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METODO RAPIDO PER LA DETERMINAZIONE DI ACIDO ASCORBICO Gloria DIMITRI, Andrea PIVA, Giuseppe ARFELLI, Ren MENGJIA Dipartimento di Scienze degli Alimenti - Università degli Studi di Teramo
Introduzione La qualità dei vini è strettamente legata alle caratteristiche sensoriali prontamente percepite dal consumatore prima ancora dell’utilizzo. Infatti, l’apparenza del prodotto (colore, limpidezza, ecc.) influenza in maniera determinante la predisposizione all’acquisto. Molti coadiuvanti tecnologici possono essere utilizzati allo scopo di rendere più durature queste caratteristiche sensoriali. Tra i vari coadiuvanti l’acido L-ascorbico è sicuramente un prodotto che, assieme all’anidride solforosa, svolge tale azione. L’acido L-ascorbico, presente nel mondo vegetale come vitamina C idrosolubile, è un antiossidante utilizzato in vari prodotti alimentari. Nel vino svolge un’efficace azione antiossidante, immediata e anche più intensa dell’acido solforoso, al quale peraltro non va a sostituirsi. Rispetto all’anidride solforosa è un antiossidante reversibile, quindi se presente nel mezzo in assenza di un accettore irreversibile di ossigeno (vedi l’anidride solforosa), la sua forma ossidata (acido deidroascorbico) diventa un forte ossidante producendo a sua volta acqua ossigenata; per un suo utilizzo è pertanto necessaria la contemporanea presenza di anidride solforosa libera. L’acido ascorbico può impedire la casse ferrica, azione accentuata dalla contemporanea presenza di acido citrico. Bertrand et al. (2003) effettuarono una sperimentazione su differenti vitigni di provenienze diverse, di cui alcuni lotti trattati con una miscela di acido ascorbico - biossido di zolfo, mentre un altro lotto non ricevette acido ascorbico, ma solamente una certa dose di anidride solforosa. I vini provenienti da uve trattate con acido ascorbico mostrarono più finezza e un aroma più fruttato; inoltre, non si osservarono notevoli differenze a livello degli esteri e degli acidi volatili, mostrando che non vi erano state modifiche del metabolismo lipidico. L’acido ascorbico, in molti casi quindi, provoca il miglioramento delle caratteristiche sensoriali dei vini conservati in bottiglia, garantendo una migliore conservazione della freschezza e del fruttato, soprattutto in alcuni tipi di vini bianchi secchi o spumanti. Inoltre, consente di abbreviare la durata del periodo critico che segue l’imbottigliamento. Negli ultimi anni l’acido ascorbico ha trovato impiego, in associazione con l’anidride solforosa, nella tecnica di prevenzione delle ossidazioni dei mosti d’uva, tuttavia il suo impiego è per legge previsto solo sui vini a dosi massime di 250 mg/L. Nel trattamento finale dei vini contro gli effetti ossidativi, è diffuso l’uso di formulati a base di acido citrico anidro, metabisolfito di potassio e acido L-ascorbico. L’acido ascorbico presente riduce drasticamente l’ossigeno disciolto, mentre l’acido citrico complessa i metalli impedendo la formazione di casse ferrica, mentre l’anidride solforosa blocca l’eventuale formazione di acqua ossigenata. Sembra, inoltre, che in fase di soluzione acquosa nel formulato si originino dei composti tra acido ascorbico e solforosa con forte azione antiossidante. Lo scopo del presente lavoro è stato quello di elaborare e ottimizzare un metodo rapido per la determinazione dell’acido ascorbico attraverso misure spettrofotometriche.
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MATERIALI E METODI Preparazione della soluzione modello La soluzione modello è stata ottenuta aggiungendo ad una soluzione idroalcolica (12% v/v di etanolo) 5 g/L di acido tartarico, 5 mg/L di (+)catechina e saturando con tartrato acido di potassio. La soluzione così ottenuta è stata aggiunta di piccole concentrazioni di idrossido di sodio concentrato per portare il pH a 3.2. La soluzione modello è stata infine trasferita all’interno di provette in pyrex da 20 mL con tappo a vite ed aggiunta di diversi volumi di soluzione concentrata di acido ascorbico, al fine di raggiungere un volume finale pari a 10 mL ed una concentrazione pari a 0, 100 e 200 mg/L di acido ascorbico. Piano di campionamento Il piano di campionamento ha previsto l’analisi di campioni preparati in funzione di uno studio parallelo relativo ad una sperimentazione più ampia. I campioni oggetto di studio sono stati otto, come riportato schematicamente in tabella 1, dove si evidenzia la contemporanea aggiunta di altri coadiuvanti tecnologici, come tannino di galla ed anidride solforosa. Nello specifico, è stato effettuato lo stoccaggio delle soluzioni in provetta a 40 e 50 °C per 15 giorni, per un totale di sei campionamenti al giorno 0, 2, 4, 7, 10 e 14. Per tale motivo, per ogni concentrazione di acido ascorbico, sono state preparate sei ripetizioni, coerentemente con il piano di campionamento, al fine di garantire le stesse condizioni sperimentali, in termini di spazio di testa ed esposizione all’ossigeno, nell’intero periodo di conservazioe. Complessivamente, dunque i campioni analizzati sono stati 48. Tabella 1 Campioni oggetto di studio contenenti diverse concentrazioni di acido ascorbico.
Campioni sperimentali C3 C4 C5 C6 C8 C9 C10 C11
Ac. Ascorbico mg/L 100 100 200 200 200 100 100 100
Tannini di galla mg/L 200 0 200 100 0 100 100 100
SO2 mg/L 0 100 100 0 50 50 50 50
Purificazione dei campioni I campioni sono stati purificati tramite estrazione in fase solida (SPE), preventivamente attivata con 5 mL di etanolo e 2x5 mL di acqua distillata. La purificazione del campione è stata effettuata caricando un’aliquota di campione (1 mL) su cartuccia SPE C18 (ISOLUTE® C18 500 mg/6 mL) ed eluendo successivamente con 5 mL di soluzione modello senza catechine. Il campione così eluito è stato raccolto in provetta e il volume finale è stato pari a 6 mL, con un coefficiente di diluizione pari a 6. Questa procedura viene normalmente utilizzata per trattenere la componente fenolica, perché più affine alla fase stazionaria delle cartucce, e separare dunque la componente più polare, come acidi e zuccheri.
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Condizionamento
Coricamento campione
Eluizione campione
Serbatoio
Filtro Fase solida assorbente Filtro
Cartuccia SPE
Figura 1: Purificazione mediante estrazione in fase solida (SPE)
Metodologia analitica La misura analitica è stata effettuata utilizzando uno spettrofotometro 20 LambdaBio (Perkin Elmer, Massachusetts, USA) a doppio raggio. È stata impostata la scansione spettrofotometrica in un range di lunghezza d’onda pari a 200÷350 nm, e lo spettro che si è ottenuto è stato quello tipico dell’acido ascorbico, che ha un massimo di assorbimento a 245 nm. Le cuvette utilizzate sono state del tipo standard in quarzo, con un percorso ottico di 10 mm. L’azzeramento strumentale è stato effettuato utilizzando la soluzione modello senza catechine e sottraendo, durante la misura, l’assorbimento della soluzione modello a quella del singolo campione. Sono state inoltre preparate soluzioni a concentrazione nota di acido ascorbico, in più ripetizioni, conservate alla stessa temperatura del piano sperimentale. Ogni soluzione è stata analizzata subito dopo la sua preparazione per la costruzione di una curva di calibrazione, costruita considerando l’intensità del picco dello spettro dell’acido ascorbico a 245 nm. Le successive ripetizioni sono state analizzate al fine di individuare la diminuzione dell’acido ascorbico nel tempo in condizioni standard. RISULTATI E DISCUSSIONE Studi preliminari per l’impostazione del metodo sono stati effettuati preparando una soluzione modello contenente acido tartarico, solfato di rame e portando al pH 3.2 con idrossido di potassio e aggiunte di 100 mg/L di (+) catechina, quale substrato di ossidazione presente nei vini, come riportato in uno studio di Peng et al. (1998). Le misure spettrofotometriche effettuate su tali soluzioni hanno evidenziato una forte interferenza del segnale di assorbanza, tale da non rendere visibile lo spettro di assorbimento dell’acido ascorbico. Successivamente è stata modificata la composizione della soluzione modello, come riportato in “materiali e metodi”.
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Inoltre, prove preliminari sono state effettuate su soluzioni di standard di acido ascorbico a diverse concentrazioni. Lo standard, inoltre è stato solubilizzato in acqua e in soluzione modello. Per entrambe le prove, sono stati ottenuti gli spettri di assorbimento per la costruzione delle relative curve di calibrazione. In particolare, le curve sono state costruite utilizzando la risposta strumentale, sia in termini di area del picco dello spettro dello standard, sia utilizzando l’altezza del picco dello standard, alla lunghezza d’onda pari a 245 nm. Di seguito sono riportati gli spettri delle soluzioni standard preparate in soluzione modello (figura 2).
4.00
3.5
PUNTO 8 PUNTO 7
3.0
PUNTO 6
Abs
2.5
A
PUNTO 5 PUNTO 4
2.0
PUNTO 3 1.5
PUNTO 2 PUNTO 1
1.0
0.5
-0.03 200.0
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
310
nm
320
330
340
350.0
nm Figura 2: Punti di calibrazione dello standard di acido ascorbico in soluzione modello (0-200 mg/L). Misura spettrofotometrica: scansione da 200 a 350 nm. Le soluzioni standard, sono poi state utilizzate per costruire la retta di calibrazione. In particolare sono stati utilizzati i valori dell’intensità di assorbanza corrispondente al massimo di assorbimento dell’acido ascorbico 2 (245 nm). La retta di calibrazione ottenuta è y = 0.0494x + 0.1211, con un R pari a 0.9966.
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Curva di calibrazione acido ascorbico in soluzione modello
Altezza del picco (abs)
3
2.5
2
y = 0.0494x + 0.1211 R² = 0.9966 1.5
1
0.5
0 0
10
20
30
40
50
60
Concentrazione
Figura 3: Retta di calibrazione costruita con l’altezza del picco dello spettro delle soluzioni standard di acido ascorbico in soluzione modello.
I campioni, preparati sulla base del piano sperimentale, sono stati sottoposti ad una prima misura spettrofotometrica, previa diluizione di 5 volte, per mantenere le condizioni analitiche simili a quelle utilizzate per la costruzione della curva di calibrazione. Di seguito sono riportate le scansioni relative a tali campioni. 4.00
3.5
3.0
2.5
A
2.0
1.5
1.0
0.5
-0.04 200.0
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
310
320
330
340
350.0
nm
Figura 4: Misura spettrofotometrica dei campioni sperimentali tal quali previa diluizione di 5 volte in soluzione modello.
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Dalla figura 4 è possibile evidenziare come vi siano delle interferenze nel segnale di assorbanza durante la scansione. Tale interferenza è riconducibile al contributo dell’assorbanza relativa alle catechine, contenute in tutti i campioni, e alle altre componenti chimiche aggiunte in alcuni campioni a diversa concentrazione (tannino di galla e metabisolfito di potassio), come previsto dal piano sperimentale. Per eliminare le interferenze, i campioni sono stati purificati tramite estrazione in fase solida (SPE). Questa procedura viene normalmente utilizzata per trattenere la componente fenolica e separando quindi quella più polare rappresentata da acidi organici e zuccheri. In figura 5, sono riportati gli spettri di assorbimento dei campioni contenenti acido ascorbico, sottoposti preventivamente a purificazione in C18.
4.00
3.5
3.0
2.5
A
2.0
200 mg/L
1.5
1.0
0.5
100 mg/L
0.01 200.0
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
310
320
330
340
350.0
nm
Figura 5: Misura spettrofotometrica dei campioni sperimentali al tempo 0 (t0), contenenti acido ascorbico 100 e 200 mg/L (corsa 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 e 11) e purificati in colonne C18 (1 mL di campione eluito con 5 mL di soluzione modello) dopo attivazione della cartuccia SPE con 5mL di metanolo + 5 mL x 2 volte di acqua).
Si può notare come i campioni così trattati mostrino un evidente abbassamento delle interferenze sul segnale dell’acido ascorbico. Inoltre, i campioni possono essere raggruppati in due sottoinsiemi, rispettivamente con concentrazione di acido ascorbico pari a 100 e 200 mg/L, coerentemente con le concentrazioni fissate dal piano sperimentale. Esiste, dunque, una proporzionalità del valore di assorbanza che è doppia al raddoppiare della concentrazione dell’acido ascorbico. Calcolando, inoltre, attraverso l’utilizzo della retta di calibrazione costruita con l’intensità di assorbanza a 245 nm (assorbanza corrispondente al massimo dello spettro dell’acido ascorbico), è stato possibile calcolare la concentrazione di acido ascorbico nei campioni sperimentali.
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Per verificare che il pretrattamento di purificazione fosse efficace, in termini di completa eluizione dell’acido ascorbico, sono state effettuate prove di recupero. Pertanto, una soluzione di acido ascorbico standard, a concentrazione nota e preparata nelle stesse condizioni dei campioni sperimentali, è stata analizzata immediatamente dopo la sua preparazione (considerando un fattore di diluizione uguale a quello che si ottiene dopo il passaggio in C18), mentre un’ulteriore aliquota è stata purificata tramite cartucce SPE C18 e quindi analizzata. Di seguito, in figura 6, sono riportati i segnali relativi alle due determinazioni sopramenzionate, ed è possibile notare come tutto l’acido ascorbico sia recuperato nell’eluito dopo il trattamento di purificazione.
2.10 2.0
a
1.9 1.8 1.7 1.6
STANDARD 1 DILUITO 1:6 1.5 1.4 1.3
STANDARD 1 C18 (DILUIZIONE 1:6)
1.2
b
1.1 A
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 -0.02 200.0
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
310
320
330
340
350.0
nm
Figura 6: (a) Soluzione standard di acido ascorbico (diluito 1:6); (b) Soluzione standard di acido ascorbico purificato in C18.
Ulteriori prove di recupero sono state effettuate sui campioni sperimentali C6 e C8. Sono stati fatti eluire ulteriori 5 mL di soluzione modello attraverso la cartuccia SPE, dopo la purificazione del campione e, raccolto l’eluito, sono state effettuate le misure spettrofotometriche, per verificare che la cartuccia non trattenesse parte dell’acido ascorbico contenuto nel campione sperimentale. Nella figura 7 vengono messe a confronto le scansioni relative al campione 8 purificato (blu) e la corrispondente prova di recupero (rosso). La misura dell’eluito del recupero dimostra come la cartuccia non trattenga acido ascorbico, il cui segnale è vicino allo zero.
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2.00 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 A
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.00 202.0
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
310
320
330
340
350.0
nm
Figura 7: Campione 8 purificato (blu); prova di recupero del campione 8 (rosso).
Analizzando poi i campioni sperimentali al tempo 2 (t2) (figura 8), è possibile evidenziare una forte riduzione del segnale di assorbanza a 245 nm. Ciò è probabilmente legato alla completa ossidazione dell’acido ascorbico. 4.00 3.5 3.0 2.5
A
2.0 1.5 1.0 0.5 0.00 200.0
220
240
260
280 nm
300
320
340 350.0
Figura 8: Misura spettrofotometrica dei campioni sperimentali al tempo 2 (t2).
A conferma di tale ipotesi, sono state effettuate misure sperimentali di due soluzioni standard di acido ascorbico (100 e 200 mg/L rispettivamente) sottoposte a scansione spettrofotometrica immediatamente dopo la loro preparazione (A), e dopo conservazione di 3 giorni alla temperatura di 50 °C (B) (figura 9).
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3.00 2.8 2.6 2.4 2.2
STANDARD T2_t0
2.0
A
1.8 1.6 A
1.4
B
STANDARD 1_t0
1.2 1.0 0.8
STANDARD T2_t3_50 °C 0.6 0.4
STANDARD T_t3_50 °C
0.2 -0.01 200.0
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
310
320
330
340
350.0
nm
Figura 9: (A) Soluzione standard di acido ascorbico analizzata immediatamente dopo la sua preparazione; (B) Soluzione standard di acido ascorbico dopo 3 giorni di conservazione a 50 °C.
Calcolando le concentrazioni di acido ascorbico, relativamente ai campioni di standard si osserva come esso sia quasi completamente degradato, probabilmente per l’effetto molto spinto della temperatura, che indubbiamente determina una degradazione dell’acido ascorbico già dopo due giorni a 50 °C. Il secondo picco, con il massimo di assorbimento a 295 nm, rappresenta invece l’acido deidroascorbico, formatosi per completa ossidazione dell’acido ascorbico dopo pochi giorni di stoccaggio. Per evidenziare la completa ossidazione dell’acido ascorbico nei campioni oggetto di sperimentazione, sono stati messi a confronto gli spettri di assorbimento del campione 8 acquisti nel tempo, come riportato in figura 10. È evidente come l’acido ascorbico diminuisca nel corso della conservazione, mentre aumenti proporzionalmente il picco relativo alla sua forma ossidata.
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2.34 2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2 A 1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
-0.05 200.0
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
310
320
330
340
350.0
nm
Figura 10: Scansione degli spettri di assorbimento del campione 8 acquisiti durante durante i campionamenti nell’arco dei 14 giorni di conservazione a 40 °C.
Relativamente ai dati sperimentali sino ad ora ottenuti, di seguito si riportano i valori di concentrazione dell’acido ascorbico rispettivamente a 40 e 50 °C in figura 11 (a) e (b). I campioni analizzati mostrano un’evidente diminuzione sin dai primi 4 giorni di conservazione alle due temperature studiate (40 e 50 °C), a conferma di una spinta e quasi completa degradazione dell’acido ascorbico. Inoltre, alla temperatura di 50 °C, già dal secondo giorno di campionamento, per tutti i campioni, l’acido ascorbico è stato completamente ossidato, per l’influenza della temperatura elevata sulla velocità di ossidazione di tale molecola. Il metodo suggerisce, inoltre, come per i campioni analizzati il limite di rilevabilità strumentale sia leggermente superiore a quello osservato per le soluzioni standard utilizzate per la costruzione della retta di calibrazione. Questo potrebbe rappresentare un punto di partenza per l’ottimizzazione del metodo in oggetto, in termini di minimizzazione delle interferenze del segnale che potrebbero portare a sovrastimare la reale concentrazione di acido ascorbico nei campioni reali.
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Sperimentazione alla temperatura di 40 °C 240
Concentrazione Ac. Ascorbico (mg/L)
C03
C04
C05
C06
C08
C09
C10
C11
190
140
90
40
-10
0
2
4
6
8
10
12
14
16
14
16
Tempo di campionamento (giorni)
(a)
Sperimentazione alla temperatura di 50 °C 240
Concentrazione Ac. Ascorbico (mg/L)
C03
C04
C05
C06
C08
C09
C10
C11
190
140
90
40
-10 0
2
4
6 8 10 Tempo di campionamento (giorni)
12
(b) Figura 11: Concentrazione di acido ascorbico dei campioni conservati a 40 °C (a) e 50 °C (b).
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CONCLUSIONI Questo lavoro sperimentale ha permesso di focalizzare l’attenzione sull’importanza di ottimizzare e sperimentare una metodica analitica semplice, poco costosa, quale valida alternativa per l’indagine di un coadiuvante tecnologico, l’acido ascorbico, normalmente utilizzato durante la produzione dei vini, specie quelli bianchi. Ulteriori approfondimenti e sperimentazioni saranno sviluppati al fine di ottenere dati utili per il trasferimento diretto in azienda delle eventuali informazioni, al fine di impiegare tale metodica per un diretto controllo e monitoraggio di questo composto, abbattendo i costi analitici e semplificandone le procedure. BIBLIOGRAFIA -
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Peng. Z., Duncan B., Pocock K.F. and Sefton M.A. (1998). The effect of acorbic acid on oxidative browning of white wines and model wines. Australian Journal of grape and wine research: 4-127135. Bertrand A., Canal-Llaubéres R.M., Feuillat M., Hardy G., Lamadon F., Lonvaud-Funel A., Pellerin P., Vivas N. (2003). Prodotti di trattamento ed ausiliari di elaborazione dei mosti e dei vini. Eno-one, Reggio Emilia.
Riassunto Le applicazioni enologiche di sostanze protettive e antiossidanti, aggiunte in fase di produzione, è una prassi ormai consolidata per assicurare la stabilità del prodotto vino. Dato il sempre maggiore utilizzo dell’acido ascorbico in diverse fasi della vinificazione, è stato sviluppato un metodo analitico rapido per la sua determinazione. Sono state condotte ripetute analisi in spettrofotometria con l’acquisizione dello spettro di assorbimento in un intervallo di lunghezza d’onda pari a 200÷350 nm. L’altezza del picco dello spettro dell’acido ascorbico, che ha un massimo di assorbimento a 245 nm, è stata poi messa in relazione con la relativa concentrazione, attraverso la elaborazione della retta di calibrazione, costruita mediante determinazioni analitiche di soluzioni di acido ascorbico standard. I campioni sono stati pretrattati al fine di ridurre l’interferenza analitica della componente fenolica presente (catechine e tannini). Tale pretrattamento è stato effettuato attraverso il passaggio dei campioni in colonne C:18 SPE (solid phase extracion). Il tempo totale dell’analisi (pretrattamento e lettura spettofotometrica) è di 10 minuti per un singolo campione, ma può essere ulteriormente ridotto se si analizzano più campioni in parallelo. Lo studio e l’ottimizzazione di misure spettrofotometriche per la determinazione dell’acido ascorbico potrebbe rappresentare un metodo rapido ed economico, facilmente trasferibile in azienda.
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