Le mutazioni 4
Lezione 13 By NA
MUTAZIONI DINAMICHE
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MEMENTO La cosidetta patologia molecolare ha come fine quello di spiegare se e come un particolare allele sia collegabile ad un fenotipo clinico, quindi ci si domanda: la mutazione che effetto ha sulla quantita', qualita', funzione del prodotto? cosi' si tenta di spiegare perche' sia o meno patogenetica ormai vi saranno chiare le difficolta' che si incontrano e la portata della sfida per comprendere il funzionamento del genoma umano: le malattie genetiche sono il risultato di un complesso network di interazioni, ma costituiscono il fulcro per lo studio delle funzioni.
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&Insorgenza tardiva
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Anticipazione
L alcuni fenotipi a trasmissione autosomica dominante diventano piu’ gravi nelle generazioni successive perche?
M
espansione di triplette: tipo di mutazione individuata nel 1990
&Corea di Hunghinton, X fragile, Distrofia Miotonica L premutazione : stato che aumenta il rischio di trasmettere il fenotipo patologico. Il rischio non e’ piu’ quantizzabile in termini probabilistici
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Schema di mutazioni dinamiche Mutazione completa, range di mutazione Premutazione Normale
CGG 1000
GAA900
CTG 3000
CGG
GAA
CTG
CGG
280
CGG CGG CGG 200
GAA GAA GAA
CGG 60 CGG 52
GAA GAA
CGG
6
GAA
GAA
5’UTR
esone
X-fragile
200
CTG CTG CTG
GAA 22 GAA
CGG CGG CGG
CTG
GAA
CTG 50 CTG
CTG CTG
7
introne
CTG CTG
esone
introne
Atassia di Friedrich
Mutazione completa, range di mutazione
CAG 121
Premutazione
CAG 35
CGG 25
CAG
CGG
Normale
CAG CAG CAG CAG CAG
esone 3’UTR Distrofia miotonica
CGG 75
CAG
CGG
36
CGG
10
CGG CGG
49
7
Esone ORF
Corea di Huntington By NA
37 3
Atassia spinocerebellare 1
Mutazioni dinamiche – effetto fondatore Dal momento che le ripetizioni del range di normalità NON aumentano di numero dopo replicazione, da dove sono nati gli alleli instabili? EFFETTO FONDATORE: Eccezionalmente, in uno o pochi individui, si sono verificati degli errori nella trascrizione, producendo degli alleli con un numero di ripetizioni aumentato, che sono stati ereditati nelle successive generazioni, producendo un pool di alleli instabili presenti oggi nella popolazione Per molte delle mutazioni dinamiche l ’effetto fondatore è stato dimostrato Questo effetto fondatore si riconosce anche nell ’assenza o maggior frequenza di alcune di queste patologie in certe aree geografiche
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Mutazioni dinamiche meccanismo dell ’instabilità Perché oltre una certa lunghezza compare il fenomeno dell ’instabilità? La presenza di un aumentato numero di ripetizioni provoca, nel DNA, la formazione di strutture alternative , assenti quando il numero di ripetizioni è nel range di normalità Queste strutture causano problemi sia nei processi di trascrizione (slippage della polimerasi), sia probabilmente nei meccanismi di riparazione del DNA La conseguenza ultima è la tendenza all ’incremento numerico delle ripetizioni dopo replicazione (sia mitotica che meiotica!) Per lo stesso principio, sono possibili anche le contrazioni di ripetizioni , ma per la maggior parte delle patologie le espansioni sono favorite
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Mutazioni dinamiche strutture alternative del DNA
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Mutazioni dinamiche espansioni e contrazioni
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Mutazioni dinamiche principi generali delle mutazioni dinamiche INSTABILITÀ MITOTICA: determina la presenza di espansioni di grandezze differenti all’interno dello stesso tessuto e tra tessuti differenti. Produce dunque un mosaicismo tissutale INSTABILITÀ MEIOTICA: determina la trasmissione alle generazioni successive di una espansione di diversa ampiezza. E’alla base del meccanismo dell ’anticipazione TRASMISSIONE PATERNA O MATERNA: in alcune patologie, si possono avere espansioni o contrazioni del numero di ripetizioni a seconda che l’allele mutato sia trasmesso dal padre o dalla madre By NA
Mutazioni dinamiche Localizzazione delle espansioni Perché un aumento nel numero di sequenze ripetute causa una patologia?
Esistono differenti meccanismi molecolari alla base delle diverse patologie By NA
Mutazioni dinamiche Classificazione molecolare Espansioni in porzioni codificanti (esoniche) del gene: • Poliglutamine (Corea di Huntington, malattia di Kennedy, SCAs) • Polialanine (Oloprosencefalia, sinpolidattilia, hand-footgenital syndrome) Espansioni in porzioni non codificanti del gene: • • • • By NA
Promotore (Epilessia progressiva mioclonica) 5’-UTR (Sindrome dell’X-fragile, SCA12) Introne (Atassia di Friedrich, Distrofia miotonica di tipo 2) 3’-UTR (Distrofia miotonica di tipo 1, SCA8)
Mutazioni dinamiche – Sindrome dell ’X fragile Come si spiega il paradosso di Sherman? La sindrome dell ’X-fragile è stata la prima patologia da espansione di triplette riconosciuta (1991). Il gene responsabile è FMR1 che mappa sul cromosoma Xq27.3 La tripletta responsabile è CGG, situata nella porzione 5 ’-UTR L ’espansione di questa tripletta è causa del 99% dei casi di FRAXA Valori normali: < 44 repeats Gray zone: 45-54 repeats Premutazione : 55-200 repeats Mutazione: > 200 repeats
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Mutazioni dinamiche – Sindrome dell ’X fragile Soluzione del paradosso di Sherman: Nel passaggio da una generazione all ’altra, soprattutto per trasmissione materna, il numero di triplette tende ad aumentare > normalmente, i maschi figli di portatrici avranno un numero di triplette più elevato rispetto alle madri Ø Oltre le 200 ripetizioni: affetti Ø Inferiore a 200 ripetizioni : clinicamente sani Se l’aumento resta nell ’ambito della premutazione, i maschi che ricevono l’allele premutato lo trasmetteranno mediamente invariato alle figlie Le loro figlie avranno quindi un numero maggiore di ripetizioni rispetto alle nonne >aumentato rischio di salto oltre le 200 ripetizioni = aumentato rischio di figli con ritardo mentale rispetto alle nonne (effetto di posizione nell ’albero genealogico) Oggi possiamo quantificare meglio il rischio di avere un figlio con ritardo mentale : Ø Triplette inferiori a 55: rischio pari a 0 Ø Triplette superiori a 100: rischio pari al 100% Ø Valori intermedi: il rischio cresce esponenzialmente
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Mutazioni dinamiche – Sindrome dell ’X fragile Come nella distrofia miotonica, l’espansione è localizzata in una porzione del gene non tradotta Diversamente da questa e ’una patologia da silenziamento genico
perche ’
Il gene e’ composto di 17 esoni ed e’ lungo 38 Kb.All’interno del primo esone al 5’UTR e’ presente una serie di CGG.Nella popolazione questa regione e’ polimorfica: varia da 7 a 52 ripetizioni: l’allele piu’ comune e’ quello di 30 (effetto fondatore). Quando il numero delle triplette supera 230 l’intera regione viene ipermetilata aggiungendo un gruppo metilico a C su entrambe le eliche
M il promotore del gene viene inattivato e FRM1 diviene silente By NA
e la cromatina non riesce a condensare correttamente
Mutazioni dinamiche – Sindrome dell ’X fragile riassumendo
*La tripletta CGG si trova vicina al promotore del gene FMR1 in una zona ricca di CpG islands
*Un’espansione
oltre i 200 repeats causa il richiamo di specifiche proteine che metilano le citosine del promotore del gene FMR1> MODIFICA EPIGENETICA
*La proteina FMRP è importante nello sviluppo neuronale e dei dendriti. Se il gene è silenziato > APLOINSUFFICIENZA
*Nei maschi, non si avrà alcun prodotto proteico (emizigoti) > affetti *Nelle femmine, il prodotto presente dipende da quale cromosoma X è inattivato > affette se è maggiormente inattivo il cromosoma X normale, altrimenti sane (mosaicismo di metilazione )
*Ecco perché la frequenza delle femmine affette è minore
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Mutazioni dinamiche – Sindrome dell ’X fragile riassumendo Ridefininizione di mutazione patologica: è definita come corrisponde all ’allele con oltre 200 triplette metilate
full mutation ,
Casi particolari (rari): Mosaicismo di lunghezza (normale/premutato; premutato/full mutato; normale/mutato) > fenotipo variabile Mosaicismo di metilazione >fenotipo variabile
(alleli con > 200 triplette metilati e non metilati)
1% dei pazienti non presenta espansione di triplette : mutazioni puntiformi, delezione del gene Perché i maschi affetti non hanno figlie affette? I maschi con full mutation hanno solo premutazioni negli spermatozoi per la selezione degli spermatozoi durante lo sviluppo embrionale Di conseguenza, le figlie di maschi affetti saranno solo premutate e mai full mutate By NA
Mutazioni dinamiche – FMR1 related disorders FMR1 -related disorders * Il 20% delle donne con premutazione presenta Premature Ovarian Failure (POF, esaurimento follicolare precoce) *Circa il 20% degli uomini con premutazione presenta Fragile X ataxia/Tremor Syndrome (FXTAS), mentre è rarissima tra le donne Il gene FMR1 presenta quindi ETEROGENEITÀ ALLELICA NON sono patologie da aploinsufficienza : sono probabilmente patologie RNA mediate:Gli alleli premutati non solo non sono silenziati, ma presentano anche un’aumentata trascrizione, per compensare il difetto di traduzione degli alleli espansi ? accumulo di RNA
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Mutazioni dinamiche – Corea di Huntington – meccanismi 1
Meccanismo patogenetico principale: tossicità da poliglutamine
L’eccesso di glutamine nella sequenza aminoacidica impedisce il giusto ripiegamento (folding) della proteina stessa La proteina viene degradata ma i frammenti con le poliglutamine si aggregano Si formano accumuli all’interno dei nuclei dei neuroni con guadagno di funzione ed effetto citotossico ? apoptosi e degenerazione neuronale Accanto a questo, ci sono altri meccanismi che contribuiscono a determinare il fenotipo (danno mitocondriale, alterazione della trascrizione di altri geni, alterazione del trasporto assonale) By NA
Mutazioni dinamiche – Corea di Huntington – meccanismi 2
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Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica 1 – classificazione molecolare Gene responsabile: l ’espansione riguarda la tripletta da CTG e si trova nella regione 3 ’UTR del gene DMPK che mappa sul cromosoma 19q13.3 Classificazione molecolare: •5-36 repeats: alleli normali •50-150 repeats: classe E1 •150 -1000 repeats: classe E2 •1000 - >4000 repeats: classe E3 La forma congenita si manifesta in genere per espansioni di classe E3, trasmesse per via materna. Le espansioni trasmesse dal padre tendono ad essere più stabili (presenza sia di espansioni, sia assenza di variazione, sia rare contrazioni )
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Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica 1 pedigree
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Il gene DMPK
Nei pazienti (CTG)n è espanso
Distrofia miotonica
M questo non e ’sufficiente per dire che quel gene e
’il responsabile della malattia: bisogna individuare anche affetti con mutazioni puntiformi.
M Nel caso di FMR1 ci sono affetti senza espansione con mutazioni puntiformi che impediscono l ’espressione.
M si ritiene che il gene identificato sia il principale, ma non si e’ancora compreso perche l ’espansione provochi la patologia. Forse altera l ’espressione dei geni adiacenti. Esistono modelli murini che sembrerebbero validare questa ipotesi.
M Ma allora bisogna ritenere DM
una sindrome da geni contigui
Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica 2 Miopatia miotonica prossimale (PROMM), simile e spesso indistinguibile a livello clinico dalla DM1 La sua frequenza non è chiara (1/50.000 circa) Le differenze maggiori con la DM1 riguardano • Presenza di una clinica globalmente più lieve • Possibile presenza di crampi e algie, mai presenti nella DM1 • Colpisce prima i muscoli prossimali • Non è mai presente una forma congenita con ritardo mentale By NA
Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica 2 La patologia è determinata da un ’espansione di un tetranucleotide CCTG, presente nel primo introne del gene ZNF9, che mappa in posizione 3q21.3 Alleli normali: 11 -26 repeats Alleli mutati: 75 -11.000 repeats (media: 5.000 repeats) Nonostante il grandissimo numero di ripetizioni, non è possibile effettuare una correlazione genotipo -fenotipo La penetranza è completa e l ’espressività è variabile DM1 e DM2 sono un esempio di ETEROGENEITÀ GENETICA, cioè mutazioni in geni differenti possono produrre lo stesso fenotipo Entrambe le patologie sono dotate di grandissimo
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mosaicismo somatico
Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica – Patologia ad RNA Perché una mutazione in una regione non codificante provoca una patologia? Patologia dell’RNA
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Mutazioni dinamiche – Distrofia Miotonica – Patogenesi Il gene DMPK è trascritto in mRNA che deve essere traslocato dal nucleo al citoplasma per essere processato Se è presente l ’espansione, questa sarà trascritta in RNA (CUG). In seguito allo splicing dell ’mRNA, il messaggero contenente la ripetizione CUG forma degli aggregati resistenti alla distruzione che rimangono intrappolati nel nucleo Questi aggregati interferiscono con altre proteine nucleari >
guadagno di
funzione In particolare, gli aggregati ( “foci ”) di RNA sequestrano una classe di proteine (MBNL1) e “spiazzano ”una seconda famiglia di proteine (CELF). Questi due tipi di proteine sono necessari per un corretto assemblaggio dello spliceosoma L ’effetto finale è l ’alterazione dello splicing di altri geni, con conseguente alterazione funzionale di diversi pathways (effetto in trans ) By NA
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