RISOLUZIONE ENO 8/2008
CODEX - CELLULASI L’ASSEMBLEA GENERALE Visto l’articolo 2, paragrafo 2 iv dell’accordo del 3 aprile 2001 che istituisce la creazione dell’Organizzazione Internazionale della vigna e del vino, Su
proposta della Sottocommissione dei metodi d’analisi e
del
gruppo
d’esperti
"Specificazioni dei prodotti enologici", DECIDE di completare il Codice Enologico internazionale con la seguente monografia: CELLULASI (endo-(1→4)-ß-D-glucanasi) (EC 3.2.1.4 – CAS n° 9012-54-8) Specifiche generali Questi enzimi non sono stati trovati allo stato puro, ma sono presenti all’interno di un complesso enzimatico. Salvo indicazioni contrarie, le specifiche devono essere conformi alla risoluzione œno 14-2003 relativa alle specifiche generali per le preparazioni enzimatiche che figurano nel Codice Enologico internazionale. 1. Origine e campo d’applicazione Gli enzimi che catalizzano la degradazione dei polisaccaridi di tipo cellulosa delle pareti cellulari dell’acino d’uva le cui beta glucanasi (in questo caso l’endo (1→4)ß-D-glucanasi) sono utilizzati per la chiarificazione dei vini, per migliorare la filtrabilità dei mosti e dei vini, e per aumentare i fenomeni di diffusione nel corso della macerazione. I preparati enzimatici contenenti queste attività provengono da fermentazioni dirette d’Aspergillus niger e/o di una miscela Aspergillus niger – Trichoderma reesei Attività secondarie : proteasi, beta-glucosidasi. Nel presente caso si può applicare la clausola dei 50% (risoluzione Eno 14/2003 4.1) 2. Campo d’applicazione Il metodo di dosaggio è stato messo a punto con l’aiuto di una glucanasi reperibile in commercio (5.4). Le condizioni ed il metodo sono stati sviluppati per l’applicazione ai preparati enzimatici commerciali reperibili sul mercato enologico. Esemplare certificato conforme Verona, il 20 giugno 2008 Il Direttore Generale dell’OIV Secretario dell’Assemblea Generale Federico CASTELLUCCI
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3. Principio L’endo (1→4)-ß-D-glucanasi catalizza l’idrolisi casuale dei legami glicosidici all’interno della cellulosa. La sua attività può quindi essere valutata dosando gli zuccheri riduttori (espressi in glucosio), liberati al momento dell’incubazione, con il metodo NELSON (1944). Si misurano solo le attività di tipo « endo- » data la presenza di gruppi carbossimetili che bloccano l’azione delle eso-glucanasi. Le endo-glucanasi agiscono all’interno delle catene nelle zone non carbossimetilate. In ambiente alcalino, il gruppo pseudoaldeidico degli zuccheri riduce gli ioni rameici Cu2+. Questi ultimi reagiscono con il reagente arseniomolibdico producendo una colorazione blu il cui assorbimento, misurato a 520 nm, varia in modo lineare con la concentrazione in zuccheri riducenti (tra 0 e 250 µg/mL) 4. Attrezzatura 4.1 agitatore magnetico riscaldante 4.2 bagno d’acqua a 40°C 4.3 bagno d’acqua a 100°C 4.4 becker da 100 mL 4.5 centrifuga adatta a contenere provette di vetro da 15 mL 4.6 cronometro 4.7 matraccio tarato da 100 mL 4.7.1 matraccio tarato da 500 mL 4.8. siringa di precisione da 200 µL 4.8.1 siringa di precisione da 1 mL 4.9 pipetta da 10 ml graduata a 1/10 di mL 4.10 spettrofotometro 4.11 provette di vetro da 15 mL 4.12 agitatore di tipo vortex 4.13 matraccio in vetro scuro da 500 mL. 4.14 camera fredda a 4°C 4.15 stufa a 37°C 4.16 cotone cardato 4.17 carta Kraft 4.18 pH-metro 4.19 supporto metallico per provette da 15 mL 4.20 cuvette monouso da 1 cm di cammino ottico, per misure spettrofotometriche nel visibile 4.21 sonda a ultrasuoni 5. Prodotti 5.1 acetato di sodio (CH3COONa puro al 99% - PM = 82g/mole) 5.2 acido acetico (CH3COOH puro al 96% - PM = 60 g/mole, densità = 1,058) 5.3 carbossimetilcellulosa (CMC) con un grado di sostituzione dal 65 al 95%. 5.4 cellulasi di Trichoderma reesei (Fluka, 4U/mg, rif : 22173) a titolo di esempio. Una unità, libera 1 µmole di glucosio derivante dalla carbossimetilcellulosa al minuto. 5.5 solfato di sodio anidro (Na2SO4 puro al 99,5% - PM = 142 g/mole) 5.6 carbonato di sodio anidro (Na2CO3 puro al 99,5% - PM = 105,99 g/mole) 5.7 tartarato di potassio e di sodio (KNaC4H4O6.4H2O puro al 99% - PM = 282,2 g/mole) 5.8 idrogenocarbonato di sodio anidro (NaHCO3 puro al 98% - PM = 84,0 1 g/mole) Esemplare certificato conforme Verona, il 20 giugno 2008 Il Direttore Generale dell’OIV Secretario dell’Assemblea Generale Federico CASTELLUCCI
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5.9 solfato di rame penta-idratato (CuSO4.5H2O puro al 99% - PM = 249,68 g/mole) 5.10 acido solforico (H2SO4 puro al 98%) concentrato 5.11 eptamolibdato d’ammonio ((NH4)6MO7O24.4H2O puro al 99% - PM = 1235,86 g/mole) 5.12 idrogenoarseniato di sodio (Na2HAsO4.7H2O puro al 98,5% - PM = 312,02 g/mole). Tenuto conto della tossicita’ di questo prodotto, si deve fare un’attenzione particolare nella sua manipolazione. I rifiuti devono essere trattati in maniera appropriata. 5.13 D-glucosio anidro (C6H12O6 puro al 99% - PM = 180,16 g/mole) 5.14 acqua distillata 5.15 preparazione enzimatica commerciale da analizzare 6. Soluzioni 6.1 Reagenti della soluzione ossidante Questi reagenti dovranno essere preparati per primi, tenuto conto del termine di 24 ore per la soluzione D. 6.1.1 Soluzione A : Mettere in un becker da 100 mL (4.4) in successione 20 g di solfato di sodio anidro (5.5) 2,5 g di carbonato di sodio anidro (5.6) 2,5 g di tartarato di potassio e di sodio (5.7) 2 g di idrogenocarbonato di sodio anidro (5.8) Sciogliere in 80 mL di acqua distillata (5.14). Scaldare (4.1) fino alla dissoluzione e travasare in un matraccio da 100 mL (4.7). Portare a volume con acqua distillata (5.14). Conservare a 37 °C (4.15); se si forma un deposito: filtrare. 6.1.2 Soluzione B : Sciogliere 15 g di solfato di rame idratato (5.9) in 100 mL d’acqua distillata (5.14) ed aggiungere una goccia di acido solforico concentrato (5.10). Conservare a 4°C (4.14). 6.1.3 Soluzione C : Questa soluzione è preparata al momento per avere una buona proporzione tra la densità di colore e la quantità di glucosio miscelando 1 mL di soluzione B (6.1.2) con 24 mL di soluzione A (6.1.1). 6.1.4 Soluzione D : In un matraccio graduato da 500 mL (4.7.1), sciogliere 25 g di molibdato d’ammonio (5.11) in 400 ml d’acqua (5.14). Aggiungere 25 mL d’acido solforico concentrato (5.10) (raffreddato sotto acqua corrente fredda). In un becker da 100 mL (4.4) sciogliere 3 g d’arseniato di sodio (5.12) in 25 mL di acqua (5.14) e travasare quantitativamente nel matraccio graduato da 500 mL (4.7.1) contenente il molibdato d’ammonio (5.11). Portare a volume con acqua (5.14). Tenere a 37°C (4.15) per 24 ore poi conservare a 4°C (4.14) in un matraccio di vetro scuro da 500 mL (4.13).
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6.2 Tampone acetato di sodio (pH 4,2, 100 mM) E’ costituito dalle soluzioni A e B. 6.2.1 Soluzione A : acetato di sodio 0,1 M: sciogliere 0,5 g d’ acetato di sodio (5.1) in 60 mL d’acqua distillata (5.14) 6.2.2 Soluzione B: acido acetico 0,1 M: diluire 1 mL d’acido acetico (5.2) con 175 mL d’acqua distillata (5.14) 6.2.3 Preparazione del Tampone acetato di sodio: miscelare 23,9 mL di soluzione A (6.2.1) + 76,1 mL di soluzione B (6.2.2). Verificare il pH del tampone con l’aiuto di un pH metro (4.18). La soluzione deve essere conservata a 4°C (4.14). 6.3 Soluzione di carbossimetilcellulosa (CMC) al 2% (p/v) In un matraccio tarato da 100 mL (4.7) introdurre 2 g di CMC (5.3) e portare a volume con acqua distillata (5.14) Tenendo conto dell’alta viscosita’, e per avere una soluzione omogenea, occorre poterla sottoporre a ultrasuoni (4.21), agitare senza scaldarla (4.1) e mantenerla in sospensione in agitazione costante. 6.4 Soluzione madre di glucosio a 250 µg/mL In un matraccio graduato da 100 mL (4.7), sciogliere 0,0250 g di glucosio (5.13) e portare a volume con acqua distillata (5.14).
7. Preparazione delle soluzioni standard di glucosio Le soluzioni sono ottenute a partire dalla soluzione madre di glucosio a 250 µg/mL(6.4.), come indicato nella Tabella 1. Tabella 1: Soluzioni standard di glucosio a partire dalla soluzione madre Glucosio (µg/mL)
0
25
50
100
150
200
250
Glucosio (µmole/mL)
0
0,139
Vol (µl) soluzione madre (6.4)
0
100
200
400
600
800
1000
Vol (µl) acqua distillata (5.14)
1000
900
800
600
400
200
0
0,278 0,555 0,833 1,110 1,388
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8. Preparazione del campione E’ importante omogeneizzare la preparazione enzimatica prima del prelievo del campione, per esempio tramite il capovolgimento del recipiente. La soluzione enzimatica ed i bianchi devono essere preparati al momento dell’utilizzo. 8.1 Soluzione enzimatica a 2 g/l da preparare estemporaneamente Mettere 200 mg di preparato commerciale (5.15) in un matraccio tarato da 100 mL (4.7), portare a volume con acqua distillata (5.14), agitare al fine di ottenere una miscela omogenea. 8.2 Bianco denaturato tramite riscaldamento da preparare estemporaneamente Mettere 10 mL della soluzione enzimatica a 2 g/l (8.1) nella provetta da 15 mL (4.11), tappare con cotone cardato (4.16) ricoperto da carta Kraft (4.17) ed immergere la provetta per 5 minuti nel bagno d’acqua a 100° C (4.3). Poi raffreddare e centrifugare per 5 min a 6 500 giri/min. 9. Procedura 9.1 Cinetica enzimatica: Le provette sono realizzate almeno in doppio. Nelle 5 provette da 15 mL (4.11) numerate da 1 a 5, sistemate in un supporto (4.19) in un bagno d’acqua a 40° C, introdurre 200 µl di soluzione enzimatica a 2 g/l (8.1), con l’aiuto della siringa di precisione (4.8), 400 µl di tampone acetato di sodio (6.2), con l’aiuto della siringa di precisione (4.8.1), 600 µl di soluzione di carbossimetilcellulosa (6.3) portata in precedenza a 40 °C nel bagno d’acqua, azionare il cronometro (4.6). Dopo averle agitate (4.12), le provette tappate con cotone cardato (4.16) e carta Kraft (4.17) sono riposizionate nel bagno d’acqua a 40 °C (4.2). Per la durata di 1 min per la provetta n° 1 Per la durata di 2 min per la provetta n° 2 Per la durata di 5 min per la provetta n° 3 Per la durata di 10 min per la provetta n° 4 Per la durata di 15 min per la provetta n°5 La reazione si blocca mettendo per 10 min nel bagno d’acqua a 100°C ogni provetta numerata da 1 a 5 immediatamente dopo averla tolta dal bagno d’acqua a 40°C (4.3) Le provette sono in seguito raffreddate sotto acqua corrente fredda. Nota: il punto di cinetica a 10 min. Permette di valutare l’attivita’ enzimatica ricercata.
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9.2 Dosaggio delle sostanze riduttrici liberate In una provetta da 15 mL (4.11) mettere 1 mL di soluzione di reazione (9.1) aggiungere 1 mL di soluzione C (6.1.3) dopo aver agitato (4.12), la provetta è messa in bagno d’acqua a 100°C (4.3) per 10 min. La provetta è successivamente raffreddata sotto acqua corrente fredda. Aggiungere 1 mL di soluzione D (6.1.4) aggiungere 9,5 mL d’acqua (5.14) con l’aiuto della pipetta da 10 mL (4.9) attendere 10 mn per la stabilizzazione del colore. Centrifugare (4.5) ogni provetta a 2430 giri/min per 10 min. Mettere il supernatante in una cuvetta (4.20). Realizzare lo zero sullo spettrofotometro con acqua distillata. Misurare subito l’assorbimento a 520 nm, mediante uno spettrofotometro (4.10). 9.3 Bianchi Procedere come descritto al punto 9.1 sostituendo la soluzione enzimatica a 2 g/l (8.1) con il bianco denaturato tramite calore (8.2). Per ogni punto della cinetica la reazione enzimatica di ogni bianco e’ realizzata contemporaneamente a quella della soluzione enzimatica. 9.4 Soluzioni di riferimento Procedere come descritto al punto 9.2 sostituendo la soluzione di reazione (9.1) con le soluzioni standard di glucosio da 0 a 250 µg/mL (7). 10. Calcoli 10.1 Realizzazione di una cinetica In generale, il calcolo dell’attività enzimatica può essere effettuato solo se il substrato e l’enzima non sono in quantità limitanti. Ci si posiziona allora nella parte ascendente della curva, in questa fase l’attività enzimatica è lineare nel tempo. In caso contrario, l’attività sarebbe sottostimata. (Figura 1).
cinétique réaction enzymatique cineticade della reazione enzimatica 0,7
Assorbanza absorbance
0,6 0,5
plateau
Plateau
0,4 0,3 0,2
phase ascendante fase ascendente
0,1 0 0
2
4
6
8
10
12
14
16
temps (min) Tempo (min)
Figura 1: Cinetica della reazione enzimatica
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Si realizza una cinetica su 15 minuti. L’attività relativa è misurata a T=1 min T=2min, T=5 min, T=10 min, T=15 min. Dopo aver realizzato la cinetica di reazione enzimatica, ottenere la curva di variazione dell’assorbimento in funzione del tempo di reazione. L’assorbimento corrisponde alla differenza tra l’assorbimento della preparazione enzimatica e del bianco corrispondente ad un tempo T. Poi calcolare l’equazione (1) della retta di regressione tenendo conto solamente dei punti della fase ascendente. (vedi figura 1) 10.2 Realizzazione della retta di calibrazione La retta di calibrazione corrisponde ad un concentrazioni di campione di glucosio (da 0 a densità ottiche corrispondenti, ottenuti al punto retta di regressione (2) che risulta dalla linearità
grafico avente in ascissa le differenti 0,693 µmole/mL) e in ordinata i valori di 9.4. Calcolare poi la pendenza (Q/T) della dei dati del grafico.
10.3 Calcolo dell’attività enzimatica A partire dalla retta di regressione (1) calcolare l’assorbimento per un tempo medio T (per esempio 4 min nel caso della figura 1) ricavare la quantità Q di glucosio liberato (in µmole) per questo tempo intermedio con l’aiuto dell’equazione (2). La formula per calcolare l’attività enzimatica in U/g di preparato è la seguente : Attività in U/g = 1000 x Q/T)/(VxC) Dove Q: quantità di glucosio liberato in µmole durante un tempo T (min) V: quantità di soluzione enzimatica introdotta (mL) in questo caso 0,2 mL C: concentrazione della soluzione enzimatica (g/l) in questo caso 2 g/l Si può poi esprimere l’attività enzimatica in nanokatal. Questa unità corrisponde al numero di nanomoli di prodotto formato al secondo nelle condizioni definite dai protocolli di dosaggio e quindi : Attività in nkat/g = attività in U/g 1000/60
11. Caratteristiche del metodo r
0,084
R
0,056
Sr
0,03
SR
0,02
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La ripetibilità intralaboratori del metodo è stimata tramite la deviazione standard dei valori di assorbimento risultanti da uno stesso prelievo del preparato enzimatico, dosato 5 volte. Così, per il dosaggio della carbossimetilcellulasi la deviazione standard dei valori è di 0,03 con una percentuale di errore del 13,56. La % di errore corrisponde a: (deviazione standard dei valori x 100) media dei valori delle prove In questo modo il metodo di dosaggio presentato è giudicato ripetibile. Le prove di riproducibilità intralaboratori sono state effettuate mediante 2 preparazioni enzimatiche e 5 prelievi di campioni per ognuna. Sono stati utilizzate 2 prove che hanno permesso di determinare la buona riproducibilità del metodo : - l’analisi della varianza (studio della probabilità di comparsa degli scarti tra i prelievi di campione). L’analisi di varianza è un metodo statistico che permette di testare l’ipotesi di omogeneità di un insieme di k medie. Effettuare l’analisi della varianza vuol dire verificare se l’effetto « trattamento » è « significativo o no » Questa analisi della varianza da uno scarto tipo di riproducibilita’ di 0,02. - l’efficacia del test al rischio α di prima specie (5%) - Il rischio α di prima specie è il rischio di decidere che trattamenti effettivamente identici, sono diversi. Se l’efficacia è debole (≅ 20%), vuol dire che non è stata scoperta alcuna differenza tra i trattamenti, ma esistono poche probabilità di vedere una differenza qualora ne fosse realmente esistita una. Se l’efficacia è elevata (≅ 80%), vuol dire che non è stata scoperta alcuna differenza tra i trattamenti, ma, qualora ne fosse esistita una, avevamo i mezzi per vederla. I risultati sono riportati nella tabella 2: Dosaggi
Ipotesi dell’analisi varianza
Endo (1→4)-ßRispettate D-glucanasi
di
Probabilità Efficacia della Test Test prova (α = 5%) Newman- Bonferroni Keuls (*) (**) 0,00011
95%
Significativo Significativo
Tabella 2 : Analisi della varianza – studio dell’effetto del prelievo di campione * Test Newmann-Keuls: questo test di confronto delle medie permette di costituire gruppi omogenei di trattamenti: quelli appartenenti a un medesimo gruppo sono considerati non differenti al rischio α di prima specie scelto ** Test di Bonferroni: chiamato anche « test del t corretto », il test di Bonferroni permette di realizzare tutti i confronti di medie 2 a 2, cioè (t (t-1) )/2 confronti prima dei trattamenti, rispettando il rischio α di prima specie scelto.
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In questo modo, le prove attuate permettono di vedere una differenza se realmente ne esiste una (efficacia della prova forte); il metodo di dosaggio presenta inoltre una probabilità di comparsa di scarto d’attività (tra i prelievi di campione) inferiore al 5%.
12.
Bibliografia
NELSON N., A photometric adaptation of the SOMOGYI method for the determination of glucose. The may Institute for medical research of the Jewish hospital, 1944. p 375380. Attivita’ enzimatiche e loro misurazione – Documento OIV, FV 1226, 2005
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