de variations circadiennes très similaires et de même amplitude pour les deux techniques utilisées. Fv/Fm comme σPS2 présente des variations circadiennes d’une amplitude d’environ 20 % et voit ses valeurs décroître dès l’allumage de la lumière. Les valeurs minimales de Fv/Fm ont été observées autour du midi-solaire alors que la baisse des valeurs de σPS2 est décalée de quelques heures. De même, la récupération vers les valeurs les plus fortes de Fv/Fm commence dès que PAR décroît, alors que celle de σPS2 commence seulement en fin d’après-midi. Les valeurs maximales de Fv/Fm étaient de l’ordre de 0.63, confirmant que les cellules n’étaient pas limitées par les apports de sels nutritifs (Kolber et al., 1988). La figure I-15 montre les résultats obtenus pour les rendements quantiques de fluorescence lors d’une des expériences répliquées sur petit volume. Le rythme des variations circadiennes obtenu avec φ FS et φ F ' était très similaire à celui observé pour φ Fo m
et φ Fm lors de l’expérience principale (Figure I-14A). De plus l’amplitude de ces variations était également très similaire : un facteur 2. Sur la figure I-16 sont représentés les résultats concernant le taux de ré-oxydation du premier accepteur de la chaîne de transport d’électron, la quinone QA. Alors que durant la nuit le taux moyen de ré-oxydation de QA ( k Q A ) est à peu près constant (autour de 0.35 ms-1), ce taux moyen chute jusqu’à 0.15 ms-1 après 4 heures d’exposition à la lumière. En d’autres mots, le temps de « turn-over » moyen du photosystème 2 passe, en 4 heures d’exposition à la lumière, de ~ 2.5 à ~ 7 ms. Durant l’après-midi, k Q A ré-augmente lentement pour atteindre sa valeur maximale au crépuscule (0.40 ms-1).
- 40 -
1000
3.5
A
3.0
800
Relative transcript level
-2-1-1 Intensité lumineuse (µmol quanta-2m.s s )) Irradiance (µmol quanta.m
Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
600
400
200
0 18:00 06:00 18:00
1.5 1.0 0.5
6
60
40
20
0 18:00 06:00 18:00
psbA
3
2
1
0 18:00 06:00 18:00
06:00 18:00 06:00 18:00 06:00 18:00
Temps (heure) Time (h)
Quantité relative de transcrit Relative transcript level
C
E
psbD
4 3 2 1
35
4
06:00 18:00 06:00 18:00 06:00 18:00
5
0 18:00 06:00 18:00
06:00 18:00 06:00 18:00 06:00 18:00
5
Quantité relative de transcrit Relative transcript level
2.0
B Relative transcript level
% de Cells in G1en G1 % age cellule
100
psbC
2.5
0.0 18:00 06:00 18:00
06:00 18:00 06:00 18:00 06:00 18:00
80
D
30
06:00 18:00 06:00 18:00 06:00 18:00
D F D
pcbA
25 20 15 10 5 0 18:00 06:00 18:00
06:00 18:00 06:00 18:00 06:00 18:00
Temps Time(heure) (h)
Figure I-18. Effet du cycle jour-nuit sur la synchronisation de l’expression des gènes photosynthétiques : A : Variations du PAR (µmol quanta m-2s-1). B : Pourcentage de cellules en phase G1 (interphase). C : Quantité de transcrit ARNm du gène psbA. D : Quantité de transcrit ARNm du gène pcbA.. Figure reproduite de Garczarek et al., 2001.
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
VI.
TRANSCRIPTION DU GENE rbcL
Les variations circadiennes de la quantité de transcrit ARNm du gène rbcL (codant la grosse sous-unité de la RubisCO), sont illustrées sur la figure I-17. Les mesures réalisées montrent que le niveau de transcription (illustré par la quantité d’ARNm) augmente durant la période nocturne jusqu’à 8:00. Durant l’après-midi, la quantité d’ARNm transcrit décroît très fortement jusqu’à la fin de la journée.
VII. TRANSCRIPTION
DES
GENES
CODANT
L’APPAREIL
PHOTOSYNTHETIQUE
Le figure I-18 est reproduite de Garczarek et al. (2001). Elle présente les résultats relatifs à la quantité de transcrit ARNm de deux des gènes codant les protéines de l’appareil photosynthétique (Figure I-18C et D), ainsi que le pourcentage de cellules en phase G1 (Figure I-18B). Ce pourcentage était maximal à la fin de la nuit et durant la première partie de la journée et décroissait durant l’après-midi jusqu’au début de la nuit. Ceci indique que la division cellulaire avait lieu au début de la période nocturne. Deux rythmes différents de transcription pour les gènes pcbA et psbA ont été observés. Le gène psbA – qui code la protéine D1 du centre réactionnel du PS2 – a montré de très fortes variations circadiennes de sa quantité de transcrit ARNm. Ces variations étaient fortement corrélées à l’intensité de la lumière avec les quantités de transcrit les plus fortes autour du midi-solaire (Figure I18C). Au contraire, le gène pcbA –qui code une partie de l’antenne collectrice de lumière du PS2 – présentait un rythme bi-modal de sa quantité de transcrit (Figure I-18D). Deux minima : l’un au début de la période de jour et l’autre au début de la nuit ont été observés.
◊ DISCUSSION I.
SYNCHRONISME DE LA DIVISION CELLULAIRE
Le système de culture de type « cyclostat » qui a été employé durant cette expérience a permis de maintenir une population de Prochlorococcus à un taux de croissance relativement élevé de 0.69 j-1 (i.e. une division par jour) (Bruyant et al., 2001). La parfaite reproductibilité des conditions du milieu alimentant la culture ainsi que l’excellente simulation du cycle naturel de lumière, ont permis durant cette expérience - 41 -
Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
1000
0.35 800
0.30 0.25
600
0.20 400
0.15 0.10
NFS
0.05
DNA Fluo
0.00
PAR ( mol quanta m-2 s-1 )
NFS et fluorescence dede ADN (unités relatives) NFS et fluo l'ADN (unités rel
0.40
200
PAR
12:00
12:00
12:00
12:00
0
Temps (heure)
120
1200
10
100
1000
80
800
60
600
40
400
20
200
0 -10 -20 -30 -40
% de cellules en phase G1
20
0 18:00
PAR (µmol quanta m-2s-1)
d(% cellules en phase G1)/dt
Figure I-19. Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1), de la fluorescence de l’ADN cellulaire, ainsi que du NFS (Near Forward Scattering), obtenues lors de l’expérience principale.
0 06:00
% cellules en G1 d(% cellules en G1)/dt PAR
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
Temps (heure)
Figure I-20. Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1), du pourcentage de cellules en phase G1, ainsi que de la dérivée par rapport au temps de ce pourcentage, indicateur de l’intensité relative du phénomène de division cellulaire.
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
d’obtenir une culture d’une grande stabilité. Pour illustrer cela, la figure I-19 montre les variations durant l’expérience du PAR et de deux paramètres permettant de mettre en évidence la stabilité physiologique du phytoplancton : 1/ la diffusion avant par les cellules (traduction de « near forward scaterring » ; noté ci-après NFS) et 2/ la fluorescence de l’ADN cellulaire. Le NFS est un paramètre mesuré par cytométrie en flux. Il est lié à la taille des cellules Ackleson et Spinrad (1988) ainsi qu’a leur contenu en carbone car ce dernier est corrélé à l’indice de réfraction de la cellule (Stramski et Reynolds, 1993). Les variations circadiennes du NFS ont ici principalement été dues à 1/ l’accumulation de carbone cellulaire durant la journée du fait de l’activité photosynthétique et 2/ à la division cellulaire suivie de la consommation du carbone par le catabolisme durant la période de nuit. La fluorescence de l’ADN cellulaire indique le contenu de la cellule en ADN. Celui ci était caractérisé par une brutale augmentation juste à la fin de la période de jour pendant la phase de synthèse, suivi juste après la division cellulaire d’une diminution brutale. Les variations de ces deux paramètres (NFS et fluorescence de l’ADN cellulaire) ont été remarquablement reproductibles durant les 4 jours d’échantillonnage. Il est rappelé ici que du fait de la progression de la contamination bactérienne (restant néanmoins non préjudiciable à la plupart des mesures effectuées), les données acquises lors du 4ème jour de travail ne seront pas considérées dans la suite de cette discussion. Les conditions dans le cyclostat peuvent donc, à la vue de ces données, être considérées comme très stables au cours des 4 jours de mesures. Ceci est également confirmé par plusieurs autres paramètres (cf. par exemple la figure I-14). La division cellulaire de Prochlorococcus était très fortement synchronisée au sein de la population (Figure I-18B et Figure I-19). Le nombre de cellules en phase G1 (interphase) était minimum à la fin de la journée et au tout début de la nuit, indiquant que la division cellulaire avait lieu durant la première partie de la phase nocturne. Ceci est encore plus net lorsque l’on regarde la dérivée par rapport au temps du nombre de cellules en phase G1 (Figure I-20). La division cellulaire prenait donc clairement place lors de cette expérience entre 16:00 et 2:00, avec un maximum de cellules en cours de division entre 21:00 et minuit.
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Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
Ce synchronisme du cycle cellulaire au sein de la population, par ailleurs déjà observée dans le milieu naturel (Vaulot et al., 1995), est clairement mis en évidence par l’analyse de l’évolution temporelle de la quantité de transcrits ARNm des gènes codant l’appareil photosynthétique lui-même. La diminution de la quantité de transcrits des gènes psbA et pcbA au début des périodes de nuit (Figure I-18) résulte du commencement du processus de division cellulaire. En effet, la transcription des gènes ne peut avoir lieu en même temps que la réplication. Les variations circadiennes de la quantité de transcrits ARNm du gène rbcL semblent soumises à un rythme différent (Figure I-17). La forte transcription semble être initiée suite à la division cellulaire en fin de nuit pour être maximale en début de journée. La quantité de transcrit chute ensuite durant la journée, mais il est important de souligner que ceci ne rend pas forcément compte de la quantité de protéine active (une fois la protéine transcrite, elle reste présente dans la cellule). Ce rythme de transcription bien que différent de ceux des autres gènes, présente l’avantage de permettre potentiellement à une grande quantité de RubisCO d’être disponible dès l’allumage de la lumière, du fait de l’abondance de transcrit durant la fin de la nuit et au tout début de la journée.
II.
INFLUENCE SUR LA FIXATION DE CARBONE
Si le cycle cellulaire – via son synchronisme – influence aussi nettement la transcription des gènes qui codent les protéines prenant part au phénomène de la photosynthèse, il doit nécessairement influencer le processus de photosynthèse lui-même. En fait, toutes les variables décrivant les propriétés structurelles et fonctionnelles de l’appareil photosynthétique ont présenté de très fortes variations circadiennes durant cette expérience. Ces variations circadiennes de la photosynthèse ont déjà été plusieurs fois observées (Doty et Oguri, 1957; Holmes et Haxo, 1958; Shimada, 1958; McAllister, 1963; Malone, 1971). Des études ont déjà été menées sur des cultures phytoplanctoniques (Prézelin et Sweeney, 1977; Harding et al., 1981; Legendre et al., 1988) ainsi que sur des populations naturelles (Taguchi, 1976; Prézelin et Boczar, 1986; Robarts et HowardsWilliams, 1989; Babin et al., 1995 et 1996; Dandonneau et Neveux, 1997). Le rendement quantique de fixation de carbone, φCmax (Figure I-11) et le taux maximal spécifique de B fixation de carbone Pmax (Figure I-10) ont montré de fortes variations circadiennes chez
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Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
Prochlorococcus. Ces variations suggèrent une efficacité maximale des processus photosynthétiques à la fin de la nuit et au début de la période diurne. Les faibles valeurs observées de φCmax (la moitié de la valeur théorique maximale), peuvent être expliquées par une absorption forte de la zéaxanthine par rapport à celle des autres pigments. En effet, le rapport zéaxanthine/div-chl a mesuré durant cette expérience reste élevé (voir la discussion dans Babin et al., 1996). Bien que le taux maximal spécifique de fixation de carbone varie de plus d’un facteur 4 au cours de la journée, la culture n’est en rien pénalisée par ces changements d’efficacité. En effet, la figure I-13B, montre clairement que la quantité de carbone fixée lors de cette expérience (symboles blancs) est forte par rapport à la quantité de carbone qui serait fixée par une culture ne présentant pas de variations circadiennes de ses paramètres photosynthétiques (symboles gris). Cette efficacité est liée à la fixation de carbone réalisée durant la matinée, les 2/3 de la quantité totale de carbone fixé au cours de la journée étant fixés avant midi. Ceci constitue une programmation optimale des fonctions cellulaire et de la division. La culture fonctionne donc efficacement et de manière proche de la saturation, comme indiqué par les variations circadiennes observées sur le paramètre de saturation EK (Figure I-12). EK est en effet inférieur à l’éclairement dans la culture dès 1 heure après l’allumage de la lumière et jusqu’à 1 heure avant l’extinction. Durant tout ce temps, les algues fonctionnent donc à saturation pour fixer le carbone, dans la partie asymptotique de B (Figure Introduction-1). la courbe P vs. E au Pmax
Cette optimisation de la fixation de carbone est en fait également rendue possible car dans un cyclostat (au sens que lui entend Kroon et al., 1992), la culture n’est limitée par aucun facteur et le taux de croissance est égal au µmax (ou bien en est très proche) (Bruyant et al., 2001). En effet, dans le cyclostat, chaque nutriment est apporté en quantité suffisante pour assurer une croissance exponentielle. La limitation carbonée (inexistante dans le milieu marin) est un problème important dans les cultures phytoplanctoniques dans lesquelles la biomasse peut atteindre des niveaux très élevés. Dans le cas présent, plusieurs arguments peuvent être avancés afin de pouvoir éliminer l’hypothèse d’une limitation carbonée. Premièrement, si l’on considère le taux de dilution appliqué à la culture et la concentration du milieu de renouvellement en carbone inorganique, la quantité de carbone fixée chaque jour dans la culture était trois fois inférieure à la quantité de carbone apportée
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Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
par le milieu “frais”. Deuxièmement, la très petite taille de Prochlorococcus, augmente sa capacité à piéger le carbone en améliorant son rapport surface/volume. Cependant, malgré tous ces arguments, cette hypothèse de non-limitation carbonée a été vérifiée en suivant les changements circadiens de la concentration en carbone inorganique dissous. La concentration en DIC présente bien des variations circadiennes avec des valeurs plus fortes la nuit que le jour, mais l’amplitude de ces variations est inférieure à ± 15%. Ceci ne peut donc en aucun cas expliquer les changements circadiens observés pour le taux maximal de fixation de carbone dont l’amplitude était d’un facteur 4. La croissance de cette culture n’était donc pas limitée par les nutriments, ce qui permettait un fonctionnement de la photosynthèse très efficace. La quantité de carbone fixée était très importante, principalement du fait de la fixation réalisée dans la première moitié du jour. Cette forte fixation de carbone le matin est liée à un fonctionnement B en début de journée ainsi qu’à la disponibilité optimisé par les fortes valeurs de Pmax
d’une grande quantité de RubisCO. La culture fonctionnait de plus à saturation la plupart du temps. Dans ces conditions de fonctionnement à saturation, la photosynthèse est donc limitée par les réactions sombres (Sukenik et al., 1987) qui sont entre autres les réactions enzymatiques de la fixation de carbone. Ceci est un scénario typique à fort éclairement. Cependant, même si ce fonctionnement s’avère efficace sur le plan de la quantité de carbone fixée, il peut y avoir des conséquences sur l’appareil photosynthétique. En effet, les forts éclairements peuvent induire une excitation excessive du PS2 pouvant conduire dans un premier temps à des phénomènes de photoinhibition, mais par la suite également à des « photo-dommages27 ». Les différents processus de photoacclimatation permettent la dissipation de cet excès d’énergie. Une tentative d’identification de ces mécanismes est faite dans la prochaine section à l’aide de l’analyse des paramètres de fluorescence.
27
photo-dommage : détérioration de tout ou partie de l’appareil photosynthétique liée au trop fort éclairement de celui-ci.
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III.
QUELLES VARIATIONS AU NIVEAU DU PHOTOSYSTEME 2 ?
Les variations circadiennes qui ont été observées lors de cette étude pour les rendements quantiques de fluorescence ainsi que pour la section efficace d’absorption effective et pour l’efficacité photochimique du PS2 (Figure I-14), ont déjà été observées dans le milieu naturel (Prézelin et Ley, 1980; Dandonneau et Neveux, 1997). Il s’agit donc d’un phénomène ayant un intérêt écophysiologique réel et non pas seulement de la résultante de conditions particulières appliquées lors de cette expérience. L’énorme amplitude des variations circadiennes observée pour les rendements quantiques de fluorescence était très similaire pour les données obtenues après 30 minutes d’adaptation à l’obscurité et pour les données acquises en présence de lumière (Figure I-14A et I-15). Les tendances de ces variations étaient également très similaires présentant une très importante et brutale chute dès l’augmentation de l’intensité lumineuse, et une récupération plus lente des valeurs de fluorescence durant l’après-midi et la période de nuit. Ceci indique l’absence d’un phénomène de quenching28 rapide (à faible temps de ½ vie). De plus, la cinétique de récupération des fortes valeurs déterminée sous faible éclairement ainsi que l’utilisation de chlorure d’ammonium (NH4Cl, dilué dans de l’eau Milli-Q, concentration finale 2mM) et de gramicidine (dans l’éthanol, concentration finale 5µM) comme découpleurs des membranes thylakoïdiennes, ont permis de confirmer l’absence d’un quenching gouverné par le ∆pH trans-thylakoïdien. Les variations circadiennes de φ Fo et φ Fm semblent donc être liées à celle de σPS2 et de Fv/Fm. En effet, la diminution abrupte des valeurs des rendements quantiques de fluorescence (Figure I-14A) et la diminution concomitante de σPS2 (Figure I-14B) suggèrent l’existence d’un quenching non-photochimique très large (Falkowski et al., 1986; Schreiber et al., 1986; Neale, 1987; Genty et al., 1990; Krause et Weis, 1991), mais pour lequel les variations de σPS2 et de Fv/Fm restent de faible amplitude. L’amplitude des variations observées de σPS2 est de l’ordre de 20 %, ce qui est en accord avec le phénomène des états de transition dans le PS2 (Allen, 1992; Falkowski et Raven, 1997). Mais le 28
Le terme anglais “quenching” sera employé dans ce manuscrit pour désigner un phénomène induisant la diminution de la fluorescence in vivo de la chlorophylle a.
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Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
quenching non-photochimique lié aux états de transition ne peut pas suffire à faire face aux très fortes intensités lumineuses appliquées dans la culture (Falkowski et al., 1994; Falkowski et Raven, 1997). De plus, avec les données des rendements quantiques de fluorescence, la constante de récupération du quenching non-photochimique a pu être estimée à KD = 0.283± 0.0516 h-1 pour les rendements minimum et maximum (données non représentées). Or, avec une telle constante de vitesse pour la récupération (le t1/2 correspondant est de 2.45h), le quenching non-photochimique lié aux états de transition ne peut pas être le seul phénomène lié aux variations de la fluorescence (il agit à des échelles de temps inférieures à 2.45h). Il y a donc ici deux quenching non-photochimiques de nature différentes. Les états de transition expliquent les variations de faible amplitude de σPS2 et de Fv/Fm agissant sur une échelle de temps assez brève. Mais pour répondre à la très forte intensité lumineuse dans la culture et pour expliquer la très forte amplitude de variation de φ Fo et φ Fm , il faut rechercher un autre phénomène de quenching non-photochimique qui se superpose aux états de transition. Il existe plusieurs phénomènes ayant déjà été observés qui permettent aux algues phytoplanctoniques de relarguer l’excès d’énergie lumineuse qui pourrait être dommageable à leur appareil photosynthétique : • Le « spill over » : Il s’agit du passage de l’énergie lumineuse directement du PS2 au PS1 sans passer par le centre réactionnel ni la chaîne de transporteurs classique. Mais dans le cas de spill over, une amplitude plus importante des variations de σPS2 aurait du être observée ainsi qu’un décalage entre les variations de φ Fo et de φ Fm , l’un restant affecté, mais pas l’autre. • La libération de molécules de chlorophylle dans le Lumen : Outre le fait que ce système d’évacuation d’énergie reste très risqué pour l’intégrité des molécules de chlorophylles considérées, il devrait entraîner non pas une baisse, mais une augmentation de φ Fo durant la journée.
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• Substitutions métalliques dans l’hème : Il a déjà été observé in vitro une réduction de l’émission de fluorescence de plus d’un facteur 20 par des molécules de chlorophylle (bactériochlorophylles chez Acidiphilium rubrum) dont l’atome de magnésium – situé dans l’hème – avait été substitué par d’autres atomes métalliques (Akiyama et al., 1998; Kobayashi et al., 1998; Yamamura et al., 1998). De plus, la substitution du Mg par du Cd ou bien du Zn dans des molécules de chlorophylle a déjà été observée dans le milieu naturel (Küpper et al., 1996; Küpper et al., 2000). Cette hypothèse pourrait donc expliquer la très grande amplitude de variation des rendements quantiques maximum et minimum de la fluorescence alors que l’efficacité photochimique et la section efficace d’absorption effective du PS2 ne varient que de 20 %. En plus de ces deux phénomènes de quenching non-photochimique, des changements fonctionnels du coté accepteur du PS2 ont également été observés. Une diminution significative du taux de ré-oxydation de QA liée à la lumière a été mesurée. Il a été proposé (Ohad et al., 1988) que ces phénomènes du coté accepteur seraient liés au phénomène de photoinhibition au niveau du centre réactionnel du PS2. Le photosystème 2 devient ainsi la cible des photo-dommages lorsque les différents phénomènes décrit jusqu’ici ne suffisent plus face à l’augmentation du niveau de l’intensité lumineuse. Ces photo-dommages entraînent la dégradation de la protéine D1 (gène psbA) par des espèces d’oxygène hautement réactives. Dans ces expériences, la photoinhibition démarre sans doute lorsque le temps de turn-over de la protéine D1 devient faible par rapport à sa dégradation (elle agit comme un fusible). Ce mécanisme impliquant la protéine D1, a été mis en évidence comme étant un mécanisme de photoprotection chez les cyanobactéries permettant de dissiper l’énergie à l’intérieur du centre réactionnel. La cascade d’événement décrite ici et allant du quenching non-photochimique, au turn-over de la protéine D1 puis à la photoinhibition du centre réactionnel du PS2, permet à l’appareil photosynthétique de compenser l’augmentation du PAR et les dommages qu’elle peut causer. Chacun de ces mécanismes participe à la photoprotection de l’appareil photosynthétique. Tant que l’étape de la photosynthèse limitant la fixation de carbone se situe au niveau des réactions enzymatiques de la phase sombre (Sukenik et al., 1987; Falkowski et Raven, 1997), les changements qui se produisent dans et en amont du centre réactionnel du - 48 -
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
B PS2 n’influencent pas le taux spécifique maximal de fixation de carbone ( Pmax ). Cependant
vers 10:00, le taux de ré-oxydation de la plastoquinone QA atteint sa plus faible valeur alors que le PAR augmente et que la quantité de transcrit du gène rbcL diminue jusqu’à devenir presque nulle (Figure I-16 et I-17). Ceci correspond au moment de la chute tardive des B valeurs de Pmax , quelques heures après celle des valeurs de φCmax. Cette corrélation entre B Pmax et la quantité de transcrit du gène rbcL, bien que déjà observée (Pichard et al., 1996),
doit néanmoins être considérée avec prudence. En effet, il ne s’agit pas ici de l’évaluation directe de la quantité de protéine RubisCO active qui a été faite lors de cette expérience. Il s’agit de l’évaluation de la quantité d’ARNm transcrit, celui-ci n’étant pas forcément couplé dans le temps à la synthèse des protéines. Néanmoins, une corrélation positive et B significative entre des valeurs de Pmax et la quantité de protéine RubisCO a déjà été
observée par Orellana et Perry (1992). Ainsi, alors que la quantité de RubisCO atteint son niveau le plus bas, il semble que la limitation de la fixation de carbone se situe plutôt au niveau de la vitesse de ré-oxydation du réservoir des molécules de plastoquinone. Ceci B (Behrenfeld et al., 1998). pourrait expliquer la chute tardive des valeurs de Pmax
IV.
RECUPERATION
DE LA PHOTOINHIBITION ET EFFETS DU CYCLE
CELLULAIRE
Durant l’après-midi et la nuit, l’intensité lumineuse passait de 970 µmol quanta m2 -1
s à 0 en 6 heures (de 12:00 à 18:00), puis la période de nuit durait 12 heures. Durant
cette période, une lente augmentation des valeurs de φ F0 et de φ Fm (Figure I-14A) ainsi que de φ F '0 et φ F 'm (Figure I-15) a été observée. La récupération complète des valeurs maximum n’était achevée qu’à la fin de la période de nuit, juste avant l’allumage de la lumière pour la période de jour suivante. Les cinétiques de relaxation du quenching de fluorescence mesurée au midi solaire indiquent un t1 2 d’environ 2.45 h. Ce laps de temps est trop court si on le compare au temps total nécessaire à la récupération des valeurs maximales des rendements de fluorescence. Afin de clarifier ce point, les constantes d’installation et de désinstallation (Ki et KD) du phénomène de photoacclimatation mis en place durant la première phase ont été évaluées. En accord avec le modèle de Neale (1987),
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Chapitre I :Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
700
-10 -20 -30 -40
φFm (unités relatives)
10 0
1200
800
1000
600 800
500
600
400 300 200 100 0 18:00
400
PAR d(% cellules en G1)/dt
200
φFm φFm modèle 06:00
PAR (µmol quanta m-2s-1)
d (% cellules en G1) / dt
20
18:00
0 06:00
18:00
06:00
18:00
Temps (heure) Figure I-21. Variations circadiennes du PAR (µmol quanta m-2s-1), et du rendement quantique maximal de fluorescence (φFm ) mesuré ou recalculé à l’aide du modèle de Neale. La dérivée du pourcentage de cellules en G1 indique le moment de la division cellulaire.
Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
les variations théoriques de φFo et φFm au cours du jour et de la nuit ont été reconstruites, en utilisant l’équation : dφ F = − K i σ PS 2τ PAR φ F + K D φ Fi − φ F dt
(
)
(12)
dans laquelle φF remplace le rendement quantique minimum ou maximum, φ Fi est la valeur initiale du rendement quantique considéré, Ki est le taux d’installation du phénomène de photoacclimatation et KD son taux de désinstallation. Notons ici que le phénomène de photoacclimatation a été considéré dans son ensemble : les deux quenching non-photochimique et la photoinhibition ont été associés pour cette modélisation. Dans un premier temps, KD a été déterminé sur un échantillon prélevé au midi-solaire (intensité lumineuse maximale) en mesurant sa fluorescence toutes les 5 minutes alors que l’échantillon restait exposé à l’obscurité. Ces mesures ont été faites jusqu’à ce que les valeurs des rendements quantiques de fluorescence n’augmentent plus (notons que dans le noir, l’Eq. 12 devient une cinétique du premier ordre). En utilisant cette valeur du KD ainsi que les valeurs mesurées de σPS2 et de PAR, Ki a été estimé en ajustant l’équation 12 aux valeurs expérimentales de φF obtenus entre 06:00 et 10:00. Pour cela, le premier terme de la partie droite dans l’équation 12 était supposé responsable de la plus grande partie des variations de φF. Les valeurs de Ki obtenues étaient très reproductibles sur les trois jours de mesure de même que entre les calculs faits avec φFo ou φFm. Par exemple en considérant
φFo, les valeurs de KD étaient de 9.406 10-7 ± 1.014 10-7 (h)-1. Finalement, l’équation 12 a été recalculée pas-à-pas numériquement en utilisant les valeurs de Ki, KD, σPS2 et PAR. Les calculs ont été conduits séparément pour chaque période de jour en démarrant à 6:00. Pour compenser l’augmentation progressive des valeurs de φFo et φFm à 6:00 d’un jour à l’autre (Figure I-14A) d’environ 20 % (variations non-significative), les valeurs calculées ont du être décalées linéairement. Sur la figure I-21 on peut comparer les résultats obtenus lors de l’expérience pour les valeurs mesurées de φFm et le modèle. Les variations recalculées avec le modèle de Neale (1987), rendent compte de ce qui se passerait si les mécanismes de photoacclimatation étaient les seuls phénomènes impliqués dans les variations du rendement quantique de fluorescence. Les données expérimentales correspondent très bien au modèle durant toute la période de jour. Par contre, dès le début de la période de nuit, on
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Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
observe un décrochement entre les données expérimentales et le modèle, les valeurs mesurées ré-augmentant moins vite que les valeurs théoriques. Ceci suggère clairement l’influence d’au moins un autre phénomène sur les variations circadiennes des propriétés structurelles et fonctionnelles de l’appareil photosynthétique chez Prochlorococcus. En décomposant l’augmentation des valeurs de φ F0 et φ Fm au cours de la période de diminution du PAR et durant la nuit (Figure I-21) 3 phases successives ont été observées. Dans un premier temps, les rendements quantiques de fluorescence ré-augmentent très rapidement du midi solaire jusqu’à la fin de la période de jour. Ceci correspond réellement à la récupération, au sens “disparition du quenching” car durant cette période, les calculs issus du modèle sont conformes aux données expérimentales : la photoacclimatation est donc le seul phénomène impliqué. La seconde période s’étend de 18:00 à 3:00 et on note que la ré-augmentation des valeurs expérimentales est plus lente que la ré-augmentation théorique. Cette période est celle qui couvre le moment de la division cellulaire. La troisième période montre de nouveau une ré-augmentation des valeurs expérimentales aussi rapide que celle des valeurs théoriques ; cette période s’étend de la fin de la division cellulaire (vers minuit, voir Figure I-18) jusqu’au début de la période de jour suivante (Figure I-21). La coïncidence entre le moment où a lieu la division cellulaire et le ralentissement de la ré-augmentation des valeurs des paramètres mesurés, principaux marqueurs de la potentialité photosynthétique, indique que la photoacclimatation et le cycle cellulaire ont bien des effets combinés sur la réorganisation de l’appareil photosynthétique et donc sur la régulation de la photosynthèse.
◊ CONCLUSIONS I.
LE SYSTEME DE CULTURE
La mise au point de ce système de culture spécial a joué un rôle essentiel dans la qualité finale des données acquises lors de l’atelier scientifique PROMOLEC. Le travail réalisé lors de cette étude a permis de démontrer dans un premier temps la faisabilité de
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Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
maintenir une culture continue de Prochlorococcus en grand volume dans des conditions axéniques (Bruyant et al., 2001). Il faut néanmoins attirer l’attention sur plusieurs points très importants : de nombreuses précautions doivent être prises afin d’éviter les contaminations (comme il est advenue dans le cyclostat #1) durant les phases d’échantillonnage intensif. Il est également recommandé que le volume échantillonné chaque jour soit nettement inférieur au volume de milieu frais apporté à la culture. Ceci permettrait d’éviter la dilution progressive de la culture liée au sur-échantillonnage. Cependant ce point est moins crucial car même lors de la dilution de la culture, la population d’algues reste en général saine et présente toujours une croissance exponentielle. Le système d’illumination original qui a été spécialement créé, permettra à l’avenir la simulation de n’importe quelle configuration lumineuse et pourra ainsi être utilisé par exemple pour l’étude de l’effet du passage des nuages ainsi que de celui du mélange vertical. Ce système de culture est simple dans son déploiement et peu coûteux. Les seuls inconvénients sont 1/ le spectre des tubes néons qui ne correspond pas au spectre de la lumière solaire et 2/ la quasi-totale absence d’éclairement UV. Certaines lampes à décharge d’halogénure métallique peuvent être achetées et elles présentent des spectres plus proches de celui de la lumière solaire. Cependant ces lampes sont toujours très chères et ne sont jamais modulables dans leur intensité. Elles produisent également une grande quantité de chaleur. Leur mise en œuvre nécessiterait donc l’utilisation d’autres dispositifs moins simples pour simuler les changements progressifs de l’intensité lumineuse (des stores vénitiens par exemple). Néanmoins il faut compter sur la prochaine apparition dans le commerce de lampes mieux adaptées pour ce genre de travail. L’existence sur le marché de nombreux filtres peut aussi aider à améliorer la qualité du spectre de lumière.
II.
UNE CASCADE D’EVENEMENTS
Le jeu de données disponible à l’issue de cet atelier de travail était très complet (chacun des paramètres a été mesuré toutes les 2 ou 4 heures pendant les 3 jours) et extrêmement robuste. En effet, toutes les tendances observées ont été parfaitement reproductibles d’un jour sur l’autre. Aussi, le taux de croissance de la culture correspondait durant toute l’expérience à une division cellulaire par jour, permettant de dire que la
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Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
croissance exponentielle a été maintenue pour la population qui est restée parfaitement synchronisée tout au long de l’expérience. Il a donc été possible de suivre dans de parfaites conditions les changements circadiens des paramètres photosynthétiques ainsi que ceux des rendements quantiques de la fluorescence. Les variations circadiennes qui ont été observées dans l’organisation structurelle et fonctionnelle de l’appareil photosynthétique de Prochlorococcus s’articulent en deux phases successives (Bruyant, in prep): 1/ la diminution de l’efficacité photosynthétique et des rendements quantiques de la fluorescence in vivo de la chlorophylle a lors de l’augmentation de l’intensité lumineuse dans la matinée et 2/ la récupération du potentiel photosynthétique durant la diminution de l’intensité lumineuse et la phase nocturne. La baisse du rendement de la photosynthèse est due à la photoacclimatation de la population phytoplanctonique sous l’effet de différents mécanismes : 1/ deux phénomènes de quenching non-photochimique différents et 2/ les processus de photoinhibition se mettant en place au niveau du PS2. Les deux quenching non-photochimique vraisemblablement mis en jeu sont : 1/ les états de transition et 2/ un autre type de quenching (n’affectant que les rendements quantiques de fluorescence) qui pourrait être lié à des substitutions métalliques dans l’hème de la molécule de divinyle-chlorophylle a. La lente récupération du potentiel photosynthétique lors de la diminution de l’intensité lumineuse et de la phase nocturne est quant à elle due au retardement de la reconstruction de l’appareil photosynthétique. La coïncidence entre la récupération progressive de toute la capacité photosynthétique des algues et les changements dans les rythmes de transcription des gènes codant les principales protéines formant l’appareil photosynthétique semblent indiquer l’influence effective des processus de la division cellulaire. Aucun phénomène de transcription ne peut se dérouler lors de la division cellulaire.
Ainsi,
elle
empêche
la
transcription
des
gènes
codant
l’appareil
photosynthétique et donc la reconstruction protéique de la chaîne. L’influence majeure du cycle cellulaire sur les variations circadiennes de la photosynthèse mise en évidence lors de cette étude, indique bien l’existence d’un contrôle au moins en parti endogène de ce phénomène. Afin de confirmer cela, il pourrait être utile de vérifier l’impact d’une variation de la durée relative des périodes de jour et de nuit, de
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Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
façon à vérifier de quelle façon le rythme de variation des paramètres photosynthétiques se modifient et donc quelle est la partie du contrôle qui domine.
III.
PRODUCTION PRIMAIRE ET MODELISATION
Quoi qu’il en soit, malgré les difficultés rencontrées par Prochlorococcus pour faire face aux importants changements de l’intensité lumineuse, une très importante adaptation des processus de fixation de carbone a été constatée. Celle-ci permet aux algues de fixer la majeure partie du carbone nécessaire à leur croissance avant la mise “hors circuit” de leur appareil photosynthétique du fait de la forte augmentation du PAR. La croissance de la population n’est ainsi à aucun moment remise en question. Au contraire, il a été mis en évidence (Figure I-13B) que la quantité de carbone fixée dans la journée était considérable même en comparant avec ce qui ce passerait si les paramètres restaient constants au cours de la journée. Cette information devrait être prise en compte dans les estimations de la production primaire faite à l’aide de la modélisation. Pourtant, la grande majorité des modèles mathématiques estimant la production primaire dans le milieu naturel à partir des paramètres de la photosynthèse et de la concentration en chlorophylle a, ne prennent pas en compte les variations circadiennes de ces paramètres du fait du manque de données disponibles (Platt et Sathyendranath, 1988; Platt et al., 1988; Sathyendranath et al., 1989; Smith et al., 1989; Morel, 1991; Wozniak et Ostrowska, 1992; Morel et al., 1996). Bien que de nombreuses études aient été menées pour modéliser les variations liées à la photoacclimatation, (Cullen et Lewis, 1988; Lewis et al., 1988; Lande et al., 1989), tous les phénomènes physiologiques ne sont pas clairement identifiés et lorsque l’on travaille à une échelle globale, des valeurs standards moyennes sont appliquées (Morel et André, 1991; Antoine et al., 1995; Antoine et Morel, 1996) qui prennent seulement en compte la dépendance du taux maximal spécifique de fixation de carbone à la température. Une étude de sensibilité qui s’appuierait sur les résultats de cette expérience pourrait préciser si la prise en compte des variations circadiennes de la photosynthèse dans les modèles permettrait d’améliorer leur qualité prédictive. Par la suite et dans l’affirmative, le même type d’expérience en culture pourrait être mené sur des espèces phytoplanctoniques caractéristiques d’autres zones de l’océan mondial. Ainsi, chaque bassin océanique pourrait être modélisé de façon plus fiable jusqu’à obtenir des résultats à
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Chapitre I : Variations circadiennes des paramètres photosynthétiques chez Prochlorococcus : Effets combinés de la photoacclimatation et du cycle cellulaire.
l’échelle globale. Pour cela, il convient cependant de vérifier en premier lieu l’existence de telles variations circadiennes dans le milieu naturel. C’est ce qui sera le propos des deux chapitres suivants. Dans un premier temps les études seront menées dans des zones a priori hydrologiquement stables, puis l’étude sera faite dans une zone où les forçages physiques sont très importants. En plus de documenter les variations des paramètres photosynthétiques, leurs variations circadiennes seront étudiées afin d’évaluer leur amplitude et d’essayer d’en identifier les causes.
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Chapitre II
Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
Sommaire du Chapitre II
◊
Introduction................................................................................................................... 59 I.
La campagne PROSOPE .....................................................................................................59
II.
Une stratégie d’échantillonnage adaptée............................................................................61
III. Quels axes dans cette étude ?...............................................................................................62 IV. Organisation de ce chapitre.................................................................................................63
◊
Matériels et Méthodes ................................................................................................... 63 I.
Acquisition sur les profils ....................................................................................................63
II.
Echantillons Discrets ............................................................................................................64 A.
Dosage des sels nutritifs ..................................................................................................................64 a. Analyses des Nitrates (NO3-)............................................................................................................64 b. Analyses du Phosphore réactif dissous (PO42-)................................................................................64 c. Analyses de Silicates (Si (OH)4).......................................................................................................64 d. Analyses du Fer ...............................................................................................................................65
III. Détermination des concentrations pigmentaires ...............................................................65 A.
Méthode d’analyse...........................................................................................................................65
B.
Indicateurs des communautés phytoplanctoniques ..........................................................................65
IV. Détermination de l’absorption spécifique ..........................................................................67 V.
Détermination des paramètres de la relation entre le taux de fixation de carbone et
l'éclairement...................................................................................................................................68 VI. Etude de la fluorescence.......................................................................................................70
◊
A.
Etudes des variations circadiennes de la fluorescence : mesures en “configuration pont”. .............70
B.
Echantillons discrets : le Xe-PAM...................................................................................................71
Résultats et Discussion ................................................................................................. 71 I.
Structure hydrologique et trophique ..................................................................................72 A.
Les conditions hydrologiques ..........................................................................................................72
B.
Les sels nutritifs...............................................................................................................................73 a. Nitrates et Phosphates .....................................................................................................................73 b. Fer et Silice......................................................................................................................................73
II.
La répartition du Phytoplancton ........................................................................................74 A.
Biomasse totale................................................................................................................................74
B.
Répartition des communautés phytoplanctoniques..........................................................................74
C.
Biomasse intégrée............................................................................................................................75
III. Quelles conditions trophiques ? ..........................................................................................75 IV. Variations des paramètres photosynthétiques liées aux régimes trophiques..................76 A.
Au site eutrophe UPW .....................................................................................................................76
B.
Au site oligotrophe DYF..................................................................................................................78
C.
Au site ultra-oligotrophe MIO .........................................................................................................79 a. Population de surface ......................................................................................................................80 b. Population profonde ........................................................................................................................80 c. Le rôle des sels nutritifs ...................................................................................................................81
V.
◊
Variations circadiennes........................................................................................................81 A.
Acquisition en configuration “pont” ................................................................................................82
B.
Les profils d’échantillons discrets ...................................................................................................85
Conclusions ................................................................................................................... 86
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
◊ INTRODUCTION Dans le premier chapitre, l’existence d’importantes variations circadiennes de la photosynthèse liées aux effets combinés de divers phénomènes photoadaptatifs et du cycle cellulaire a clairement été mise en évidence. De plus, il a été montré comment une population phytoplanctonique tire in fine avantage de ces variations circadiennes qui permettent : 1/ une limitation des photo-dommages sur son appareil photosynthétique et 2/ une fixation de carbone à l’échelle de la journée suffisante pour assurer un taux de croissance élevé, traduisant une organisation optimale des différentes fonctions à remplir au cours d’une journée par les cellules (voir aussi Bruyant, in prep, Annexe 2). Rappelons ici que le choix de Prochlorococcus pour mener cette étude en culture avait été motivé par le fait que cette espèce constitue une population phytoplanctonique majeure dans la zone intertropicale, mais aussi en Méditerranée (Partensky et al., 1999a; Partensky et al., 1999b), tant sur le plan numérique que sur le plan de la production primaire. L’une des idées de départ de cette étude était d’appliquer par la suite la compréhension des variations circadiennes de la photosynthèse au milieu naturel de façon à pouvoir, entre autre, en comprendre les interactions avec les autres facteurs faisant également varier la photosynthèse. Les différents facteurs qui affectent la photosynthèse dans le milieu naturel ; conditions de lumière, nutriments et température ont été énumérés dans l’introduction et la complexité avec laquelle ils interagissent entre eux a été soulignée. Dans ce second chapitre, mon propos sera de tenter de mieux comprendre comment les conditions du milieu naturel s’articulent pour réguler la photosynthèse, en plus de voir si des variations circadiennes peuvent y être observées et, dans l’affirmative si elles ont les mêmes origines et les mêmes effets sur des populations phytoplanctoniques composites.
I.
LA CAMPAGNE PROSOPE
Cette étude dans le milieu marin a été réalisée au cours de la campagne PROSOPE, (opération JGOFS France- PROOF) coordonnée par Hervé Claustre. Cette campagne a eu lieu en Méditerranée en fin de période estivale (4 septembre – 4 octobre 1999) à bord du NRH Thalassa (IFREMER). Trois des objectifs principaux de cette campagne étaient :
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Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
TOULON
DYF 9 8
3 1
4 7
2 5
6
MIO
UPW AGADIR
Figure II-1. Trajet du navire et emplacement des stations d’échantillonnage lors de la campagne PROSOPE. Les points rouges représentent les stations courtes 1 à 9 ; les étoiles représentent les stations longues.
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
9 Réaliser les études des processus biogéochimiques couramment étudiés par JGOFS. 9 Etudier l’influence respective des nitrates, des phosphates et du fer sur la fertilité océanique. 9 Identifier les facteurs régissant les processus biogéochimiques à petite échelle, et en particulier à l’échelle circadienne. De façon à remplir ses objectifs, cette campagne océanographique devait répondre à un certains nombre de critères : 9 Il fallait mener une investigation dans des sites océaniques couvrant une large gamme de conditions trophiques. 9 Il fallait étudier des systèmes océaniques stables pendant des périodes de temps suffisamment longues et avec une haute fréquence dans l’acquisition des données. De façon à remplir ces objectifs, la stratégie d’échantillonnage lors de la campagne s’est organisée comme suit (Figure II-1). 3 stations ont été occupées pendant 5 jours chacune ("stations longues") et un échantillonnage à haute fréquence (une CTD29 toutes les 3 heures) y a été conduit de façon à pouvoir étudier les différents points décrits dans les objectifs, en insistant sur la variabilité circadienne des processus biogéochimiques. Ces 3 stations étaient situées dans des zones dont les caractéristiques trophiques étaient a priori très différentes : 9 l’UPWelling30 du Maroc situé au large d’Agadir 9 la Mer IOnienne (site au sud/ouest de la Crète) 9 la mer Ligure (site DYFamed31). 9 "stations courtes" occupées pendant moins d'un jour (stations 1 à 9) ont également été explorées, mais les résultats obtenus à ces stations ne seront pas détaillés ici.
29
CTD pour Conductivity, Temperature Depth, les trois paramètres mesurés par l’appareil. Le terme anglais “upwelling” sera employé pour désigner une résurgence. 31 DYFAMED : Dynamique des Flux Atmosphériques en MEDiterrannée. 30
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Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
II.
UNE STRATEGIE D’ECHANTILLONNAGE ADAPTEE
Les trois stations longues étudiées durant la campagne ont été choisies parce qu'elles permettaient a priori de couvrir cette large gamme de conditions trophiques recherchée. L’upwelling du Maroc (UPW) est un système quasi permanent de remontée d’eau profonde. Sous l’effet du régime des vents et de l’équilibre géostrophique, le transport d’Ekman induit le mouvement vers le large des eaux superficielles laissant ainsi arriver en surface des eaux profondes plus froides et riches en sels nutritifs. Ce phénomène est à l'origine d'une forte productivité primaire de ce site avec des valeurs de production atteignant 730 g C m-2an-1 au large de la Mauritanie, soit 2 g C m-2j-1 (Minas et al., 1982), et une biomasse phytoplanctonique estimée à plus de 20 mg chl a m-3 - mesurés par le capteur CZCS - (VanCamp et al., 1991). Malgré son caractère persistant, l’intensité des remontées d’eau profonde et l’activité globale de ce système d’upwelling a été identifiée comme étant plus intense à la période de fin d’été (Nykjaer et VanCamp, 1994). La mer Méditerranée, par opposition au site UPW, est depuis longtemps considérée comme une zone océanique globalement oligotrophe (Redfield et al., 1963). Ceci s’explique par le nombre réduit d’apports extérieurs en sels nutritifs de cette “mer au milieu des terres”. Dans le bassin occidental (limité à l’Est par le seuil de Sicile) l’apport des eaux du Rhône explique la plus grande productivité de la mer d’Alboran et du Golfe du Lion (Antoine et al., 1995; Moutin et Raimbault, 2002). Dans le bassin oriental, l’absence d’apport par les eaux du Nil depuis la construction du barrage d’Assouan (Moutin et Raimbault, 2002) fait de l’apport d’origine atmosphérique la principale source d’éléments nutritifs (Bergametti et al., 1992; Guerzoni et al., 1999; Herut et al., 1999; Ridame, 2001). Le bassin oriental est en conséquence ultra-oligotrophe (Yacobi et al., 1995) avec une production primaire très faible (Sournia, 1973; Turley et al., 2000) limitée principalement par l’apport en phosphates (Krom et al., 1991; Zohary et Robarts, 1998). Cette limitation par les phosphates existe aussi dans le bassin occidental lors de la période de stratification estivale. Elle est due à la sortie en profondeur d’eaux riches en phosphates au détroit de Gibraltar et à la faiblesse des apports extérieurs (fluviatiles et atmosphériques) (C. Ridame, comm. pers.). De plus, l’apport atmosphérique en fer par les particules d’origine saharienne favoriserait la fixation de N2 atmosphérique par certaines cyanobactéries constituant ainsi un apport supplémentaire en azote, qui induirait une limitation du système
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Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
par les phosphates pour lesquels les apports extérieurs restent insuffisants (Krom et al., 1991). Ceci est confirmé par les fortes valeurs du rapport N/P en Méditerranée (27-29:1 contre 16:1 Redfield habituellement) (Krom et al., 1991). Il existe en fait en mer Méditerranée deux gradients d’oligotrophie : un gradient d’ouest en est, et un autre allant du nord au sud, le nord étant légèrement moins oligotrophe que le sud (Sournia, 1973; Berland et al., 1988; Morel et André, 1991; Antoine et al., 1995).
III.
QUELS AXES DANS CETTE ETUDE ?
Rappelons ici que l’un des buts de cette thèse est aussi de poursuivre la description du milieu naturel quant aux valeurs des paramètres photosynthétiques. Un assez grand nombre de mesures de la courbe P vs. E ainsi que de nombreuses mesures de fluorescence ont donc été effectuées, dans le but de caractériser chacune des zones étudiées. Grâce à ces mesures, l’influence des conditions trophiques sur la photosynthèse et son rendement a été étudiée en comparant les résultats obtenus aux trois stations longues. Plus particulièrement, c’est l’impact d’une limitation par les phosphates qui a été étudié. Relativement peu d’études, se sont déjà intéressées aux effets d’une limitation par les phosphates sur les paramètres photosynthétiques. Senft (1978) avait mis en évidence la corrélation entre la photosynthèse et le contenu en phosphore cellulaire. Depuis, certain mécanismes ont été identifiés, mais toujours sur des expériences menées en culture. On sait par exemple qu’une large disponibilité en phosphate du milieu influe positivement sur l’activité spécifique de la RubisCO (Brooks, 1986), mais les phosphates pourraient aussi avoir une action directe sur la régulation des réactions entre phase sombre et phase claire de la photosynthèse de par leur importance dans les molécules d’ADP32 et d’ATP33 (Sharkey, 1990). Le rôle du phosphore au sein dans la régénération des trioses-phosphates contribue également à faire de ce sel nutritifs, l’un des plus importants (Karl, 2000). Geider et al. (1998) ont montré que la limitation d’une culture phytoplanctonique (Dunaliella tertiolecta) en phosphate entraînait la diminution de l’efficacité photosynthétique et du taux maximal spécifique de fixation de carbone. Aucune étude similaire n’a à notre 32 33
ADP : Adénosine di-phosphate ATP : Adénosine tri-phosphate
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Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
connaissance été menée dans le milieu naturel marin. Le dernier axe d’étude sera la vérification de l’existence de variations circadiennes de la photosynthèse et l’identification des différents facteurs pouvant être à leur origine dans le milieu naturel.
IV.
ORGANISATION DE CE CHAPITRE
En suivant les objectifs décrits ci-dessus, ce chapitre sera organisé comme suit : dans un premier temps, toutes les techniques utilisées au cours de cette campagne pour l’acquisition des données seront détaillées, puis les conditions hydrologiques et trophiques rencontrées à chacun des trois sites étudiés seront caractérisées. Enfin les résultats obtenus selon les deux axes de recherche décrit plus haut seront présentés et interprétés :
1/ Quelle est l’influence du régime trophique des zones océaniques sur le fonctionnement de la photosynthèse ? 2/ Quels sont les facteurs qui régissent les variations circadiennes de la photosynthèse dans le milieu naturel ?
◊ MATERIELS ET METHODES La majorité des données acquises durant cette campagne correspondent à des échantillons discrets prélevés à l'aide d'une "rosette” lors de l’acquisition de profils. L’étude des variations circadiennes de la photosynthèse s’est faite, elle, de deux façons différentes et sera donc détaillée à part.
I.
ACQUISITION SUR LES PROFILS
La caractérisation de chacune des stations échantillonnées lors de la campagne a été effectuée grâce à des profils répétés de prélèvements à la rosette. La rosette de 24 bouteilles Niskin de 12 litres chacune était équipée d’une sonde CTD (Sea-bird Inc., SBE 911+,), d’un fluorimètre (Chelsea Instr., Aquatracka), et d’un transmissiomètre (Seatech Inc., 25 cm). A chaque profil, étaient ainsi déterminés instantanément en fonction de la profondeur, la température (°C), la salinité (g kg-1), la concentration en oxygène dissous et une estimation de la concentration en chlorophylle a ainsi que de la charge en particules.
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Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
L’excès de densité potentielle (σθ, kg m-3) a été calculé systématiquement à partir des données de conductivité et de température acquises à chaque profil. Les échantillons discrets d’eau de mer étaient prélevés à la remontée de la rosette pour effectuer diverses analyses.
II.
ECHANTILLONS DISCRETS A. DOSAGE DES SELS NUTRITIFS
Des échantillons ont été prélevés pour l’analyse des sels nutritifs sur tous les profils. a. Analyses des Nitrates (NO3-) Les échantillons (20 mL) étaient empoisonnés immédiatement après le prélèvement avec 50 µL d’une solution de HgCl2 à 8 mg L-1 puis conservés à 5°C jusqu’à l’analyse. Les dosages ont été effectués selon la méthode de Tréger et LeCorre (1975) par Patrick Raimbault du C.O.M. de Marseille. b. Analyses du Phosphore réactif dissous (PO42-) La concentration en orthophosphates a été déterminée à bord du navire par Thierry Moutin (C.O.M. Marseille) selon la méthode de Murphy et Riley (1962) après concentration (× 6) selon la méthode MAGIC (Karl et Tien, 1992). Les mesures spectrophotométriques ont été faites à l’aide d’un spectrophotomètre (modèle CECIL CE 1011) de 10 cm de chemin optique. c. Analyses de Silicates (Si (OH)4) La concentration en acide orthosilicique (Si(OH)4) a été déterminée selon la méthode spectrophotométrique de Mullin et Riley (1965) par l’équipe de Bernard Quéguiner du C.O.M de Marseille.
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Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
d. Analyses du Fer Les concentrations en fer total dissous ont été mesurées sur des profils aux trois stations longues (UPW, MIO et DYF). Les échantillons ont été prélevés selon deux méthodes : par pompage entre 0 et 200 m et par des prélèvement à la rosette au delà de 200 m. L’analyse du fer dissous a été faite par le méthode de chemiluminescence selon Obata et al. (1993), par Stéphane Blain (U.B.O, Brest).
III.
DETERMINATION DES CONCENTRATIONS PIGMENTAIRES A. METHODE D’ANALYSE
Les échantillons pour les analyses des concentrations pigmentaires ont été prélevés à la rosette. 2.8 litres d’eau de mer étaient systématiquement filtrés sur des filtres en fibre de verre de 0.7 µm de porosité nominale (Whatman, GF/F). Sur ces filtres était déterminé le spectre d’absorption du matériel particulaire (voir section suivante) avant que l’analyse des pigments par HPLC soit faite à bord ou au laboratoire, les échantillons étant dans ce dernier cas conservés dans l’azote liquide. La méthode d’analyse en phase inverse, basée sur un gradient entre un mélange (70:30) méthanol - acétate d’ammonium et une solution 100% méthanol (solvant A et B respectivement) était similaire à celle décrite dans Vidussi, et al. (1996). Cependant, afin d’améliorer la sensibilité de la méthode, quelques modifications ont été apportées à la méthode comme au Chapitre I (J. Ras, pers. comm.) B. INDICATEURS DES COMMUNAUTES PHYTOPLANCTONIQUES La concentration totale de chlorophylle a (TChl a, mg m-3) sera utilisée comme indicateur de la biomasse phytoplanctonique. Elle est définie ici comme étant la somme des concentrations en chlorophylle a, en divinyle-chlorophylle a, en isomères et épimères de la chlorophylle a ainsi qu’en chlorophyllides a. La prise en compte des chlorophyllides a dans l’évaluation de TChl a était liée à la volonté de maintenir une possible comparaison des données acquises par HPLC avec celles estimées depuis l’espace, les capteur satellitaux ne pouvant faire la différence entre chlorophyllides et les autres dérivés de la chlorophylle.
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Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
Les molécules pigmentaires sont pour la plupart caractéristiques de certaines classes phytoplanctoniques (pour un aperçu général voir Jeffrey et al., 1997). D’autre part, d’un point de vue biogéochimique les classes phytoplanctoniques ayant une taille proche ont souvent des caractéristiques écophysiologiques proches. Ainsi par exemple, les zones oligotrophes de l’océan sont plus souvent colonisées par des espèces de petite taille contrairement aux zones plus riches des hautes latitudes. Ainsi, la partition en classes de tailles et l’identification de chaque classe par ses pigments caractéristiques rend l’interprétation des données souvent plus aisée (Sieburth et al., 1978; Vidussi, 1998; Vidussi et al., 2000; Vidussi et al., 2001). Dans cette étude, la partition en classe de taille proposée par (Sieburth et al., 1978 sera utilisée, et l’abondance de ces différentes classes sera étudiée grâce aux indices pigmentaires taxonomiques proposés par Vidussi (1998) (Tableau II-1). Tableau II-1 : Classes de taille des populations phytoplanctoniques et leurs pigments taxonomiques caractéristiques. Chaque pigment est caractéristique d’un groupe phytoplanctonique (Vidussi et al., 2001 et références citées dans l’article).
Pigment
Signification Taxonomique
Picoplancton
Zéaxanthine
Cyanobactéries et Prochlorophytes
( < 2 µm)
Chlorophylle b et Divinyle-Chlorophylle b
Prochlorophytes et flagellés verts
Nanoplancton
Alloxanthine
Cryptophytes
( 2 à 20 µm)
19’ Hexanoyloxyfucoxanthine
Nanoflagellés Chromophytes
19’ Butanoyloxyfucoxanthine
Nanoflagellés Chromophytes
Microplancton
Fucoxanthine
Diatomées
( > 20 µm)
Péridinine
Dinoflagellés
Trois indices seront donc calculés de façon à quantifier chacun des groupes ainsi définis :
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Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
Picoplancton =
[zéaxanthine] + [chlorophylle b ] + [divinyle − chlorophylle b ] [Tous les Pigments Taxonomiques]
Nanoplancton =
[alloxanthine] + [ 19'BFucoxanthine] + [ 19'HFucoxanthine] (1) [Tous les Pigments Taxonomiques]
Microplancton =
[fucoxanthine] + [péridinine] [Tous les Pigments Taxonomiques]
Tous les pigments présents dans une cellule phytoplanctonique absorbent la lumière. Cependant, tous ne transmettent pas l’énergie lumineuse captée aux centres réactionnels, limitant ainsi l'utilisation de cette énergie absorbée pour la photosynthèse. Les pigments dont l'absorption ne contribue pas à alimenter l'appareil photosynthétique sont dits “non-photosynthétiques” (NPP pour “Non-Photosynthetic Pigments” en anglais) et jouent un rôle très important dans les phénomènes de photoprotection chez certaines algues (Demmig-Adams, 1990; Demmig-Adams et Adams, 1992). Afin de mieux étudier leurs variations lors de la campagne, un indice a été construit pour les quantifier (Babin et al., 1996) : l’indice NPP (sans unité) est calculé comme suit : NPP =
[Zéaxanthine] + [Diadinoxanthine] + [Diatoxanthine] + [β − Carotène] ∑ [tous les pigments]
IV.
DETERMINATION DE L’ABSORPTION SPECIFIQUE
(2)
Les spectres d’absorption du phytoplancton ont été directement mesurés à l’aide d’un spectroradiomètre LICOR (LI-1800UW) sur les filtres en fibre de verre (Whatman, GF/F) servant aux analyses HPLC avant extraction. Ce “double emploi” des mêmes filtres permet d’éviter certains biais liés à l’échantillonnage, comme par exemple lorsque les communautés phytoplanctoniques sont constituées de grosses cellules pouvant sédimenter dans les bouteilles Niskin entre deux prélèvements. La densité optique de l’échantillon (DO) a été mesurée entre 370 et 750 nm avec un incrément de 1 nm. Le coefficient d’absorption du phytoplancton aph (λ) (m-1) a été calculé après correction du spectre d’absorption particulaire total de l’effet d'amplification dû au filtre de fibre de verre (Mitchell et Kiefer, 1988), et après déconvolution selon Bricaud et Stramski, (1990) de
- 67 -
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
14
Activité totale
50 µL éthanolamine
C
Fixation de carbone
+ 12 * 50mL échantillon
+ 25 µL échantillon
+ 3 * 1 mL ∆H2O
2 heures d’incubation
Filtration sur GF/F + 3 * 10 mL scintillant
+ 12 * 1 mL HCl
COMPTAGE
1 heure sous la hotte aspirante
+ 12 * 10 mL scintillant
COMPTAGE
Figure II-2. Déroulement schématisé de l’expérience de détermination de la relation “fixation de carbone vs. éclairement”.
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
façon à exclure la contribution des particules détritiques. Le coefficient d’absorption spécifique du phytoplancton a ensuite été calculé selon la formule : a *ph (λ ) =
V.
DETERMINATION
a ph (λ )
(3)
Tchl a
DES PARAMETRES DE LA RELATION ENTRE LE
TAUX DE FIXATION DE CARBONE ET L'ECLAIREMENT.
La relation entre le taux de fixation de carbone et l’éclairement (" courbes P vs. E ") a été déterminée selon le méthode décrite par Babin et al. (1994). Des prélèvements à 10 profondeurs (entre 0 et 200 m) ont été analysés à chaque profil, effectué au midi solaire. Pour chaque échantillon, 750 mL d’eau de mer étaient prélevés dans une bouteille ambrée à la rosette (Figure II-2). Chaque échantillon était inoculé avec du ®
14
14
C inorganique
-1
(Amersham , NaH CO3, 0.4 µCimL ) à l’aide d’une pipette à déplacement positif (Finnpipet®). Afin de déterminer l’activité initiale du mélange, des aliquotes de 25 µL (trois pour chaque échantillon) étaient prélevées et ajoutées à 50 µL d’éthanolamine (Sigma-Aldrich®) et à 1 mL d’eau distillée. 10 mL de cocktail à scintillation (Packard®, Aquasol-2) étaient ensuite ajoutés. Chaque échantillon d’eau de mer inoculé était ensuite subdivisé en 12 sous-échantillons de 50 mL chacun, versés dans 12 flacons à culture (NUNC®) en polycarbonate, et incubés dans un photosynthétron radial (Figure II-3) (Babin et al., 1994). Le photosynthétron radial est composé de 10 chambres d’incubations disposées en étoile sur une plaque d’aluminium autour d’un trou central duquel dépasse la source de lumière (Figure II-3A). Chaque chambre d’incubation (en Plexiglas noir) présente une face avant blanche diffusante et un double fond permettant la circulation d’eau thermostatée par un système de trop plein (Figure II-3B). La lumière produite par une ampoule à halogénure métallique (OSRAM, Powerstar HQI-TS 250 W/D lumière du jour) diminue graduellement dans la chambre d’incubation en fonction de la distance des 12 flacons à culture par rapport à la face diffusante. L'intensité de la source était ajustée par l’ajout devant la face de chaque chambre à incubation de filtres en polycarbonate (filtres LEE, densité neutre : n° 209, 210 et 211). Il est important de noter que les flacons à cultures NUNC® ne modifient pas le spectre de l’éclairement fourni par la lampe (Babin et al.,
- 68 -
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
Figure II-3. Schéma simplifié du photosynthétron radial utilisé lors de la campagne PROSOPE, d’après Babin et al., 1994. A : Schéma global vu du dessus. B : Détail en coupe longitudinale d’une chambre d’incubation.
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
1994). Ce spectre d’éclairement à été déterminé au laboratoire de Villefranche à l’aide d’un spectroradiomètre (LICOR, LI-1800UW). Le PAR dans les chambres d’incubation a été mesuré à plusieurs reprises durant la campagne à l’aide d’un quantamètre (Biospherical Instr., QSL-100) équipé d’un collecteur 4π. Le PAR maximum dans chaque chambre d’incubation correspondait à l’éclairement maximum auquel pouvait être soumis les échantillons durant la journée en fonction de leur profondeur de prélèvement. La température dans les chambres d’incubation a été maintenue constante et proche des températures observées in situ à l’aide d’une circulation d’eau refroidie par des cryothermostats à circulation (Lauda, RMS6). Après deux heures d’incubation, les échantillons ont été filtrés sur des filtres en fibre de verre (Whatman®, GF/F 25 mm). Après avoir été placés dans les fioles à scintillation et sous une hotte aspirante, les filtres étaient acidifiés (1mL d’HCl 1N) de façon à éliminer l’excès de carbone inorganique marqué. Après une heure d’évaporation, 10 mL du cocktail à scintillation (Packard®, Aquasol-2) étaient ajoutés sur chacun des filtres (Figure II-2). Au laboratoire, la radioactivité a été comptée à l’aide d’un compteur à scintillation liquide (Packard, MINAXI Tricarb série 4000), en tenant compte du phénomène de quenching de la fluorescence . Le taux de fixation de carbone a été déterminé tel que décrit par Parsons et al. (1984), puis normalisé par TChl a pour donner PB [mg C (mg chl a)-1h-1]. La pente initiale de la courbe P vs. E [αB , mg C (mg chl a)-1h-1 (µmol quanta m-2s-1)-1] et le B taux maximal spécifique de fixation de carbone [ Pmax , mg C (mg chl a)-1h-1] ont été
estimés en ajustant aux données expérimentales de PB et de PAR la relation proposée par Jassby et Platt (1976) (Eq. 5 du chapitre I), à l’aide de l’algorithme quasi-newton du logiciel Systat® (version 8.0). Le choix de ce modèle lors de cette partie du travail était motivé par les mêmes raisons qu’au chapitre I Le paramètre de saturation, EK (µmol quanta m-2s-1), et le rendement quantique de fixation de carbone, φCmax [mol C (mol quanta)-1], ont été définis comme au chapitre I (Eq. 6, 7 et 8). Afin d’éliminer l’effet des pigments nonphotosynthétiques sur le rendement quantique de fixation de carbone, il a également été calculé en normalisant l’efficacité photosynthétique αB par le coefficient d’absorption * spécifique des seuls pigments photosynthétiques du phytoplancton ( a PS ) (Babin et al.,
1996) selon la formule :
- 69 -
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
φ CPSmax =
αB * a PS
(4)
* dans laquelle a PS est pondéré par l’éclairement spectral de la source lumineuse utilisée
pendant l’incubation :
a PS
*
∫ =
700
400
a *PS (λ ) E (λ )dλ
∫
700
400
VI.
E ( λ ) dλ
(5)
ETUDE DE LA FLUORESCENCE
L’étude de la fluorescence lors de cette campagne s’est faite selon deux axes différents. Dans un premier temps la fluorescence a été utilisée pour valider les observations faites sur Prochlorococcus en culture (expériences décrites au Chapitre I), et pour cela les variations circadiennes de la fluorescence ont été étudiées sur les eaux de surface lors de l’échantillonnage de deux des stations longues hydrologiquement les plus stables ( voir plus bas la caractérisation trophique) : MIO et DYF. A. ETUDES DES VARIATIONS CIRCADIENNES DE LA FLUORESCENCE : MESURES EN “CONFIGURATION PONT”.
Les mesures de l’efficacité photochimique du PS2, Fv/Fm ainsi que de la section efficace du PS2 ont été effectuées à l’aide d’un profileur FRR. Lors des deux stations longues étudiées (MIO et DYF), le Fastracka était installé 24h/24h sur le pont avant du bateau (au soleil). Un système de pompage en continu via les bacs d’incubation utilisés par d’autres expériences permettait une alimentation constante du profileur. Le principe de mesure du Fastracka est celui du fluorimètre FRR tel que décrit dans Kolber et al. (1998) et Steglich et al. (2001). σPS2 a également été mesurée par la même technique. En plus des données acquises en “configuration pont” par le Fastracka, un suivi de la fluorescence sur les profils discrets a été effectué (un profil toutes les 3 heures) en mesurant la fluorescence sur les échantillons d’eau avec un fluorimètre à amplitude modulée (Xe-PAM, Walz GmbH, Allemagne). Sur ces échantillons discrets, la haute
- 70 -
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
fréquence des profils et l’étude aux différents sites a permis de documenter les deux axes de recherche, variabilité circadienne et variabilité liée aux régimes trophiques. B. ECHANTILLONS DISCRETS : LE XE-PAM. Lors de chaque profil CTD, des échantillons discrets étaient prélevés à la rosette dans des flacons ambrés à 12 profondeurs entre 0 et 200 m. La technique de fluorescence à amplitude modulée (PAM) a été appliquée en utilisant un fluorimètre à lampes xénon (XePAM, Walz GmbH Allemagne). Durant la période de jour, les niveaux minimum et maximum de fluorescence in vivo, Fo et Fm ont été mesurés après que l’échantillon ait été laissé à l’obscurité pendant 30 min. Fo était obtenu après l’application à l’échantillon de flashs non-actiniques à une fréquence de 2 Hz pendant quelques secondes. Ces flashs étaient produits par une lampe xénon dont le faisceau lumineux était modifié par des filtres (comme au chapitre I). Fm était ensuite mesuré selon la méthode du “Pump and Probe” (Mauzerall, 1972) comme au chapitre I excepté que le flash sonde était émis 80 µs après le flash saturant. La combinaison de filtres sur le détecteur était la même qu’au chapitre I. Le signal de fluorescence était lu sur un oscilloscope (Lecroy, 9310C) en valeurs relatives. Les rendements quantiques minimum et maximum de fluorescence (φFo et φFm, respectivement) ainsi que l’efficacité photochimique du photosystème 2, Fv/Fm, ont ensuite été calculés comme au chapitre I (Eq. 11 et 10 respectivement).
◊ RESULTATS ET DISCUSSION Une partie des résultats présentés ici ont été fournis par des collaborateurs qui sont identifiés dans le Tableau II-2.
- 71 -
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
-3
Excès de densité potentielle (kg m )
Température (°C) 15
20
25
24
30
0
0
20
20
40
40
60
60
Profondeur en m
Profondeur en m
10
80 100 120
A
140 160 180
25
26
27
28
29
30
80 100 120 140 160
UPW MIO DYF
B
180 200
200
TOULON
DYF 9 8
3 1
4 7
2 5
6
MIO
UPW AGADIR
Figure II-4. Conditions hydrologiques de température A (°C) et excès de densité B (kg m-3) aux 3 stations longues visitées durant la campagne PROSOPE : UPW en vert, MIO en bleu et DYF en rouge.
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
Tableau II-2 : Résultats obtenus lors de la campagne océanographique PROSOPE et personnes ayant fournies ces données.
Type de donnée
Personne responsable
Laboratoire d’origine
Hydrologie, CTD
D. Tailliez
LOV Villefranche sur mer
Sels nutritifs : NO3
P. Raimbault
COM Marseille
PO4
T. Moutin
COM Marseille
Si (OH)4
B. Quéguiner
COM Marseille
Fer
C. Guieu / S. Blain
LOV Villefranche / UBO Brest
Pigments
H. Claustre/J. Ras/J-C. Marty
LOV Villefranche sur mer
Fluorescence Fastracka
F. Bruyant / M. Babin
LOV Villefranche sur mer
Fluorescence PAM
F. Bruyant / O. Prasil / B. Genty
CEA Cadarache / AVCR Trebon
Comme indiqué au début de ce chapitre, l’un des objectifs de la campagne PROSOPE était de pouvoir étudier des zones océaniques couvrant une large gamme de conditions hydrologiques et trophiques. Pour commencer, les principales caractéristiques des trois stations longues visitées lors de cette campagne, UPW, MIO et DYF sont détaillées dans la section suivante.
I.
STRUCTURE HYDROLOGIQUE ET TROPHIQUE A. LES CONDITIONS HYDROLOGIQUES
La figure II-4 illustre les conditions hydrologiques aux 3 stations considérées. La structure hydrologique verticale du site UPW situé en Atlantique correspond bien à celle d’un upwelling, avec une homogénéité assez marquée des paramètres physiques indiquant un fort mélange vertical de la masse d’eau lié aux remontées d’eau profonde. Au nord de la Méditerranée, au site DYF, la température de surface était plus élevée que dans l’Atlantique (~ 22.3 °C) et la stratification de la masse d’eau est bien marquée avec une couche mélangée de surface assez peu épaisse (~ 15 m). Le maximum d’excès de densité potentielle sur 200 m est atteint dès 40 m de profondeur avec en deçà de cette limite une couche d’eau homogène. Au point le plus à l’Est de cette étude, le site MIO, la structure
- 72 -
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique. [ PO 4 ] (µM )
[ NO 3 ] (µM ) 2
4
6
8
10
0.0
12 0
20
20
40
40
60
60
Profondeur en m
Profondeur en m
0 0
80 100 120
0.2
1.0
100 120
160
A
180
B
180 200
200
[ Fer ] (nM ) 0
1
2
[ Si (OH) 4 ] (µM ) 3
0
4
0
0
20
20
40
40
60
60
Profondeur en m
Profondeur en m
0.8
140
160
80 100
C
1
2
3
4
5
6
7
80 100 120 140
140 160
0.6
80
140
120
0.4
U PW M IO D YF
160
180
180
200
200
TOULON
D
DYF 9 8
3 1
4 7
2 5
6
MIO
UPW AGADIR
Figure II-5. Abondance des sels nutritifs aux 3 stations longues visitées lors de la campagne. 4A : NO3 (données fournies par P. Raimbault) 4B : PO4 (données fournies par T. Moutin), 4C : Fer (données fournies par S. Blain et C. Guieu) et 4D : Si(OH)4 (données fournies par B. Quéguiner).
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
hydrologique est différente, avec une température des eaux de surface beaucoup plus élevée (~ 26.7 °C) et une plus forte stratification de la masse d’eau indiquée par l’augmentation plus progressive de l’excès de densité potentielle avec la profondeur par rapport à ce qui a été observé au site DYF. Le couche mélangée de surface à MIO était légèrement plus épaisse : ~ 18 m. B. LES SELS NUTRITIFS Afin de déterminer les caractéristiques trophiques de chacune des stations, la répartition des sels nutritifs sur la colonne d’eau a été prise comme référence (Figure II-5). a. Nitrates et Phosphates A l’upwelling du Maroc, les nitrates et les phosphates sont abondants dès la surface (Figure II-5A et 5B), traduisant les mouvements d’eau verticaux apportant les sels nutritifs depuis le fond. La diminution de leur concentration au dessus de 30 m indique cependant qu’ils sont abondamment consommés par le phytoplancton dans la couche la plus éclairée, sans pour autant que l’on arrive à une limitation. Au site DYF, nitrates et phosphates sont totalement épuisés dans la couche de surface (jusqu’à 25 m pour les nitrates et 40 m pour les phosphates). Les concentrations augmentent ensuite rapidement vers le fond. Au site de la mer Ionienne, l’appauvrissement en sels nutritifs est encore plus marqué avec une nitracline autour de 90 m et une phosphacline autour de 110 m. Il est important de noter que la phosphacline est toujours plus profonde que la nitracline suggérant un appauvrissement plus marqué en phosphates qu’en nitrates. b. Fer et Silice Les profils de concentration en Fer déterminés aux trois stations longues (Figure II5C) indiquent une plus grande richesse en Fer dans la couche de surface et des concentrations homogènes plus faibles en profondeur. A la station UPW, les concentrations près du fond ré-augmentent. Les concentrations en Fer sont plus élevées à DYF qu’à MIO, et dans les deux cas ne constituent pas un facteur de limitation à la production phytoplanctonique (C. Guieu, comm. pers.)
- 73 -
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
[ TChl a ] (mg m-3) 0
1
2
3
4
0 20
Profondeur en m
40 60 80 100 120 140
UPW MIO DYF
160 180 200
TOULON
DYF 9 8
3 1
4 7
2 5
6
MIO
UPW AGADIR
Figure II-6. Concentration en TChl a (mg m-3) aux 3 stations longues visitées lors de la campagne PROSOPE : UPW en vert, MIO en bleu et DYF en rouge.
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
L’allure générale des profils de concentration en silice est la même que celle des profils de concentration en nitrate et phosphate avec des concentrations relativement homogènes dans les couches de surface et augmentant en profondeur (Figure II-5D). Cependant, la couche de surface n’est jamais complètement dépourvue de silice avec une concentration minimale résiduelle de ~ 0.8 µM au site MIO et ~1.35 µM au site DYF.
II.
LA REPARTITION DU PHYTOPLANCTON
De façon à définir le statut trophique des différentes zones explorées lors de la campagne, l’information apportée par l’analyse des pigments phytoplanctoniques a également été utilisée. A. BIOMASSE TOTALE Comme indiqué dans la partie Matériel et Méthodes, l’indice TChl a (chlorophylle a totale) a été utilisé pour quantifier la biomasse phytoplanctonique totale. Lors de cette campagne, des changements importants dans la répartition de TChl a le long de la colonne d’eau ont été observés (Figure II-6). Au site UPW, la biomasse phytoplanctonique était très abondante avec des concentrations jusqu’à 3.5 mg m-3 et présentait un maximum de subsurface. La présence de cette forte biomasse est permise par l’abondance en surface des sels nutritifs (Figure II-5) dans la couche d’eau fortement éclairée. Aux deux autres sites étudiés, les profils de TChl a présentent un maximum profond. Celui-ci est moins important (~ 0.2 mg m-3) et plus profond (~ 90 m) au site MIO qu’au site DYF (~0.45 mg m-3 et ~40 m). B. REPARTITION DES COMMUNAUTES PHYTOPLANCTONIQUES Afin de déterminer comment se répartissent les différentes communautés phytoplanctoniques aux différentes stations, les trois indices pigmentaires décrit par Vidussi et al., 2001 et calculés comme indiqué dans Matériel et Méthodes ont été examinés. La figure II-7 illustre la répartition de ces indices aux trois stations longues étudiées. A l’upwelling du Maroc, la quasi totalité de la biomasse phytoplanctonique est représentée par du microphytoplancton, dont l’abondance relative diminue ensuite vers - 74 -
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
Proportion classe phyto. 0.2
0.4
0.6
0.8
Proportion classe phyto. 0.0
1.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Proportion classe phyto. 1.0
0.0
0
0
20
20
20
40
40
40
60
60
60
80 100 120
microphyto nanophyto picophyto
140
80 100 120
160
UPW
180
Profondeur en m
0
Profondeur en m
Profondeur en m
0.0
TOULON
0.8
1.0
120
160
160
200
200
0.6
100
140
MIO
0.4
80
140
180
0.2
180
DYF
200
DYF 9 8
3 1
4 7
2 5
6
MIO
UPW AGADIR
Figure II-7. Proportions relatives des trois classes de taille du phytoplancton aux 3 stations longues visitées lors de la campagne ; microphytoplancton en vert, nanophytoplancton en violet et picophytoplancton en bleu.
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
DYF et surtout vers MIO où la biomasse microphytoplanctonique ne représente plus que 5 à 10% de la biomasse totale. Au site DYF, le microphytoplancton est présent en dessous de 50 m de profondeur, en dessous de la nitracline, là où les nitrates sont de nouveaux présents. A l’inverse, le picophytoplancton est présent au dessus de la nitracline, mais pas en dessous. Au site MIO, la biomasse phytoplanctonique est composée de pico- et de nanophytoplancton en proportion équivalente, la population de nanophytoplancton étant légèrement majoritaire dans la couche de surface (0 à 70 m) et inversement en deçà de 70 m. C. BIOMASSE INTEGREE Si l’on considère la biomasse intégrée sur le couche mélangée (données nonreprésentées) pour ce qui est de la biomasse totale et des différentes classes de phytoplancton, on remarque que le site de l’upwelling du Maroc est celui où la biomasse est la plus abondante (largement avec plus de 100 mg m-2), majoritairement représentée par le microphytoplancton. Le site DYF est ensuite celui où la biomasse est la plus abondante (17 mg m-2), l’importance relative du picophytoplancton y étant moins importante qu’à MIO où la biomasse intégrée est la plus faible (10 mg m-2).
III.
QUELLES CONDITIONS TROPHIQUES ?
A l’aide de ces résultats, il est possible de caractériser précisément les régimes trophiques de chaque site étudié. Ces caractéristiques sont d’ailleurs en accord avec la littérature et les descriptions générales faites en introduction de ce chapitre. Le site de l’upwelling du Maroc présente une biomasse très importante localisée près de la surface et dominée par du microphytoplancton. En relation avec les concentrations en sels nutritifs (qui restent détectables jusqu’en surface), il s’agit d’un site
EUTROPHE
dont la production
primaire résulte d’une production nouvelle (associée aux nitrates et aux cellules phytoplanctoniques de grande taille, Malone, 1980; Michaels et Silver, 1988; Chisholm, 1992; Dugdale et Wilkerson, 1992; Goldman, 1993). En Méditerranée par contre, les concentrations en chlorophylle a sont bien moins élevées et les profils présentent des maxima en profondeur. La Méditerranée est en effet une mer globalement oligotrophe (Redfield et al., 1963). Néanmoins entre les deux sites
- 75 -
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique. P
B
-1 -1
max
2
4
6
B
-1 -1
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
8
0
0
20
20
40
40
60
60
80 100 120
80 100 120 140
140 UPW MIO DYF
160 180
160 180 200
200
φ Cmax (m ol C m ol quanta -1) 0.00
0.04
0.08
φ Cmax
0.12
0.0
0
0
20
20
40
40
60
60
Profondeur en m
Profondeur en m
-2 -1 -1
α [ m g C (m g Chl a) h (µm ol quanta m s ) ]
Profondeur en m
Profondeur en m
0
[m g C (m g Chl a) h ]
80 100 120
-1
(mol C m ol quanta ) 0.1
0.2
0.3
80 100 120
140
140
160
160
180
180
200
200
TOULON
PS
DYF 9 8
3 1
4 7
2 5
6
MIO
UPW AGADIR
Figure II-8. Paramètres photosynthétiques le long de la colonne d’eau aux trois sites visités lors de la campagne, UPW B en vert, MIO en bleu et DYF en rouge. 8A : Pmax le taux maximal de fixation de carbone [mg C (mg chl a)-1h-1], 8B : αB l’efficacité photosynthétique [mg C (mg chl a)-1h-1 (µmol quanta m-2s-1)-1], 8C : φCmax le rendement quantique de fixation de carbone [mol C (mol quanta)-1] et 8D : φ CPSmax , le rendement quantique de fixation de carbone correspondant à la seule absorption des pigments photosynthétiques [mol C (mol quanta)-1]. Notez ici qu’aucune des courbes P vs. E mesurées ne présentait de coefficient de photoinhibition (β) significatif. N = 5.
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
étudiés ici, des différences importantes peuvent encore être soulignées. En effet, nitracline et phosphacline sont situées plus profond dans la colonne d’eau au site MIO, indiquant un appauvrissement de la masse d’eau plus accentué, particulièrement pour ce qui est des phosphates (Yacobi et al., 1995; Moutin et Raimbault, 2002). La colonne d’eau est d’ailleurs légèrement plus stratifiée au site MIO. D’autre part, la communauté picoplanctonique est plus importante à MIO en relation avec la position plus profonde de la nitracline et de la phosphacline (Vidussi et al., 2001). Il y a donc bien ici encore deux niveaux trophiques distincts : un site OLIGOTROPHE,
IV.
OLIGOTROPHE,
le site DYF, et un site
ULTRA-
le site MIO.
VARIATIONS
DES PARAMETRES PHOTOSYNTHETIQUES LIEES AUX
REGIMES TROPHIQUES
A. AU SITE EUTROPHE UPW B Le taux maximal spécifique de fixation de carbone, Pmax (Figure II-8A) est
relativement homogène sur toute la colonne d’eau avec cependant des valeurs légèrement B plus forte en surface. Les valeurs maximales au site UPW pour Pmax (3 mg C (mg chl a)-1h-
1
) sont équivalentes ou bien moins fortes par rapport à celles obtenues aux autres sites (3.2
et 4.8 mg C (mg chl a)-1h-1 respectivement à MIO et à DYF). Parallèlement à cette répartition
homogène,
αB, l’efficacité photosynthétique
(qui
rend
compte
du
fonctionnement de l’appareil photosynthétique aux faibles éclairements) est relativement constante sur toute la colonne d’eau (Figure II-8B). C’est la structure hydrologique du site UPW qui, résultant d’un mouvement ascendant de la masse d’eau, entraîne des conditions relativement homogènes sur toute la colonne et donc l’homogénéité des valeurs de αB. Malgré cette structure hydrologique caractéristique, on constate cependant que la biomasse phytoplanctonique est surtout présente en surface (Figure II-6) et y induit la consommation des sels nutritifs (Figure II-5A et 5B). Ce signe d’une forte activité physiologique est confirmé par la légère augmentation de la teneur en NPP dans les eaux très proches de la surface (Figure II-9A), indiquant que malgré le régime hydrologique, le phytoplancton a néanmoins le temps de réaliser une légère photoacclimatation (Lewis et al., 1984),
- 76 -
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
E K (µ m o l q u a n ta m -2 s -1 )
In d ic e N P P 0 .1
0 .2
0 .3
0 .4
0
0 .5 0
20
20
40
40
P ro fo n d e u r e n m
P ro fo n d e u r e n m
0 .0 0
60 80 100 120
A
100
200
300
60 80 100 120 140
140 UPW M IO DYF
160 180
160
B
180 200
200
Figure II-9. Photoacclimatation aux trois sites visités lors de la campagne, UPW en vert, MIO en bleu et DYF en rouge. 9A :Répartition de l’indice NPP (pigments photoprotectants) et 9B : paramètre de saturation EK (µmol quanta m-2s-1)
Fv / Fm 0 .0
0 .1
0 .2
0 .3
0 .4
0 .5
0 .6
0 20 40
Profondeur en m
60 TOULON
DYF
80
9 8 3
100
1
4 7
2 5
6
MIO
UPW
120
AGADIR
140 160 180
U PW M IO DYF
200
Figure II-10. Efficacité photochimique du PS2, Fv/Fm (sans dimensions) aux trois sites visités lors de la campagne, UPW en vert, MIO en bleu et DYF en rouge
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
confirmée par les valeurs de EK observées en surface qui sont supérieures à celles observées au fond (Figure II-9B). Les profils de φCmax et de φ CPSmax donnent plusieurs informations sur le mode de fonctionnement du phytoplancton à ce site. Juste sous la surface, le rendement quantique de fixation de carbone est légèrement plus faible que pour l’échantillon suivant (Figure II8C et 8D). Ceci est vraisemblablement dû à un phénomène de photoinhibition (Long et al., 1994; Olaizola et Yamamoto, 1994), ou bien à la présence d’une proportion légèrement plus forte de pigments photoprotectants (Figure II-9A). Le phytoplancton suivant le mouvement vertical lié à la structure de l’upwelling, est acclimaté à un éclairement plus modéré que celui existant à la surface. Il est également possible que les concentrations en nitrates et phosphates devenant à cette profondeur plus faibles, puissent entraîner une diminution des rendements quantiques de fixation de carbone (Kolber et al., 1988; Cleveland et al., 1989; Falkowski et al., 1992; Vassiliev et al., 1994), malgré le fait que ces nutriments restent détectables. En dessous de ce premier échantillon, les valeurs de φCmax et de φ CPSmax étaient élevées, indiquant une très grande efficacité photosynthétique de la communauté phytoplanctonique (au dessus de 30 m, Figure II-8C et 8D). Dans ces eaux de sub-surface, les sels nutritifs sont abondants ce qui explique ces fortes valeurs des rendements quantiques de fixation de carbone (Welschmeyer et Lorenzen, 1981; Cleveland et Perry, 1987; Kolber et al., 1988; Herzig et Falkowski, 1989; Chalup et Laws, 1990; Babin et al., 1996). Ceci est d’ailleurs confirmé par les fortes valeurs de l’efficacité photochimique du PS2, Fv/Fm (Figure II-10), avec pour les échantillons considérés des valeurs supérieures à 0.5, indiquant que le phytoplancton n’était pas limité par les sels nutritifs (Kolber et al., 1988). En dessous de 30 m de profondeur, les valeurs de φCmax et de φ CPSmax étaient beaucoup plus faibles (Figure II-8C et 8D). Le rendement de la photosynthèse était donc plus faible que plus en surface, et ce malgré l’abondance des sels nutritifs à ces profondeurs. Ceci s’explique par l’augmentation de l’absorption spécifique de la surface vers les couches profondes (Figure II-11A). Ceci est lié à la diminution de la teneur en chlorophylle a vers le fond, mais aussi à l’augmentation de la proportion de phaeopigments
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Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
0.09
A
absorption spécifique (m2(mg chl a)-1)
0.08 2m 5m 10 m 20 m 30 m 40 m 50 m 60 m
0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
longueur d'onde (nm)
absorption phytoplanctonique (m-1)
0.12
B
2m 5m 10 m 20 m 30 m 40 m 50 m 60 m
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00 350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
longueur d'onde (nm)
Figure II-11. Absorption au site UPW ; 11A : spectres d’absorption spécifique (m²(mg chl a)-1), à différentes profondeurs 11B : spectres d’absorption du phytoplancton avant normalisation par la quantité de chlorophylle a à différentes profondeurs.
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
(Figure II-11B et II-12). Les spectres de l’absorption phytoplanctonique (avant normalisation, Figure II-11B) montrent en effet aux plus grandes profondeurs, un épaulement vers 415 nm, caractéristique des produits dégradés de la chlorophylle qui participent à l’absorption, mais ne transmettent pas l’énergie lumineuse à l’appareil photosynthétique (Jeffrey et al., 1997). Leur contribution croissante à l’absorption vers le fond contribue donc à la diminution du rendement quantique de fixation de carbone. Les effets de la contribution à l’absorption de pigments ne transmettant pas l’énergie lumineuse à l’appareil photosynthétique a déjà été observé pour des caroténoïdes sur des cultures, entraînant de même une diminution du rendement quantique de fixation de carbone (Geider et al., 1998). B. AU SITE OLIGOTROPHE DYF Les valeurs de l’efficacité photochimique du PS2 indiquent que la communauté phytoplanctonique était limitée par l’absence des sels nutritifs, avec des valeurs maximales de Fv/Fm autour de 0.3 (Figure II-10) (Kolber et al., 1988). Le taux maximal spécifique de B fixation de carbone Pmax , (Figure II-8A) mesuré au site DYF est pourtant le plus fort des
trois sites visités (4.8 mg C (mg chl a)-1h-1 en surface) indiquant une forte efficacité de la photosynthèse aux fortes lumières par unité de TChl a. Le profil de l’efficacité photosynthétique αB (Figure II-8B) montre une augmentation marquée en profondeur traduisant la forte photoacclimatation du phytoplancton. Ceci est confirmé par le profil de pigments non-photosynthétiques (Figure II-9A), dont l’abondance diminue avec la profondeur, et par celui du paramètre de saturation EK (Figure II-9B) qui présente lui aussi des valeurs plus élevées en surface, indiquant que les différentes populations sont bien acclimatées aux conditions de lumière auxquelles elles sont soumises (Sakshaug et al., 1997…). L’influence de l’absence de sels nutritifs dans la couche de surface se fait néanmoins largement sentir. En effet, les rendements quantiques maximaux de fixation de carbone (φCmax et φ CPSmax , Figure II-8C et 8D) restent faible tant que la couche d’eau reste épuisée en nutriments et augmentent en dessous de la phosphacline (vers 40 m, Figure II5A) (Welschmeyer et Lorenzen, 1981; Cleveland et Perry, 1987; Kolber et al., 1988; Herzig et Falkowski, 1989; Chalup et Laws, 1990; Babin et al., 1996). Ces résultats sont en accord avec ceux trouvés sur des cultures phytoplanctoniques pour lesquels le rendement
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Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
[T C h l a ] (m g m 0
1
2
-3
)
3
4
[ p h e o p h o rb id e s ] / [ T C h l a ] (s a n s u n ité ) 0 .0 0
0 .0 5
0 .1 0
0 .1 5
0 .2 0
0 .2 5
0
P ro fo n d e u r e n m
20 40 60 80 100 120 [ p h e o ] /[ T c h l a ] [T ch l a ]
140
Figure II-12. Contribution des phaeopigments à la chlorophylle a totale au site UPW. Concentration en chlorophylle a totale en vert, et contribution de la phaeophorbide en marron, aux différentes profondeurs.
[ div-chl a] (mg m-3) 0.00 0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
20 40 TOULON
DYF
Profondeur en m
60
9 8 3
80
1
4 7
2 5
6
MIO
UPW
100
AGADIR
120 140 160 180
UPW MIO DYF
200
Figure II-13. Contribution des Prochlorophytes à la biomasse aux 3 sites visités lors de la campagne : Concentration en div-chl a (mg m-3) à UPW (en vert), à MIO (en bleu) et à DYF (en rouge).
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
quantique de fixation de carbone était également plus faible pour une culture limitée en phosphate (Geider et al., 1998). Mais 40 m, c’est aussi la profondeur à laquelle les populations phytoplanctoniques changent : au dessus vers la surface, la majorité de la communauté est représentée par du picophytoplancton (Figure II-7C), sans doute des cyanobactéries en surface (il n’y a pas de div-chl a en surface, Figure II-13) et une population de Prochlorococcus autour de 40m. En dessous de 40m, la majorité de la communauté est représentée par du nanophytoplancton (et un peu de microphytoplancton) (Figure II-7C). Ici, la répartition des paramètres photosynthétiques indique que les deux populations superposées l’une sur l’autre, fonctionnent selon deux modes différents : 1/ La population de surface s’acclimate à la grande quantité de lumière en augmentant sa proportion de NPP (Figure II-9A). Elle est bien adaptée au niveau lumineux (voir les valeurs de EK, Figure II-9B), mais se trouve dans une couche dépourvue de sels nutritifs (Figure II-4A et 4B), ce qui se ressent sur les valeurs de son rendement quantique de fixation de carbone (Figure II-8C et 8D, Herzig et Falkowski, 1989; Olaizola et Yamamoto, 1994; Vassiliev et al., 1994). Pourtant, le taux maximal spécifique de fixation de carbone est très fort (Figure II-8A), indiquant que la population n’a pas de difficulté à se développer et qu’elle fonctionne bien à ces fortes lumières. 2/ En dessous, la population phytoplanctonique n’est plus affectée ni par l’absence de sels nutritifs, ni par la forte intensité lumineuse (l’intensité lumineuse devenant d’ailleurs ici le facteur limitant). Ici, le phytoplancton est adapté aux faibles lumières (valeurs de αB élevées, Figure II-8B) ce qui permet de maintenir un φCmax élevé (Figure II-8C,). C. AU SITE ULTRA-OLIGOTROPHE MIO La situation hydrologique du site MIO est assez proche de celle du site DYF, si ce n’est pour l’enfoncement plus prononcé de la nitracline et de la phosphacline. Cependant, certaines différences sont à souligner, en relation avec la limitation en phosphates plus prononcée au site MIO par rapport au site DYF. L’efficacité photosynthétique, αB , ainsi que les rendements quantiques de fixation de carbone, φCmax et φ CPSmax sont plus faibles dans toute la couche de surface appauvries en phosphates au site MIO par rapport au site DYF. Le taux maximal spécifique de fixation de carbone est lui aussi plus faible à MIO qu’à
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Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
DYF au moins pour les échantillons situés dans la couche de surface (la plus appauvrie en phosphates). Ceci confirme les résultats observés sur des cultures, qui présentaient des B et αB plus faibles lors d’une limitation par les phosphates (Geider et valeurs de φCmax, Pmax
al., 1998). Par ailleurs, nous avons le long la colonne d’eau deux populations superposées : en surface, une majorité de nanophytoplancton, et en dessous de 70 m une population de picophytoplancton (avec une population de Prochlorococcus prédominante vers 90 m, Figure II-13). a. Population de surface Pour la population de surface, le taux maximal spécifique de fixation de carbone B ( Pmax , Figure II-8A) est relativement élevé, mais l’efficacité photosynthétique (αB, Figure
II-8B) est très faible, ce qui indique que cette population est adaptée aux fortes intensités lumineuses (en relation avec sa position dans la colonne d’eau). Ceci est confirmé par ailleurs par les valeurs de NPP et de EK très élevées (Figure II-9). Le rendement quantique de fixation de carbone est faible (Figure II-8C et 8D), jusqu’à 50 m de profondeur, et augmente au delà de cette profondeur, soulignant la limitation par les sels nutritifs de la croissance de la population phytoplanctonique (Falkowski et al., 1992; Olaizola et Yamamoto, 1994; Vassiliev et al., 1994). b. Population profonde La population de picophytoplancton présente en dessous de 70 m, montre des valeurs de αB plus élevées qu’en surface, ainsi que pour φCmax, qui indique un meilleur rendement dans l’utilisation de l’énergie lumineuse aux faibles éclairements. Celle-ci étant disponible dans une moindre quantité en profondeur, elle doit être utilisée plus efficacement si la croissance veut être optimale. L’effet de la carence en sels nutritifs se fait par ailleurs moins sentir puisque l’on se rapproche des nutriclines (Chalup et Laws, 1990).
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Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
c. Le rôle des sels nutritifs Sur les profils mesurés lors de la campagne PROSOPE, φCmax augmente avant (vers 50 m) que les concentrations en sels nutritifs augmentent elles-mêmes (vers 90 m et 110 m seulement respectivement pour NO3 et PO4). Cependant, il faut souligner que lors de la mesure des concentrations en sels nutritifs, la nitracline et la phosphacline apparaissent là où les concentrations en nitrates et en phosphates ne sont plus mesurables par les techniques employées. Cependant, entre le niveau 0 réel (0 nM de NO3 et de PO4) et le niveau 0 de la détection, les variations de concentrations peuvent être d’amplitude suffisante pour du phytoplancton parfaitement adapté à l’assimilation de ces substances (Ducobu et al., 1998). Ainsi, des quantités suffisantes de sels nutritifs ont pu apparaître vers 50 m et entraîner ainsi l’augmentation du rendement quantique de fixation de carbone (Welschmeyer et Lorenzen, 1981; Kolber et al., 1988; Cleveland et al., 1989; Long et al., 1994; Geider et al., 1993; Geider et al., 1998). D’autre part, il faut tenir compte d’un fond d’ammonium toujours présent et qui peut servir de source azotée aux différentes communautés phytoplanctoniques. La limitation en phosphates aux deux sites étudiés les plus oligotrophes a pu être clairement mise en évidence par la situation plus profonde de la phosphacline par rapport à la nitracline. Cependant, l’effet de la limitation par les phosphates se fait largement sentir puisque le rendement quantique maximal de fixation de carbone mesuré lors de la campagne est d’autant plus faible que l’on se trouve dans une zone plus carencée en phosphates (de UPW à MIO).
V.
VARIATIONS CIRCADIENNES
Les variations circadiennes de la photosynthèse ont été étudiées selon deux méthodes différentes durant cette campagne. Les paramètres de la fluorescence ont été acquis en continu à l’aide d’un fluorimètre FRR en pompant de l’eau de surface, au travers des bacs à incubation situés sur le pont avant du bateau. En parallèle, ces mêmes paramètres ont été acquis sur des échantillons discrets prélevés à la rosette (un profil toute les 3 heures).
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Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
A
0.8 0.7
Fv/Fm Fv/Fm lissé
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 6000
0.0 PAR
-2 -1 PAR (µmol quanta m s )
Fv / Fm (sans dimensions)
0.9
4000 2000
0 00:00 12:00 00:00 12:00 00:00 12:00 00:00 12:00 00:00 12:00 00:00 Temps (heure)
1600 1400
σPS2 σPS2 lissé
1000 800 600 400 200 6000
0 PAR
-2 -1 PAR (µmol quanta m s )
σPS2 (A²)
1200
B
4000 2000
0 00:00 12:00 00:00 12:00 00:00 12:00 00:00 12:00 00:00 12:00 00:00 Temps (heure)
Figure II-14. Variations circadiennes de la photosynthèse au site DYF. A : PAR (µmol quanta m-2s-1, en jaune) efficacité photochimique du PS2 (Fv/Fm, sans dimensions, en rouge), et efficacité photochimique du PS2 (Fv/Fm, sans dimension, en noir) lissée par une moyenne mobile sur 30 points de mesure. B : : PAR (µmol quanta m-2s-1, en jaune) section efficace du PS2 (σPS2, A², en rouge), et section efficace du PS2 (σPS2, A², en noir) lissée par une moyenne mobile sur 30 points de mesure.
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
A. ACQUISITION EN CONFIGURATION “PONT” Cette configuration a pu être déployée aux deux sites les plus stables hydrologiquement : Le site oligotrophe DYF et le site ultra-oligotrophe MIO. A ces deux sites de fortes variations circadiennes de l’efficacité photochimique du PS2 (Fv/Fm) d’une part, et de la section efficace du PS2 (σPS2 ) d’autre part, ont été observées. Au site DYF (Figure II-14), l’amplitude des variations circadiennes de Fv/Fm était d’un facteur 2 avec des valeurs faibles durant la journée et fortes durant la nuit (Figure II-14A). Les valeurs maximales étaient d’environ 0.6, indiquant que les populations phytoplanctoniques restaient photosynthétiquement efficaces malgré les faibles concentrations en sels nutritifs (mais voir la suite de la discussion). Les variations circadiennes de σPS2 (Figure II-14B) étaient également fortement marquées avec des valeurs plus faibles durant les périodes de jour et une amplitude de variations de 60%. Au site MIO (Figure II-15), des variations circadiennes très importantes des deux paramètres ont également été observées avec des amplitudes de variations plus fortes : un facteur 2.5 pour Fv/Fm et un facteur 1.7 pour σPS2. Les valeurs les plus faibles étaient observées durant la période de jour et les valeurs les plus fortes durant la nuit. Les valeurs maximales de Fv/Fm mesurées au site ultra-oligotrophe MIO étaient légèrement plus faibles qu’à DYF avec seulement 0.5 (contre 0.6 à DYF) soulignant la plus forte limitation par les sels nutritifs (Kolber et al., 1988, mais voir la suite de la discussion). La plus forte amplitude de variations des paramètres étudiés ici au site MIO par rapport au site DYF peut s’expliquer par la différence d’intensité lumineuse entre les deux sites. En effet, il a été montré au chapitre I que les variations circadiennes de Fv/Fm et de σPS2 étaient liées à un (ou plusieurs) phénomène(s) de photoacclimatation, il est donc logique que l’intensité lumineuse ait une influence sur l’amplitude de ces variations. L’ensoleillement maximum mesuré lors de la campagne au midi solaire était d’environ 1300 µmol quanta m-2s-1 au site DYF et de 1650 µmol quanta m-2s-1 au site MIO (notons que ces valeurs d’intensité lumineuse sont celles ayant été déterminées par le capteur PAR fixé sur le mat Météo à l’avant du navire et non par le capteur PAR du Fastracka). Cette différence d’illumination peut expliquer les différences d’amplitude observées aux deux sites. Il est peu probable qu’il pourrait également y avoir un effet de la durée du jour, celleci ayant été très proche aux deux sites (11h30 à DYF et 12h30 à MIO). Cette très forte
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Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
0.6
A
Fv/Fm Fv/Fm lissé
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 6000
0.0 PAR
4000
PAR (µmol quanta m-2s-1)
Fv / Fm (sans dimensions)
0.7
2000 0 00:00 12:00 00:00 12:00 00:00 12:00 00:00 12:00 00:00 12:00 00:00 Temps (heure) 2500 σPS2 lissé
1500 1000 500 6000
0 PAR
4000
-2 -1 PAR (µmol quanta m s )
σPS2 (A²)
2000
σPS2
B
2000 0 00:00 12:00 00:00 12:00 00:00 12:00 00:00 12:00 00:00 12:00 00:00 Temps (heure)
Figure II-15. Variations circadiennes de la photosynthèse au site MIO. A : PAR (µmol quanta m-2s-1, en jaune) efficacité photochimique du PS2 (Fv/Fm, sans dimensions, en rouge), et efficacité photochimique du PS2 (Fv/Fm, sans dimension, en noir) lissée par une moyenne mobile sur 30 points de mesure. B : : PAR (µmol quanta m-2s-1, en jaune) section efficace du PS2 (σPS2, A², en rouge), et section efficace du PS2 (σPS2, A², en noir) lissée par une moyenne mobile sur 30 points de mesure.
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
intensité lumineuse explique aussi au moins en partie la forte différence d’amplitude dans les variations de Fv/Fm et σPS2 entre l’étude faite en culture (Emax = 970 µmol quanta m-2s-1, chapitre I) et le milieu naturel. La différence entre les plus faibles valeurs (observées la nuit) dans la culture (~ 0.5) et dans le milieu naturel (~ 0.3) peut être expliquée quant à elle par l’oligotrophie du milieu naturel alors que la culture était clairement caractérisée par des conditions eutrophes. Quel(s) est (sont) les phénomènes responsables des ces variations circadiennes ? Les variations circadiennes de φFo et φFm déterminées aux sites DYF et MIO, étaient bien marquées avec une amplitude de ces variations de l’ordre d’un facteur 2 à DYF et 2.5 à MIO (Figure II-16 et II-17). Ceci correspond à ce qui avait été observé durant les expériences en culture (Chapitre I) pendant lesquelles l’amplitude des variations de φFo et
φFm était également élevée (un facteur 2). La différence principale se situe par contre au niveau de Fv/Fm qui montre ici une amplitude de variation bien plus forte que celle qui avait été observée lors des expériences décrites au Chapitre I (un facteur 2 ici contre 20 %). La différence dans l’amplitude des variations de φFo et φFm d’une part et de Fv/Fm et
σPS2 d’autre part, n’est pas significative (entre les deux sites étudiés), alors qu’elle était important lors de l’étude menée en culture. Aussi, en reprenant les conclusions faites au chapitre I, il semblerait qu’un seul phénomène de quenching non-photochimique soit impliqué dans les variations circadiennes de la photosynthèse observées dans le milieu naturel lors de cette campagne. Ce quenching non-photochimique influencerait donc de manière similaire chacun des paramètres étudiés. Quel pourrait être le phénomène de quenching non-photochimique impliqué ? • Contrairement à ce qui a été observé lors de l’expérience PROMOLEC, ici, les variations circadiennes de σPS2 s’étendent sur plus de 50%. Ceci est incompatible avec le seul effet d’un quenching non-photochimique lié aux états de transition (Allen, 1992; Falkowski et Raven, 1997).
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16
Fo Fm F m lissé F o lissé
14 12 10 8 6 4 2 0
6000 PAR 4000 2000 0
0 0 :0 0 1 2 :0 0 0 0 :0 0 1 2 :0 0 0 0 :0 0 1 2 :0 0 0 0 :0 0 1 2 :0 0 0 0 :0 0 1 2 :0 0 0 0 :0 0
P A R(µ m o l q u an ta-2sm-1)
ren d e m en ts d e flu o re sce n c e
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
T e m p s (h eu re )
Figure II-16. Variations circadiennes de la photosynthèse au site DYF. PAR (µmol quanta m-2s-1, en jaune), Taux minimum de fluorescence (Fo,, en bleu et lissé par un moyenne mobile sur 40 valeurs), Taux maximal de fluorescence (Fm ; en rouge et lissé par une moyenne mobile sur 40 valeurs).fluorescence (Fm ; en rouge et lissé par une moyenne mobile sur 40 valeurs).
Fo Fo lissé Fm Fm lissé
600 500 400 300 200 100 0
6000 PAR
4000 0
00:00
12:00
00:00
12:00
00:00
12:00
00:00
12:00
00:00
12:00
-2 -1
2000
PAR (µmol quanta m s )
rendements de fluorescence
700
00:00
Temps (heure)
Figure II-17. Variations circadiennes de la photosynthèse au site MIO. PAR (µmol quanta m-2s-1, en jaune), Taux minimum de fluorescence (Fo,, en bleu et lissé par un moyenne mobile sur 40 valeurs), Taux maximal de fluorescence (Fm ; en rouge et lissé par une moyenne mobile sur 40 valeurs).
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
• Les rendements quantiques minimum et maximum de fluorescence variant de plus avec la même amplitude que la section efficace et l’efficacité photochimique du PS2, il n’est pas non plus envisageable qu’il s’agisse d’une substitution métallique dans la molécule de chlorophylle, puisque ce phénomène n’influencerait que φFo et φFm. • Un des phénomènes maintenant bien identifié dans le milieu naturel permettant la dissipation de l’énergie excédentaire au niveau de l’antenne du PS2 par les populations phytoplanctoniques exposées à une forte intensité lumineuse, est le cycle des xanthophylles (Demmig-Adams, 1990; Demmig-Adams et Adams, 1992 et 1993). Ce cycle met en jeu chez les eucaryotes (sauf chez les chlorophytes) deux caroténoides : la diatoxanthine et la diadinoxanthine (Demmig-Adams et Adams, 1993; Olaizola et Yamamoto, 1994). Dans le cadre de ce quenching non-photochimique, l’équilibre entre les concentrations de ces deux pigments intervient à l’échelle de la minute (Hervé Claustre, comm. pers.), aussi étant donné la fréquence des prélèvements ayant donné lieu aux analyses HPLC (6 heures), il n’est pas possible de mettre en évidence un cycle dans les concentrations de ces deux caroténoides. Cependant, leur présence (la somme des deux) dans les eaux de surface aux deux sites MIO et DYF est un bon indice permettant d’envisager cette hypothèse. De plus, la proportion de picoeucaryotes - classes phytoplanctoniques contenant ces caroténoides (Jeffrey et al., 1997) – est différente aux deux sites étudiés. Elle est de 50% de la biomasse au site ultra-oligotrophe MIO et de 33% environ au site oligotrophe DYF. Cette proportion plus forte au site MIO, pourrait expliquer un plus fort impact du quenching nonphotochimique sur les valeurs de Fv/Fm et σPS2, et ainsi expliquer la plus forte amplitude de leurs variations à ce site d’étude. La différence la plus notable pourtant entre ces variations circadiennes de la photosynthèse dans le milieu naturel et celles décrites au Chapitre I, est la nette symétrie du signal observée ici, que ce soit au site DYF ou bien à MIO. Les valeurs de Fv/Fm comme de σPS2 chutent très brutalement lorsque PAR augmente, et elles ré-augmentent dès que PAR diminue. Pour le travail effectué sur Prochlorococcus le rôle du cycle cellulaire dans les variations circadiennes de la photosynthèse a été clairement identifié (Chapitre I et Bruyant, en préparation). Or la mise en évidence de celui-ci avait été rendue possible par l’asymétrie des signaux des différents paramètres lors de la diminution de PAR et dans la nuit. Aussi ici, il semblerait que l’effet du cycle cellulaire ne puisse pas être mis en
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Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
évidence. Cependant, l’existence d’un effet de la division cellulaire dans le milieu naturel ne peut pas être totalement éliminé et ce pour deux raisons : • La première est la différence d’intensité lumineuse entre l’expérience en culture (970 µmol quanta m-2s-1) et la présente étude dans le milieu naturel (1300 µmol quanta m2 -1
s
à DYF et 1650 µmol quanta m-2s-1 à MIO). De telles différences induisent des
phénomènes de photoacclimatation plus intenses qui peuvent masquer l’effet du cycle cellulaire par leur plus forte amplitude. • La deuxième est que la population phytoplanctonique présente dans ce cas est composite, comprenant en surface une proportion variable de Synechococcus et de picoeucaryotes. Même si les populations phytoplanctoniques de surface présentaient elles aussi la particularité d’être synchronisées dans leur division cellulaire, elles n’étaient vraisemblablement pas synchrones entre elles. Ceci a donc pu conduire à une dilution des signaux, et cacher l’effet du cycle cellulaire sur les paramètres étudiés alors qu’il était très visible dans une situation ultra-simplifiée comme une culture. B. LES PROFILS D’ECHANTILLONS DISCRETS Les mesures des paramètres de fluorescence faites sur les échantillons discrets prélevés à la rosette par la technique de fluorescence à amplitude modulée toutes les trois heures aux sites DYF et MIO n’ont pas montré de variations circadiennes. Le cycle des xanthophylles a été évoqué comme étant le phénomène pouvant être responsable du quenching non-photochimique induisant les variations circadiennes de Fv/Fm. Or ce phénomène est un quenching rapide et le délais imposé entre le prélèvement et la mesure par l’adaptation à l’obscurité dans le cas des analyses réalisées avec le PAM explique que l’on n’ait pas observé ces variations sur les échantillons discrets. Il est important de noter également qu’au site MIO (au moins), les valeurs de fluorescence mesurées en surface étaient proches de la limite de détection du fait de la faible concentration en chlorophylle a en surface (0.033 ± 6.36 10-3 mg m-3). Même si l’on écarte les valeurs obtenues en surface sur les profils de Fv/Fm mesurés par le PAM aux trois sites étudiés, les valeurs mesurées par la technique PAM sont bien inférieures à celles mesurées avec le FRR. En effet, la nuit, les valeurs mesurées avec le
- 85 -
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
Fastracka en “configuration pont” remontent jusqu’à des valeurs très élevées qui sont incompatibles avec l’état de limitation dans lequel se trouvent les populations phytoplanctoniques (Kolber et al., 1988). Ceci résulte vraisemblablement d’une surestimation des valeurs de Fv/Fm mesurées avec le Fastracka. En effet dans la technique FRR employée par cet appareil, le taux d’émission minimal de la fluorescence Fo (qui entre dans le calcul de Fv/Fm) n’est pas mesuré, mais estimé. Cette estimation dépend de plus largement des paramètres d’entrée imposés au logiciel de traitement des données. Une surestimation de Fv/Fm a donc pu avoir lieu lors de ce traitement. Par contre la comparaison des données entre les deux MIO et DYF (relativement l’un par rapport à l’autre) reste correct puisque le traitement appliqué aux deux sites a été le même.
◊ CONCLUSIONS 9 Il fallait mener une investigation dans des sites océaniques couvrant une large gamme de conditions trophiques. Cet objectif de la campagne PROSOPE a été pleinement atteint, puisque trois sites dont les conditions trophiques étaient très contrastées ont pu être étudiés. Le site de l’upwelling du Maroc, présentait des conditions typiquement eutrophes en accord avec le caractère permanent de ce système et sa puissance particulière à la fin de l’été (Minas et al., 1982; Nykjaer et VanCamp, 1994). Pourtant, les valeurs mesurées de biomasse n’ont pas atteint les 20 mg chl a m-3 mesurés par le capteur satellital CZCS (VanCamp et al., 1991). Cependant, la production primaire calculée par le modèle de Morel et al. (1996) est très élevée (1.42 g C m-2 j-1). Les deux sites étudiés en Méditerranée ont permis de confirmer plusieurs tendances déjà observées sur ses caractéristiques trophiques. Une plus forte oligotrophie dans la partie orientale de la Méditerranée a pu entre autre être mise en évidence (Sournia, 1973; Yacobi et al., 1995; Turley et al., 2000) (site MIO) par rapport à la partie occidentale (site DYF) ; avec notamment des nutriclines plus profondes associées à une biomasse plus faible, dont la croissance serait limitée par l’absence de phosphates (Krom et al., 1991; Zohary et Robarts, 1998). Cette plus forte oligotrophie est d’ailleurs confirmée par les plus faibles valeurs de production primaire calculées grâce au modèle de Morel et al. (1996) au site MIO (127 mg C m-2 j-1) par rapport au site DYF (252 mg C m-2 j-1). Ces différences dans les valeurs de production primaire sont d’ailleurs également en accord avec ce qui a été mesuré lors de la campagne océanographique - 86 -
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
MINOS (Juin 1996, Moutin et Raimbault, 2002), bien que les valeurs obtenues lors de la campagne PROSOPE soient globalement plus faibles, ce qui peut s’expliquer par la différence de période d’échantillonnage (en Septembre dans la cas présent et en Juin dans le cas de la campagne MINOS). 9 Quelles conséquences sur la photosynthèse ? Les différences observées dans les caractéristiques trophiques des trois sites étudiés se retrouvent aussi dans le rendement de la photosynthèse. Le point le plus important relevé lors de cette étude est l’influence de la carence en phosphates sur le rendement quantique de fixation de carbone. Ainsi, il a pu être mis en évidence que φCmax diminue du site le plus riche en phosphate (UPW) au site le plus carencé en phosphate (MIO). Le rôle des sels nutritifs a de plus été confirmé sur le profil à un même site, avec des valeurs de φCmax plus forte en profondeur, là où les nutriments sont de nouveaux présents. Les valeurs mesurées en surface de la section efficace d’absorption effective du PS2, σPS2, aux deux sites les plus carencés en sels nutritifs, ont de plus confirmé l’effet d’une limitation par les phosphates sur la photosynthèse, avec des valeurs plus fortes à MIO par rapport à DYF. Les résultats obtenus lors de cette campagne dans le milieu naturel confirment ce qui avait été précédemment observé en culture : σPS2 augmente en parallèle à la limitation phosphatée augmente (Geider et al., 1998). Aux deux sites méditerranéens DYF et MIO, la superposition verticale des deux populations phytoplanctoniques a systématiquement été observée sur les profils étudiés. Une population de surface bien adaptée aux fortes lumière a pu être observée au dessus d’une population vivant plus en profondeur et adaptée à des niveaux lumineux moins élevés. Malgré les limitations par les sels nutritifs, ces caractéristiques des différentes populations présentes permettent une production primaire non négligeable. Si l’on prend l’exemple du site ultra-oligotrophe MIO, le rapport de biomasse intégrée totale entre UPW et MIO est d’un facteur 10. Or un facteur 10 a également été observé entre les productions primaires calculées (127 mgC m-2j-1 et 1.42 g Cm-2j-1) ; ce qui confirme l’efficacité de la fixation de carbone y compris au site le plus pauvre. En un sens, il semblerait donc que l’absence de phosphates limite l’abondance de la biomasse, mais que les populations phytoplanctoniques
présentent
sont
capables
d’adaptations
environnementales leur permettant une forte efficacité photosynthétique. - 87 -
aux
conditions
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
Encart n° 2 : l’approche moléculaire in situ. Lors de cette étude dans le milieu naturel, une approche moléculaire aurait pu être envisagée de même que lors de l’étude en culture afin de déterminer les éventuels contrôles endogènes du processus photosynthétique liés au cycle cellulaire. La principale difficulté d’une telle approche dans le milieu naturel est le manque de matériel. Lors de notre étude en culture (Chapitre I), afin de faire les différentes analyses moléculaire, la quantité de culture filtrée était supérieure à -3
500 mL alors que la concentration en chlorophylle était supérieure à 50 mg m . Dans le milieu -3
naturel, et par exemple au site MIO où la concentration en chlorophylle n’était que de 0.03 mg m , il aurait donc fallu pour obtenir la même quantité de matière phytoplanctonique filtrer plus de 800 L d’eau de mer à chaque échantillon ; ce qui bien sur n’était pas possible vu la fréquence des prélèvements. De nouvelles techniques de marquage par des sondes spécifiques sont en cours de développement et permettent un tri cellulaire selon différents critères à l’aide d’un cytomètre en flux. Lors de la campagne PROSOPE, le cytomètre présent à bord n’était pas configuré pour une telle utilisation, ce type d’analyse n’a donc pas pu être effectué.
Chapitre II : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en Méditerranée : Influence du régime trophique.
Du fait d’un problème de fonctionnement du treuil bathysonde sur le Thalassa, les variations circadiennes de la photosynthèse au site UPW n’ont pas pu être étudiées. Néanmoins, l’étude a fonctionné aux sites MIO et DYF grâce à l’emploi d’un appareil dont la sensibilité était bien adaptée aux faibles biomasses présentes en surface en Méditerranée. Des variations circadiennes très marquées ont été observées aux deux sites avec des amplitudes plus fortes au site le plus oligotrophe. Cette plus forte amplitude semble néanmoins être liée plus à la différence d’intensité lumineuse mesurée qu’à la limitation trophique supplémentaire, d’autant qu’aux deux sites en surface les sels nutritifs étaient absents. Cette influence du PAR, confirme bien qu’il s’agit d’un phénomène de quenching non-photochimique – comme identifié lors de l’expérience en laboratoire (voir chapitre I). Cependant, dans le cas du milieu naturel présenté ici, il existe un argument fort en faveur d’un quenching non-photochimique d’antenne faisant intervenir le cycle des xanthophylles entre diatoxanthine et diadinoxanthine. Il est cependant impossible d’éliminer totalement l’hypothèse de l’influence concomitante d’un quenching impliquant les états de transition. Le point le plus surprenant dans cette étude du milieu naturel est l’apparente absence de l’effet du cycle cellulaire. Cependant, il faut souligner l’absence totale de Prochlorococcus dans les eaux de surface aux deux sites DYF et MIO ainsi que le caractère composite de la population phytoplanctonique. Il est très probable que les effets du cycle cellulaire aient été masqués par une dilution du signal, les différentes espèces se divisant indifféremment à tout moment de la journée (voir encart n°2). Au cours de ce chapitre, les variations circadiennes de la photosynthèse ont pu être étudiées ainsi que l’interaction de certains des paramètres environnementaux qui en contrôlent les rendements. Une partie de la complexité du phénomène a pu être mise en évidence et pourtant, cette étude a été menée dans des milieux hydrologiquement stables. Au cours du dernier chapitre, l’étude sera poursuivie en envisageant en plus les phénomènes physiques liés à la circulation des masses d’eau, en travaillant cette fois dans une zone hydrologiquement perturbée : le système frontal de la mer d’Alboran.
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Chapitre III Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : Influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
Sommaire du Chapitre III ◊
Introduction ________________________________________________________91
◊
Matériels et méthodes ________________________________________________93 I.
II.
La stratégie d’échantillonnage ____________________________________________ 94 A.
Leg 1 ______________________________________________________________________ 94
B.
Leg 2 ______________________________________________________________________ 95
Couche de mélange et couche euphotique ___________________________________ 96
III. Mesure des concentrations en sels nutritifs__________________________________ 96 IV. Analyses pigmentaires___________________________________________________ 96 V.
Détermination de l’absorption spécifique ___________________________________ 97
VI. Paramètres de la courbe P vs. E ___________________________________________ 97
◊
Résultats ___________________________________________________________98 I.
Structures hydrologiques et statuts trophiques ______________________________ 98
II.
Répartition des communautés phytoplanctoniques __________________________ 100
III. Répartition des paramètres photosynthétiques _____________________________ 101 IV. Variabilité circadienne des paramètres photosynthétiques____________________ 103
◊
Discussion ________________________________________________________104 I.
Structures et caractéristiques physiques des différentes masses d’eau __________ 104
II.
Effets de la photoacclimatation et de la disponibilité en nitrates sur les paramètres
photosynthétiques dans les eaux méditerranéennes et dans le tourbillon atlantique ___ 106 III. Variations des paramètres photosynthétiques dans la zone frontale et processus physiques associés__________________________________________________________ 109 IV. Variations circadiennes de la photosynthèse________________________________ 112
◊
Conclusion ________________________________________________________113
Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
◊ INTRODUCTION Dans les deux précédents chapitres, les variations circadiennes et spatiales des paramètres de la photosynthèse ont été examinées dans des systèmes “simples” (cultures ou bien populations naturelles situées dans des systèmes océaniques hydrologiquement stationaire) dont les conditions étaient celles de systèmes typiques. De nombreuses études réalisées dans le milieu naturel ont déjà documenté assez largement les tendances de ces variations dans de tels systèmes (i.e. des systèmes où la dynamique de la couche mélangée, l’atténuation verticale de la lumière et l’abondance en nutriments déterminent les variations des paramètres photosynthétiques (Mallin et Paerl, 1992, Gervais et al., 1997 Dusenberry et al., 2000 et 2001). Par exemple, Babin et al. (1996) ont décrit et analysé la distribution verticale des propriétés photosynthétiques du phytoplancton dans des systèmes typiquement eutrophe, mésotrophe et oligotrophe dans l’océan Atlantique tropical. Ils ont quantifié l’impact respectif de la disponibilité en nutriments et des pigments nonphotosynthétiques sur le rendement quantique de fixation de carbone et ont souligné le rôle du rapport entre l’épaisseur de la couche mélangée et la profondeur de la couche euphotique. Certaines études ont également décrit ces variations de la photosynthèse à des échelles plus globales. Longhurst et al. (1995) ont proposé un découpage de l’océan mondial en provinces biogéographiques auxquelles ils ont attribué différents jeux de paramètres photosynthétiques représentatifs des conditions locales. Behrenfeld et Falkowski (1997), en se basant sur un très grand nombre de données, ont développé une paramétrisation du profil vertical du taux de fixation de carbone et ont établi des relations empiriques entre leurs paramètres, et la lumière et la température. De telles paramètrisations des propriétés photosynthétiques phytoplanctoniques sont supposées être robustes à grande échelle lorsque les systèmes océaniques considérés sont stables et lorsque la structure verticale de la couche supérieure de l’océan est principalement gouvernée par la dynamique de la couche mélangée. Dans les systèmes à méso-échelle comme les fronts où de très complexes schémas de circulation se développent, la variabilité des propriétés photosynthétiques du phytoplancton est nettement moins bien représentée par les paramétrisations à grande échelle. Par exemple, Johnson, et al., in press n’ont pas réussi à mettre en évidence un lien clair entre les propriétés photosynthétiques,
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
les nitrates et la profondeur de la couche mélangée en mer d’Arabie qui est caractérisée par des processus hydrodynamiques complexes. Les systèmes frontaux sont très souvent caractérisés par des biomasses phytoplanctoniques plus élevées ainsi que de plus fortes production primaires (e.g. (Pingree et al., 1975; Simpson et al., 1982; Bouchet et al., 1987; Traganza et al., 1987; Franks, 1992; Claustre et al., 1994b) en comparaison aux eaux adjacentes. De plus, même si la contribution des systèmes frontaux à la fixation de carbone globale est faible (du fait de leur faible étendue dans l’océan mondial), cette fixation de carbone peut contribuer significativement à la production nouvelle localement (Sournia et al., 1990), mais aussi à plus large échelle (Lohrenz et al., 1988). Plusieurs études ont déjà tenté de faire une estimation de la production nouvelle à partir des données satellitales de couleur de l’océan (Sathyendranath et al., 1991) et de profondeur de la thermocline (Turk et al., 2001), mais ces études ne sont sensibles qu’à de large échelles d’espace. Dans l’optique de la modélisation de la production primaire à l’échelle globale, il serait nécessaire d’être en mesure de considérer l’impact des zones frontales au moins à l’échelle des bassins océaniques de taille modérée. Cela passe par la compréhension de la variabilité des propriétés photosynthétiques du phytoplancton dans ces systèmes hydrologiquement complexes. Dans ce dernier chapitre, je me suis penchée sur l’étude d’un système hydrologiquement très complexe et perturbé : le front géostrophique de la mer d’Alboran. Situé à environ 280 km à l’est d’Algéciras, le front géostrophique de la mer d’Alboran est engendré par l’entrée d’un jet34 d’eau atlantique en mer Méditerranée par le détroit de Gibraltar (Prieur et Sournia, 1994). La circulation géostrophique de tels jets dans les systèmes océaniques entraîne par la force des choses le contact entre des masses d’eau de propriétés différentes et ce dans une zone relativement limitée en surface (par rapport à l’échelle océanique). Dans le cas présent, la circulation du jet d’eau atlantique entraîne la formation de deux tourbillons anticycloniques dans les parties est et ouest de la mer d’Alboran (LaViolette, 1988; Tintoré et al., 1988; LaViolette, 1989). Par ailleurs, la circulation principale (dite primaire) des systèmes frontaux océaniques provoquée par 34
Langue d’eau étroite présentant un fort courant d’ouest en est constituée ici d’eau d’origine atlantique.
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
l’écoulement d’un jet, n’est pas toujours strictement géostrophique. En conséquence, une circulation secondaire se met en place sous la forme de mouvements
verticaux et
horizontaux (Bower et Rossby, 1989; Arnone et al., 1990; Dewey et al., 1991; Tintoré et al., 1991). Les mouvements verticaux dus à cette circulation secondaire provoquent une redistribution des caractéristiques physiques des masses d’eau au niveau des zones de contact. C’est la complexité de la circulation au niveau des zones frontales qui rend l’étude de l’influence sur la biologie des forçages physiques nécessaire, d’autant plus que les zones frontales présentent des phénomènes physiques dont l’échelle temporelle– suffisamment réduite – coïncide avec celle des phénomènes biologiques (Sournia et al., 1990, Fogg, 1991). Des précautions particulières doivent donc être prises lors des études menées dans ces zones afin de respecter, dans le pas d’échantillonnage, les échelles des différents phénomènes représentés dans la zone frontale. Mon propos lors de l’étude de ce système frontal a été de déterminer dans quelle mesure la physique forçait la photosynthèse et ainsi de répondre aux questions suivantes : 1/ Comment l’appareil photosynthétique réagit-il aux différents phénomènes hydrodynamiques d’un front ? 2/ En retour, est-ce que la distribution des paramètres photosynthétiques dans de tels systèmes fournit des indices originaux sur les processus hydrodynamiques ? Pour cela j’ai considéré le caractère non-conservatifs des paramètres photosynthétiques et l’information qu’ils véhiculent sur le passé lumineux des masses d’eau (Steeman-Nielsen et Hansen, 1959; Marra, 1978 et 1980; Falkowski, 1980 et 1983; Lewis et al., 1984…).
◊ MATERIELS ET METHODES Les données qui seront présentées dans ce chapitre ont été récoltées lors de la campagne océanographique ALMOFRONT 2 (30 novembre 1997 – 18 janvier 1998) qui a eu lieu dans la partie est de la mer d’Alboran (à l’ouest de la mer Méditerranée) à bord du navire océanographique l’Atalante. Cette campagne coordonnée par Louis Prieur faisait partie du programme de recherche JGOFS France, et plus particulièrement des activités du groupe “frontal”.
- 93 -
Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
A Cartagene
Almeria
Espagne Gibraltar
Tanger
Oran
Tres Forcas
Maroc
B
Figure III-1. A. Localisation de la zone d’étude couverte lors de la campagne ALMOFRONT 2. B. Schéma simplifié de la circulation dans la mer d’Alboran. WAG : Western Anticyclonic Gyre, EAG ; Eastern Anticyclonic Gyre. Figure 1B extraite de Baldacci et al. (2001)
Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
I.
LA STRATEGIE D’ECHANTILLONNAGE
Durant cette campagne, l’échantillonnage a été réalisé selon deux stratégies différentes, appliquées lors de chacun des deux legs successifs de la campagne. A. LEG 1 Pendant le premier Leg (30 novembre – 21 décembre), la zone d’étude (de Cartagène en Espagne au Cap Tres Forca en Algérie, Figure III-1) a, dans un premier temps, été couverte à plusieurs reprises par le navire de manière à déterminer et localiser précisément ses caractéristiques physiques et hydrologiques. Pour ce faire, les ADCP35 (300 et 75 kHz) du navire ont été utilisés afin de déterminer la direction et l’intensité des courants marins à 20 m de profondeur. La position du jet d’eau atlantique entrant en Méditerranée par le détroit de Gibraltar ainsi que celles des autres courants de la zone d’étude ont ainsi pu être déterminées. Des sections transversales de la zone d’étude ont également été explorées en utilisant un dispositif spécial surnommé : To-Wyo. Ce système constitué d’une armature métallique accrochée à un câble électroporteur, dans laquelle étaient fixés une bathysonde (Sea-bird electronics Inc., SBE911+) ainsi qu’un fluorimètre (Chelsea Instr., Aquatracka) et un transmissiomètre (Sea-Tech Inc., 25 cm). Déployé à partir du portique arrière à l’aide d’un treuil spécial, ce système était tracté derrière le navire faisant route à 5 nœuds tout en effectuant des profils verticaux entre 0 et 400 m de profondeur à une vitesse verticale de 30 m min-1. Ce mode d’investigation permettait de visualiser en temps réel et de manière quasi-synoptique la distribution en deux dimensions des principaux paramètres physiques (température, conductivité, teneur en oxygène), ainsi que de la concentration en chlorophylle a et la charge en particules. Des sections au travers de la zone d’étude ont également été explorées à l’aide d’un autre dispositif, le SHET36, déployé entre 0 et 200 m. Le SHET est construit sur le même principe que le To-Wyo, mais permet en plus de remonter de l’eau de mer en continu à l’aide d’un système de pompage. Des échantillons d’eau de mer prélevés in situ étaient ainsi continuellement distribués dans les différents laboratoires du navire permettant des analyses instantanées 35 36
ADCP : Acoustic Doppler Current Profiler. SHET : Système HydroElectrique Tracté.
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
38°N
38°N
B
A Cart agen a
C de Pa los
C de Pa los
Cart agen a
Espagne
Espagne
37°N
37°N
252
Alm eria
Site 8
Alm eria
253 254
C de Ga ta
255
C de G ata
256
Site 7
Site 2
257 258
Site 4
259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270
36°N
Site 5
Site 3 Site 6
36°N Site 1
271 272 273
C Tres Forca
Oran
274
Oran C Tre s Forc a
275
Beni-Saf
35°N 3°W
2°W
1°W
Beni-Saf
Algérie 35°N 0°W 3°W
2°W
1°W
Algérie 0°W
Figure III-2. Localisation des stations CTD effectuées durant la campagne ALMOFRONT 2. A : Positionnement des 24 stations de la section trans-frontale étudiée durant le Leg 1. B : Situation des 8 sites de longue durée échantillonnés durant le Leg 2.
Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
incluant la concentration en oxygène, la pression partielle de CO2, les concentrations en sels nutritifs, la fluorescence et la concentration des pigments phytoplanctoniques. La totalité de la zone d’étude a ainsi pu être caractérisée rapidement et précisément sur la tranche des 400 premiers mètres. Dans un deuxième temps, une section trans-frontale allant du nord vers le sud a été échantillonnée en détails (Figure III-2A). Cette section traversait successivement les eaux oligotrophes de la Méditerranée, le jet d’eau atlantique puis le tourbillon anticyclonique est d’eau atlantique modifiée (Figure III-1B et voir la section Résultats pour le détail de la structure hydrologique). Cette section trans-frontale a été parcourue en échantillonnant à 24 stations successives occupées pendant une courte durée. Ces 24 stations étaient plus ou moins distantes les unes des autres de 3 à 6 miles suivant leur localisation sur le transect. La section complète a été couverte en 3 jours (soit environ une station toutes les trois heures). A chaque station, des profils verticaux de la température, de la conductivité ainsi que de la fluorescence et de la charge en particule étaient déterminés lors de la descente de la rosette qui était équipée d’une sonde CTD SBE911+ (Sea-bird Inc.), d’un fluorimètre (Chelsea Instr., Aquatracka) et d’un transmissiomètre (Sea-Tech Inc., 25 cm). Des échantillons discrets d’eau de mer étaient récoltés grâce aux 24 bouteilles Niskin de 12 litres chacune lors de la remontée de la rosette, à des profondeurs choisies entre autre dans la couche euphotique et éventuellement, au niveau du maximum profond de chlorophylle. B. LEG 2 Lors du second Leg (24 décembre 1997-18 Janvier 1998), suite à l’identification et à la caractérisation précise des différentes masses d’eau en présence, une stratégie différente à été adoptée. 8 sites (Figure III-2B) ont été visités successivement pendant 36 heures. Chacun de ces sites était situé dans une masse d’eau différente (ou du moins dans des zones où les conditions hydrologiques et biologiques n’étaient pas les mêmes). A chaque site, une ligne de pièges à sédiment dérivante était déployée (une trappe à 100 m et une à 300 m) et le navire suivait sa course durant les 36 heures suivantes restant ainsi dans la même masse d’eau. Pendant ces stations longues, plusieurs profils étaient effectués chaque jour avec la rosette de la même manière que durant le Leg 1, permettant le prélèvement d’échantillons discrets.
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale. -4 dσ / dz (kg m )
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
-3 Excès de densité (kg m )
26
27
28
29
0 -20
excès de densité dσ / dz
Profondeur en m
-40 -60 -80 -100 -120 -140 -160
Figure III-3. Détermination de la profondeur de la base de la couche de mélange Zm . Ici, pour la station 269 : les cercles blancs indiquent l’excès de densité en fonction de la profondeur. La ligne continue indique le rapport dσθ/dz. La ligne bleue indique la valeur seuil de 0.01.
Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
II.
COUCHE DE MELANGE ET COUCHE EUPHOTIQUE
Pour chaque profil de conductivité et de température, le profil de l’excès de densité
σθ (kg m-3) a été déterminé. La profondeur de la couche de mélange (Zm) a été évaluée à partir du rapport dσθ/dz calculé avec un pas de 1 m. La profondeur de la base de la couche de mélange, Z m , était considérée comme atteinte dès lors que dσθ/dz devenait supérieur à 0.01 kg m-4 sur le profil (Figure III-3). Sur la figure III-3, en exemple, la valeur seuil de 0.01 est atteinte pour z = 84 m (intersection avec la ligne bleue). La profondeur de la couche euphotique, Ze (qui est la profondeur à laquelle subsiste 1 % de la lumière solaire incidente en surface) a été estimée en sa basant sur les données de concentration en chlorophylle a et la paramètrisation de Morel (1988) pour les eaux océaniques.
III.
MESURE DES CONCENTRATIONS EN SELS NUTRITIFS
Le long du transect trans-frontal, les concentrations en nitrates ont été déterminées par Pascal Morin sur des échantillons discrets à l’aide d’un Technicon Autoanalyser® selon la méthode de Tréger et LeCorre (1975).
IV.
ANALYSES PIGMENTAIRES
2.8 litres d’eau de mer étaient filtrés sur des filtres en fibre de verre (Whatman®) GF/F de 25 mm de diamètre. Les concentrations en pigments étaient déterminées à bord ou au laboratoire de Villefranche après extraction dans 3 mL de méthanol 100 %, selon la méthode décrite par Vidussi et al. (1996). Afin de pouvoir comparer les résultats avec ceux présentés dans le chapitre précédent, les mêmes indices pigmentaires ont été utilisés ici. Ainsi, TChl a (Chlorophylle a Totale, mg m-3) sera utilisé comme indicateur de la biomasse phytoplanctonique totale. Il correspond à la somme des concentrations en chlorophylle a, divinyle-chlorophylle a, ainsi que celles des allomères et épimères de la chlorophylle a. Les trois indices taxonomiques [Picophytoplancton, Nanophytoplancton et Microphytoplancton] ont été calculés selon l’Eq. 1 du Chapitre II (Vidussi et al., 2001). De
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
même l’indice NPP des pigments non-photosynthétiques a été calculé comme au Chapitre II (Eq. 2, et Babin et al., 1996).
V.
DETERMINATION DE L’ABSORPTION SPECIFIQUE
Les spectres d’absorption du phytoplancton ont été mesurés à l’aide d’un spectroradiomètre LICOR (LI-1800UW) tel que décrit par Babin et al. (1996). Les mesures ont été faites sur les filtres de fibre de verre Whatman (GF/F) destinés aux analyses HPLC juste après la filtration, ceci afin d’éviter les biais pouvant découler de l’échantillonnage (par exemple : hétérogénéité dans les bouteilles Niskin lorsque la communauté phytoplanctonique est composée d’espèces de grandes tailles). La densité optique de l’échantillon (DO) a été mesurée entre 370 et 750 nm avec un incrément de 2 nm. Le coefficient d’absorption du phytoplancton, aph (λ) (m-1), a été calculé après correction du spectre d’absorption particulaire total de l’effet d’amplification du filtre (Mitchell et Kiefer, 1988) et après déconvolution selon Bricaud et Stramski (1990) de façon à supprimer la contribution des particules détritiques. Le coefficient d’absorption *
spécifique, a ph (λ ) [m2 (mg chl a)-1], a ensuite été calculé selon la formule : a * ph (λ ) =
VI.
a ph (λ )
(1)
[Tchl a]
PARAMETRES DE LA COURBE P VS. E
La relation entre le taux de fixation de carbone et l’éclairement (courbes P vs. E) a été déterminée, selon le même protocole expérimental que pour la campagne PROSOPE B et αB ont été estimés en ajustant la (Chapitre II). Les paramètres photosynthétiques Pmax
relation de Platt et al. (1980) (Eq. 2) aux données expérimentales de PB et de PAR, à l’aide de l’algorithme quasi-newton du logiciel Systat® (version 8.0) : B P B = Pmax (1 − e
B −αE Pmax
)e
B − βE Pmax
(2)
relation dans laquelle β est le coefficient de photoinhibition (en mg C (mg chl a)-1 h-1 (µmol quanta m-2s-1)-1). Le paramètre de saturation EK (µmol quanta m-2s-1) et le rendement quantique maximal de fixation de carbone dû à l’absorption réalisée par les seuls pigments
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
38°N Cartagene
C de Palos
Espagne
37°N
Almeria C de Gata
36°N Oran t rajet de la radiale 2 0 cm /s t rajet du jet at lan t ique t rajet du co uran t M ed.
C Tres Forca
Beni-Saf
35°N 3°W
2°W
Algérie 1°W
0°W
Figure III-4. Orientation et intensité des courants marins dans la zone étudiée lors de la campagne ALMOFRONT 2, 20 m sous la surface. Les traits noirs indiquent la direction et l’intensité des courants (longueur), le trait rouge rappelle le tracé de la section trans-frontale. Les traits gras indiquent la circulation des différents courants présents dans la zone déduite de nos investigations (données fournies par Y. Graton et C. Lafleur).
Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
photosynthétiques, φ CPSmax [mol C (mol quanta)-1] ont été déterminés comme au Chapitre II (Eq. 5, 8 et 9, section V). Durant le Leg 1, les paramètres photosynthétiques ont été déterminés à 10 profondeurs (entre 0 et 200 m) à toutes les stations de la section trans-frontale. Lors du Leg 2, les paramètres photosynthétiques ont été mesurés sur des échantillons prélevés en surface seulement, et ce toutes les 2 heures pendant les 36 heures d’occupation de chaque site. Les mesures étaient systématiquement dupliquées, un des prélèvements se faisant à la sortie du thermosalinographe du bord et l’autre en surface à l’aide d’un seau.
◊ RESULTATS Une partie des données qui seront présentées ici ont été fournies par les personnes citées au Tableau III-1 : Tableau III-1 : Données acquises lors de la campagne ALMOFRONT 2 et personnes ayant fourni ces données.
Type de données
Personne responsable
Laboratoire d’origine
Hydrologie, CTD
J. Raunet
LOV Villefranche sur mer
D. Tailliez
LOV Villefranche sur mer
ADCP
Y. Gratton et C Lafleur
Sels nutritifs
P. Morin
Station Biologique Roscoff
Pigments
J.C. Marty
LOV Villefranche sur mer
H. Claustre
LOV Villefranche sur mer
I.
UQAR, Québec
STRUCTURES HYDROLOGIQUES ET STATUTS TROPHIQUES
L’exploration de la zone d’étude faite grâce aux profileurs acoustiques (ADCP) du navire durant le premier Leg de cette campagne, a permis d’établir une carte des courants à différentes profondeurs sous la surface (Figure III-4). . Le Jet Atlantique vient directement
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Chapitre III : Variations circadiennes et spatiales de la photosynthèse en mer d'Alboran : Influence des mouvements verticaux des masses d'eau.
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Salinité (g kg -1 )
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Distance sur la section trans-frontale (km) Figure III-5. Répartition de la salinité (g/kg) le long de la section transfrontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras continu indique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze.
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Température (°C)
Profondeur (m)
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Distance le long de la section trans-frontale (km) Figure III-6. Répartition de la Température (°C) le long de la section transfrontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras continu indique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze.
Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
du détroit de Gibraltar et s’écoule d’ouest en est. Le courant Méditerranéen arrivant du nord-est le long des cotes de l’Espagne ; bifurque ensuite vers le sud-ouest et vient se coller au Jet Atlantique. Les résultats présentés à partir d’ici sont ceux obtenus lors du Leg 1 le long de la radiale trans-frontale. Sur les figures III-5 et III-6, sont représentés respectivement la salinité (g kg-1) et la température (°C) dans la zone d’étude. Pour plus de clarté, tous les graphiques sont représentés de la même façon : l’abscisse représente la distance en km parcourus le long de la radiale du nord au sud (voir figure III-2A et II-4) ; l’ordonnée représente la profondeur en mètres entre 0 et 125 ; l’échelle de couleur indique la valeur de la variable représentée ; les points représentent le positionnement des échantillons discrets ; les lignes continues fines représentent les isopycnes ; et la ligne grasse indique le bas de la couche mélangée Zm ; et finalement, la ligne grasse pointillée représente la profondeur de le couche euphotique Ze déterminée tel qu’indiqué dans la section II de Matériels et Méthodes. La distribution trans-frontale de la salinité et de la température illustre ici clairement le contraste entre les eaux méditerranéennes plus froides et plus salées au nord (les 85 premiers kilomètres) et les eaux atlantiques plus chaudes et moins salées formant le tourbillon anticyclonique au sud (les 100 derniers kilomètres). La distribution des isopycnes indique une stratification verticale accentuée dans les eaux méditerranéennes avec une couche de mélange en surface d’environ 25 m. Au contraire, le tourbillon anticyclonique d’eau atlantique (les 100 derniers km au sud) présentait une couche mélangée relativement profonde d’environ 130 m, avec des valeurs très homogènes de température (17.70 ± 0.15 °C) et de salinité (36.60 ± 0.10 g kg-1). Entre ces deux structures (km 85 à 115), des eaux présentant des valeurs intermédiaires de température et de salinité ont été observées. En surface, cette partie de la zone d’étude était occupée par le jet atlantique. On peut y remarquer l’orientation verticale des isopycnes, indiquant la position du front lui même et la potentialité d’importants mouvement verticaux des masses d’eau à ce niveau. La figure III-7 montre la répartition des nitrates le long de la section trans-frontale qui témoigne du statut trophique des différentes masses d’eau. Il apparaît clairement ici que les eaux méditerranéennes de surface étaient très appauvries en nitrates (concentrations indétectables en dessous de 0.03 µM), et ce jusqu’à la profondeur de 25 m environ. Les
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d'Alboran :nnfluence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale..
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Concentration en nitrates (µM)
Profondeur en m
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Distance le long de la section trans-frontale (km) Figure III-7. Répartition de la concentration en NO3 (µM) le long de la section transfrontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras continu indique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze.
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1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 < 0.2
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Distance le long de la section trans-frontale (km) Figure III-8. Répartition de la concentration en chlorophylle a Totale (mg/m3) le long de la section transfrontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras continu indique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze.
[ Tchl a] (mg m -3 )
Profondeur en m
25
Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
concentrations en nitrates en dessous de la couche de mélange étaient plus élevées (> 5 µM). Le tourbillon d’eau atlantique était lui aussi appauvri en nitrates dans sa couche mélangée, mais avec cependant des concentrations détectables entre 0.03 et 0.6 µM. La zone frontale était caractérisée par une forte remontée de nitrates entre 92 et 103 km. La répartition des phosphates le long de la même section trans-frontale confirme l’existence d’une remontée d’eau au niveau de la zone frontale (entre 92 et 103 km). La répartition des phosphates dans la zone est très similaire à celle des nitrates, avec des eaux méditerranéennes appauvries en surface et riches en dessous de la couche de mélange. Le tourbillon d’eau atlantique modifiée présente quant à lui des concentrations comprises en surface entre 0.02 et 0.07 µM (données non représentées).
II.
REPARTITION DES COMMUNAUTES PHYTOPLANCTONIQUES
Lors de cette étude, les pigments ont été utilisés pour évaluer la biomasse totale et en tant qu’indicateurs taxonomiques de façon à déterminer la répartition des différentes populations phytoplanctoniques dans les différentes masses d’eau de la zone étudiée. La figure III-8 montre que la biomasse phytoplanctonique se situait principalement dans les 50 premiers mètres en mer Méditerranée et jusqu’à 80 m dans le tourbillon d’eau atlantique. Deux maxima de Tchl a ont été observés en sub-surface vers le km 73 et en surface au km 90 avec des concentrations atteignant 1.6 mg m-3. Dans les eaux méditerranéennes appauvries en nitrates près de la surface, la biomasse se situait principalement en dessous de la couche mélangée au niveau de la nitracline. La distribution relative des différents groupes phytoplanctoniques est illustrée sur la figure III-9 par les trois indices taxonomiques calculés à partir des pigments. Les valeurs de ces indices correspondant à des valeurs de Tchl a inférieure à 0.1 mg m-3 n’ont pas été représentées ici, car elles comportaient un rapport signal-bruit trop faible. L’échelle de couleur utilisée pour la figure III-9C (picophytoplancton) n’est pas la même que celles utilisées pour les deux autres catégories phytoplanctoniques, ceci en raison des faibles valeurs observées. Dans le tourbillon anticyclonique atlantique, le nanophytoplancton (Figure III-9B) dominait avec environ 55% de la biomasse totale, suivi par le picophytoplancton (Figure
III-9C) qui représentait 35% de la biomasse.
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Le
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0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00
picophytoplancton
50
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> 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 < 0.2
nanophytoplancton
Profondeur en m
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Profondeur en m
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
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C
0.9 0.8 0.7 0.6
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B
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microphytoplancton
Profondeur en m
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0
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Distance le long de la section transfrontale (km) Figure III-9. Répartition des communautés phytoplanctoniques le long de la section transfrontale effectuée pendant le Leg 1. A: Proportion de microphytoplancton, B: proportion de nanophytoplancton, C: Proportion de picophytoplancton (l'echelle de couleur du panel C est différente de celles des deux autres panels).
Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d'Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
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Profondeur en m
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Indice NPP (sans dimension)
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Distance le long de la section trans-frontale (km) Figure III-10. Répartition de l'indice NPP (sans dimension) le long de la section trans-frontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras continu indique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze.
Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d'Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale. 0
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B Pmax [mg C (mg chl a) -1h -1]
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Distance le long de la section trans-frontale (km) Figure III-11. Répartition du taux maximal spécifique de fixation de carbone [mg C/(mg chl a)/h] le long de la section transfrontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras continu indique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze.
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Distance le long de la section trans-frontale (km) Figure III-12. Répartition de l'efficacité photosynthétique [mg C/(mg chl a)/h/(µmol quanta/m²/s)] le long de la section transfrontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras continu indique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze.
D B [mg C (mg chl a) -1 h -1 (µmol quanta m-2 s -1)-1 ]
Profondeur en m
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
microphytoplancton (Figure III-9A) était totalement absent dans les eaux du tourbillon. Dans les 30 premiers km des eaux méditerranéennes, le picophytoplancton dominait la biomasse phytoplanctonique avec le nanophytoplancton dans la couche mélangée de surface. En dessous de Zm par contre, le microphytoplancton dominait. De même, dans la zone frontale, le microphytoplancton dominait la communauté phytoplanctonique (65% de la biomasse) là où un maximum de biomasse a été observé en sub-surface. La distribution de l’indice NPP est illustré sur la figure III-10. Les plus faibles valeurs ont été observées dans les eaux méditerranéennes en dessous de la couche de mélange. Les valeurs les plus fortes par contre, ont été trouvées dans la couche de surface des eaux méditerranéennes dans les 35 premiers km de la section trans-frontale. De fortes valeurs ont également été observées autour du km 85 et ce jusqu’à la profondeur de 60 m. Dans le tourbillon anticyclonique d’eau atlantique, des valeurs intermédiaires homogènes jusqu’à 100 m de profondeur ont été observées.
III.
REPARTITION DES PARAMETRES PHOTOSYNTHETIQUES
Les variations des paramètres photosynthétiques le long de la section trans-frontale sont illustrées sur les figures III-11 à III-14 pour les échantillons présentant des valeurs de Tchl a supérieures à 0.1 mg m-3 pour les raisons évoquées plus haut à propos des indices B , mg C pigmentaires. Les valeurs du taux maximal spécifique de fixation de carbone ( Pmax
(mg chl a)-1h-1) variaient entre 0.1 et 4.0 mg C (mg chl a)-1h-1 (Figure III-11). Dans le B tourbillon anticyclonique, Pmax présentait des valeurs relativement homogènes sur la
verticale autour de 1.0 mg C (mg chl a)-1h-1. Au contraire, les valeurs étaient légèrement plus faibles dans les eaux méditerranéennes (autour de 0.5 mg C (mg chl a)-1h-1). Les B les plus fortes ont été observées dans la zone frontale, atteignant valeurs de Pmax
jusqu’à 4.0 mg C (mg chl a)-1h-1. Ces fortes valeurs coïncident avec les plus fortes valeurs B de l’indice NPP (Figure III-10). De fortes valeurs de Pmax ont également été observées sur
le bord gauche du tourbillon anticyclonique au km 125 (jusqu’à 4.0 mg C (mg chl a)-1h-1).
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d'Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
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Cmax
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0.10 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01
I PS [mol C (mol quanta)-1]
Profondeur en m
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Distance le long de la section trans-frontale (km) Figure III-13. Répartition du rendement quantique de fixation de carbone lié à l'absorption par les pigments photosynthétiques (mol C/mol quanta), le long de la section transfrontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras continu indique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze.
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jusqu'à 110 90 75 60 45 30 15
EK (µmol quanta m -2 s -1 )
Profondeur en m
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Distance le long de la section trans-frontale (km) Figure III-14. Répartition du paramètre de saturation Ek (µmol qaunta/m²/s), le long de la section transfrontale effectuée lors du Leg 1 entre 0 et 125 m de profondeur. Le trait gras continu indique la profondeur de la couche de mélange Zm, le trait gras pointillé indique la profondeur de la couche euphotique Ze.
Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
Les valeurs de l’efficacité photosynthétique αB variaient entre 0.02 et 0.13 mg C (mg chl a)-1h-1 (µmol quanta m-2s-1)-1 (Figure III-12). Les plus fortes valeurs ont été mesurées dans la zone frontale jusqu’à 80 m de profondeur. Les valeurs les plus faibles étaient localisées dans la partie la plus au nord (les 40 premiers km de la section) des eaux méditerranéennes de surface. Des valeurs intermédiaires (autour de 0.03 mg C (mg chl a)1 -1
h (µmol quanta m-2s-1)-1) ont été mesurées dans toute la couche homogène du tourbillon
anticyclonique d’eau atlantique. La figure III-13 illustre les variations du rendement quantique de fixation de B carbone, φ CPSmax , le long de la section trans-frontale. Tout comme Pmax et αB, φ CPSmax atteint
ses valeurs les plus fortes dans la zone frontale – jusqu’à 0.12 mol C (mol quanta)-1 mesuré au km 125 – et dans la zone de contact entre les eaux méditerranéennes et le Jet (vers 75 – 80 km). Les valeurs étaient également élevées en dessous de la nitracline et de la couche de mélange dans les eaux méditerranéennes, avec un maximum profond autour de 50 m là où le microphytoplancton était le plus abondant. Dans le tourbillon atlantique, les valeurs de φ CPSmax étaient modérées et relativement homogènes sur toute la couche de mélange (autour de 0.07 mol C (mol quanta)-1). Des fortes valeurs du paramètre de saturation EK ont été mesurées dans les eaux de surface méditerranéennes (autour de 60 µmol quanta m-2s-1 entre 0 et 20 m, Figure III-14) là où la couche de mélange est la moins épaisse. Les plus fortes valeurs de EK ont été mesurées sur le bord du tourbillon atlantique (km 125) ainsi que dans la zone frontale (km 85 à 110) avec des valeurs atteignant 110 µmol quanta m-2s-1. Les valeurs de EK les plus faibles ont été observées en dessous de Zm dans les eaux méditerranéennes (moins de 20 µmol quanta m-2s-1). Dans la couche mélangée du tourbillon anticyclonique, les valeurs observées étaient relativement homogènes avec des valeurs intermédiaires autour de 45 µmol quanta m-2s-1.
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
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Indice NPP (sans dimension)
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0.10
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12:00
00:00
12:00
00:00
12:00
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12:00
00:00
Temps sur la section transfrontale (heure)
Figure III-15. Variations de l’indice NPP (sans dimension) à 5m de profondeur le long de la section trans-frontale en fonction de l’heure.
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Site 8
2
Site 2
0 1 2 3 4 5
Site 7a
-3
Site 4
TChl a (mg m )
Site 7b
Site 5
Site 6
Site 1
Site 3
Atlantique
Figure III-16. Profils verticaux moyens en noir (et écart-type en grisé) de la chlorophylle a totale (mgm-3) aux 8 sites explorés durant le Leg 2. Les échelles des abscisses sont toutes identiques à celle du site 8 sauf celle du site 7a. Les différents sites ont été replacés ici sur une radiale virtuelle des sites ayant le plus de caractéristiques méditerranéennes à ceux ayant le plus de caractéristiques atlantiques. Données fournies par Annabelle Cuttelod.
Méditerranée
Profondeur en m
Chapitre III : Variations circadiennes et spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : Influence des mouvements verticaux des masses d’eau.
Figure III-17. Schéma conceptuel de la structure hydrologique et de la circulation au niveau d’un front géostrophique. Les 8 sites visités au Leg 2 y sont positionnés.
Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
IV.
VARIABILITE
CIRCADIENNE
DES
PARAMETRES
PHOTOSYNTHETIQUES
Une tendance à des variations circadiennes de l’indice NPP a pu être observée le long de la section trans-frontale. Sur la figure III-15, les valeurs de cet indice à 5 m de profondeur présentent des valeurs plus élevées d’un facteur 3 en début d’après-midi par rapport aux valeurs mesurées la nuit. Durant la seconde partie de la campagne (Leg 2, 24 décembre 1997 – 18 janvier 1998), la stratégie d’échantillonnage a permis d’étudier les variations circadiennes des paramètres photosynthétiques, en suivant leur évolution à différents sites (Figure III-2B) sur 36 heures à chaque fois (voir section I dans Matériel et Méthodes). Les paramètres principaux
(température, excès de densité potentielle, sels
nutritifs,
pigments
phytoplanctoniques) ont également été déterminés à chacun des 8 sites visités, ce qui a permis de replacer les différents sites sur une radiale “virtuelle” de façon à pouvoir comparer les données acquises durant chacun des deux Legs. Ainsi, sur la figure III-16, les profils moyens de la distribution en chlorophylle a totale ont été replacés sur cette radiale virtuelle en comparaison de ceux obtenus sur la section trans-frontale effectuée au Leg 1. Remarquez que le site 7 a été divisé en deux sites distincts (7a et 7b) correspondant chacun à un des deux jours de mesure : le site 7a présentant réellement une structure frontale et le site 7b se trouvant localisé plus vers le centre du Jet Atlantique. Chacun des sites a ensuite pu être replacé dans le schéma conceptuel de la circulation en mer d’Alboran (Figure III17). A chaque site exploré durant la seconde partie de la campagne, les paramètres photosynthétiques ont été déterminés toutes les deux heures sur des échantillons prélevés en surface. Il est à noter que les deux modes de prélèvements utilisés (seau et thermosalinographe) ont permis d’obtenir des duplicatas de bonne qualité au début du Leg 2. Cependant la qualité de ces duplicatas s’est dégradée au cours du Leg, les résultats donnés par les échantillons prélevés avec les deux méthodes devenant de plus en plus différents. Ceci peut être dû à l’encrassement progressif du thermosalinographe au fil du temps.
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d'Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
0
25
50
75
100
125
5
175
200 5
Tourbillon
25
Profondeur en m
150
Pauvre en nitrate nanophytoplancton PAR moyen = 24 µmol quanta/m²/s
Eaux Méditerranéennes
50
25
50
Front
75
75
Eaux Méditerranéennes 100
100 Riches en nitrate Microphytoplancton
125
0
25
50
75
175 125 100 150 Distance le long de la section trans-frontale (km)
200
125
Courant Méditerranéen Jet d'eau Atlantique Mouvements verticaux des masses d'eau Profondeur de la couche de mélange Figure III-18. Schéma conceptuel de la répartition des différentes masses d'eau en présence dans la zone d'étude, ainsi que de la position et du sens d'écoulement des deux courants rencontrés. Les eaux méditerranéennes de surface sont caractérisées par un appauvrissement total en sels nutritifs et par un éclairement moyen journalier de 101 µmol quanta/m²/s ainsi que par l'abondance du nanophytoplancton et du picophytoplancton. La zone frontale est caractérisée par un éclairement journalier moyen de 115 µmol quanta/m²/s dans la partie située au dessus de sa couche de mélange, la communauté microphytoplanctonique y dominait.
Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
Sur les 8 cycles de 36 heures de mesures effectués lors du second Leg aux 8 différents sites visités, des variations circadiennes des paramètres photosynthétiques nettes n’ont pu être observées qu’aux sites 3 et 6 (dans le tourbillon d’eau atlantique) et dans une moindre mesure au site 7b (sur le bord du Jet Atlantique). Dans le tourbillon, ces variations s’étendaient sur un facteur 3 pour le paramètre de saturation EK alors que sur le bord du jet, l’amplitude n’était que d’un facteur 2.5 (toujours pour EK).
◊ DISCUSSION I.
STRUCTURES ET
CARACTERISTIQUES PHYSIQUES DES DIFFERENTES
MASSES D’EAU
La petite échelle de la grille d’échantillonnage appliquée durant cette campagne a permis d’obtenir une description quasi-synoptique détaillée de la structure hydrologique et physique de ce système frontal si complexe. Cette structure est représentée schématiquement sur la figure III-18, où les trois principales composantes hydrologiques ont été identifiées. Dans les 90 km les plus au sud de la zone d’étude, le tourbillon anticyclonique d’eau atlantique était caractérisé par une couche mélangée profonde (Zm descend jusqu’à 120 m) et relativement homogène pour la plupart de ses caractéristiques. La concentration en nitrates était modérée avec en moyenne 0.56 µM (Figure III-7), ainsi que l’éclairement moyen journalier avec seulement 24 µmol quanta m-2s-1. Le nanophytoplancton représentait la moitié de la communauté phytoplanctonique totale, suivi par le picoplancton. Le microphytoplancton y était quasiment absent. La biomasse phytoplanctonique modérée était pratiquement totalement contenue dans la partie supérieure de la couche mélangée, au dessus de Ze dont la profondeur était d’environ 50 m dans tout le tourbillon. Notons pourtant un léger maximum vertical de nanophytoplancton au km 135. Le phytoplancton ne pouvait sans doute pas se développer en dessous de Zm du fait de l’extension de la couche de mélange au delà de la couche euphotique (Zm > Ze) et donc du très faible éclairement en dessous de la pycnocline. Le tourbillon d’eau atlantique présentait les caractéristiques d’un système mésotrophe tel que celui décrit par Babin et al. (1996).
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
Dans les 75 km les plus au nord de la section trans-frontale, les eaux méditerranéennes de sub-surface étaient beaucoup plus stratifiées que le tourbillon d’eau atlantique avec une couche de mélange de seulement 25 m de profondeur. Dans cette couche de mélange, les sels nutritifs étaient indétectables à l’échelle de la nanomole. Par contre l’éclairement moyen sur la journée dans la couche de surface était élevé avec environ 101 µmol quanta m-2s-1. Dans ces conditions de carence en sels nutritifs, le picophytoplancton et le nanophytoplancton dominaient la communauté phytoplanctonique comme c’est souvent le cas dans les systèmes oligotrophes (Morel et al., 1993; Partensky et al., 1999a; Vidussi et al., 2001). En dessous de la pycnocline, l’éclairement journalier moyen était modéré puisque la couche euphotique s’étendait entre 60 et 40 m. Dans cette couche homogène profonde, les nutriments étaient très abondants soutenant un maximum profond de TChl a constitué majoritairement de microphytoplancton. Les différences entre les caractéristiques observées dans la couche mélangée de surface et dans les eaux situées en dessous de la pycnocline étaient particulièrement marquées dans les 25 premiers km de la section trans-frontale là où circule le premier bras du courant Méditerranéen (Figure III4 et III-18). Les eaux méditerranéennes présentaient les caractéristiques d’un système stratifié oligotrophe. La localisation de la zone frontale est clairement indiquée par l’orientation verticale des isopycnes entre les km 85 et 125 (Figure III-18). Dans la partie la plus au nord du front, la distribution des nitrates (Figure III-7) indique l’existence d’un enfoncement jusqu’à environ 60 m. Plus au sud, entre les km 95 et 105, une cheminée riche en nitrates remonte des couches profondes jusqu’en surface. Cette répartition des nitrates indique l’existence dans la zone frontale de mouvements verticaux des masses d’eau (représentés par les flèches sur la figure III-18). L’enfoncement constaté à l’extrême nord du front est dû à la convergence entre le courant Méditerranéen et le Jet d’eau atlantique (L. Prieur, comm. pers.) alors que la remontée sur le bord gauche du Jet atlantique est lié à la circulation secondaire classique d’un jet géostrophique (Bower et Rossby, 1989; Franks, 1992). TChl a était faible dans la langue d’eau subductée au dessus de 30 m entre les km 85 et 95 (Figure III-8). La communauté phytoplanctonique dans cette langue d’eau était dominée par du pico- et du nanophytoplancton (Figure III-9) suggérant une origine de surface, confirmée par les valeurs relativement élevées de l’indice NPP
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
jusqu’à 60 m de profondeur (Figure III-10). Dans la cheminée d’eau riche en nitrates, TChl a était très faible en dessous de 35 m mais présentait des valeurs plus fortes en surface (Figure III-8). Le refoulement de la biomasse vers la surface dans une zone de remontée a été démontré par Zakardjian et Prieur (1998) à l’aide d’un modèle de croissance du phytoplancton couplé à un modèle hydrodynamique 1-D. Notons ici que le microphytoplancton était majoritaire à toutes les profondeurs dans la zone d’upwelling (Figure III-9) en relation avec l’abondance des nitrates. En accord avec la circulation secondaire, une zone d’enfoncement d’eau est attendue sur le bord droit du Jet Atlantique (Claustre et al., 1994b) tel qu’illustré sur le schéma conceptuel (Figure III-18, au km 125, mais voir la suite de la discussion).
II.
EFFETS DE LA PHOTOACCLIMATATION ET
DE LA DISPONIBILITE EN
NITRATES SUR LES PARAMETRES PHOTOSYNTHETIQUES DANS LES EAUX MEDITERRANEENNES ET DANS LE TOURBILLON ATLANTIQUE
Il a été montré à maintes reprises que les paramètres photosynthétiques du phytoplancton varient largement dans l’océan en fonction du passé lumineux des populations (Falkowski et Wirick, 1981; Lewis et al., 1984), de la disponibilité en sels nutritifs (quantité et qualité) (Greene et al., 1992; Long et al., 1994; Geider et al., 1998) et de la température (Eppley, 1972; Davison, 1991). En retour, les paramètres photosynthétiques ont été utilisés comme des variables diagnostiques ou des proxis de ces facteurs. EK, par exemple, pourrait être un indicateur robuste de la photoacclimatation (Sakshaug et al., 1997) et ainsi du passé lumineux d’une population. EK pourrait en effet refléter les processus de photoacclimatation se déroulant au niveau des réactions de la phase claire de la photosynthèse (en particulier les changements de la section efficace du PS2), mais aussi de la phase sombre (comme par exemple les changements dans la concentration en RubisCO) (Kolber et Falkowski, 1993). Il semblerait en fait que EK covarie avec l’éclairement moyen dans la couche de mélange (Babin et al., 1996; Sadoudi, 1997, Laws et al., sous presse). Le rendement quantique de fixation de carbone, φCmax, lui est sensible à la disponibilité en sels nutritifs (Cleveland et al., 1989; Lizotte et Priscu, 1994; Lindley et al., 1995). De plus, du fait de l’accumulation de pigments nonphotosynthétiques (Babin et al., 1996), il varie en général inversement avec la lumière.
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
φCmax est également sensible à l’état d’oxydation de la source en azote puisqu’il dépend du quotient photosynthétique (Laws, 1991). Une approche proposée par Babin et al. (1996) et déjà détaillée dans le Chapitre II consiste à distinguer l’effet des pigments photosynthétiques sur φCmax en calculant φ CPSmax qui ne dépend plus que de la disponibilité en sels nutritifs et du quotient photosynthétique. L’indice NPP permet d’envisager séparément l’effet des pigments photosynthétiques sur la photosynthèse. Finalement, le B taux maximal spécifique de fixation de carbone Pmax est le plus compliqué à interpréter des
paramètres photosynthétiques. Il dépend des réactions enzymatiques de la phase sombre. Il est donc fonction de la température avec un Q10 d’environ 2 (Eppley, 1972). Il dépend aussi de la lumière (Chalup et Laws, 1990). Sukenik et al. (1987) ont en effet montré que B les changements de Pmax avec l’intensité lumineuse, résultaient de changements dans les
tailles relatives des pools cellulaire de RubisCO et de chlorophylle. De tels changements existent par ailleurs d’une espèce phytoplanctonique à l’autre du fait des variations dans l’abondance typique de la chlorophylle cellulaire. Par exemple, les cyanobactéries qui contiennent beaucoup moins de chlorophylle a en comparaison de leurs autres pigments B très élevés (Babin et al., 1996, leur (Prézelin et Boczar, 1986), peuvent présenter des Pmax B site mésotrophe). La limitation azotée peut aussi affecter Pmax dans un sens ou dans l’autre
(e.g. Chalup et Laws, 1990; Herzig et Falkowski, 1989) selon l’effet sur le rapport entre la chlorophylle a et la RubisCO. De part et d’autre du front, des systèmes stables ont été identifiés avec des caractéristiques physiques, chimiques et biologiques typiques de zones oligotrophes et mésotrophes. La distribution des paramètres photosynthétiques dans ces zones est cohérente avec les observations faites dans le passé dans différentes régions de l’océan mondial (Cleveland et al., 1989; Babin et al., 1995; Marra et al., 1995, Babin et al., 1996; Marra et al., 2000; Dusenberry et al., 2000 et 2001). Dans la partie la plus au nord des eaux méditerranéennes, deux couches d’eau superposées sont séparées par la pycnocline. Dans la couche de surface, les valeurs relativement plus fortes de NPP et de EK (Figure III-10 et III-14) suggèrent une photoacclimatation à des niveaux de lumière relativement élevés. Les faibles valeurs de φ CPSmax (autour de 0.02 mol C (mol quanta)-1, Figure III-13) suggèrent les effets de la carence en sels nutritifs (Babin et al., 1996, et références citées). Dans la
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
couche profonde en dessous de la pycnocline, l’indice NPP et EK étaient beaucoup plus faibles, et φ CPSmax beaucoup plus fort (Figure III-10, III-14 et III-13). Ces observations indiquent clairement la photoacclimatation d’une population cantonnée dans une zone où l’éclairement moyen reste très faible, et correspond à la forte disponibilité en sels nutritifs en dessous de la pycnocline (Figure III-7). Des résultats similaires ont été observés par Babin et al. (1996) à un site oligotrophe de l’Atlantique tropical nord-est. Dans leur étude, les facteurs clés pour expliquer ces variations étaient : 1/ une zone euphotique s’étendant largement en dessous de la couche mélangée et 2/ une forte limitation nutritive dans la couche
de
surface
avec
de
forts
apports
en
dessous.
Deux
communautés
phytoplanctoniques pouvaient ainsi se développer chacune dans une couche distincte. Les petites espèces de phytoplancton dominaient dans la couche supérieure, alors que de plus grosses espèces se développaient dans la couche profonde. Ce schéma s’applique tout à fait dans le cas des eaux méditerranéennes de cette étude. Dans le tourbillon d’eau atlantique, au sud du front, tous les paramètres photosynthétiques montraient des amplitudes de variations nettement moins importantes en fonction de la profondeur et des valeurs globalement plus modérées. Dans ce système, la couche de mélange s’étend au delà de la couche euphotique (l’éclairement est donc insuffisant), c’est pourquoi le phytoplancton ne peut se développer en dessous de Zm là où les nutriments sont abondants,. Dans la couche mélangée, les mouvements verticaux liés à la convection essentiellement induisent une photoacclimatation à des intensités lumineuses modérées (ici, 24 µmol quanta m-2s-1). Ce schéma est confirmé par les valeurs modérées de l’indice NPP et de EK (Figure III-10 et III-14) observées dans les 90 derniers km de la section trans-frontale. La stabilité verticale de ces deux variables est particulièrement claire en comparaison aux forts gradients observées dans les eaux méditerranéennes. Les valeurs de φ CPSmax observées dans le tourbillon étaient de modérées à fortes, semblant indiquer que la limitation azotée, si elle était présente, était toutefois modérée. Ce site est similaire en bien des points au site mésotrophe décrit par Babin et al. (1996). Lorsque
l’on
compare
les
couches
mélangées
superficielles
des
eaux
B soient en méditerranéennes et du tourbillon atlantique, il semble que les variations de Pmax
grande partie gouvernées par la limitation en sels nutritifs plus que par la lumière puisque
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
de fortes valeurs ont été observées dans le tourbillon où l’éclairement moyen reste faible. Le plus forte température dans les eaux du tourbillon par rapport aux eaux méditerranéennes (plus 2 °C, Figure III-6), pourrait être responsable de cette différence mais seulement pour une petite partie. En effet, avec un Q10 de 2, une telle différence de B température ne pourrait mener qu’à une augmentation de 20 % de Pmax , alors qu’une B différence de près d’un facteur 2 a été observée. Des variations de Pmax liés aux
changements d’espèces phytoplanctoniques ne sont pas à exclure.
III.
VARIATIONS
DES PARAMETRES PHOTOSYNTHETIQUES DANS LA
ZONE FRONTALE ET PROCESSUS PHYSIQUES ASSOCIES
Alors que les propriétés conservatives que sont la salinité et la température permettent d’obtenir une image globale claire de la structure physique des systèmes étudiés (Figure III-5 et III-6), ils ne donnent pas d’information sur les vitesses de mouvement des différentes masses d’eau ni selon quels processus hydrodynamiques se font ces mouvements. Les résultats discutés dans la précédente section montrent clairement comment les paramètres photosynthétiques sont sensibles au passé lumineux des masses d’eau ainsi qu’à la disponibilité en sels nutritifs. Ils peuvent en retour fournir une information sur les processus physiques qui engendrent ces variations des facteurs qui affectent la photosynthèse. En d’autres mots, les paramètres photosynthétiques peuvent être utilisés comme propriétés non-conservatives des masses d’eau (Steeman-Nielsen et Hansen, 1959; Marra, 1978; Falkowski, 1980 et 1983; Lewis et al., 1984). Relativement à la lumière, les paramètres photosynthétiques s’acclimatent en général selon une cinétique de premier ordre (Falkowski, 1984) avec un temps de demi-vie (t1/2) le plus souvent entre 10 et 24 heures (e.g. Cullen et Lewis, 1988). En gardant ces valeurs à l’esprit, la distribution du paramètre de saturation EK peut être interprétée en terme de processus hydrodynamiques (Falkowski, 1983; Lewis et al., 1984; Lande et Lewis, 1989; Claustre et al., 1994a). Relativement à la disponibilité en sels nutritifs, φ CPSmax indique les zones où les apports nutritifs sont importants.
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
A première vue, la distribution des paramètres photosynthétiques dans la zone frontale présente une distribution en taches (Figure III-11 à III-14), mais en fait elle révèle quelques structures très spécifiques au front. Entre les km 92 et 99 là où l’upwelling de nitrates semble être le plus intense (Figure III-7), EK présente un fort gradient vertical (un ordre de grandeur) avec de très fortes valeurs près de la surface. De fortes valeurs de EK ont également été observées sur le coté sud de l’upwelling. Ce gradient vertical reflète le mouvement ascendant d’eau en provenance de la profondeur et le confinement relatif de ces eaux en surface (permettant la photoacclimatation et donc l’augmentation des valeurs de EK) qui se fait également dans le cœur du Jet Atlantique. Un tel phénomène a été décrit et modélisé pour ce qui est de la biomasse et de la croissance phytoplanctonique dans ce système frontal par Zakardjian et Prieur (1998). La distribution de EK permet aussi de mettre en évidence l’enfoncement des eaux de surface méditerranéennes dans la direction isopycnale entre les km 65 et 85 et ce jusqu’à 65 m de profondeur environ (Figure III-14), ce phénomène d’enfoncement étant d’ailleurs confirmé par la répartition de l’indice NPP (Figure III-10). B , comme celle de φ CPSmax , montre les plus fortes valeurs sur La distribution de Pmax
les bords nord et sud de l’upwelling (Figure III-11 et III-13). Ceci est particulièrement clair B pour Pmax qui présente un maximum horizontal au km 125 s’étendant jusqu’à la
profondeur de 80 m au moins (Figure III-11). Il est intéressant de noter qu’un maximum de biomasse a été observé dans la même zone (Figure III-8), ainsi qu’une augmentation de la contribution de la biomasse nanophytoplanctonique un peu plus au sud (Figure III-9B). Cette distribution (au km 125) reflète les mouvements descendants des masses d’eau caractéristiques de la circulation secondaire d’un jet géostrophique sur les bords droits des courants (Figure III-18). Une estimation des vitesses verticales de déplacement des masses d’eau a été faite pour le système frontal de la mer d’Alboran suite à la mission ALMOFRONT 1 (mai 1991) et les valeurs obtenues étaient comprises entre 43 et 60 m j-1 (Claustre et al., 1994b; Videau et al., 1994). L’enfoncement mis ici en évidence par la B distribution de Pmax s’étend jusqu’à environ 80 m de profondeur, soit entre 32 et 45 heures
si l’on considère les vitesses verticales estimées en 1991. Ce temps de descente est supérieur aux temps de photoacclimatation estimés admis généralement. Cullen et Lewis (1988) ont montré que pour un passage d’un éclairement fort à un éclairement plus faible,
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
B le temps de photoacclimatation pour Pmax était au plus de 10 heures. Donc, si l’on
considère ce temps de photoacclimatation, la vitesse d’enfoncement verticale de la masse d’eau serait de 192 m j-1. Cette vitesse verticale est considérable, et en tout cas incompatible avec des vitesses verticales pouvant être imputées à une circulation géostrophique secondaire comme celle évoquée plus haut. Pourtant, si la circulation secondaire liée au jet ne peut pas être directement mise en cause, elle peut néanmoins engendrer (ou bien favoriser) un mouvement convectif dans la couche mélangée d’autant qu’au km 125 une inversion de salinité a été observée entre la surface et 80 m de profondeur permettant potentiellement de tels mouvements verticaux (L. Prieur, comm. pers.). Les vitesses verticales des mouvements liés à des phénomènes de convection sont elles compatibles avec la vitesse estimée à l’aide des paramètres photosynthétiques, cependant, ceci nécessiterait un flux de flottabilité de surface pour lequel aucune données n’est malheureusement disponible. Ces résultats reflètent de plus de quelle manière l’upwelling de nitrate permet au tourbillon d’eau atlantique de tirer lui aussi profit de ces apports et ainsi de maintenir des conditions mésotrophes et d’augmenter sa production. La distribution de φ CPSmax confirme de plus que l’impact de l’upwelling sur l’approvisionnement de la zone en sels nutritifs se fait sentir sur une plus grande étendue (Figure III-14). C’est la démonstration de l’impact sur le régime trophique de la rencontre des deux masses d’eau relativement oligotrophes : les eaux méditerranéennes et les eaux du Jet Atlantique (en tout cas peu productives avec B , Figure III-12). Cette rencontre en induisant des mouvements des faibles valeurs de Pmax
d’eau verticaux, permet une production plus élevée : « The ocean’s deserts are blooming » (Kerr, 1986). La production primaire associée aux différents systèmes étudiés a été calculée et intégrée sur 1.5 fois la profondeur de la couche euphotique d’après la méthode de Morel et al. (1996). Les valeurs obtenues confirment pleinement cet effet d’enrichissement dû à la zone frontale. Dans les eaux méditerranéennes, la production primaire moyenne journalière est de 142.8 ± 82.8 mg C m-2 (SD). La grande variabilité des estimations de production primaire faites pour les eaux méditerranéennes est liée aux valeurs largement plus élevées à proximité de la zone frontale. Dans le tourbillon d’eau atlantique, la production primaire
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Chapitre III : Variations circadiennes et spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : Influence des mouvements verticaux des masses d’eau.
0.10 Nuit NPP à 5 m φCmaxPS à 5 m
0.20
0.08
0.15
0.06
0.10
0.04
0.05
0.02
0.00
φCmaxPS [mol C (mol quanta)-1]
Indice NPP (sans dimension)
0.25
0.00 00:00
12:00
00:00
12:00
00:00
12:00
00:00
12:00
00:00
Temps sur la section transfrontale (heure)
Figure III-19. Variations circadiennes de l’indice NPP (sans dimensions) et du rendement quantique de fixation de carbone dû à la seule absorption des pigments photosynthétiques φCPSmax [mol C (mol quanta)-1] le long de la section trans-frontale réalisée au Leg 1 de la campagne à 5 m et à 20 m de profondeur.
Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
moyenne journalière est de 273.26 ± 115 mg C m-2 (SD). Dans la zone frontale, la production primaire moyenne journalière est la plus élevée avec 311.05 ± 133 mg C m-2 (SD). Les valeurs calculées avec les données acquises durant le Leg 2 sont en moyenne plus élevées de 25 %, mais laissent apparaître la même tendance entre les trois différents systèmes. La zone frontale est donc significativement plus productives que les zones adjacentes, et il est probable qu’elle induit une partie du surcroît de production primaire réalisé par la zone du tourbillon. Même si ces zones frontales ne sont pas spatialement importantes (elles occupent une surface réduite par rapport au reste de l’océan mondial), il convient de tenir compte de ces zones et de leur effet sur les eaux adjacentes dans les estimations de production primaire à des échelles plus globales.
IV.
VARIATIONS CIRCADIENNES DE LA PHOTOSYNTHESE
Dans le précédent chapitre, il a été montré que d’importantes variations circadiennes de la photosynthèse existaient dans des milieux hydrologiquement stables. Durant cette étude le but était d’essayer de mettre en évidence des variations circadiennes de la photosynthèse dans le milieu hydrologiquement très perturbé qu’est le système frontal de la mer d’Alboran. Des variations circadiennes du paramètre de saturation EK n’ont pu être observées qu’à trois des 8 sites étudiés durant le Leg 2 de la campagne. Dans les trois cas, l’amplitude de ces variations circadiennes n’était que d’un facteur 2, ce qui est très faible par rapport aux variations spatiales observées dans la zone (un ordre de grandeur). En regardant les données acquises à 5 m le long de la section trans-frontale lors du Leg 1, des valeurs de l’indice NPP plus fortes aux stations explorées le jour par rapport à la nuit ont été mesurées (Figure III-11). Si l’on trace les valeurs correspondantes de φ CPSmax , (Figure III-19), on peut constater la même tendance (sauf pour la troisième nuit). L’amplitude de ces variations circadiennes était d’un facteur 3 pour l’indice NPP et d’un facteur 9 pour φ CPSmax . Même si l’amplitude de variation est très élevée pour le rendement quantique de fixation de carbone, ces amplitudes restent inférieures à celles constatées pour les variations spatiales de ces paramètres. D’autre part, le paramètre de saturation EK, lors de cette section trans-frontale du Leg 1 n’a pas montré de variations circadiennes
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
s’étendant en profondeur (comme attendu en cas de variations d’un autre paramètre photosynthétique, voir Chapitre I et Bruyant, in prep). Il est donc ici très difficile de faire la part entre : 1/ des variations de NPP et de φ CPSmax sur la section réellement dues à des changements circadiens ou bien 2/ la simple coïncidence du moment du prélèvement (le jour) avec la présence du navire dans les masses d’eau présentant ces caractéristiques spécifiques. De plus, dans un champ de lumière aussi complexe que celui de la zone qui nous intéresse ici, les temps de demi-vie (t1/2) des différents paramètres photosynthétiques résultent de multiples mécanismes coexistant ayant pu masquer les variations circadiennes de ces paramètres (Vincent, 1990). Il n’était pas possible lors de cette mission d’étudier de façon synoptique la zone frontale dans le détail comme cela a été fait, sans échantillonner jour et nuit et donc prendre le risque de voir se superposer d’éventuels signaux circadiens aux variations spatiales. Il faut néanmoins souligner que la campagne s’étant dérouler lors de la période hivernale, il est probable que même si des variations circadiennes des paramètres de la photosynthèse avaient pu être observées, celles-ci auraient sans doute été de faible amplitude étant donnés les faibles éclairements. Il semble donc ici que l’hydrologie perturbée de la zone frontale prenne le pas sur la succession du jour et de la nuit dans le contrôle des variations des paramètres photosynthétiques.
◊ CONCLUSION Au cours des deux précédents chapitres (voir aussi Bruyant, in prep), il a été montré comment les paramètres photosynthétiques variaient dans des systèmes artificiels contrôlés et dans des zones océaniques hydrologiquement stables. Le rôle prépondérant de la lumière via l’influence du cycle nycthéméral a pu être souligné, ainsi que le rôle du statut trophique de la zone étudiée. Dans ce chapitre, la répartition des propriétés photosynthétiques du phytoplancton dans une zone dont le régime hydrologique est beaucoup plus complexe a été étudiée : le système frontal de la mer d’Alboran. Durant cette campagne, cette zone frontale a été étudiée d’une manière synoptique à une très petite échelle d’espace de façon à identifier toutes les structures fines qui pourraient intervenir dans la régulation de la photosynthèse, ce qui a permis de souligner largement à nouveau la très grande complexité de cette zone océanique sous l’influence de la circulation géostrophique du Jet Atlantique.
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
Cette circulation particulière - à laquelle se rajoute celle du courant Méditerranéen entraîne des mouvements d’eau horizontaux et verticaux très intenses (Bouchet et al., 1987, Franks, 1992), qui contribuent très localement à engendrer un fonctionnement “en sur-régime”. En effet la biomasse est plus élevée au niveau du front par rapport aux zones adjacentes, ainsi que la production et le rendement de la photosynthèse. Cet enrichissement ponctuel résumé par Kerr (1986) pourrait même avoir une influence non négligeable à une échelle plus globale (Lohrenz et al., 1988; Claustre et al., 1994b). A cette variabilité spatiale de la biomasse à petite échelle s’ajoute en plus une variabilité inter-annuelle forte de la biomasse, puisque des concentrations en chlorophylle plus fortes avaient déjà été observées par Gould et Wiesenburg (1990) à la même période de l’année en 1987. Malgré ces variations inter-annuelles, les résultats des calculs d’estimation de la production primaire dans chacune des trois zones caractéristiques mises en évidence, confirment la très forte productivité de la zone frontale. Lors de cette étude, 3 masses d’eau différentes ont pu être caractérisées, avec deux systèmes typiques de conditions oligotrophes (les eaux méditerranéennes) et mésotrophes (le tourbillon atlantique) respectivement. Dans ces systèmes, la distribution des paramètres photosynthétiques correspondait à des situations déjà décrites (voir la discussion) classiques où le champ de lumière et la disponibilité en sels nutritifs étaient les conditions du milieu qui gouvernaient cette distribution. Au niveau du front lui-même, la complexité des circulations verticales a pu être mise en évidence grâce aux différents paramètres. De plus, les paramètres photosynthétiques étant non-conservatifs, des hypothèses quant à la vitesse de déplacement de certaines masses d’eau ont pu être émises, comme ceci avait été suggéré par Cullen et Lewis (1988). Dans ce système, la prédominance des variations spatiales des paramètres photosynthétiques par rapport aux variations circadiennes a pu être soulignée. Bien que l’existence de telles variations au sein de chacune des masses d’eau considérée séparément (cf. les variations observées en surface lors du Leg 2 dans le tourbillon) ne puisse être exclue, il est clair que l’essentiel des variations des paramètres photosynthétiques est ici gouverné par la disponibilité en sels nutritifs d’une part et par le champ moyen de lumière disponible dans la masse d’eau considérée ; ce dernier étant défini par la structure hydrologique du système via les différentes circulations. Soulignons pour finir que cette
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Chapitre III : Variations spatiales des paramètres de la photosynthèse en mer d’Alboran : influence des phénomènes hydrodynamiques à méso-échelle dans une zone frontale.
étude a eu lieu durant la période hivernale et qu’en conséquence, la faible amplitude circadienne de l’éclairement pourrait en partie expliquer qu’il n’ait pas été possible de mettre en évidence des variations circadiennes claires et marquées à tous les sites.
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Conclusions Générales
Conclusions générales
Dans ce travail de thèse, je me suis intéressée à l'étude des variations de la photosynthèse dans le milieu marin. Les 3 objectifs principaux de ce travail étaient : 1/ identifier les causes des variations circadiennes de la photosynthèse, 2/ étudier les effets d’une carence en phosphates du milieu naturel sur les paramètres photosynthétiques et 3/ étudier
la
répartition
des
paramètres
photosynthétiques
dans
une
zone
hydrodynamiquement instable. Dans un premier temps, une étude en laboratoire sur le procaryote photosynthétique marin Prochlorococcus a permis d’étudier les variations de la photosynthèse à l’échelle circadienne. Ces variations avaient déjà été mise en évidence y compris dans le milieu naturel. L’idée de travailler sur une culture était fondée sur la possibilité de pouvoir contrôler toutes les conditions et de limiter les variations circadiennes de l’environnement à celles de l’éclairement. A priori, si la photosynthèse présentait des variations circadiennes contrôlées par un facteur externe, elles devaient donc être liées à l’éclairement. Lors de cette étude, l’existence de variations circadiennes de la photosynthèse chez Prochlorococcus a été confirmée : le contenu cellulaire en zéaxanthine, les rendements de fluorescence et de fixation de carbone présentent bien des variations circadiennes. Mais la diversité des études menées au cours de cette expérience a permis en plus l’identification des processus induisant ces variations circadiennes. Comme pressenti, la lumière joue un rôle important, via le phénomène de photoacclimatation. Trois processus différents ont pu être identifiés comme étant à l’origine d’une part des variations circadiennes de la photosynthèse : 1/ le quenching nonphotochimique lié aux états de transition, 2/ un autre quenching non-photochimique peutêtre lié à des substitutions métalliques au niveau de la molécule de divinyle-chlorophylle a et 3/ la photoinhibition se mettant en place dans le centre réactionnel du PS2. Le rôle prépondérant du cycle cellulaire a pu être démontré pour la première fois grâce aux études réalisées lors de cette expérience sur la transcription de certains gènes impliqués dans le processus de la photosynthèse. Ainsi, les variations circadiennes de la photosynthèse résultent à la fois d’un contrôle externe par les facteurs environnementaux et d’un contrôle endogène lié au cycle cellulaire. Un autre point important est la mise en évidence réalisée au cours de cette étude de l’efficacité des processus adaptatifs existants chez Prochlorococcus. En effet, la culture a conservé sa croissance exponentielle tout au long de l’expérience et la quantité de carbone fixée chaque jour était considérable. Il a pu
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Conclusions générales
être montré que la majorité du carbone fixé quotidiennement l’était au cours de la matinée, ce qui permet à la cellule de demeurer disponible le restant de la journée afin de réaliser les autres fonctions vitales (et entre autre, la division cellulaire). Cette adaptation est en fait une organisation optimale des différentes fonctions cellulaires. Dans un deuxième temps, l’étude des variations des paramètres photosynthétiques a été menée dans le milieu naturel dans des zones hydrologiquement stables caractérisées par des régimes trophiques différents. L’existence de variations circadiennes de la photosynthèse a pu être confirmée. Et grâce à l’étude faite en culture sur Prochlorococcus, une partie des phénomènes mis en jeu dans ces variations naturelles a pu être identifiée. L’hypothèse de l’influence de la photoacclimatation, via un phénomène de quenching rapide (lié au cycle des xanthophylles) a pu être émise. Par contre, lors de cette étude dans le milieu naturel, il n’a pas été possible de confirmer le rôle éventuel de la division cellulaire sur les variations circadiennes de la photosynthèse (voir encart n° 2, page 88). En réponse à l’un des objectifs de la campagne PROSOPE, l’influence de la carence en phosphates sur les paramètres photosynthétiques a pu être étudiée dans le milieu naturel, en travaillant en Méditerranée. Les différents niveaux de carence observés aux différents sites visités ont permis de mettre en évidence qu’une carence prononcée en phosphates induit une baisse du rendement quantique de fixation de carbone ainsi que du taux maximal spécifique de fixation de carbone. En contrepartie, cette carence semble conduire à une augmentation de la section efficace d’absorption effective du PS2. Dans un troisième temps, l’étude des variations des paramètres photosynthétiques a été menée dans une zone hydrologiquement perturbée. Lors de ce travail effectué sur la zone frontale de la mer d’Alboran, deux systèmes océaniques ont été identifiés, de part et d’autre du front, présentant des caractéristiques classiques d’oligotrophie (les eaux méditerranéennes) et de mésotrophie (le tourbillon d’eau atlantique) respectivement. Dans ces deux systèmes, la distribution des paramètres photosynthétiques indiquait l’influence : 1/ de la lumière, avec une photoacclimatation différente de part et d’autre du front en relation avec la profondeur de la couche de mélange vs. la profondeur de la couche euphotique, 2/ des conditions trophiques, avec une photosynthèse plus efficace dans le système le plus riche, et 3/ de la température, avec un taux maximal spécifique de fixation de carbone plus élevé dans le tourbillon d’eau atlantique (plus chaud). Dans la
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Conclusions générales
zone frontale proprement dite, la distribution des paramètres photosynthétiques a contribué à l’identification des processus hydrodynamiques s’y développant. Ces structures sont dues aux mouvements d’eau engendrés par la circulation secondaire et sont: 1/ une remontée d’eaux profondes sur le bord gauche du Jet Atlantique, 2/ un enfoncement d’eau sur le bord droit du courant Méditerranéen et 3/ un mouvement d’enfoncement lié à la convection sur le bord gauche du tourbillon atlantique. La distribution des paramètres photosynthétiques dans cette zone a de plus permis de confirmer le caractère eutrophe et très productif de la zone frontale alors que celle-ci est engendrée par la rencontre de masses d’eau à caractère plus pauvre et dans lesquelles la fixation de carbone est moins importante. Ce surcroît de fixation de carbone réalisé dans la zone frontale est limité à une zone spatialement réduite. Cependant, il semble que la présence du front induise une hausse de la fixation de carbone (via l’augmentation du taux maximal spécifique de fixation de carbone) dans la zone adjacente du tourbillon et explique ainsi son caractère mésotrophe. Ainsi l’impact sur la production primaire de telles zones peut s’exercer à plus large échelle. Il semble donc d’autant plus nécessaire d’étudier cet impact des zones frontales dans les modèles évaluant la production primaire à plus large échelle ; cet impact pouvant être non négligeable lorsque l’on considère des fronts situés dans des zones oligotrophes. Ce travail a donc permis d’identifier les principaux processus induisant les variations circadiennes de la photosynthèse en culture comme dans le milieu naturel. Il a également permis de comprendre l’impact de la limitation par les phosphates sur les paramètres photosynthétiques. Enfin, il a été montré au cours de ce travail que les paramètres photosynthétiques pouvaient être utilisés dans le milieu naturel comme traceurs de certains processus physiques. Pour établir un bilan de la partie de ce travail réalisée en mer, les données des paramètres de saturation (EK) moyens mesurés dans les couches mélangées échantillonnées lors des campagnes ALMOFRONT 2 et PROSOPE, en fonction de l’éclairement moyen dans les couches de mélange considérées (PARZml, µmol quanta m2 -1
s ) (voir Babin et al., 1996 et leur Figure 12), ont été comparées aux données obtenues
lors de précédentes campagnes (Figure Conclusion-1). Les données acquises lors de ce travail de thèse sont très cohérentes avec celles obtenues auparavant lors des campagnes
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Conclusions générales
EK moyen (µmol quanta m-2s-1)
800 Almofront (eaux méditerrannéennes) Almofront (front) Almofront (tourbillon atlantique) Prosope UPW Prosope MIO
600
Prosope DYF Flupac Olipac Eumeli EK = 1/2 PARZml
400
EK = 1/3 PARZml
200
0 0
200
400
600
800
1000
1200
PARZml (µmol quanta m-2s-1)
Figure Conclusion-1. EK moyen dans la couche mélangée (µmol quanta m-2s-1) en fonction de l’éclairement moyen dans la couche de mélange (PARZml, µmol quanta m-2s-1 ) pour différentes campagnes.
Conclusions générales
FLUPAC et OLIPAC réalisées dans l’Océan Pacifique, avec des valeurs de EK moyen réparties entre les droites EK = ½ PARZml et EK = 1/3 PARZml. Seul le point obtenu lors de la campagne PROSOPE sur le site de l’upwelling du Maroc se détache de ce jeu de données en se situant nettement en dessous de ces droites. Ceci s’explique logiquement par la provenance profonde du phytoplancton amené rapidement en surface par les mouvements ascendants de l’upwelling et donne un indice supplémentaire sur la cinétique de ce mouvement ascendant par rapport à ceux rencontrés dans le système frontal de la mer d’Alboran. Le site eutrophe échantillonné lors de la campagne EUMELI (EK > PARZml) présente lui aussi des caractéristiques particulières vraisemblablement liées aux conditions hydrologiques.
• Quelles sont les perspectives de ce travail ? L’un des propos majeurs de l’océanographie actuelle est, nous l’avons déjà dit, la compréhension globale du cycle du carbone à l’échelle de la planète dans le but de prédire l’évolution de la concentration atmosphérique en dioxyde de carbone ainsi que les conséquences de cette évolution (par exemple au niveau de la modification de la température moyenne de notre planète). Mais pour travailler sur le cycle du carbone dans l’océan à une échelle aussi globale, il est maintenant indispensable d’utiliser l’outil mathématique de façon à modéliser le fonctionnement des différents bassins océaniques. La plupart des modèles permettant d’évaluer la production primaire océanique, ne tiennent pas compte de la physiologie du phytoplancton – responsable de cette fixation -, mais seulement des conditions “physiques” du milieu. Le modèle de Morel (1991) tient compte de la physiologie du phytoplancton, mais les paramètres décrivant cette physiologie sont considérés comme étant constants au cours de la journée. Etant donné qu’il paraît clair à présent que ceci ne reflète pas le fonctionnement réel de la photosynthèse dans l’océan, il faudrait envisager d’intégrer ces variations circadiennes de la photosynthèse aux différents modèles de production primaire.
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Conclusions générales
“direction pour les travaux futurs” Dans un premier temps, il est nécessaire de faire une étude de sensibilité afin de déterminer l’impact de la prise en compte des variations circadiennes des paramètres photosynthétiques sur l’estimation de la production primaire. Si l’on prend comme exemple l’étude menée en culture lors de ce travail de thèse, il faudra donc tester l’impact B d’une variation circadienne de Pmax d’un facteur 4 dans les prévisions de la production
primaire. Pour cette étude de sensibilité il n’est peut être pas nécessaire de travailler tout de suite à l’échelle d’un bassin, mais de choisir un nombre suffisant de profils par exemple. Cette étude pourrait se faire en découpant la durée du jour en période de 1 ou 2 heures (par exemple) et en appliquant à chacune d’elle une valeur de PBmax différente. Par la suite la somme des différentes périodes de jour se ferait de la même façon et il serait ainsi possible de voir si cette prise en compte modifie significativement les résultats obtenus par rapport à la prise en compte de paramètres constants. Dans l’affirmative, il conviendrait alors d’envisager de faire le même type de modifications à l’échelle d’un bassin entier. Par la suite, des corrections des modèles pour les différentes régions océaniques devront être envisagées. Il sera par exemple possible d’utiliser le système de culture original décrit dans ce travail, de façon à pouvoir étudier (comme nous l’avons fait pour une espèce caractéristiques de la zone océanique tropicale) des espèces phytoplanctoniques caractéristiques d’autres systèmes océaniques. En effet, même s’il a déjà été montré que des variations circadiennes de la photosynthèse existent chez d’autres organismes phytoplanctoniques, les rythmes de variations des différents paramètres ne sont pas forcément les mêmes. A la lumière des travaux effectués ici, il conviendrait de tester dans un premier temps les zones océaniques caractérisées par des régimes hydrologiques stationnaires (Pacifique Sud, Gyre Atlantique, mer des Sargasses, ensemble de la Méditerranée), celle-ci étant a priori les plus susceptibles de présenter ce types de variation. Il sera alors possible de déterminer l’étendue géographique de l’impact des variations circadiennes des paramètres photosynthétiques. Une modélisation de plus grande précision pourra ainsi être faite dans les différentes zones de l’océan mondial permettant par là même l’établissement d’un nouveau bilan de carbone plus précis à l’échelle globale.
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Conclusions générales
Dans un second temps, il serait également intéressant de vérifier l’étendue en profondeur des variations circadiennes de la photosynthèse. On sait déjà que la synchronisation de certaines populations naturelles s’étend en profondeur dans la colonne d’eau en se décalant dans le temps (Vaulot et al., 1995). On sait également que les phénomènes de photoacclimatation s’étendent en profondeur, par contre, il conviendrait de vérifier quelle est l’amplitude d’éventuelles variations circadiennes des paramètres photosynthétiques (et en particulier de PBmax) le long de la colonne d’eau de façon à encore affiner les estimations de la fixation de carbone à une échelle globale.
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ANNEXE 1
Bruyant et al. (2001) An axenic cyclostat of Prochlorococcus PCC 9511 with a simulator of natural light regimes. J. Appl. Phycol. 13 : 135-142.
Journal of Applied Phycology 13: 135–142, 2001. © 2001 Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands.
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An axenic cyclostat of Prochlorococcus PCC 9511 with a simulator of natural light regimes F. Bruyant, M. Babin∗ , A. Sciandra1 , D. Marie2 , B. Genty3 , H. Claustre, J. Blanchot2 , A. Bricaud, R. Rippka4 , S. Boulben2 , F. Louis & F. Partensky2 Laboratoire de Physique et Chimie Marines, Universit´e Pierre et Marie Curie and CNRS, ESA 7077, BP 8, 06238 Villefranche-sur-Mer CEDEX, France 1 Laboratoire d’Oc´eanographie Biologique et Ecologie du Plancton Marin, Universit´ e Pierre et Marie Curie and CNRS, BP 28, 06234 Villefranche-sur-Mer CEDEX, France 2 Station Biologique, Universit´ e Pierre et Marie Curie and CNRS, BP 74, 29680 Roscoff, France 3 Laboratoire d’Ecophysiologie V´eg´ etale, Universit´e Paris Sud and CNRS, UPRESA 8079, 91405 Orsay, France 4 Unit´e dePhysiol Microbienne (CNRS URA 1129), D´ epartement de Biochimie et G´en´etique Mol´eculaire, Institut Pasteur, 28 Rue du Dr. Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France (∗ Author for correspondence; phone +33-4 93 76 37 12; +33-4 93 76 37 39; e-mail
[email protected]) Received 29 September 2000; revised 15 November 2000; accepted 15 November 2000
Key words: cyclostat, Prochlorococcus, culture, axenic, cycle, phytoplankton
Abstract A cyclostat was designed for growing the oceanic oxyphotobacterium Prochlorococcus PCC 9511. Culture of this organism, known to be difficult to grow, was mastered for a large volume. Prochlorococcus grew well and axenic conditions were maintained for up to 15 days. We designed an illumination system allowing a smooth bellshaped irradiance curve reaching almost 1000 µmol quanta m−2 s−1 to be obtained. Cell division was strongly synchronised under these illumination conditions, which were close to those found at low latitude in the upper layer of ocean. The described device is particularly well suited to make experiments requiring up to 6 L per day of well synchronised, exponentially-growing Prochlorococcus culture.
Introduction Automatic systems for the culture of unicellular algae are commonly used in experimental phycology for replacing batch cultures when stable and/or controlled growth conditions are required. In such systems, renewal rate of the culture medium is fixed, or continuously adjusted according to prescribed values of growth (chemostat) or biomass (turbidostat) criteria. Chemostat is well designed to study the static or dynamic effect of nutrient deficiency on microalgal physiology (e.g. Herzig & Falkowski, 1989; Sciandra et al., 1997). Turbidostat, which allows to maintain cultures at maximal growth rate, has often been used for the study of physiological processes governed by light (e.g. Falkowski & Owens, 1980).
A major limitation in the use of automatic culture systems is the difficulty to maintain axenic conditions. This is because these systems always involve a fresh medium input and several outputs for waste, punctual sampling and continuous analyses. Moreover, the special dishes used are often cumbersome, complicated to handle (to set up and remove) and not proper for sterilisation treatments. Although Groeneweg and Soeder (1978) have successfully run axenic turbidostats and chemostats for up to 2 months using a special, smallvolume (ca. 350 mL) glassware, continuous culture in axenic conditions remains little used, especially for phytoplankton like Prochlorococcus, partly because the deployment of such a system is expensive and laborious. Non-axenicity has many drawbacks. When
136 phototrophs have a size close to that of contaminant heterotrophic bacteria, as is the case for some small cyanobacteria, discrimination is not possible using most particle counters. Analysis of the particulate carbon concentration is also useless in this case as a significant part of the biomass in fact belongs to bacteria. Measured respiration results both from phototrophs and bacteria catabolism. Finally, for molecular studies dealing with expression of non-photosynthetic genes, presence of bacteria makes interpretation difficult because of the risk of cross-hybridisation of gene probes with contaminant DNA or RNA. Another difficulty when running continuously cultures for the study of environmental forcing is encountered with light. The smooth temporal variations and the spectrum of solar radiation are hard to simulate. Therefore, turbidostats are often run under binary or stepwise light:dark cycles. Kroon et al. (1992) introduced a ‘cyclostat’ with computer-controlled venetian blinds that allows the natural sun cycle to be accurately simulated (see also Kroon & Dijkman, 1996). New technologies now allow such a system to be deployed much more easily and at a low cost. In this paper, we present a large-volume axenic cyclostat with a very simple design, that uses common non-toxic consumables now commercially available, and is equipped with an easy to handle computercontrolled illumination system that relies upon the use of dimmable neon tubes. This cyclostat was developed for the culture of Prochlorococcus PCC 9511, the first Prochlorococcus strain having been made axenic (Rippka et al., 2000). Until recently, Prochlorococcus was known to be difficult to grow in the laboratory as it is an algae very sensitive to any small change in its culturing conditions (R. Rippka, pers. comm.). With an average cell size of ca. 0.6 µm, Prochlorococcus is the smallest photosynthetic organism known to date (Partensky et al., 1999a). It is particularly abundant in the oligotrophic tropical ocean from the well-illuminated surface waters down to the ‘deep chlorophyll maximum’, where irradiance is often below 1% of the incident solar light in surface (Partensky et al., 1999b). Furthermore, at all depths, Prochlorococcus cell division has been found to be highly synchronised by the natural alternation of day and night (Vaulot et al., 1995). The problem to be overcome was to grow Prochlorococcus PCC 9511 in continuous culture at a maximum irradiance approaching 1000 µmol quanta m−2 s−1 , i.e. close to that observed in the upper layer of open ocean. Furthermore, this cyclostat
had to remain axenic during the entire duration of the experiment (PROchlorococcus MOLecular ECology, lab-workshop held in Roscoff France in May 1999), and to produce a sufficient amount of culture to concomitantly perform a large variety of measurements (including flow cytometric cell counting, optical and photosynthetic parameters determination, pigments, carbon and nitrogen content evaluation as well as expression of photosynthetic and cell cycle genes).
Methods Characteristics of the axenic Prochlorococcus PCC 9511 have been recently described (Rippka et al., 2000). Two experiments using this strain are presented below. In the first one, we determined some parameters of the turbidostat on a moderate culture volume and under continuous illumination. In the second experiment, we tested the system for large volume and exposed it to a simulated natural light cycle (cyclostat mode). First experiment The culture medium was directly prepared into a 20-L polycarbonate tank using sea water from the English Channel collected at 5 m in the Bay of Morlaix (France). Sea water was stored during more than one month at room temperature, then filtered through a Millipore 0.2 µm filtering cartridge and autoclaved at 120 ◦ C during one hour. The PCR-S11 stock solutions (Partensky et al., 1999a; Rippka et al., 2000) were added after filtration through 0.2 µm sterile filters (vitamins and metals solutions) or autoclaving [HEPES, Na2 .EDTA/FeCl3 , (NH4 )2− SO4 and Phosphate buffer]. The only modifications with regard to the original PCR-S11 recipe were that Na2 EDTA/FeCl3 and vitamin B12 were supplied at 2 µM and 0.7 nM, respectively. Prochlorococcus PCC 9511 was grown at 21 ◦ C in a 2.8-L cylindrical polycarbonate bottle filled with 1.7 L culture medium. The entire culture set up, including the vessel, the different input and output tubes and filters, was autoclaved at 110 ◦ C for 20 min. All parts were made of either Teflon, silicone, polycarbonate or polyethylene. The renewal medium was introduced continuously into the culture using a peristaltic pump (Gilson Minipulse 2) through a 0.2 µm sterile filtration cartridge (Pal Gelman SpiralCapr ). Air could exchange with the culture vessel through a sterile 0.3µm
137
Figure 1. Schematic diagram of the turbidostat.
Whatman Hepa-VentTM. Continuous illumination was provided by three mercury lamps (OSRAM HQI – TS) placed above the culture system, through a Plexiglas cover and sheets of blue supple plastic filter (Lee Filters, n◦ 183). Photosynthetically available radiation (PAR, irradiance integrated between 400 and 700 nm), as measured using a quantum scalar irradiance meter (Biospherical Instruments, QSL 100), was set at 45 ± 5 µmol quanta m−2 s−1 , a value close to the optimal continuous growth irradiance under blue light for the closely related strain MED4 (Moore et al., 1995). The volume of the culture was stabilised at 1.7 L by pumping excess out (Figure 1). Samples were collected twice a day, after a gentle stirring of the vessel, although culture seemed homogeneous by eye. To reduce the risk of contamination, the end of the collector tubing was pinched with two clamps. For sampling, the part of the tube located between the two clamps was cut with flamed scissors. After sampling near a Bunsen, the removed clamp was put back upstream the remaining clamp till the next sampling. The spectral absorbance, A(λ), due to algal cells was measured in a 1-cm quartz cuvette using a dual beam spectrophotometer equipped with an integrating sphere (Varian, DMS-100), with 1-nm increments between 380 and 750 nm. Filtered medium from the culture (0.2 µm syringe filters; Pal Gelman Acrodiscr ) was used as reference. A(750) was subtracted from A(λ) to correct for residual scattering (see e.g. Stramski & Reynolds, 1993). A(λ) measure-
ments, used here as biomass index, were duplicated (as well as the reference) and averaged. During the batch phase, the growth rate, µ, was calculated from: h A(442) i t µ(t) = 1n 1t −1 A(442)t −1t where A(442)t and A(442)t −1t are the absorbances at time t and t-1t, respectively, 1t being the time elapsed between current and previous measurements. During the turbidostat phase, the dilution flow rate was controlled twice a day by weighing, and adjusted to a new value if necessary, to compensate for A(442) variations. Axenicity of the culture was checked daily. Petri plates were filled with PCR-S11 medium with 8 gL−1 agar and enriched with 1 g D+ glucose and 0.2 g of casein acid hydrolysate per litre of medium. Two different inoculum volumes were tested, 50 and 200 µL. Absence of bacterial colonies on plates 6 days after inoculation, as compared to a positive control consisting in a similar volume of non-bacteria-free Prochlorococcus culture, indicated that the initial sample was axenic. Second experiment The turbidostat culture was then modified in order to yield large daily volumes of Prochlorococcus culture. Twelve polycarbonate Nalgene carboys filled with 10 L of sterile PCR-S11 medium were connected by an equal length of silicone tubing to a peristaltic pump (Masterflex model 7523-37, Cole-Parmer Instrument Co), set at a mean rate of ca. 8 mL min−1 and running on continuously. Note that the total quantity of fresh medium needed for the entire experiment must be planned before the start in order to avoid changes in medium composition. The medium was then split into two lines, each having two autoclaved 0.2 µm SpiralCapTM capsules mounted serially and being coupled to a 20 L Nalgene polycarbonate jerry-can. Both jerry-cans (cyclostats 1 and 2) were immersed into a glass aquarium filled with running water thermostated at 21 ± 1 ◦ C using a circulating bath (Huber, Minichiller). The entire culture set up (tubing, connections and containers) was rinsed before use (HCl and Milli-Q water) and autoclaved to decrease the risks of contamination. Assemblages of the different tubing should be done under the laminar hood or near a Bunsen. The excess volume of culture was continuously pumped out with a peristaltic pump in a closed carboy which was sterilely emptied by pumping when needed. In our experiment, the culture vessels were
138 not stirred at any time since healthy Prochlorococcus cells generally do not settle down. Use of this culture system for studies of nutrient limited cultures may require the cultures to be gently stirred to allow a better homogenisation of nutrients in the culture. The most original part of the set-up was the illumination system, which transformed the turbidostat into a ‘cyclostat’ (sensu Kroon et al., 1992). It consisted of two white plates placed on opposite faces of the culture containers, each supporting a set of six 50-cm U-shaped, dimmable neon tubes (OSRAM, DULUXr L, 2G11, 55 W / 12 – 950, LUMILUX DE LUXE, daylight). The tubes were disposed head to tail with a ca. 20 m−1 density. Each tube was connected to an electronic ballast (OSRAM, Quicktronicr, QT 1 × 55 / 230 – 240 DIM), power supplied with 220 VAC. Their 0–10 VDC analogue input allows to modulate the neon tube output between 1 to 100%. The ballast’s were controlled using a data acquisition board (ADAC, 5525MF-V, 26330) equipped with two 12-bit digital-to-analogue channels and sixteen 12-bit analogue-to-digital channels. The ADAC card was driven by a personal computer using the Labtech Notebook software (Laboratory Technologies Corp.) version 10.11. To generate a simulated natural lightdark cycle, two functions were sequentially applied: a PAR vs. time function and an input-VDC vs. PAR one. The PAR vs. solar time relationship was calculated with 300-s time steps using a radiative transfer code (Sequoia Scientific Inc., Hydrolight, Version 3) for June 1, at equator, under standard clear sky atmospheric conditions (as defined in Morel, 1991), and just below ocean surface. The resulting lookup table was read every second using linear interpolation. The input-VDC vs. PAR relationship of the neon tube – ballast set was determined using a laboratory power supply coupled to an oscilloscope (LeCroy, 9310 C) and a quantum scalar irradiance meter. A least squares spline function was fitted to the experimental relationship and a lookup table was produced with 1 × 10−5 increments on a PAR 0–1 relative scale. At the beginning of the light period, the shift from 0 to 1% was done in two time steps by turning on one neon tube over two. All tubes were then controlled together using the functions described above. The light provided by this system was diffused through a plastic foil (Lee Filters, ‘white frost’, n◦ 220) wrapped around the aquarium where Prochlorococcus cultures were immersed. Just after the end of the experiment, PAR was measured inside the cul-
ture at full light power (equivalent to solar noon) using a quantum scalar irradiance meter (LI-COR LI1000) equipped with a 4-π spherical probe. Average irradiance was 970 and 912 µmol quanta m−2 s−1 in cyclostats 1 and 2, respectively. PAR temporal variations were monitored in relative units using another quantum scalar irradiance meter (Biospherical Instruments, PNF-300 reference collector) connected to the analogue-to-digital channels of the data acquisition board. The irradiance spectrum of the neon tube was measured between 350 and 750 nm with 1nm increments using a spectroradiometer (LI-COR, LI-1800UW). Prochlorococcus cells were acclimated for 15 days to the light:dark cycle before a four-day period of extensive sampling. Culture was first grown in batch for 4 days then run for 7 days in cyclostat mode with a maximal level in the Jerry-cans set at 2 L, then the volume was progressively increased up to 10 L within one day and remained at this level for three days prior to the beginning of extensive sampling. With this volume and when accounting for wastes, approximately 6 L of culture growing at an estimated growth rate of one division per day (i.e. µ = 0.69 d−1 ) could be sampled daily without affecting population growth (but see results). During the dark period, sampling was made under low green illumination, which is not absorbed by Prochlorococcus cells (Morel et al., 1993; Shimada et al., 1996) and therefore did not disturb cell growth. The two cyclostats were not sampled at the same frequency. Cyclostat 1 was sampled every second hour (except at 04:00) for a variety of analyses (including optics, flow cytometry, photosynthetic parameters, pigments, C/N, TEM, etc.) and cyclostat 2 every fourth hour for flow cytometry and RNA. In the present paper, we will only report absorbance at 442 nm, cell number, individual cell near-forward light scattering (hereafter denoted NFS) and DNA cellular content. Absorbance was measured as described above but using a Perkin Elmer Lambda 19 spectrophotometer. Cell number, NFS and DNA cellular content were determined using a FacScan flow cytometer (Becton Dickinson). Immediately after sampling, cells were fixed with a mixture of 1% paraformaldehyde and 0.1% glutaraldehyde for 15 min (both chemicals from Sigma), then frozen in liquid nitrogen and stored at –80 ◦ C. Once thawed, cells were stained using a 1/10 000th dilution of the commercial solution of the DNA dye SYBR-Green I (Molecular Probes Inc.), then analysed, as detailed elsewhere (Marie et al., 1999). The same measurement
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Figure 2. Changes in absorbance at 442 nm with time for the batch culture grown during the first experiment (determination of the optimal conditions). An exponential function was fitted to experimental data within the window illustrated on the plot to determine the growth rate (µ).
Figure 3. Changes in absorbance at 442 nm with time for the turbidostat grown during the first experiment. Absorbance first increases during the batch mode culture. Absorbance is stable during the turbidostat mode culture. At day 10,75 the dilution rate was increased. At day 15,75, the dilution was stopped.
allowed to determine Prochlorococcus cell number using divinyl-chlorophyll a red fluorescence, their NFS, and their DNA cellular content using green fluorescence, and to determine whether contaminant bacteria were present in the culture.
To start the turbidostat, a second batch culture was initiated under conditions similar to the first one. µmax was estimated to 0.55 d−1 during the exponential phase. This discrepancy of µmax values between the 2 runs is not significant and might be due to error in the determination of the growth rate (up to 10%, Sciandra, pers. comm.), and to the use of absorbance which is a better indicator of the biovolume than of the cell number. Once the density reached A(442) = 0.04, the culture was then diluted with new medium at a rate of ca. 0.5 d−1 with daily adjustments. Note that in theory, the renewal rate (r), when defined as: 1v r= V 1t where v is the renewed volume and V is total volume of the culture, must equal µmax to maintain the biomass constant but must not exceed µmax to prevent flushing the culture. Figure 3 shows that a nearly constant A(442) was maintained within ca. 10%. After 10.75 days, the dilution rate was increased to 0.6 d−1 to see if the growth could be enhanced. µ did not change significantly (data not shown), which indicates that the culture was not nutrient limited, and consistently A(442) decreased. After 15.75 days, dilution was stopped to evaluate the capacity of the remaining medium in the turbidostat to support higher biomass. After the dilution was stopped µ was 0.51 d−1 , and the biomass increased up to 0.06 only, which emphasises the occurrence of natural and experimental variations. The axenicity was maintained until day 13.
Results and discussion First experiment Prior to starting the turbidostat, a batch culture was first done to determine the exponential-growth range and the maximum carrying capacity (MCC) of the medium in terms of A(442), as well as the maximal growth rate (µmax ) of the Prochlorococcus PCC 9511 under the experimental conditions. Figure 2 shows A(442) as a function of time for the batch culture. The growth was exponential up to a A(442) value of 0.06 and the MCC was 0.09. µmax was on average 0.66 d−1 (one doubling per day) during the exponential phase, as estimated by fitting an exponential function to A(442) vs. time data within the time window shown in Figure 2. Although the exponential-growth range extended up to 0.06 in terms of A(442), we adopted 0.04 as upper limit for turbidostat operation 1) to anticipate variations in the culture medium composition that may induce a slower growth, 2) to account for the fact that, at A(442) = 0.06, cells are probably growing on internal reserves, and 3) to keep the culture optically thin.
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Figure 6. Spectral values of irradiance for the neon tube used in the second experiment, measured at 3 different input-VDC (1, 5 and 10 VDC) corresponding to 1, 42 and 100% of maximal neon tube irradiance.
Figure 4. PAR as a function of time during the cyclostat experiment.
Figure 5. PAR vs. Input-VDC response of the ballast – neon tube set. The data from two independent measurement series have been pooled to calculate the least-square spline function.
Second experiment Figure 4 shows PAR as a function of time, as determined from radiative transfer calculations and as measured during the second experiment. Figure 5 illustrates the input-VDC vs. PAR response of the ballast – neon tube set and the fitted spline function. The measured PAR vs. time function shows some departure from the calculated one (< 7%), as well as a slight asymmetry. This discrepancy between the input and output PAR vs. time relationships is partly due to the fact that the PAR vs. input-VDC response was characterized on a single ballast-neon-tube unit, i.e. in a configuration different from the final one (with
12 units). The asymmetry in the measured PAR vs. time relationship is likely due to some hysteresis in the PAR vs. input-VDC response of the ballast-neon tube set. It could be compensated for by deriving separate PAR vs. input-VDC responses for the increasing and decreasing components of the PAR vs. time relationship. Figure 6 illustrates normalised irradiance [E(λ)] spectra of the neon tube, measured at 3 different inputVDC (1, 5 and 10 VDC) corresponding to 1, 42 and 100% of maximal neon tube irradiance. It shows that the shape of the E(λ) spectrum does not change significantly with input-VDC. Although these spectra are much featured compared with the sun irradiance spectrum, they cover well the PAR range. To better simulate the underwater irradiance spectrum, one can complement the system for instance with blue filters such as the ‘Moonlight Blue’ (Lee Filters, n◦ 183) which allows to simulate realistic underwater spectral irradiance. Note that the illumination system described here can reach PAR values of up to about 3 000 µmol quanta m−2 s−1 closer to the source, which is plenty to obtain high PAR even with a blue filter. Figure 7 shows A(442) variations in cyclostat 1 during the four-day period of intensive sampling. It varied first around 0.02, then dropped down around 0.013 at the end of the second light period, and progressively decreased to 0.01. Cell number in both cyclostat showed a similar pattern with a clear oscillation during the first two days. The night increase was due to cell division, which was highly synchronised, whereas the day decrease was due to dilution with fresh medium. This oscillation was obscured during the last 48 h (and especially last day) of the
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Figure 7. Temporal variations over 4 complete days of sampling in cyclostat 1 and 2 of Prochlorococcus cell number, and cyclostat 1 A(442) and PAR.
experiment, likely because of oversampling combined with excessive dilution to maintain the volume of the culture. Nevertheless, as will be shown below and detailed elsewhere, cells still divided at high rates and most cellular parameters (cell size, pigments, photosynthetic parameters) continued to show strong and reproducible diel patterns (see below). It is worth noting here the reproducibility between the two cyclostats in terms of cell number (Figure 7). The fact that biomass indicators oscillates when phototrophs are submitted to a light-dark cycle was previously noted by Kroon et al. (1992). He suggested that continuous monitoring as well as continuous adjustment of biomass could not be conducted without ambiguity when a dynamic light regime is applied. In fact, the cyclic light regime induces cyclic variations in all biomass descriptors. Using such a biomass descriptor to continuously adjust dilution would obviously lead to cyclic variations in the dilution rate that may in turn eventually affect the biomass index. To avoid any such loop in the culture physiology and biomass control, dilution rate must be adjusted only once a day, and always at the same time of the cell cycle, based on some optical measurement or cell counts. Here, we adopted a continuous dilution strategy where dilution was adjusted (according to cell counts) at the dark to light transition. This strategy proved to be relatively efficient in terms of biomass and physiological
Figure 8. Temporal variations over 4 complete days of sampling in cyclostat 1 of Prochlorococcus NFS, DNA cellular content, and PAR.
stability at least during the pre-experiment phase as well as for the first 48 h of the extensive sampling. The cyclostat remained perfectly axenic from inoculation until the beginning of the sampling period (15 days in all). During the 4-day experiment, presence of bacteria was extemporarily followed by flow cytometry. No bacteria were detected till 36 h after sampling start. After this time, a bacterial population, probably introduced during the intensive sampling, was systematically observed in cyclostat 1 (not determined for cyclostat 2) and its density slowly increased from less than 1.6% of the Prochlorococcus cell population at t = 38 h to ca. 5.6% at the end of the experiment (96 h). Figure 8 shows diel variations in NFS and DNA cellular content observed during 4 days in order to illustrate the stability of the cyclostat presented here in physiological terms. In the Prochlorococcus size range, NFS depends on cell size (Ackleson & Spinrad, 1988), and on cellular carbon content as it depends on the refractive index (Stramski & Reynolds, 1993). Therefore the diel cycle in NFS was likely produced by 1) the accumulation of cellular carbon during the light period which resulted from photosynthetic activity, and 2) a decrease during the dark period due to cell division followed by the consumption of carbon by catabolism. The diel pattern of the average DNA content per Prochlorococcus cell was even more reproducible. It was characterized by a sharp increase starting just before the end of the light period and that
142 lasted 4 h. This increase corresponded to the DNA synthesis phase. It was followed by a strong decrease of DNA content due to cell division, which lasted approximately the same time as DNA synthesis.
authors gratefully acknowledge Bernard Gentili for calculating the bell-shaped illumination curve. References
Conclusion This study has demonstrated the feasibility of maintaining the difficult-to-grow Prochlorococcus in large volume (10 L) axenic containers. Special care must be taken to avoid contamination during intensive sampling, as it apparently happened after two days in at least one of the cyclostats. We also recommend that the volume of sample taken each day should rather be slightly below than at the expected growth rate of the species, as oversampling may lead to dilution of the population. However, the latter may not be a major problem, since even at lower concentration, the population remained healthy, very well synchronised (Figure 8), and therefore usable to study a number of processes such as e.g. cell cycle, photosynthesis, gene expression, etc. The illumination system we designed is suitable for simulating any kind of natural irradiance variations in the aquatic environment. This system can be used to precisely simulate a natural light-dark cycle in order to study in detail the synchronization of the cell division as observed in the field. It can also be very useful to study the effects of clouds and vertical mixing as well as photoinhibition. The overall system is cheap and easy to deploy. Its main drawbacks are 1) the highly featured irradiance spectrum of the neon tube which does not match the solar spectrum, and 2) the quasi-absence of any ultraviolet radiation. Metal halide discharge lamps can be found with a spectrum that mimics much better the solar one. However, these lamps are expensive, never dimmable and produce much heat. Their use to generate smooth light variations implies the use of more complicated optical set up such as, for instance, venetian blinds. Other dimmable neon tubes with better spectral properties may exist or appear on the market. Acknowledgements The culture systems described here were designed for a workshop held in the framework of the European Commission research project PROMOLEC (contract n◦ MAS3-CT97-0128). We would like to acknowledge several persons who greatly contributed to the success of this experiment, including Dr Daniel Vaulot, Stéphan Jacquet and Ms Florence LeGall. The
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ANNEXE 2
Bruyant et al., en préparation pour soumission à Limnol. Oceanogr. Diel variations in the photosynthetic parameters of Prochlorococcus strain PCC 9511 : combined effects of light and cell cycle.
Diel variations in the photosynthetic parameters of Prochlorococcus strain PCC 9511: combined effects of light and cell cycle.
Bruyant 1 F., Babin 1 M., Genty 2# B., Prasil 3 O., Behrenfeld 4 M.J., Claustre 1 H., Bricaud 1 A., Holtzendorf 5 J., Koblizek 3 M. and Partensky 6 F.
1
Laboratoire d'Océanographie de Villefranche, Université Pierre et Marie Curie and CNRS, BP 8,
06238 Villefranche sur Mer CEDEX, France 2
Laboratoire d’Ecophysiologie Végétale, Université Paris Sud and CNRS, 91405 Orsay, France
3
Photosynthesis Research Center at the Institute of Microbiology AVCR and University of South
Bohemia, Opatovicky mlyn, 37981 Trebon, Czech Republic 4
NASA / GSFC, Code 971, Building 33, Greenbelt MD 20771, USA.
5
Humboldt-University, Institute of Biology/Genetics, Chausseestr. 117, D-10115 Berlin, Germany
6
Equipe Phytoplancton Océanique, Station Biologique, Université Pierre et Marie Curie and CNRS, BP
74, 29682 Roscoff Cedex, France
Running head: quantum yield, non-photochemical quenching, carbon fixation, cell cycle, Prochlorococcus.
#
Present adress: CEA/Cadarache, DSV, DEVM, Laboratoire d’Ecophysiologie de la Photosynthèse, UMR 163
CNRS-CEA, 13108 Saint-Paul-lez-Durance cedex, France
AKNOWLEDGMENTS The results presented here were obtained during a workshop held in the framework of the European Commission research project PROMOLEC (contract n° MAS3-CT97-0128). We would like to thank Dr Daniel Vaulot, Stéphan Jacquet and Ms Florence LeGall, who greatly contributed to the success of this experiment. We are grateful to Rose-Mary Rippka for providing us the first axenic strain of Prochlorococcus PCC9511, to Laurence Garzareck for providing her data, to David d’Arena who performed the HPLC analyses and to Helena Dousova for technical assistance. O.P. and M.K. were supported by the projects Barrande 99026 and Ministry of Education LN00A141. We also thank Antoine Sciandra for helpful discussion about Neale model.
ABSTRACT We studied the diel variations in the photosynthetic properties of the oxyphotobacterium Prochlorococcus. Continuous cultures were run under a smooth light-dark cycle peaking at 970 µmol quanta m-2 s-1 that simulates natural conditions in the ocean upper layer. These growth conditions induced a strong and stable synchronization of the cell cycle in the population. During the 3-day monitoring, the maximum quantum yield (φC max) systematically showed a steep decrease (factor of 4) at the beginning of the day that paralleled the irradiance increase. The maximum rate of carbon fixation (PBmax) showed a similar amplitude of decrease but was delayed by 4 hours. Full recovery in φC max and PBmax occurred only during the second half of the dark period. To understand this variation pattern, we simultaneously monitored the quantum yield of in vivo chlorophyll a fluorescence, the photochemical efficiency of Photosystem II (PS2), the effective absorption cross section of PS2, and the redox kinetics on the acceptor side of PS2. The major cause for the initial decrease observed in φC max was induction of photoprotective mechanisms (non-photochemical quenching) and photoinhibition that progressively took place in a sequence of events on the acceptor side and in the antenna of PS2. The recovery from quenching was seemingly delayed by cell division peaking at the beginning of the dark period indicating the diel cycle in fluorescence was at least partially governed by the cell cycle. Transcription patterns of some genes encoding components of the photosynthetic apparatus were also monitored in an attempt to understand the link between the cell division and changes in the photosynthetic apparatus. The impact of the observed diel changes on primary production is examined.
SYMBOLS AND ABBREVIATIONS PS2
Photosystem 2
RC2
Reaction center of photosystem 2
FRR
Fast repetition rate
PAM
Pulse amplitude modulated
DMK
Dual-modulation kinetic
DIC
Dissolved inorganic carbon
DCMU
3-(3,4-dichloro-phenyl)-1,1-dimethylurea
DMSO
Di-methyl sulfoxide
RubisCO
Ribulose 1-5 bi-phosphate carboxylase oxygenase
rbcL
Gene encoding the large sub-unit of the RubisCO protein
pcbA
Gene encoding the major light harvesting complex of PS2
psbA
Gene encoding the D1 protein of RC2
PQ
Plastoquinone
kPQ
reoxydation rate for plastoquinol (acceptor side of photosystem 2)
div-chl a
Divinyl-chlorophyll a
PAR
Photosynthetic available radiation (µmol quanta m-2s-1)
Fx
Fluorescence flash level (rel. units) of in vivo chlorophyll a fluorescence determined after dark adaptation. Subscript x may be o for minimum, m for maximum, v for variable, or s for steady state determination.
F’x
Fluorescence flash level (rel. units) of in vivo chlorophyll a fluorescence determined immediately after sampling. Subscript x may be o for minimum, m for maximum.
φ Fx
Quantum yield of in vivo chlorophyll a fluorescence determined after dark adaptation (rel. units). Subscript x may be o for minimum, m for maximum, v for variable, or s for steady state determination.
φF'
x
Quantum yield of in vivo chlorophyll a fluorescence determined immediately after sampling (rel. units). Subscript x may be o for minimum, m for maximum.
Fv/Fm
Photochemical efficiency of Photosystem 2 (dimensionless)
σPS2
Effective absorption cross section of Photosystem 2 (A²)
Q A-
kQ
Reduced form of the plastoquinone QA
A
−
Rate constant for reoxydation of the primary quinone acceptor QA (ms-1)
OD (λ)
Optical density (dimensionless)
a (λ)
Absorption coefficient (m-1)
a*(λ)
Chlorophyll specific absorption coefficient [m2 (mg div-chl a)-1]
a
*
αB
Mean chlorophyll specific absorption coefficient [m2 (mg div-chl a)-1] Chlorophyll specific photosynthetic efficiency [mg C (mg div-chl a)-1 h-1 (µmol quanta m-2s-1)-1]
PB
Chlorophyll specific carbon fixation rate [mg C (mg div-chl a)-1h-1]
PBmax
Maximum chlorophyll specific carbon fixation rate [mg C (mg div-chl a)-1h-1]
φCmax
Maximum quantum yield of carbon fixation [mol C (mol quanta)-1]
EK
Saturation parameter (µmol quanta m-2s-1)
ΠB
Chlorophyll-specific concentration of carbon fixed [mg C (mg div-chl a)-1]
t½
Half life time of recovery in the quantum yields of in vivo chlorophyll a fluorescence from quenching, in the dark (min)
Kq
Rate constant for quenching of fluorescence under continuous light (µmol quanta-1).
Kr
Rate constant for recovery of fluorescence from quenching under continuous light or in the dark (h-1)
INTRODUCTION Diel changes in the photosynthetic properties have been now currently observed since their evidencing by Doty and Oguri (1957). Numerous studies have thereafter evidence the diel changes in photosynthesis and in many other parameters (Holmes and Haxo 1958; Shimada 1958; McAllister 1963; Malone 1971), for phytoplanktonic cultures (Prézelin and Sweeney 1977; Harding et al. 1981; Legendre et al. 1988) as well as in the natural environment (Taguchi 1976; Prézelin et al. 1986). In marine phytoplankton, the only environmental factor inducing significant diel changes in properties of the photosynthetic apparatus is illumination. All acclimation mechanisms have in this case to take place within the cell. Many of the mechanisms for the regulation of photosynthesis (photoprotective mechanisms, electron transport…) are known to be directly controlled by light intensity (Strasser et al. 1999). The persistence for few days of diel variations in photosynthetic properties after phytoplankton is switched to continuous light however suggests that some photosynthetic properties may be also controlled by an endogenous program (Chisholm and Brand 1981; Brand 1982; Vandevelde et al. 1989; Johnson and Golden 1999; Strasser et al. 1999). This control occurs either directly or indirectly through the cell cycle. Indeed, the cell cycle of phytoplankton is often phased with the light cycle, in culture (Strasser et al. 1999) as well as in the natural environment (e.g Vaulot et al. 1995). How are structural and functional properties of the photosynthetic apparatus related with the light cycle versus the cell cycle? This is the question we address in this paper. Strasser et al. (1999) have recently tried to distinguish the respective effects of light and cell cycle on the photosynthetic apparatus of phytoplanktonic culture by applying light shifts and monitoring fluorescence parameters. In the present study, we examined the diel variations in photosynthetic carbon fixation and tried to separate the responsible mechanisms directly controlled by the light changes from those rather linked to the cell cycle. We also examine the impact of diel changes in photosynthetic yield on primary productivity. We have conducted this study with Prochlorococcus, the most representative phytoplankton species at low to medium latitude. Prochlorococcus is the most abundant photosynthetic organism on earth and realize the largest part of the primary production where it occurs (Partensky et al. 1999). The cell cycle of natural Prochlorococcus populations is known to be well phased with the light cycle (Vaulot et al. 1995). Recently a strain of Prochlorococcus has been axenised (Rippka et al. 2000), which allows genetic studies without bacterial contamination. In order to simulate on the best manner the natural light
cycle, we build a culture system allowing to expose our culture to a smooth bell-shaped light cycle peaking up at 970 µmol quanta m-2s-1, rather than working using light shifts experiments.
MATERIAL AND METHODS Culturing system and sampling strategy: Two cyclostats of the oxyphotobacterium Prochlorococcus strain PCC 9511 (Rippka et al. 2000) were maintained in axenic conditions for more than 15 days. The entire culture device has been described in details elsewhere (Bruyant et al. 2001). Briefly, it was composed of two 20-L polycarbonate flasks (Nalgene™) containing 10 L of the PCR S11 medium (Partensky et al. 1999), continuously renewed with fresh medium at a mean rate of 8 mL min-1. The culture flasks were placed between 2 sets of 6 dimmable neon tubes providing a smooth light-dark circadian cycle peaking at 970 µmol quanta m-2 s-1, that simulates light conditions in the ocean upper layer. The temperature of the culture was maintained constant (21 ± 1°C) using thermostated water circulation. Biomass control was achieved through daily adjustment of the medium renewal rate, based on flow cytometric cell counts performed at the dark to light transition. After 15 days of acclimation, the two cyclostats were extensively sampled during 3 full days. Samples were collected every second hour in the first one (cyclostat 1) for all analyses excluding gene transcription (see details below). In the second one (cyclostat 2), samples were collected every fourth hour only for flow cytometry analyses, measurements of variable fluorescence and gene transcription analyses. The former two allowed comparison between the two cyclostats. This experiment was successfully replicated two times later on two 2-L cyclostats to complete the set analyses based on variable fluorescence measurements (see details below). Flow cytometry analyses Cell number and DNA cellular content were determined using a FacScan flow cytometer (Becton Dickinson). Immediately after sampling, cells were fixed with a mixture of 1% paraformaldehyde and 0.1 glutaraldehyde for 15 min (both chemicals from Sigma), then frozen in liquid nitrogen and stored at 80°C. Once thawed, cells were stained using a 1/10,000th dilution of the commercial solution of the DNA dye SYBR-Green I (Molecular Probes Inc.), and then analyzed according to Marie et al. (1999; 2000). The same measurement allowed to count Prochlorococcus cell number by detecting div-chl a red fluorescence, and their DNA cellular content by detecting the green fluorescence of SYBR-Green I. It also allowed to determine whether contaminant bacteria were present in the culture (particles without red fluorescence).
Pigment analyses The concentration of Prochlorococcus pigments was determined on the first cyclostat after filtration onto glass fiber filters (Whatman®, GF/F) of 40 mL of culture. The reverse phase HPLC protocol described by Vidussi et al. (1996) was applied. In the present study, however, we used a flow rate of 0.5 mLmin-1 and a reverse phase chromatographic column (RP-C8, Hypersil™, MOS.3µm). Light absorption coefficient The optical density (OD) of Prochlorococcus was measured between 220 and 800 nm with 1-nm increments on a sample of the culture suspension contained into a 1-cm quartz cuvette, using a dual-beam spectrophotometer (Lambda 19, Perkin-Elmer) equipped with a 60-mm integrating sphere (see Bricaud et al. 1999 for details). Filtered culture was used as reference. The Prochlorococcus absorption coefficient, a(λ) (m-1), was obtained from:
a (λ ) =
ln (OD(λ )) l
(1)
were l is the pathlength of the cuvette (0.01-m). The chlorophyll-specific absorption coefficient, a*(λ) (m2 mg-1), was calculated from :
a * (λ ) =
a(λ ) [div − chl a ]
where [div-chl a] is the concentration of divinyl-chlorophyll a (mg m-3). Parameters of the carbon fixation vs. light relationship The relationship between the rate of carbon fixation and irradiance (so-called "P vs. E" curve) was derived in duplicate every second hour according to Lewis and Smith (1983). A 50-mL culture sample was collected in cyclostat 1, subdivided into 2 subsamples (replicates) and inoculated with inorganic 14C (NaH14CO3, 2 µCi mL-1). To determine the total activity of bicarbonate added, three 50-µL aliquots were taken and added to 50-µL of an organic base (ethanolamin), 1-mL of distilled water and 10mL of the scintillation cocktail (90% Aquasol-2 Packard™ + 10% methanol) into glass scintillation vials. Then, 1-mL aliquots of the inoculated subsample were dispensed into twenty 20-mL glass scintillation vials and placed within separate thermo-regulated alveoli at 20 different light levels for 20 minutes. Light in the incubator was provided from the bottom by a metal halide lamp (OSRAM, Powerstar HQI-TS 150W/NDL UVS) after passing through a water screen, a plexiglas white diffusing plate and different combinations of neutral gelatin filters (Kodak). The photosynthetic available radiation (PAR; µmol quanta
(2)
m-2 s-1) in each alveolus was measured twice a day with an irradiance-meter (Biospherical QSL-100) equipped with a 4π spherical collector. Temperature in the incubator was maintained at 21 ± 1 °C. After incubation, culture aliquots were acidified (1-mL of 1 N HCl) and placed under the fuming hood for 1 hour. Then, 10-mL of the scintillation cocktail were added to each vial. The total concentration of dissolved inorganic carbon (DIC) was monitored during one of the replicate experiment. It was measured every second hour on a 10-mL aliquot to which 10 µL of 1-M HgCl2 was added, using a total organic -3
carbon analyzer (Shimadzu TOC-5000). It was found to vary by less than ±30 % around 11 g m . The rate of carbon fixation was finally computed according to Parsons et al. (1984) using the latter median value as DIC concentration, and normalized to the concentration of div-chl a [PB; mg C (mg div-chl a) -1 h-1]. The initial slope of the P vs. E curve [αB; mg C (mg div-chl a) -1 h-1 (µmol quanta m-2 s-1) -1] and the chlorophyll-specific maximum rate of carbon fixation [PBmax; mg C (mg div-chl a) -1 h-1] were estimated by fitting the following equation (Jassby and Platt 1976) to the experimental PB and PAR values:
α B PAR B P B = Pmax tanh B + P0B Pmax
(3)
where PBo is the estimated intercept. The light saturation parameter, EK (µmol quanta m-2 s-1), is defined as: B Pmax EK = B α
(4)
The maximum quantum yield of carbon fixation [φCmax; mol C (mol quanta) -1] was derived from:
φCmax =
αB a*
(5)
where a * is the mean chlorophyll-specific absorption coefficient weighted by the spectral output of the incubation light source [E(λ); µmol quanta m-2 s-1]:
∫ a* =
700
400
a * (λ ) E(λ ) dλ
∫
700
400
E(λ ) dλ
(6)
Chlorophyll-specific cumulated concentration of carbon photosynthetically fixed [ΠB; mg C (mg div-chl a)-1] in cyclostat 1 was calculated along the day from: t
Π B (t ) = ∫ P B (t ) dt 0
(7)
where PB(t) is obtained from Eq. 3 without considering PBo, and t is the time elapsed in hour since 0000 h. For these computations, αB was modified as in Babin et al. (1996) to account for the difference between the irradiance spectra in the cyclostat and in the incubator. Linear interpolation of measured PBmax and αB allowed ΠB(t) to be calculated at 10-minute intervals. Fluorescence measurements We used a Xe-PAM fluorometer (H. Walz GmbH, Germany) to measure the in vivo div-chl a fluorescence flash levels, according to the Pump and Probe approach ((Mauzerall 1972). The non-actinic probe flashes were produced by a xenon lamp and filtered by a combination of a BG39 (5 mm) filter (Schott) and a Short Pass filter cutting at 695nm (SP695, Walz). Saturating pump flashes were produced by a xenon flash lamp combined with a BG39 (5 mm) filter (Schott). For all measurements the detection was filtered by a combination of R65 (1mm) /RG645 (3mm) filters (Balzers/Schott) plus an additional RG665 (1mm) filter (Schott). The fluorescence signal was monitored using an oscilloscope (Lecroy 9310C). During the experiments, we measured the minimum and maximum fluorescence flash yields after a 30 min dark adaptation (Fo, Fm) or right after sampling, (no dark adaptation, F’o, F’m) and the fluorescence flash level at the steady-state (Fs, i.e. under light conditions prevailing in the cultures). Fo and F’o were measured by applying to the samples non-actinic probe flashes, while for Fm and F’m the measuring probe flash was applied 50µs after a saturating pump flash. The measurement of Fs was done like for Fo and F’o, but the light intensity prevailing in the culture (as measured by an irradiance-meter just before sampling) was applied in the fluorometer using halogen lamps. For the different sets of Fo and Fm and F’o and F’m measurements, we calculated the photochemical efficiency of photosystem 2, Fv / Fm, (or F’v/F’m) with Fv (or F’v) being variable fluorescence (Fm - Fo or F’m - F’o). The quantum yields for minimum and maximum fluorescence were calculated as:
φ Fx =
Fx
∫
700
400
a(λ) E probe (λ ) dλ
where subscript x is o, m or s, and Eprobe(λ) is irradiance of the Xe-PAM probe flash measured in relative units using a spectroradiometer (LI-COR, LI-1800UW) equipped with a cosine collector (0.7-mm diameter) fixed at the end of a 2-m optic-fiber.
(8)
Fast repetition rate fluorometer (FRR) described by Kolber et al. (1998) (see also Steglich et al. 2001) was used during the main experiment to measure Fo and Fm and the functional cross section of photosystem 2, σPS2. Dual-modulation kinetic (DMK) using a FL-100 fluorometer (PSI, Czech Republic) as described by Trtilek et al. (1997) (see also Dijkman et al. 1999; Steglich et al. 2001) allowed the measurement of the rate constant for reoxydation of the primary quinone acceptor QA-.The rate constant was determined from the kinetics of variable fluorescence relaxation in the time interval 100 µs - 10 s after the flash. Since the samples were kept in the dark before and during the measurement, relaxation in the fluorescence yield following a single-turnover flash reflects the reoxydation of QA-. Transcription of major components of the photosynthetic apparatus Transcription pattern for the gene encoding the large sub-unit of the Ribulose-1,5-Biphosphate Carboxylase/Oxygenase (thereafter denoted RubisCO), rbcL, was obtained after sampling 800 mL of culture in cyclostat number 2 every 4 hours. Immediately after sampling, cells were harvested by centrifugation (7min, 4°C, 18,500*g), re-suspended in RNA buffer and quickly frozen (Holtzendorff et al. 2001).
In this study, we also refer to results on the transcription patterns of the genes encoding proteins of photosystem 2. Transcription levels of psbA gene -encoding the D1 protein of the PS2 reaction center- and pcbA gene –encoding the major light harvesting complex of PS2 protein- were obtained as described in Garczarek et al. 2001.
RESULTS Pigment concentration The content of div-chl a per cell was highest at the beginning of the day, then decreased by 20% until the middle of the dark period, and re-increased until light was switched on again (Fig. 1). Zeaxanthin per cell showed a clear and more reproducible diel variations over the entire experiment. It decreased by about 40% during the night, and increased steadily during the entire light period with a transient slow down each day at the beginning of the afternoon (Fig. 1). The zeaxanthin-to-div-chl a ratio remained high during the entire experiment (above 1.5), and also increased during the day and decreased by night by almost a factor of 2 (Claustre et al., submitted)).
Photosynthetic parameters Fig. 2 shows variations in φCmax and a * together with the PAR cycle. φCmax systematically decreased abruptly by nearly a factor of 4 as PAR increased. Then, φCmax remained low from around noon to the middle of the dark period and re-increased to its highest value just before light was switched on again (Fig. 2). The φCmax peak values were less than half the theoretical maximum of 0.125 mol C (mol quanta)-1. The diel changes in
a * were of small amplitude but systematic (Fig. 2), with values increasing
during the day and decreasing during the night. Therefore, variations in φCmax are responsible for most of the variations in αB (cf. Eq. 5; data not shown). PBmax also showed strong diel variations over a factor of 4 (Fig. 3). It first started to drop abruptly from the highest values at ca. 1000 h, i.e. about 4 hours after
φCmax did, and decreased at a slower rate between 1200 h and 0300 h. Then, it increased sharply to the highest value within about 7 hours. A break in this increase was systematically observed at light onset. This pattern in PBmax variations was especially clear and reproducible during the second and third sampling days. During the three days of sampling, PBmax reached relatively high values around 10 mg C (mg div-chl a)-1 h-1. The diel cycle in EK was slightly lagged relative to the PAR cycle and skewed to left. It spanned over about a factor of 2 (Fig. 3). Ek changed in such a way that the carbon fixation remained in saturation for most of the light period. Fig. 4 shows calculated PB and ΠB for cyclostat 1 as a function of time, for the three days of the experiment. As a result of diel variations in αB and PBmax, the PB vs. time relationship is skewed to the right and maximum PB systematically occurs between 0800 h and 1100 h. This pattern differs much from what would be observed with constant αB and PBmax values (Fig. 4A). Half of maximum ΠB was reached around 1040 h, and two thirds of daily carbon fixation occurred before 1200 h (Fig. 4B).
Diel variations in photosystem 2 functional properties Variations in
φ Fo and φ Fm as measured using the Xe-PAM fluorometer during the main
experiment are shown in Fig. 5A. Both showed strong diel variations that spanned over about a factor of 2. The similar trends in
φ Fo and φ Fm were characterized by a sharp decrease at the beginning of the light
period, with the minimum values around noon, and an increase that lasted from the second part of the day to the end of the dark period, with a transient slow down between 2100 and 0000 h. The highest yields were measured at or 2 hours after the light onset. The variation trends observed for the quantum yields of
fluorescence during this experiment were very well reproduced during replicate ones, which makes the three experiments comparable (data not shown). Fig. 5B shows variations in Fv/Fm as determined using the Pump and Probe and FRR fluorometry protocols, and σPS2 determined by FRR fluorometry. Fv/Fm results showed same trends and variation amplitudes between the two different protocols However, after the second afternoon of sampling, different values were measured by the two different techniques. Both Fv/Fm and σPS2 decreased by about 20% as PAR increased. The minimal values for Fv/Fm were observed around noon, while changes in σPS2 clearly lagged behind by 2 hours. Both then increased rapidly as PAR decreased, although with some delay for σPS2. Highest Fv/Fm values were around 0.63, indicating that the cultures were nutrient repleted (Kolber et al. 1988). Fig. 6 shows the results obtained for the quantum yield of fluorescence during one of the replicate experiment. The patterns of
φ F ' and φ F ' diel variations were very similar to the ones of φ Fo o
m
and φ Fm' (Fig. 5A). Also the ranges of variations of the fluorescence quantum yields measured at light during replicated experiments were similar to those of Fig. 7 shows variations in
φ Fo and φ Fo' (a factor of 2).
k Q − . While during the night, the average reoxydation rate of QA was A
almost constant (~0.35 ms-1), it dropped rapidly and within 4 hours after exposure to light it reached only 0.15 ms-1. In other words, the average turnover time of PS2 measured in the dark increased from ~2.5 to ~ 7 ms. In the second half of the day
-1 k Q − slowly recovered, reaching the highest value (0.40 ms ) again A
at dusk.
Transcription level of RubisCO Variations in the transcription level of rbcL gene encoding the large sub-unit of the RubisCO protein are illustrated in Fig. 8. It increased from the beginning of the dark period to 0800 h. During the second half of the day, the amount of rbcL transcript decreased sharply until the end of the light period down to nearly zero.
Transcription level of pcbA and psbA genes and cell cycle Annex 1 panel B shows the percentage of cells in G1 phase. This percentage was maximal at the end of the night and during the first part of the day. In the afternoon, it decrease abruptly to reached the minimum values a the beginning of the night, indicating that the cell division took place at that time. The
transcription patterns of the genes encoding the photosynthetic apparatus showed different trends. PsbA gene –encoding the D1 protein of the PS2 reaction center- showed strong diel variations with a transcription level peaking up around noon (at the time of maximum light intensity) (Annex 1). On the contrary, pcbA gene –encoding a part of the light harvesting complex of PS2 protein- showed a bimodal transcription rhythm with a first minimum at the beginning of the light period and a second minimum at the beginning of the night.
DISCUSSION The cyclostat used in this study allowed a high growth rate (0.69 d-1, i.e. one division per day) to be maintained for the three consecutive days of sampling (Bruyant et al. 2001). All variation patterns in monitored variables showed good day-to-day reproducibility. Because bacterial contamination slowly started during the fourth day, the data collected then were discarded (Bruyant et al. 2001). The division of Prochlorococcus was highly synchronized within the population (Annex 1, and Figure 8 in Bruyant et al. 2001), as already observed in the field (Vaulot et al., 1995). The percentage of Prochlorococcus cells in G1 phase (interphase) was minimum at the very end of the light period and at the beginning of the dark period indicating that cell division occurred during the first part of the night (for details, see Garczarek et al. 2001). The effects of this cell cycle synchronization are clearly evidenced by the molecular biology analyses done during this experiment. The abrupt decrease in the transcription of the psbA gene – encoding the D1 protein of the RC2-, might result from the beginning of the cell division process. Also the transcription pattern of the pcbA gene -encoding the main part of the light harvesting system of PS2, i.e. the antenna- showed a second minimum during the first part of the night (Annex 1, panel D) coincident with the peak in cell division. This impact of the cell cycle on the transcription patterns may however also infer in the pattern of photosynthetic functions. All variables describing structural and functional properties of the photosynthetic apparatus showed strong diel variations that have been observed currently in the natural environment (Babin et al. 1995; Babin et al. 1996; Dandonneau and Neveux 1997…). The diel changes in the maximum quantum yield of carbon fixation φCmax (Fig. 2) and in the maximum chlorophyll specific carbon fixation rate
B Pmax
(Fig. 3), indicated strong diel changes in the carbon fixation processes during our experiment, with maximum efficiency at the end of the night and at the beginning of the day. The fact that the highest φCmax value we observed is near half the maximum theoretical one may result from the high light absorption by
zeaxanthin relative to other pigments, as suggested by the high zeaxanthin to div-chl a ratio observed during this study (see the discussion by Babin et al. 1996). Also diel changes in the photosynthetic properties have been currently observed since many years (Doty and Oguri 1957; Holmes and Haxo 1958; Shimada 1958; McAllister 1963; Malone 1971), for phytoplanktonic cultures (Prézelin and Sweeney 1977; Harding et al. 1981; Legendre et al. 1988) as well as in the natural environment (Taguchi 1976; Prézelin et al. 1986); diel patterns were not systematically observed with such a shift of the maximum values (Babin et al. 1995). However, the comparison on Fig. 4 between the amount of carbon fixed during our experiment (empty symbols) and the carbon that would have been fixed if there were no diel changes in photosynthetic parameters (black symbols) indicate clearly that our culture functioned efficiently, the 2/3 of the carbon fixed per day being fixed before noon. Actually the total amount of carbon fixed during one light period is higher than if no diel changes were observed (Fig. 4B). This demonstrate that our phytoplanktonic culture was functioning at a high rate and near the saturation of the photosynthetic apparatus as also indicated by the diel changes in the saturation parameter EK (Fig. 3). The rate of carbon fixation very quickly reached and remained at saturation (Fig. 4A). Under these conditions, the electron transfer by light reactions was saturated and limited by dark reactions. This is a typical scenario at high irradiance. This functioning mode (at saturation) might have some effects on the photosynthetic apparatus, actually at high irradiance levels the photosynthetic apparatus is exposed to excessive excitation of PS2 which may lead to severe photodamages through production of oxygen radicals. Therefore various photoprotection mechanisms allow dissipation of excess excitation energy. They were first studied using fluorescence tools. The diel changes we observed during this study in the quantum yields of in vivo fluorescence (Fig. 5 and 6) have already been observed in the natural environment (Prézelin and Ley 1980; Dandonneau and Neveux 1997), we then observed a natural phenomenon with ecophysiological signification’s. The huge amplitude of variation in the quantum yields of in vivo fluorescence was very similar for the data obtained after a dark adaptation or in the presence of light (Fig. 5A and 6). Also the trends of variation were similar, with the abrupt decrease at the beginning of the day and the slower increase during the afternoon and the dark period, indicating that no-short life time quenching occurred. Actually the recovery kinetics determined under low light and the use of ammonium chloride (NH4Cl diluted in Milli-Q water, final concentration 2 mM), gramicidin (in ethanol final concentration 5 µM) and DCMU (in DMSO final concentration 0.5 µM) as uncouplers of thylakoid membranes allowed to
evidence that no significant energy-dependent quenching controlled by ∆pH was presented. The diel changes in kQA− and
φ Fm are then surely related to photoinhibition, in relation to changes observed in the
effective absorption cross-section. Surprisingly, the amplitude of variations of the effective absorption cross-section of PS2 (σPS2) and in the photochemical efficiency of PS2 (Fv/Fm) were much lower than the amplitude of variation of the quantum yields of fluorescence. The changes we observed in σPS2 of about only 20% are in agreement with state transitions in PS2 (Allen 1992; Falkowski and Raven 1997). But state transitions might be insufficient to cope with the high light level (Falkowski et al. 1994; Falkowski and Raven 1997). Furthermore, with the fluorescence yields data, we obtained a rate constant for recovery from quenching, Kr, of 0.283 ± 0.0516 h-1 for both minimum and maximum quantum yields of fluorescence (data not shown) and with Kr = 0.283 h-1 state transitions cannot be the only phenomenon involved (Ley 1980; Falkowski and Raven 1997), as state transitions act at very short time scales (the corresponding t½ of recovery is 2.45 h). Then, even if state-transition occurred at the very beginning of the light period for a very short time, another non-photochemical quenching surely occurred thereafter to cope with the high light intensity, as only 20% of the variations in the quantum yields of fluorescence might be explained by photoinhibition. The gap we observed in the amplitude of variations of of
φ Fo and
B (a factor of 2, Fig. 5A) and σPS2 and Fv/Fm (20%, Fig. 5B), could then be explained by that metallicPmax
substitution in chlorophyll molecules. Actually, it has been already observed that metallic-substituted chlorophyll molecules have their fluorescence reduced by almost a factor of 20 (Kobayashi et al. 1998; Akiyama et al. 1998; Yamamura et al. 1998). Also, the substitution of Mg by Cd or Zn in the chlorophyll molecule was observed in the natural environment (Küpper et al. 1996; Küpper et al. 2000). This hypothesis could here explain the steep decrease in
φ Fo and φ Fm while the cross section does not vary
that much. In addition to the non-photochemical quenching, we have also observed functional changes within the acceptor side of PS2 itself. With our time resolution (2 hours), these changes occurred with the same or even faster kinetics like the fluorescence quenching processes discussed above. It has been proposed before (Ohad et al. 1988) that the acceptor side of PS2 undergoes some unspecified conformational changes that precede the loss of activity observed only during the later phases of photoinhibition.
When the capacity of photoprotective mechanisms is exhausted, reaction center of Photosystem 2 becomes target of photodamages. The mechanism of photodamages to PS2 involves reactive oxygen species and results in functionally damaged proteins D1 (PsbA). In our experiments the rate of transcription of the gene coding for this polypeptide rapidly increased in the middle of the day (Figure 3 in Garczarek et al. 2001, Annex 1), in parallel with the decrease in the photochemical yield of PS2, measured as Fv/Fm. Around 0800 h as PAR reached almost 600 µmol quanta m-2 s-1, Fv/Fm started to decrease (Fig. 5B), which most probably reflects the occurrence of photoinhibition (or photodamages) when the D1 turnover became low compared with D1 degradation. This phenomenon (increase in D1 turnover) has been proposed to be a photoprotective mechanism in cyanobacteria (reference) to allow energy dissipation within the reaction center (reference and to be rectified as necessary). The sequence going from antenna quenching, to D1 turnover and RC2 photoinhibition allowed the photosynthetic apparatus to cope with the initial increase in PAR upstream charge separation. The concurrent quenching and photoinhibition in photosystem 2 reaction center explain the steep decrease in
φCmax as PAR increased in the morning (Fig. 2). As long as the rate limiting step in carbon fixation is located in dark reactions (Sukenik et al. 1987; Falkowski and Raven 1997), changes occurring in and upstream RC2 do not affect PBmax. Around 1000 h however, the rate for QA reoxydation with fully reduced PQ pool reached its minimum value as PAR increased and the transcription level of the gene coding for RubisCO synthesis (rbcL) nearly went to 0 (Fig. 7 and 8). The correlation between rbcL mRNA transcription and PBmax values, even if already observed (Pichard et al. 1996), has to be considered carefully because no direct estimation of the concentration of RubisCO protein was done during the experiment. However, a positive correlation between PBmax and concentration of RubisCO protein was already found by Orellana and Perry 1992. Together with the fact that photoinhibition occurred in RC2, the rate limiting step in carbon fixation may have become the reoxydation of the PQ pool. This would explain the later decrease of PBmax (see Behrenfeld et al. 1998). During the afternoon and the dark period, PAR decreased from 970 µmol quanta m-2s-1 to 0 within 6 hours and remained equal to zero during the next 12 hours. During this phase, we observed a slow recovery in
φ Fo , φ Fm (Fig. 5A), φ F ' and φ F ' (Fig. 6A). The full recovery up to the maximum o
m
values only occurred at the end of the dark period. The Kr value determined at time of maximum PAR is incompatible with such a slow recovery in the cultures. To illustrate this point, we used the model of
Neale (1987), describing the dynamic changes in the quenching and recovery processes by the following equation:
dφ F = − K q σ PS 2 PAR φ F + K r φ Fi − φ F dt
(
where
)
(9)
φ F accounts for either minimum or maximum fluorescence, φ Fi is the initial value of the quantum
yield, and Kq is the rate constant for quenching of fluorescence. We first determined Kr as described in the Methods section, using the data from fluorescence yields (note that, in the dark, Eq. 9 becomes a first order kinetics expression). Using this Kr value, and measured σPS2 and PAR , we then estimated Kq by fitting Eq. 9 to the
φ F data obtained between 0600 h and 1000 h. We assumed that, during this period,
the first term on the right-hand side of Eq. 9 accounted for most of
φ F variations. Considering φ Fm we
obtained Kq = 9.406 10-7 ± 1.014 10-7 µmol quanta-1, the values of Kq being very reproducible from one day to the other and also between
φ Fo to φ Fm . Finally, we ran Eq. 9 numerically by a step-by-step
method using the estimated Kq and Kr values, and the measured σPS2 and PAR ones. Our calculations were conducted separately for each day, starting at 0600. Therefore, the used as
φ F value obtained at 0600 was
φ Fi . Note that the 0600 value increased from one day to the next over the three days of sampling
by about 20% (that does not lead to any significant variations); to take this into account, we interpolated linearly the 0600 starting data to compensate the gap between the different days. In Fig. 9, we compare observed (triangles) and modeled (lines) results. For
φ Fm (as well as for φ Fo , data not shown), the
modeled values are in agreement with the observed ones during the light period. As soon as the light is switched off, the increase in the modeled values is much faster than for the observed ones. This strongly suggests that non-photochemical quenching alone cannot explain the slow recovery in
φ Fo and φ Fm , as
well as in φCmax. When looking closer at the trends in
φ Fo and φ Fm during the recovery phase (Fig. 9), one can
notice three distinct parts. In the first one, the quantum yield of fluorescence starts to increase rapidly from noon to the end of the day as a result of recovery from non-photochemical quenching, as confirmed by the agreement between the modeled and observed values in Fig. 9. In the second part, around 2000 h when the cell division is close to peaking, the increase in
φ Fo and φ Fm becomes slower or even negative.
Finally, in the third part, the increase in the quantum yields of fluorescence is fast again and starts in the middle of the night after the cell division (i.e. after midnight, Fig. 9 and Annex 1) ( see also Garczarek et al. 2001). The coincidence between cell division and the slow down in that the cell cycle may partly govern
φ Fo and φ Fm recovery suggests
φ Fo and φ Fm diel variations, especially at night.
CONCLUSION In conditions close to the natural environment (Garczarek et al. 2001; Bruyant et al. 2001), Prochlorococcus showed important diel changes in all the functions we documented (fluorescence yields, carbon fixation, gene transcription, cell division). The diel changes observed in the quantum yields of fluorescence were not affected by short life time non-photochemical quenching phenomena governed by ∆pH. However, the largest part of the non-photochemical quenching we observed remained at that time unexplained. Those phenomena however allowed to avoid photodamages in the photosynthetic apparatus and to maintain the carbon fixation at a high level during the first part of the day. Those mechanisms lead to B Pmax values being maximum during the first part of the day period, that is before photodamages in the
photosynthetic apparatus may occur, the biggest part of the carbon necessary for growth is then anyway fixed by the phytoplanktonic population before any damage occurs, allowing the growth and reproduction to be maintained in spite of the high light level. The effect of the cell cycle seems here to be the dominant factor of control of the different processes in the Prochlorococcus population, with reduced photoacclimation processes superimposed. This influence of the cell cycle induce asymmetric rhythms in the carbon fixation processes that should be taken into account in global estimation of primary production of natural populations.
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1000
3.5
A
Relative transcript level
Irradiance (µmol quanta.m-2.s-1)
ANNEX 1
800
600
400
200
0 18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
Relative transcript level
% Cells in G1
80
60
40
20
0 18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
2.0 1.5 1.0 0.5
5
06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
E
06:00
18:00
psbD
5 4 3 2 1 0 18:00
18:00
psbC
2.5
6
B
D
0.0 18:00
18:00
100
06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
35
C
psbA
4
3
2
1
0 18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
Relative transcript level
Relative transcript level
3.0
18:00
Time (h)
30
F
pcbA
25 20 15 10 5 0 18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
Time (h)
Fig 3. Effect of a light-dark cycle on the synchronization of photosynthetic gene expression. A: Pattern of modulated light used during the experiment. B: Percentage of Prochlorococcus cells in G1 phase of the cell cycle (interphase). C-F: Transcript pattern of psbA, psbC, psbD and pcbA. The apparently lower height of peaks of psbA transcripts during the last two light dark cycles is probably an artifact due to an unequal transfer of the RNA onto the Northern blot membrane (an independent membrane was used for the other genes). Redrawn from Garczarek et al., 2001
18:00
FIGURE CAPTIONS Fig. 1. Diel changes in the PAR (µmol quanta m-2s-1), in the divinyl-chlorophyll a concentration (µg cell-1) and in the zeaxanthin concentration (µg cell-1) obtained for Prochlorococcus over the 3 consecutive days of sampling.
Fig. 2. Diel changes in the PAR (µmol quanta m-2s-1), in the maximum quantum yield of carbon fixation *
(φCmax, mol C (mol quanta)-1) and in the mean chlorophyll specific absorption coefficient ( a , m2 (mg div-chl a)-1) obtained for Prochlorococcus over 3 consecutive days of sampling.
Fig. 3. Diel changes in the PAR (µmol quanta m-2s-1), in the maximum chlorophyll specific carbon fixation rate (PBmax, mg C (mg div-chl a)-1h-1) and in the saturation parameter (EK, µmol quanta m-2s-1) obtained over the 3 consecutive days of sampling
Fig. 4. Carbon accumulation in cyclostat number 1 calculated over one light period. (A) : PB instantaneous carbon fixation rate [mg C (mg div-chl a)-1 h-1]. (B): ΠB cumulated fixed carbon values over one light period (mg C (mg div-chl a)-1). The data interpolated every 10 minutes with values of PBmax and αB either fixed or variable during the day.
Fig. 5. (A) Diel changes in the PAR (µmol quanta m-2s-1), in the minimum ( φ Fo , rel. units) and the maximum ( φ Fm , rel. units) quantum yields of in vivo fluorescence measured after 30-minutes of dark adaptation using the Xe-PAM fluorometer. (B) Diel changes in the PAR (µmol quanta m-2s-1), in the photochemical efficiency of photosystem 2 (Fv/Fm, dimensionless) acquired using the FRR fluorometry and Pump and Probe technique (FRR and PAM), and in the effective absorption cross-section of PS2 (σPS2, A²) determined using the FRR technique.
Fig. 6. (A) Diel changes in the PAR (µmol quanta m-2s-1), in the quantum yield of fluorescence measured in the steady state ( φ Fs ) and in the minimum and maximum quantum yield of fluorescence measured at light ( φ F ' and o
φ F ' ). m
Fig. 7. Diel changes in the PAR (µmol quanta m-2s-1), in the QA reoxydation rate, and in the complete reoxydation constant of PQ pool, kPQ obtained over the 3 consecutive days of sampling. The data were obtained using the DMK fluorescence technique
Fig. 8.
rbcL gene (encoding the large sub-unit of the RubisCO protein) transcription pattern over one day. The relative level of transcription was evaluated through the relative amount of mRNA averaged from triplicates.
Fig. 9. Diel changes in the PAR (µmol quanta m-2s-1) and in the minimum
φ Fo and maximum φ Fm
quantum yield of in vivo chlorophyll a fluorescence (relative units) either measured data (triangles) or recalculated with the Neale model (lines).
1200
PAR div-chl a per cell zeaxanthin per cell
7e-10
1000
6e-10
800
5e-10
600
4e-10 3e-10
400
2e-10
PAR (µmol quanta m-2s-1)
div-chl a & zeaxanthin per cell (µg cell-1)
8e-10
200
1e-10
0
0 18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
Time (hour)
Bruyant et al., Figure 1
0.025
0.06
0.020 0.015 0.010 0.005 0.000
φCmax [mol C (mol quanta)-1]
a*moy [m2 (mg div-chl a)-1]
0.07
1200
PAR
φCmax
1000
a*moy
0.05
800
0.04 600 0.03 400
0.02
200
0.01 0.00 18:00
0 06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
Time (hour)
Bruyant et al., figure 2
PAR (µmol quanta m-2s-1)
0.030
1200
12
PAR PBmax
10
EK
1000 800
8 600 6 400
4
200
2 0 18:00
PAR & EK (µmol quanta m-2s-1)
PBmax [mg C (mg div-chl a)-1h-1]
14
0 06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
Time (hour)
Bruyant et al., figure 3
10
PAR Day 1 Day 2 Day 3 Day 1 fixed Day 2 fixed Day 3 fixed
A
8 6
1200 1000 800 600
4
400
2
200
PAR (µmol quanta m-2s-1)
PB [mg C (mg div-chl a)-1h-1]
12
0 0 00:00 03:00 06:00 09:00 12:00 15:00 18:00 21:00 00:00 Time (hour)
80 60 40
1200 PAR Day 1 Day 2 Day 3
1000 800
Day 1 fixed Day 2 fixed Day 3 fixed
600 400
20 0
200
-2 -1 PAR (µmol quanta m s )
-1 B Π [mg C (mg div-chl a) ]
100
0 00:00 03:00 06:00 09:00 12:00 15:00 18:00 21:00 00:00 Time (hour)
Bruyant et al., figure 4
1200
800 PAR φ
700
Fo
800
500 400
600
300
400
-2 -1 PAR (µmol quanta m s )
600
φFo and φFm (rel. units)
1000
φFm
200 200
100 0 18:00
0 06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
Time (hour)
800 700
0.6
600
0.5
500
0.4 0.3
σPSII (A²)
0.7
1200
B 1000
800
400
600
300
0.1
100
0.0
0
400
)
200
-2 -1
0.2
PAR (µmol quanta m s
Fv / Fm (dimensionless)
0.8
200
0 18:00
06:00
PAR σPSII (FRR)
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
Time (hour)
Fv/Fm (PAM) Fv/Fm (FRR)
Bruyant et al., figure 5
1400 1200
2000
1000 1500
800
1000
600 400
500 0 18:00
PAR (µmol quanta m-2s-1)
φFs, φF'm and φF'o (rel. units)
2500
200 0 06:00
18:00
06:00
18:00
Time (hour)
06:00
18:00
PAR φFs
φF'm φF'o
Bruyant et al., figure 6
0.4
1200
PAR Qa- reoxidation
1000
kPQ
800 0.3 600 0.2 400 0.1 0.0 18:00
PAR (µmol quanta m-2s-1)
Qa- reoxidation rate and kPQ (ms-1)
0.5
200 0 06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
Time (hour)
Bruyant et al., figure 7
14
1200 PAR
1000
rbcL
10
800
8 600
6 400
4
-2 -1 PAR (µmol quanta m s )
rbcL mRNA (rel. amount)
12
200
2 0 16:00
20:00
00:00
04:00
08:00
12:00
16:00
0 20:00
Time (hour)
Bruyant et al., figure 8
800 700
φFo and φFm (rel. units)
φFm
1000
φFm model φFo model
800
500 400
600
300
400
200 200
100 0 18:00
0 06:00
18:00
06:00
18:00
06:00
18:00
Time (hour)
Bruyant et al., figure 9
-2 -1 PAR (µmol quanta m s )
600
1200
PAR φFo
ANNEXE 3
Holtzendorff et al., (2001) Diel expression of cell cycle-related genes in synchronised cultures of Prochlorococcus sp. strain PCC 9511. J. Bacteriol. 183 (3) : 915-920.
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Feb. 2001, p. 915–920 0021-9193/01/$04.00⫹0 DOI: 10.1128/JB.183.3.915–920.2001 Copyright © 2001, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
Vol. 183, No. 3
Diel Expression of Cell Cycle-Related Genes in Synchronized Cultures of Prochlorococcus sp. Strain PCC 9511 J. HOLTZENDORFF,1 F. PARTENSKY,2 S. JACQUET,2 F. BRUYANT,3 D. MARIE,2 L. GARCZAREK,2 I. MARY,2 D. VAULOT,2 AND W. R. HESS1* Institute of Biology/Genetics, Humboldt-University, D-10115 Berlin, Germany,1 and Station Biologique, CNRS, INSU, and Universite´ Pierre et Marie Curie, F-29682 Roscoff Cedex,2 and Laboratoire de Physique et Chimie Marines, ESA 7077, CNRS, INSU, and Universite´ Pierre et Marie Curie, Villefranche,3 France Received 14 August 2000/Accepted 7 November 2000
The cell cycle of the chlorophyll b-possessing marine cyanobacterium Prochlorococcus is highly synchronized under natural conditions. To understand the underlying molecular mechanisms we cloned and sequenced dnaA and ftsZ, two key cell cycle-associated genes, and studied their expression. An axenic culture of Prochlorococcus sp. strain PCC 9511 was grown in a turbidostat with a 12 h–12 h light-dark cycle for 2 weeks. During the light periods, a dynamic light regimen was used in order to simulate the natural conditions found in the upper layers of the world’s oceans. This treatment resulted in strong cell cycle synchronization that was monitored by flow cytometry. The steady-state mRNA levels of dnaA and ftsZ were monitored at 4-h intervals during four consecutive division cycles. Both genes exhibited clear diel expression patterns with mRNA maxima during the replication (S) phase. Western blot experiments indicated that the peak of FtsZ concentration occurred at night, i.e., at the time of cell division. Thus, the transcript accumulation of genes involved in replication and division is coordinated in Prochlorococcus sp. strain PCC 9511 and might be crucial for determining the timing of DNA replication and cell division. a ubiquitous bacterial protein that acts as a helicase to initiate DNA replication in eubacteria. In E. coli, it recognizes asymmetric 9-bp AT-rich elements, called DnaA boxes, near the origin of replication, oriC. Furthermore, it acts as a repressor for its own expression and as a transcriptional regulator for other genes (23). Laboratory cultures of Prochlorococcus are difficult to grow and to maintain axenically. Other obstacles are that average cell densities reached by Prochlorococcus in culture are lower than for most bacteria and that its cell size is particularly small (0.6 m on average), leading to low biomass yields (27). Here, this issue was resolved using a large-volume turbidostat exposed to a dynamic light regime, with irradiance progressively varying in a bell curve-like fashion between 0 and about 1,000 quanta (micromoles meter⫺2 second⫺1) during the 12-h photoperiod (6). These conditions allowed us to simulate average light conditions found in the upper mixed layer of oceanic waters near the equator. Using this system, the expression of ftsZ and dnaA was monitored in synchronized cultures of Prochlorococcus sp. strain PCC 9511.
Most knowledge about the regulation of bacterial cell division and replication of DNA stems from the analysis of only three species, Escherichia coli (43, 44), Caulobacter crescentus (35, 37), and Bacillus subtilis (25, 34). In some cyanobacteria these processes are reported to be under the control of a circadian clock (1, 5, 15, 18, 24, 39). However, studies directly concerning the diel expression of cell cycle-relevant genes in cyanobacteria are scarce (21). The cell cycle of the marine cyanobacterium Prochlorococcus is characterized by a well-defined and discrete DNA synthesis phase, S (42). In the field, the cell cycle is highly synchronized by the daily alternation of night and day. DNA replication occurs in late afternoon, and cell division occurs at night (15, 20, 41, 42). It is not known at which stage or by which regulatory mechanism the linkage between cell cycle and environmental conditions is achieved. Experiments in which the time of light onset was changed suggested that the passage from darkness to light (equivalent to sunrise) might be involved in timing of DNA synthesis in Prochlorococcus (16a). To elucidate potential components involved in the synchronization and diel control of cell cycle progression in Prochlorococcus, the genes dnaA and ftsZ were cloned and analyzed. The GTP-binding protein FtsZ is widely distributed among eubacteria, archaea, and plastids and is usually considered the key factor in the initiation of cell division by the formation of a ring-shaped structure that recruits several other proteins (FtsA, FtsQ, and FtsW) to the division site (8). FtsZ has also recently been found in a mitochondrion (2), where it is normally replaced by Dynamin (reviewed in reference 9). DnaA is
MATERIALS AND METHODS Culture conditions and sampling. Two replicate 10-liter turbidostat cultures of the axenic Prochlorococcus sp. strain PCC 9511 (31) were grown in PCR S11 medium (27) in 20-liter polycarbonate flasks, placed in a thermoregulated bath at 21 ⫾ 1°C and under a cycle of 12 h of light and 12 h of dark (L/D) (light from 8:00 a.m. to 8:00 p.m.). In two related studies, these times were shifted by 2 h in order to have solar noon at 12:00 (6, 12). These papers report details about the turbidostat setup and light systems (6) as well as the expression of photosynthetic genes (12). During the photoperiod, cells were illuminated by two symmetrical computercontrolled banks of light bulbs (OSRAM DuluxL 55 W daylight) providing a modulated irradiance varying in a sinusoidal way from 0 to 970 quanta or mol m⫺2 s⫺1. After 15 days of acclimation to these conditions, the two turbidostat cultures were sampled during four consecutive photocycles. One of the two replicate turbidostats was used for measuring a variety of photosynthetic param-
* Corresponding author. Mailing address: Humboldt-University Berlin, Inst. of Biology/Genetics, Chausseestr. 117, D-10115 Berlin, Germany. Phone: 49-30-2093-8144. Fax: 49-30-2093-8139. E-mail:
[email protected]. 915
916
HOLTZENDORFF ET AL.
J. BACTERIOL. TABLE 1. Bacteria and plasmids used in this study
Strain or plasmid
Strains E. coli XL1-Blue
Source or reference
Characteristic(s)
F⫺ recA1 end gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac[F⬘ proAB lacIZ⌬M15 Tn10(Tetr)]
Stratagene
Prochlorococcus sp. strain Axenic strain PCC 9511 Plasmids pGEM-T pPCCdnaA540 pPCCrnpB pMOSBlue pPCCftsZ571 pBluescript SK(⫹) p4K13 pPCCZAP4372
31
Apr cloning vector, dT-tailed EcoRV site pGEM-T with 540-bp dnaA PCR fragment cloned into the dT-tailed EcoRV site pGEM-T with 300-bp rnpB fragment cloned into the dT-tailed EcoRV site Apr cloning vector, dT-tailed EcoRV site pMOSBlue with 571-bp ftsZ PCR fragment cloned into the EcoRV site Apr cloning vector 4,790-bp HindIII fragment containing ddlB (partial), ftsQ, ftsZ, panB, and a part of hemN cloned in pBluescript pBluescript SK(⫺) 4,372-bp fragment containing ORF1 (partial), ORF2, ORF3, dnaA, and a part of ORF4
eters every 2 h, as detailed elsewhere (6), while the second was sampled for RNA (400 ml) every 4 h. Cell concentration and DNA distributions were analyzed on SYBR green I-stained cells in both cultures using flow cytometry (22). Preparation and analysis of DNA. Most DNA manipulations were carried out according to standard protocols (36). Prochlorococcus sp. strain PCC 9511 DNA was purified from freeze-dried cells as described previously (14). PCR was performed using 10 ng of DNA, 10 pmol of each primer, 250 M concentrations of each deoxynucleoside triphosphate, 2 U of Taq DNA polymerase (Qiagen) or AmpliTaq Gold (Perkin-Elmer), and 1⫻ Taq buffer supplemented with 2.5 mM MgCl2. After initial denaturation at 93°C for 5 min, the reaction mixtures were heated at 93°C for 45 s. Annealing was performed for 45 s at 54°C for a 571-bp ftsZ fragment or 62°C for the amplification of a 540-bp PCC 9511 dnaA fragment. Elongation occurred at 72°C for 1 min. After 35 cycles, the final step at 72°C was extended for 5 min. Plasmid and PCR product purification was done using commercial kits (Qiagen and Genomed). Products of cycle sequencing reactions (Bigdye terminator cycle sequencing kit) were separated on an ABI 373 automatic sequencer (Applied Biosystems Inc., Perkin Elmer). The 571-bp PCR fragment of ftsZ obtained by primers FTF and TFR (3) was cloned, yielding pPCCftsZ571 (strains and plasmids are reported in Table 1). This plasmid served as a template to generate single-stranded RNA probes or as a probe in Southern hybridization to isolate the ftsZ coding region from a size-selected HindIII plasmid minibank in vector pBluescript SK(⫹). A genomic library of Prochlorococcus sp. strain PCC 9511 was established by the ligation of partially digested EcoRI fragments into ZAPII (Stratagene). This library was screened for dnaA by hybridization using the Prochlorococcus marinus SS120 dnaA gene as a probe (30). The RNase P probe was kindly provided by Astrid Scho ¨n, Wu ¨rzburg, Germany. Primers for the generation of probes and sequencing are listed in Table 2. Preliminary sequence data for Prochlorococcus MED4 were obtained from the DOE Joint Genome Institute at http://spider.jgi-psf.org/JGI_microbial /html/. RNA extraction and Northern hybridization. RNA was extracted from 400 ml of culture for each sampling point as described (10). Northern hybridization was carried out at 61.5°C for single-stranded RNA probes and 50°C for DNA probes in 120 mM sodium phosphate buffer (pH 7.2)—250 mM NaCl—7% sodium dodecyl sulfate (SDS)—50% formamide. RNA probes were produced with 1.85 MBq of [␣-32P]UTP (Amersham) using the Maxiscript transcription kit (Ambion). Plasmids pPCCftsZ571 and pPCCdnaA540 served as templates. RNase protection assays were performed in accordance with the manufacturer’s instructions (RPAIII kit; Boehringer). Immunology. For protein extraction, cells were collected by centrifugation, disrupted by adding 0.1% SDS, sonicated three times for 10 s each time at 4°C with a Sonopuls HD 60 set at 50% of maximum power, and incubated twice at 95°C for 5 min. Protein concentrations were measured using the Bio-Rad protein assay. A polyclonal antiserum against recombinant Anabaena sp. strain PCC 7120 FtsZ (courtesy of C.-C. Zhang) was used for expression analysis (19). Western blots were prepared from total proteins separated on SDS—12% polyacrylamide gels (normalized to 1 g per lane) and blotted on Hybond-C extra membranes (Amersham). Incubation with antisera was performed at titers of 1:1,000 (FtsZ antibody). Secondary antisera were conjugated with horseradish peroxidase, and blots were developed with the chemiluminescence substrate SuperSignal (Pierce). Signals were quantified using PCBAS 2.09 software.
Promega This study A. Scho ¨n Amersham This study Stratagene This study This study
Nucleotide sequence accession numbers. The sequences reported in this paper have been deposited in the EMBL database under the accession numbers AJ011025 and AF158628.
RESULTS Organization of the genomic regions encoding DnaA and FtsQ to FtsZ in Prochlorococcus sp. strain PCC 9511. The gene arrangement around dnaA (Fig. 1A) is very unusual compared to gene arrangements in other eubacteria. However, it is apparently highly conserved among different Prochlorococcus strains, since almost the same arrangement is found in P. marinus SS120 (30). ORF1 shows pronounced similarity to the gene encoding YCF25 (AAC08078), a protein encoded in the plastid genome of Porphyra purpurea (29). The other hypothetical proteins are similar to the products of several ORFs in Synechocystis sp. strain PCC 6803 (17). Over the whole length, the amino acid sequence of strain PCC 9511 DnaA (463 amino acids) is 85% identical to that of SS120 (461 amino acids) and 49% identical to that of Synechocystis sp. strain PCC 6803. The ftsZ gene of Prochlorococcus sp. strain PCC 9511 is preceded by two genes highly similar to TABLE 2. Desoxyoligonucleotides used for the generation of probes and DNA sequence analysis Name
Sequence
FTF ........................AATGC(CT)GTTAACCG(GC)ATGATT TFR .......................GCC(CT)(GT)AC(AG)TC(AT)GCAAA(AG) dnaAPCCSP12 .....CTTGGAGGGAAGGAATATACACAAGAAG dnaAPCCRT3 ......GCTTAGATCAGTTCCCTGCCTC SPFT 3 ..................CCAATACTTGGATTCCCTCCTGCTC SPFT 4 ..................TGCAGGAGCTCCACTTCAAGAAGC SPFT 5 ..................GATTGTTGGGGTCAATTAGGTCG SPFT 6 ..................ACAGGTAACTGTTATTGCAACAGGTTT SPFT 7 ..................AGGCTCATCACTTGGTATTTCGAA SPFT 8 ..................CATGTTAGGAATGAGACTTAAAGAGGG SPFT 9 ..................TTTAACGCCCAAACCTGGTCAG SPFT 9b ................CTGGTCAGGATCGGAAGGTAG SPFT 10 ................GCTGATCCAGAGGTACAGAATGTTATTT SPFT 11 ................AAAAGGGAATATTTGTCTAAAAACTGAAAC SPFT 12 ................TAAAGATATTGCTATTAGAAGTTGTAGAGCAT SPFT 13 ................TGAATAAGAAACTTCACCGATTTCAG SPFT 14 ................AGAGAGAGCTAGAGAGTGGATGGAT SPFT 15 ................GAATGGGTAGCAGCCGAAAAG SPFT 16 ................AACCACTTGCCCAATTCCTAAAAA
EXPRESSION OF ftsZ AND dnaA IN PROCHLOROCOCCUS
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FIG. 1. Genomic region containing ftsZ and dnaA in Prochlorococcus sp. strain PCC 9511. (A) The dnaA gene is framed by four putative genes, ORF1 to ORF4, close homologues of which reside at corresponding sites in P. marinus sp. strain SS120 (30). (B) Organization of the ftsZ locus. The numbers designate putative gene start and stop codons (GenBank accession no. AJ011025 for ftsZ and AF158628 for dnaA). Genetic symbols are as follows: ddlB, D-alanine—D-alanine ligase; ftsQ, filamentous temperature-sensitive Q; ftsZ, filamentous temperature-sensitive Z; panB, 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase; and hemN, oxygen-independent coproporphyrinogen III oxidase. The locations of antisense RNA probes used in the expression analysis are indicated by arrows.
genes present in the cell wall and division gene cluster of E. coli. These genes encode a D-alanine—D-alanine ligase (8) and FtsQ, an intermediate recruit to the division site (7). PCC 9511 lacks a homologue of ftsA, which is located in E. coli between ftsZ and ftsQ. Scanning of the total genome sequence of Prochlorococcus sp. strain MED4 confirmed the absence of an ftsA homologue in the genome of that strain. The gene downstream of ftsZ shows similarity to panB and is followed by a putative homologue of hemN. Both genes overlap by 8 bp at their 3⬘ ends. In E. coli the product of hemN catalyzes the oxidative decarboxylation of coproporphyrinogen III to form protoporphyrinogen IX (40). Database searches show that FtsZ of Prochlorococcus sp. strain PCC 9511 has the highest identity to FtsZ from the marine Synechococcus strain WH8103 and a significantly lower similarity to three other cyanobacterial FtsZ proteins (Table 3). Both nucleotide sequences determined in this study (4,372 nucleotides [nt] for dnaA and 4,790 nt for ftsZ) are 100% identical to the respective DNA segments in the total genome of Prochlorococcus sp. strain MED4, indicating that these two strains might be genetically the same organism. Synchronization by modulated L/D cycles. The turbidostat culture of PCC 9511 was maintained in exponential growth at an average density of 9.76 ⫻ 107 ⫾ 3.1 ⫻ 107 cells ml⫺1 during the 4 days of sampling (data not shown). Flow cytometric
analyses indicated that the cell cycle was highly synchronized and that the daily alternation of cell cycle phases was very similar every day throughout the experiment (Fig. 2). From the beginning to the middle of the light period, almost all cells of the population were in the G1 phase. At the end of the day about 70% of the cell population had entered the S phase. Two hours after virtual sunset, this population proceeded through G2, and in the middle of the night (6 h after the end of the light period), most cells had divided and were back in G1. Transcript accumulation in synchronized Prochlorococcus sp. strain PCC 9511 cultures follows a diel rhythm. The steady-state level of ftsZ and dnaA mRNA showed considerable temporal variation and oscillated during the course of each cell cycle in a periodic way (Fig. 3). To detect minor differences in the total amount of RNA per lane, the RNA component of RNase P was used as an internal standard. The expression of ftsZ and dnaA peaked at the end of the light period (i.e., 10 h after light onset). This time corresponded to the S-phase maximum. In a parallel study using the same material, diel expression of several photosynthetic genes was shown but with maxima at time points very different from those for ftsZ and dnaA (12). Immunodetection of FtsZ. Antibodies raised against the recombinant FtsZ of Anabaena sp. strain PCC 7120 detected a single protein band of about 50 kDa in the Prochlorococcus sp.
TABLE 3. Sequence identity between the FtsZ protein of Prochloroccocus sp. strain PCC 9511 and that of other cyanobacteria and chloroplastsa Strain
1. 2. 3. 4. 5. 6.
Prochlorococcus sp. strain PCC 9511 Synechococcus sp. strain WH 8103 Synechocystis sp. strain PCC 6803 Synechococcus sp. strain PCC 7942 Anabaena sp. strain PCC 7120 Physcomitrella patens sp. strain FtsZ1 a
The alignment is available upon request.
Identity (%) to: 1
2
3
4
5
6
Accession no.
100
84 100
70 67 100
74 73 78 100
70 68 80 79 100
64 62 62 68 69 100
AJ011025 AAC72389 S77393 AAC26227 P45482 CAA04845
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HOLTZENDORFF ET AL.
J. BACTERIOL.
FIG. 2. Synchronization of Prochlorococcus sp. strain PCC 9511 by modulated L/D cycles. (A) Distribution of the cell population over the different cell cycle phases at each sampling point during four consecutive L/D cycles; (B) Flow-cytometric DNA fluorescence distributions for five representative time points (boxed). a.u., arbitrary units.
strain PCC 9511 lysate (Fig. 4A). This size corresponds well to that obtained for Anabaena (19). To analyze FtsZ abundance at different cell cycle stages, total cell proteins from three consecutive days were immunoblotted using this serum. Although expression changed slightly from day to day, the overall pattern was similar during the three consecutive photocycles. FtsZ concentration reached a minimum during the light period (when the number of cells in G1 is maximum) and increased during the S and the division phases (Fig. 4B). Two- and fourfold dilutions of the sample taken 26 h after the beginning of the experiment indicated that the amount of FtsZ varied by
a factor of 2 to 4 during a 24-h L/D cycle (Fig. 4C). This variation did not result from loading variability, since immunostaining of the same membrane using an antiserum against the photosynthesis protein PsbO did not reveal a comparable drop during the light period (data not shown). DISCUSSION The genome region surrounding ftsZ in Prochlorococcus sp. strain PCC 9511 is partially conserved compared to that in E. coli, where the genes are clustered in the order ddlB-ftsQ-ftsA-
FIG. 3. Transcript levels of dnaA (top) and ftsZ (bottom) in the turbidostat culture of Prochlorococcus sp. strain PCC 9511. Light (8 a.m. to 8 p.m.) and dark (8 p.m. to 8 a.m.) phases are shown by the black and white bars, respectively. Samples were taken at 4-h intervals. The RNA levels were determined by Northern hybridization (dnaA) or RNase protection assays (ftsZ). The size of the undigested ftsZ RNA probe was 621 nt, and that of the full-length ftsZ protected fragment was 571 nt. A DNA probe for rnpB was used to assess the amounts of RNA loaded per lane.
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EXPRESSION OF ftsZ AND dnaA IN PROCHLOROCOCCUS
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FIG. 4. Detection of FtsZ by immunoblotting. (A) FtsZ level in Prochlorococcus sp. strain PCC 9511 during three L/D cycles. Light and dark phases are displayed by black and white bars, respectively. (B) Graphic representation of FtsZ expression. (C) Semiquantitative assessment of the relative amount of FtsZ. Samples of the second L/D cycle were blotted together with two- and fourfold dilutions of the first sample of that day (taken at 26 h [stars]).
ftsZ. The apparent lack of ftsA, which is essential in E. coli (33), might be interpreted as an example of how genome minimization has been achieved during the evolution of the small genome of Prochlorococcus (38). The gene arrangement around dnaA is even less conserved than in E. coli, but it is similar to that previously found in Prochlorococcus SS120 (30). DnaA of the latter strain, expressed in vitro, recognized the oriC of E. coli and B. subtilis, suggesting a similar molecular basis for the initiation of replication in these eubacteria (30). The synteny of this genome region between the two Prochlorococcus strains is seemingly trivial. However, other markers are very different between these strains, e.g., multiple pcb genes (11) and a phycoerythrin gene cluster are present in strain SS120 (14), but not in strains MED4 and PCC 9511 (28, 31). The degree of 16S rRNA identity between the strains lies in the same range (98%) as that between members of different genera of enterobacteria. We show here that ftsZ and dnaA mRNA levels covary and are maximally expressed during the S phase. A simultaneous expression of genes like dnaA and ftsZ might well constitute the molecular basis for coordinated timing between DNA synthesis and cell division. For E. coli, cell cycle-related variations in the amount of ftsZ mRNA have previously been demonstrated (13, 16, 32). However, the method used to achieve synchronization in our study (simulation of a natural light regimen) is completely different from those used for heterotrophic bacteria. The oscillation of ftsZ mRNA abundance is partially matched by changes at the protein level. Synthesis of FtsZ starts during the S phase, and the concentration reached a maximum at night, i.e., at a time at which the mRNA level has clearly dropped again. Although we only roughly determined the timing of FtsZ expression, the maximum FtsZ level seems to correlate well with the onset of cell division. For E. coli, a titration mechanism that triggers cell division once a certain amount of FtsZ per cell is reached has been postulated (26). As far as we know, the amount of FtsZ actually required has never been assessed. As shown here, such changes in FtsZ concentration might be rather small, given that in Prochloro-
coccus the decrease in FtsZ amount per unit of total cellular protein during the day was on the order of about 50 to 75% only. The factors that coordinate the synchronous expression of genes such as the cell cycle genes dnaA and ftsZ will have to be further investigated. They could involve a circadian clock, as in the case of Synechococcus sp. strain PCC 7942 (18). Alternatively, they could be under the direct control of light through photoreceptors. Finally, these genes could be expressed when a specific cell constituent or cell property, such as size (4), reaches a critical threshold. The total genome sequences of three different Prochlorococcus strains to be available within the near future will become a powerful tool to elucidate these mechanisms in detail. ACKNOWLEDGMENTS This work was supported by the European Union program PROMOLEC (MAS3-CT97-0128) and JGOFS-France PROSOPE. We thank S. Penno for the ZAPII library of Prochlorococcus sp. strain PCC 9511, M. Hilbig for participation in molecular cloning of dnaA, S. Boulben and F. Le Gall for technical support with cultures, J. Blanchot for help with flow cytometry, R. Rippka for providing a culture of Prochlorococcus sp. strain PCC 9511, C.-C. Zhang and I. Kuhn for the FtsZ antiserum, A. Scho ¨n for the gift of rnpB, J.-C. Thomas for participation in RNA sampling, and D. Scanlan and G. Rocap for critical reading. REFERENCES 1. Armbrust, E. V., J. D. Bowen, R. J. Olson, and S. W. Chisholm. 1989. Effect of light on the cell cycle of a marine Synechococcus strain. Appl. Environ. Microbiol. 55:425–433. 2. Beech, P. L., T. Nheu, T. Schultz, S. Herbert, T. Lithgow, P. R. Gilson, and G. I. McFadden. 2000. Mitochondrial FtsZ in a chromophyte alga. Science 287:1276–1279. 3. Billi, D., M. Grilli Caiola, L. Paolozzi, and P. Ghelardini. 1998. A method for DNA extraction from the desert cyanobacterium Chroococcidiopsis and its application to identification of ftsZ. Appl. Environ. Microbiol. 64:4053– 4056. 4. Binder, B. 2000. Cell cycle regulation and the timing of chromosome replication in a marine Synechococcus (cyanobacteria) during light- and nitrogenlimited growth. J. Phycol. 36:120–126. 5. Binder, B. J., and S. W. Chisholm. 1995. Cell cycle regulation in marine Synechococcus sp. strains. Appl. Environ. Microbiol. 61:708–717. 6. Bruyant, F., M. Babin, A. Sciandra, D. Marie, B. Genty, H. Claustre, J.
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HOLTZENDORFF ET AL.
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