Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Bacheloreksamen

manan.dk

MEDICINSK BIOKEMI Aarhus Universitet

Maj 2011

Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Bacheloreksamen MEDICINSK BIOKEMI MED KEMI

2

Mandag den 16. maj, kl. 09:00 - 15:00 Skøjtehallen, Gøteborg Allé 9 Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver. Som bilag er tilføjet en Tabel med navne på – og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner m/tom hukommelse. ”Metabolic Pathways”, 22nd Edition, Sigma-Aldrich, 2003, udleveres. På eksamensbordet er fremlagt kuverter til aflevering samt gult kladdepapir og trefarvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det trefarvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Der udleveres 2 kuverter. Originalbesvarelsen puttes i kuverten med SORT påskrift og lukkes. Besvarelsen på gennemslagspapir puttes i kuverten med RØD påskrift og lukkes. Begge kuverter afleveres lukket med det indhold, som eksaminanden ønsker bedømt. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.

manan.dk

Essayopgave

Fordøjelsessystemet 1.

Polysakkarider skal nedbrydes til monosakkarider for at kunne optages af tarmens enterocytter. Angiv opbygningen af de i føden forekommende polysakkarider og gør rede for nedbrydningsprocessen af disse. Beskriv herunder de involverede enzymers reaktioner og de anatomiske områder hvor processen forløber.

2.

En forhøjet koncentration af monosakkarider i tarmlumen kan give anledning til akkumulering af væske og heraf følgende diarré. Forklar denne sammenhæng og beskriv hvorledes den enzymatiske nedbrydning af kulhydrater ved tarmepitelet kan reguleres.

3.

I mavesækken (ventriklen) spiller hovedceller og parietalceller en vigtig rolle i relation til nedbrydningen af proteiner. Gør rede for disse to celletypers funktion ved nedbrydningen af proteiner.

4.

Den enzymatiske nedbrydning af proteiner forløber også i duodenum ved hjælp af proteaser produceret af pancreas. Nævn mindst tre af disse proteaser og forklar hvorledes aktiviteten af disse etableres i duodenum.

5.

Størstedelen af fedt i vores diæt består af triacylglycerol. Angiv strukturen af et triacylglycerol og beskriv hvorledes nedbrydningen forløber i tyndtarmen. Der ønskes herunder redegjort for hvilke organer, der bidrager til processen samt hvilke produkter der dannes.

manan.dk

Opgave 1

Stoffet kinin er et naturligt, hvidt krystallinsk alkaloid, som udvindes af kinabark. Det blev brugt til behandling af malaria, især før fremkomsten af nyere bekæmpelsesmidler. I dag bliver stoffet stort set udelukkende brugt mod natlige lægkramper. Stoffet anvendes også som smagsstof i tonicvand. Ifølge legenden fik den bitre smag i kinindrik mod malaria de engelske kolonialister til at blande den med gin, hvorved den kendte cocktail gin og tonic kom til verden. Der kan benyttes følgende værdier for atommasser: H (1 gmol-1), C (12 gmol-1), N (14 gmol-1), O (16 gmol-1), og Cl (35 gmol-1).

kinin

1. Angiv molekylformen for kinin og estimer molekylets molare masse. 2. Angiv de chirale centre i kinin. 3. Hvor mange stereoisomere strukturer af kinin kan der højst forekomme?

Da kinin er en amin gives kininholdige medikamenter som et salt, for eksempel som kininhydrochlorid. 4. Angiv den dosis (i mg) af kininhydrochlorid der svarer til 100 mg kinin. 5. Kinin oxideres efter nedenstående reaktionsskema. Angiv de funktionelle grupper der dannes i produkterne ved denne reaktion.

manan.dk

Opgave 2

Hæmoglobin og allosterisk regulation af ilttransport Hæmoglobin spiller en central rolle for gastransporten i organismen.

1.

Beskriv opbygningen af hæmoglobin og redegør på den baggrund for betegnelserne holoprotein, apoprotein og prostetisk gruppe.

2.

Angiv de allosteriske modulatorer som regulerer hæmoglobins affinitet for ilt, og beskriv mekanismen for deres effekt på hæmoglobin proteinet.

3.

Skitser iltmætningskurven for hæmoglobin og angiv hvordan de enkelte allosteriske modulatorer påvirker kurven. Angiv hvad der forstås ved Bohr effekten.

manan.dk

Opgave 3

1.

Beskriv, hvordan indtag af alkohol og alkoholens omsætning i leveren påvirker de reaktioner i glukoneogenesen og i β-oxidationen, hvor der forbruges/dannes NAD+/NADH.

2.

Beskriv de metaboliske ændringer der sker i leveren ved et massivt indtag af alkohol hos en person der i forvejen faster.

manan.dk

Opgave 4 Mitochondrier 1.

Beskriv kort mekanismen ved henholdsvis oxidativ fosforylering og substratfosforylering. Hvilken type fosforylering er den kvantitativt vigtigste?

2.

Nyfødte har høje koncentrationer af et afkoblingsprotein (UCP 1) i mitochondrierne i deres fedtvæv. Beskriv kort proteinets funktion og fysiologiske virkning.

3.

Hvorledes transporteres ATP ud af mitochondrierne, og hvorledes transporteres ADP og uorganisk fosfat (Pi) ind i mitochondrierne?

manan.dk

Opgave 5

Responselementer:

1.

Giv en kortfattet beskrivelse af et responselement.

2.

Familien af steroidreceptorer indeholder to velbevarede aminosyresekvenser (domæner). Beskriv med udgangspunkt i disse to domæner hvorledes steroidreceptorer (type-1) virker.

manan.dk

Bilag.

manan.dk

Svar til Essayopgave 1.

Kostens polysakkarider udgøres af amylose og amylopectin. Amylose er et uforgrenet polysakkarid, som består af glucoseenheder forbundet via α1,4 glycosidbindinger. Amylopectin er forgrenet og opbygget af glucoseenheder forbundet med α1,4 glycosidbindinger samt α1,6 glycosidbindinger i forgreningspunkter. Glycogen findes i animalske fødevareemner og har en struktur som svarer til amylopectin. Cellulose er et polysakkarid som findes i plantevæv og indeholder glucoseenheder forbundet med β1,4 glycosidbindinger. Cellulose betegnes som kostfibre og kan ikke fordøjes af menneskets fordøjelsessystem (forventes ikke ved en fyldestgørende besvarelse). Nedbrydningen af polysakkarider initieres i mundhulen af enzymet amylase, som udskilles fra spytkirtler. I ventriklen inhiberes amylase af mavesyrens lave pH-værdi. Fordøjelsen fortsætter i duodenum ved hjælp af amylase udskilt fra den exokrine pancreas. Disse amylaser er endoglycosidaser og kan spalte α1,4 glycosidbindinger men ikke α1,6 glycosidbindinger. Ydermere kan amylase ikke spalte disakkaridet maltose (to glucoseenheder) samt α1,4 glycosidbindinger tæt ved forgreningspunkter. Produkterne af fordøjelsen bliver således glucose, maltose, maltotriose samt dextriner, som er en heterogen blanding af glucosestrukturer der indeholder forgreningspunkter. Den videre fordøjelse sker på enterocytternes overflade og involverer aktiviteten af en række enzymer herunder oligosakkaridase og α-glucosidase som virker på α1,4 glycosidbindinger samt isomaltase, som har specificitet for α1,6 glycosidbindinger. Det endelige produkt er således glucose. (Baynes & Dominiczak: s118; tabel 10.1; Fig. 10.3; Fig. 10.4; boks s121)

2.

I forbindelse med nedbrydning af kulhydrater i tarmlumen dannes der en relativt stor mængde monosakkarider, som er osmotisk aktive og derfor vil trække vand over tarmepithelet og ud i lumen. Ved tilstedeværelsen af disakkarider i tarmlumen forøges mængden af disakkaridaser på enterocytternes børstesømsmembran (med undtagelse af laktase), således at disakkariderne kan spaltes til monosakkarider for optagelse. Transport af monosakkarider over tarmens epithel er dog det hastighedsbegrænsende trin ved fordøjelse af kulhydrater. Ved uændret aktivitet af disakkaridaser vil der derfor ophobes monosakkarider i tarmlumen. For at undgå dette påvirkes disakkaridasernes aktivitet af det osmotiske tryk i tarmen og reduceres således som følge af forøget koncentration af monosakkarider. (Baynes & Dominiczak: s118-120)

3.

Hovedceller (chief cells) syntetiserer pepsinogen. Pepsinogen er et inaktivt enzym som aktiveres ved lavt pH til pepsin (autoaktivering) eller på basis af pepsin, som kan kløve og aktivere pepsinogen (autokatalyse). Pepsin er en syrestabil protease, som kan kløve proteiner i fødevarer til fragmenter (peptider) og er således det første trin i nedbrydningen af proteiner. Parietalceller er ansvarlig for at pumpe protoner ud i ventriklen, således at miljøet her er meget surt (pH < 2). Dette sker ved aktiviteten af carbon anhydrase og en protonpumpe lokaliseret i cellernes luminale membran. Den lave pH-værdi der derved etableres i mavesækken understøtter i) autoaktivering af pepsinogen og ii) denaturering (udfoldning) af proteiner i føden således at disse bedre kan spaltes af pepsin.

manan.dk

4.

5.

(Baynes & Dominiczak: s125; tabel 10.2; boks s121) Alle proteaser der udskilles af den exocrine pancreas syntetiseres som inaktive enzymer der skal aktiveres. Trypsinogen: Aktiveres på basis af enteropeptidase/enterokinase, som er et enzym der produceres i duodenum (udskilles fra Liberkinds kirtler). Trypsin kan efterfølgende aktivere trypsinogen og ligeledes aktivere andre inaktive proteaser fra pancreas. Chymotrypsinogen: Aktiveres af trypsin til chymotrypsin Proelastase: Aktiveres af trypsin til elastase Procarboxypeptidaser: Aktiveres af trypsin til carboxypeptidaser (der findes to typer som betegnes A og B) Ydermere er det essentielt for aktiviteten af disse proteaser i duodenum at pH-værdien er neutral. Derfor er det vigtigt at pancreas producerer bicarbonat, som kan neutralisere den sure kymus der kommer fra ventriklen. (Baynes & Dominiczak: s125; tabel 10.2; boks s122) Triacylglycerol (TAG) er opbygget af glycerol hvortil der er koblet tre fedtsyrer via en esterbinding:

I tyndtarmen understøttes opløsningen af de hydrofobe fedtpartikler, som indeholder TAG, af galdesalte, der udskilles fra galdeblæren til tarmlumen. Galdesalte er amfifatiske molekyler der indeholder en hydrofob del og en hydrofil del. Disse galdesalte kan inkorporeres i fedtpartikler og herved understøtte opløsningen af fedt til mindre strukturer (emulgation). Denne struktur tillader, at de vandopløselige lipaser kan kløve esterbindinger i TAG og frigive fedtsyrer. I tyndtarmen er det hovedsageligt pancreas lipasen som virker (der udskilles også syrestabile lipaser i mundhulen og i mavesækken). Lipasen er inaktiv i tilstedeværelsen af galdesalte, men bliver aktiveret ved interaktion med proteinet co-lipase, som også udskilles af pancreas. Ydermere medierer co-lipasen forankringen af lipasen på overfladen af fedtpartiklerne hvor fordøjelsen af TAG så kan forløbe. Den største del af fordøjelsen resulterer i dannelsen af 2-monoacylglycerol (2-MAG) da lipasen har vanskeligt ved at fjerne alle fedtsyrer fra glycerolstrukturen. Der dannes dog også mindre mængder af 1-MAG og 1,2 diacylglyceroler samt glycerol. Produkterne af fordøjelsen (glycerol undtaget) holdes i opløsning i miceller, som dannes af galdesalte og transporteres herefter til tyndtarmens børstesømsmembran for optagelse. (Baynes & Dominiczak: s122; Fig. 10.6; Fig 10.7)

manan.dk

Svar til opgave 1

1.

C20H24N2O2, MW = (20 x 12) + (24 x 1) + (2 x 14) + (2 x 16) gmol-1= 324 gmol-1

2.

* * * * 3.

2N = 24 = 16 (s 117 i kompendiet)

4.

m(kininhydrochlorid) = (324+35+1 gmol-1 )/(324 gmol-1) * 100 mg = 111 mg

5.

Der dannes to carboxylsyre grupper

manan.dk

Svar til opgave 2

1.

Et holoprotein er et protein, som i sin funktionelle tilstand består af en protein-del (apoproteinet) med en prostetisk gruppe bundet til apoproteinet. Den prostetiske gruppe er en cofaktor, som ikke er et peptid. Hæmoglobin er et tetramert protein, der består af 4 globin subunits. Det er en såkaldt heterotetramer der består af 2 ens alfa-kæder og 2 ens andre kæder. Den almindeligst forekommende har beta2-kæder, men ved nyfødte findes en betydelig mængde som gamma-kæder. I hver subunit er bundet et hæmmolekyle, som er en organisk forbindelse der koordinerer et jernatom. Jernet skal være på ferroform for at kunne binde ilt.

2.

Hæmoglobins affinitet for ilt reguleres negativt af en række allosteriske modulatorer. 2,3difosfoglycerat (BPG) i erythrocytten virker ved at 1 molekyle DPG reversibelt reagerer med hele hæmoglobinmolekylet og herved sænker iltaffiniteten. CO2 kan bindes til en aminogruppen i hver globinkæde så der dannes en carbaminogruppe, og herved sænkes affiniteten for ilt. H+ ioner protonerer sidekæder på visse aminosyrer og herved sænkes hele hæmoglobinmolekylets affinitet for ilt.

3.

Som vist på kurven vil de 3 allosteriske modulatorer BPG, H+ og CO2 bevirke en højreforskydning af iltmætningskurven. Det betyder, at der til et givet ilttryk vil være mindre ilt bundet til hæmoglobin og skyldes at regulatorerne sænker iltaffiniteten. Bohr effekten er det fænomen, at iltaffiniteten er sensitiv for pH niveauet.

manan.dk

Svar til opgave 3

1.

Når alkohol omsættes i leverceller (i cytosol), øges mængden af NADH, idet der dannes NADH i de reaktioner, hvor alkohol omsættes: (reaktioner kræves ikke opskrevet) CH3CH2OH + NAD+ → CH3CHO + NADH + H+ (alkohol dehydrogenase) CH3CHO + NAD+ + CoA → acetyl-CoA + NADH + H+ (acetaldehyd dehydrogenase) For at kompensere herfor vil de NADH-dannende glukoneogenetiske reaktioner i cytosol forskydes således, at NADH i stedet forbruges og omdannes til NAD+. Dette medfører hæmning af glukoneogenesen. Dette vil også medføre en øget mængde af NADH i mitochondrierne, og dette vil hæmme β-oxidationen.

2.

Leveren håndterer en fastesituation ved at respondere på et øget niveau af glukagon i blodet og vil på grund af dette øge den mængde af glukose, der frisættes til blodet via glykogenolyse og glukoneogenese. Idet der forbruges ATP i glukoneogenesen, kræves en samtidig tilførsel af fedtsyrer, der i leveren omsættes i β-oxidationen med NADH og FADH2 (og efterfølgende ATP) i udbytte. Der vil således både i β-oxidationen og i glukoneogenesen genereres NADH, hvilket er uforeneligt med, at der samtidig dannes en øget mængde NADH ved omsætning af alkoholen. Omsætningen af alkohol i levercellerne vil netop bremse de reaktioner i glukoneogenese og β-oxidation, der genererer NADH og forskyde disse modsatte vej for at kompensere for den øgede mængde NADH. Dette vil altså bremse glukoneogenesen og β-oxidationen. Der vil ikke blive frisat normal mængde glukose til blodet, idet glukoneogenese er nedsat. Desuden vil en tiltagende mængde fedtsyrer være at finde i blodbanen, da disse ikke bliver omsat i leveren i β-oxidationen, da denne også er hæmmet. Fedtsyrerne returneres derfor af levercellerne til blodbanen. Leveren vil derfor under et massivt alkoholindtag ikke være i stand til at håndtere en fastesituation på normal vis; hverken hvad angår frisættelse af glukose til blodet eller omsætning af fedtsyrer i leveren.

manan.dk

Svar til opgave 4 1.

Ved oxidativ fosforylering dannes ATP ud fra ADP og uorganisk fosfat (Pi) i ATP synthasen, som sidder i den indre membran. Energien til syntesen stammer fra H+gradienten over den indre membran: H+-koncentrationen i det intermembranøse rum er højere end i matrix, hvorfor H+ under passende omstændigheder kan diffundere ind i matrix. Hvis dette foregår via ATP synthasen, kan enzymet optage den energi, der frigives ved H+-diffusionen. H+-gradienten over membranen dannes af elektrontransportkæden, som i sit sidste trin bruger ilt. Ved substratfosforylering dannes ATP (eller GTP) ved, at energi overføres direkte fra en metabolit (et substrat) til ADP (eller GDP). Fosfatgruppen kan komme sammen med energien eller indgå i reaktionen på lavenergiform. Den oxidative fosforylering er langt den vigtigste.

2.

Afkoblingsproteinet sidder i den indre membran og lader H+ diffundere fra det intermembranøse rum ind i matrix uden at der syntetiseres ATP. Energien, som frigøres ved H+ diffusionen, bliver i stedet for til varme.

3.

ATP transporteres over den indre membran i antiport med ADP, og uorganisk fosfat transporteres over den indre membran ind i matrix i symport med H+. ATP, ADP og uorganisk fosfat kan alle diffundere frit gennem den ydre membran.

manan.dk

Svar til opgave 5

1.

Responselementer er en kort nukleotidsekvens, der kan binde specifikke transskriptionsfaktorer. Disse transskriptionsfaktorer er kendetegnet ved at blive reguleret af en specifik stimulation (eks. cyklisk AMP, insulin-like growth factor m.m.) og derved enten stimulere eller hæmme gentransskription. Responselementer er ofte en del af en promoter eller en enhancer. (Baynes s. 450)

2.

Steroidreceptorer (type-1) er opløselige receptorer, der findes i cellers cytoplasma og er kendetegnet ved at have et DNA og et ligand (steroid) bindende domæne. Når et steroid optages til cellens cytoplasma, kan det interagere med specifikke steroidreceptorer via det ligand-bindende domæne. Dette formidler dels en dimerisering af receptorkomplekset hvorved det DNA-bindende domæne eksponeres, samt en transport af komplekset til cellens kerne. Det DNA-bindende domæne, som består af såkaldte zink-finger motiver, genkender og binder de relevante responselementer, hvorved specifik transskription af DNA til RNA initieres. Responselementer hvortil steroidreceptorer binder er kendetegnet ved at være palindromiske DNA sekvenser. (Baynes s. 452)

manan.dk

MEDICINSK BIOKEMI Aarhus Universitet

December 2010

Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Bacheloreksamen MED I CI NS K B IO KE M I ME D K E MI

2

Onsdag den 1. december 2010, kl. 09:00 - 15:00 Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver. Som bilag er tilføjet en Tabel med navne på – og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner m/tom hukommelse. ”Metabolic Pathways”, 22nd Edition, Sigma-Aldrich, 2003, udleveres. På eksamensbordet er fremlagt kuverter til aflevering samt gult kladdepapir og trefarvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det trefarvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Der udleveres 2 kuverter. Originalbesvarelsen puttes i kuverten med SORT påskrift og lukkes. Besvarelsen på gennemslagspapir puttes i kuverten med RØD påskrift og lukkes. Begge kuverter afleveres lukket med det indhold, som eksaminanden ønsker bedømt. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – december 2010 – side 2

Essayopgave Binyrernes hormoner 1. Nævn de tre væsentligste hormoner, som produceres i binyrebarken. Hormonerne syntetiseres overvejende i forskellige områder af barken, nævn hvilke, og angiv med udgangspunkt i forekomsten af kritiske enzymer, hvorfor forskellige dele af binyrebarken helt eller overvejende kun kan syntetisere et af hormonerne. 2. Binyrebarkhormonerne syntetiseres på basis af kolesterol. Beskriv hvordan cellerne tilvejebringer og opbevarer den nødvendige kolesterol, og angiv i den forbindelse enzymer og membranproteiner, som er centrale i processen/processerne. 3. Produktionen af binyrebarkhormoner reguleres. Angiv hvilket/hvilke signalmolekyler/joner der virker direkte, og hvordan de virker på det cellulære niveau. Beskriv dannelsen af det/de involverede signalpeptider, herunder de stimuli, som igangsætter processen. 4. Beskriv ved hjælp af et diagram (som det anførte) de ændringer, som langvarig faste medfører i leverens glukoneogenese, samt i blodets indhold af sukker, ketonstoffer og fedtsyrer. Glukoneogenese på basis af protein/aminosyrer er uhensigtsmæssig under langvarig faste. Angiv en anden kilde til glukose, som spiller en stor rolle under faste. Giv, med udgangspunkt i levercellernes mitochondrier, et par eksempler på, at fedtforbrændig virker dæmpende på glykolysen. Niveau relativt til ”ikkefastende” værdier (0).

(+) 0 (-)

Varighed af faste (dage)

5

10 00

5. Mangel på enzymerne 21α-hydroxylase eller 17α-hydroxylase vil hver for sig resultere i markante ændringer af binyrebarkens hormonproduktion – hvilke?

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – december 2010 – side 3

Opgave 1 Aspartam, også kendt som Nutrasweet, er et modificeret dipeptid der bliver brugt til sødemiddel i fødevarer.

Aspartam

3 1

1

4

1

1 2 1. Angiv navnene på funktionalgrupperne 11til 4 i aspartam. 2. Skriv produkterne der opnås ved fuldstændig sur hydrolyse af Aspartam. Et af disse hydrolyseprodukter er særdeles farlig for personer med en bestemt genetisk arvelig sygdom. Hvilken sygdom er der tale om og hvilke metabolitter ophobes i disse patienter hvis de indtager aspartam? 3. En kemiker i produktionen er kommet til at lave en portion Nutrasweet der smager bittert. Kemisk analyse viser at såvel molekylformel som strukturformel er korrekt. Hvilken kemisk variation kan forklare problemet?

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – december 2010 – side 4

Opgave 2 DNA indeholder informationen, der via genekspression definerer den afledte organisme. 1. Gør rede for hvorledes transkription initieres og reguleres. 2. Beskriv den transkriptive proces og posttranskriptionelle modifikationer der fører til dannelse af mRNA.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – december 2010 – side 5

Opgave 3 Inden for det seneste årti har man opdaget at leveren producerer et peptidhormon kaldet hepcidin, som nedregulerer membranproteinet ferroportin, som er den cellulære Fe2+ eksportør i duodenums epitheliale basolaterale membran samt i makrofager (RES). Ved jernmangel og betændelsestilstande (inflammation) opregulerer leveren frigivelse til blodet af hepcidin, som derved påvirker ferroportin i tarm og makrofager. 1. Beskriv den kvantitativt vigtigste intercellulære (NB ikke intracellulære!) cyclus af jern optaget i blodet med angivelse af relevante celler og jern-bindende proteiner, samt beskriv hvorledes en opreguleret frigivelse af hepcidin kan tænkes at påvirke denne cyclus. 2. Hvilken rolle har proteinerne haptoglobin, ferritin, hæmosiderin og vitamin C (ascorbat) i forhold til jern. 3. Hvilket andet metal er vigtigt for oxidation af Fe2+ og nævn et protein som spiller en rolle i den forbindelse.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – december 2010 – side 6

Opgave 4

Eicosanoider Eicosanoider er intercellulære signalmolekyler, som er involverede i en bred vifte af fysiologiske processer. 1. Angiv de grupper, som eicosanioider kan opdeles i og nævn nogle fysiologiske funktioner som knytter sig til de forskellige grupper. 2. Eicosanoiderne dannes ved enzymatisk modifikation af nogle substrater, som findes oplagret i cellen. Angiv den molekylære grundstruktur, hvori substraterne er oplagret. Angiv det enzym som frigiver dem og navnet/navnene på de nu frie substrater. Substraterne modificeres enzymatisk. Angiv navnene på de enzymer, som foretager den første modifikation af substraterne. 3. Dannelsen af proinflammatoriske eicosanoider kan hæmmes på flere enzymatiske trin fra frigivelsen fra fosfolipiderne til dannelsen af de færdige eicosanoider. Angiv 2 principielt forskellige angrebspunkter for sådan en antiinflammatorisk behandling og hvilke typer farmakologiske hæmmere, som er virksomme.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – december 2010 – side 7

Opgave 5 Et peptid fordøjes ved pH 7,0 med trypsin, som hydrolyserer peptidbindinger på carboxylsyresiden af positivt ladede aminosyrerester. Primærstrukturen af peptidet er vist her. Ala-Trp-Gly-Trp-Arg-Ala-Asp-Glu-Thr-Lys-Ser-Glu-Asp 1. Forklar om ionbytningskromatografi eller gelfiltrering er den mest anvendelige separationsmetode til oprensning af de opnåede hydrolyseprodukter? 2. Forklar hvorvidt peptidet vil vandre mod anoden (+) eller katoden (-) ved elektroforese udført ved pH 7,0? Mængden af peptid i prøven blev målt ved spektrofotometri på basis af dets indhold af tryptophan. I en cuvette med en lysvej på 1,00 cm måles en absorption på 0,263 ved 280 nm. En ren tryptophan-opløsning med en koncentration på 1,00 mol/L har en absorption ved 280 nm på 5100, når lysvejen er 1 cm. Der er i alt 3 mL peptidopløsning. 3. Hvor mange nmol peptid er der i opløsningen?

Lambert Beers lov:

A=ε⋅c⋅l

Hvor, A er absorptionen ε er den molære absorptionskoefficient c er koncentration l er lysvejen

manan.dk

Bilag.

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – december 2010 – side 8

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – december 2010 – side 9

Svar til Essayopgave 1. Aldosteron, kortisol og dihydroepiandrosteron. Aldosteron syntetiseres i zona glomerulosa under anvendelse af aldosteronsyntase, som ikke findes i andre regioner af binyrebarken. Kortisol syntetiseres altovervejende i zona fasciculata og kan ikke syntetiseres i glomerulosa, som ikke udtrykker 17α-hydroxylase. 17α-hydroxylasen medvirker også i dannelsen af dihydroepiandosteron, som derfor heller ikke kan syntetiseres i zona glomerulosa. Da 17αhydroxylasen kun i mindre grad får lyasefunktion i zona fasciculata, dannes androgenet altovervejende i zona reticularis. 2. Kolesterolestere findes i LDL-partikler. Partiklerne er beklædte med ApoB-100, som via binding til LDL-receptorer på plasmamembranen medierer partiklernes optag i cellerne. Efter endocytose og nedbrydning af partiklerne, spaltes kolesterolester enzymatisk til frit kolesterol og fedtsyre ved hjælp af kolesterolesterhydrolase (CEH). Den kolesterol, som ikke umiddelbart bruges til hormonproduktion, esterificeres via acyl-CoA:kolesterolacyltransferase og deponeres i cellens lipiddråber. Alternativt kan cellen selv, ved hjælp af hydroxy-metylglutaryl CoA reduktase (HMG CoA reduktase), syntetisere kolesterol ud fra acetat. 3. Produktionen af kortisol reguleres via adrenokortikotropin (ACTH), som binder til trimert Gprotein-associerede membranreceptorer i binyrebarkens celler. Interaktionen aktiverer adenylatcyklase under dannelse af cAMP, som på sin side aktiverer PKA. PKA fosforylerer cytosolære proteiner, som dels fremmer frigivelsen af kolesterol fra cellernes lipiddepoter, og dels opregulerer ekspressionen af enzymer, som indgår i hormonsyntesen. ACTH genereres i hypofysen gennem proteolyse af precursoren pro-opio-melano-cortin (POMC). Frigivelsen sker som svar på faldende koncentration af kortisol i blodet (og hæmmes af stigende kortisolkoncentration). Aldosteron reguleres via angiotensin II, som binder til en specifik membranreceptor på cellerne i zona glomerulosa. Også angiotensinreceptoren er G-proteinassocieret, og interaktionen aktiverer en lipase, som spalter PIP2 under dannelse af IP3 og DAG og aktivering af PKC og calmodulin. Desuden stimulerer en øgning i blodets K+ koncentration cellerne direkte – idet cellerne depolariseres, hvorved spændingsfølsomme Ca++ kanaler åbnes og bl.a. calmodulin og CaM-kinaser aktiveres, hvilket medfører øget sekretion af aldosteron. Angiotensin II dannes ved proteolytisk spaltning af angiotensinogen, som først omdannes til angiotensin I ved hjælp af renin (N-terminal spaltning) og derefter til angiotensin II ved konverting enzym på endotelcellerne (C-terminal kløvning, især i lungerne). Renin er hastighedsbestemmende og frigives fra juxtaglomerulære celler (i afferente arterioler i glomeruli) som respons på i) fald i tryk, ii) faldende Na+ koncentration (i macula densa), og iii) øget sympatisk nerveaktivitet i nyrerne.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – december 2010 – side 10

4.

fedtsyrer ketonstoffer

Niveau relativt til ”ikkefastende” værdier (0).

(+) 0 (-)

glukoneogenese

Varighed af faste (dage)

5

10 blodsukker

Under langvarig faste mobiliseres fedtvævets triglycerider. Triglyceridernes fedtsyrer indgår i βoxidation og ketonstofdannelse, mens glycerol-resten udgør et substrat for glukoneogenesen og en meget vigtig ’sukkerreserve’ som skåner kroppens proteiner. Stigende koncentration af acetylCoA i forbindelse med β-oxidation hæmmer pyruvatdehydrogeneasen i mitochondrierne og dermed glykolysen. Mitochondriernes stigende koncentration af acetylCoA og oxaloacetat fører endvidere til øget eksport af citrat, som virker hæmmende på fosfofruktokinasen og dermed glykolysen. 5. Mangel på 21α-hydroxylasen forhindrer syntesen af aldosteron og kortisol, produktionen bliver dermed presset i retning af dihydroepiandrosteron. Overproduktionen af androgener bliver yderligere stimuleret af den øgede mobilisering/syntese af kolesterol og dannelse af pregnenolon, som skyldes det lave niveau af kortisol og den dermed øgede frigivelse af ACTH. 17α-hydroxylasen er nødvendig for syntesen af androgener og kortisol, mangel vil derfor få pregnenolon og progesteron til at ophobes og ’løbe over’ i retning af en øget syntese af aldosteron (mineralokortikoider).

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – december 2010 – side 11

Svar til opgave 1 1. 1: primær amin, 2: carboxylsyre, 3: peptid (amid), 4: ester. 2.

Der er tale om fenylketonuri, der stammer fra en fejl i enzymet fenylalaninhydroxylase. Patienter med denne defekt kan ikke danne tyrosin ud fra fenylalanin, hvorved metabolitterne fenylpyruvat og fenylacetat ophobes i organismen. 3. Der er to asymmetriske (chirale) C atomer i aspartam. De skal begge antage den korrekte symmetri (L-form som andre naturlige aminosyrer) for at aspartam smager sødt.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – december 2010 – side 12

Svar til opgave 2 1. Transkription reguleres af henholdsvis cis- og trans-acting elementer. Cis-acting elementer er DNA sekvensmotiver, lokaliseret på samme DNA streng som det transskriberede gen. Promoterregionen (cis-acting) er lokaliseret umiddelbart foran transkriptionsstartstedet og kan indeholde sekvensboksmotiver som: TATA, CAAT og GC. Derforuden kan andre cis-acting elementer som: enhancers, silencers og responselementer påvirke transkriptionen enten positivt eller negativt. Disse er placeret i varierende afstande fra transkriptionsstartstedet, både op- og ned-strøms for promoterregionen. Til cis-acting elementer bindes transkriptionsfaktorer, disse såkaldte trans-acting elementer er proteiner ofte indeholdende både DNA bindingsdomæner og transkriptionsregulerende domæner. Transkriptionsfaktorer danner et initieringskompleks umiddelbart foran transkriptionsstart, en proces der initieres af TBP proteinet (TATA bindende protein); RNA-polymerasen er den centrale komponent af initieringskomplekset. Andre transkriptionsfaktorer bindes til enhancers, silencers og respons-elementer. Derved påvirkes transkriptionshastigheden ved direkte interaktion med initieringskomplekset for et givet gen. 2. RNA-polymerase II syntetiserer de novo RNA kæder i 5´ mod 3´ retningen ved at bruge den ikke kodende DNA streng som skabelon (template). De transkriptive processer fører til dannelse af præ-mRNA (hnRNA). Ved posttranskriptionelle processer påsættes præmRNA henholdvis en 5’-hætte og en 3´-polyA-hale. Ved splejsningsreaktioner fjernes introns fra præ-mRNA og det modne mRNA bestående af exons overføres til cytoplasmaet.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – december 2010 – side 13

Svar til opgave 3 1. Jern transporteres i blodet som Fe3+-transferrin som bindes til transferrin receptorer. Det meste jern optages via denne receptor i erythroblaster i knoglemarv, hvor jernet indgår i hæmgruppen i hæmoglobin. Hæmoglobinet er derefter en hovedbestanddel af erythrocytten som efter en middellevetid på 120 dage optages i makrofager (RES). Hæmoglobin nedbrydes nu hvorefter Fe2+ frigives fra cellen og bindes til tranferrin igen efter oxidation til Fe3+. Ved tilstedeværelse af høj hepcidinkoncentration i blodet vil frigivelse af jern fra tarmen og makrofager være nedsat. Som følge heraf vil der dannes mindre hæmoglobin (medfører anæmi – ikke pensum). I den nævnte cycklus mellem blod , knoglemarv, erytrocytter og RES må jern tilbageholdes i makrofager pga den nedregulerede aktivitet af ferroportin. 2. Haptoglobin binder det jernholdige hemoglobin frigivet til plasma, ferritin og hæmosiderin er jern-opbevaringsmolekyler og vitamin C reducerer Fe3+ til Fe2+ i forbindelse med absorption i tarmen. 3. Kobber. Plasmamembranproteinet ceruloplasmin og membranproteinet hephaestin (ferrooxidase) er kobberafhængige proteiner (kobber kun nævnt i forbindelse med ceruloplasmin i pensum) som oxiderer Fe2+.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – december 2010 – side 14

Svar til opgave 4 1. Eicosanoiderne opdeles i følgende grupper der har vidtrækkende funktioner. Eksempler på funktioner gives (Andre eksempler kan være lige så gode i besvarelsen): 1) Leukotriener, som bl.a. er involveret i leukocytternes inflammatoriske respons. 2) Prostaglandiner, som bl.a. regulerer kartonus . 3) Prostacykliner som bl.a. frigivet fra karvæggen hæmmer blodpladernes aggregation . 4) Thromboxaner, som dannet i blodpladerne fremmer deres aggregation. (5) Desuden dannes Epoxyeicosatrienoater, som dog ikke er pensum) 2. Substratmolekylerne for den første enzymatiske omdannelse omfatter C20 fedtsyrerne (eicosatriennoat, eicosapentanoat) og arakidonsyre findes i cellernes fosfolipider, hvor de især er esterbundet til glycerolskelettets C2 position. Herfra frigives de af fosfolipase A2. Arakidonsyre er det kvantitativt vigtigste substratmolekyle i gruppen. Cyklooxygenaserne (COX1 og COX2) katalyserer det første trin i dannelsen af prostanoiderne (thromboxaner, prostacykliner og prostaglandiner), lipoxygenasen katalyserer dannelsen af leukotrienerne og epoxygenasen katalyserer dannelsen af Epoxyeicosatrienoaterne. 3. Den antiinflammatoriske behandling kan gennemføres ved at 1) hæmme frigivelsen af arakidonsyre (eller de andre ovennævnte C20 fedtsyrer) fra fosfolipiderne samt 2) hæmme deres omdannelse til prostanoiderne. Corticosteroiderne hæmmer fosfolipase A2 og derved dannelsen af alle eicosanoider. Gruppen af non-steroideantiinflammatoriske-lægemidler (NSAID) hæmmer cyklooxygenaserne og derved dannelsen af prostanoiderne, hvorimod dannelsen af leukotrienerne ikke påvirkes. Kursiverede navne er ikke målkrav.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – december 2010 – side 15

Svar til opgave 5 1. Trypsin kløver efter de positivt ladede aminosyrer arginin (Arg) og lysin (Lys). Dermed dannes 3 produkter ved hydrolyse af peptidet: Ala-Trp-Gly-Trp-Arg, Ala-Asp-Glu-Thr-Lys og Ser-Glu-Asp. Idet 2 af disse produkter indeholder 5 aminosyrerester kan hydrolyseprodukterne ikke separeres ved gelfiltrering. Ala-Trp-Gly-Trp-Arg fragmentet har 1 positiv nettoladning fra Arg. Ala-Asp-Glu-Thr-Lys fragmentet har en nettoladning på -1 (2 negative ladninger fra Asp og Glu og 1 positiv ladning fra Lys). Ser-Glu-Asp fragmentet har en nettoladning på -2 stammende fra Asp og Glu. Idet de 3 hydrolyseprodukterne har forskellige ladninger (hhv. +1, -1 og -2) kan de separeres ved ionbytning på en anionbytter (Ala-Trp-Gly-Trp-Arg fragmentet med +1 nettoladning vil løbe gennem anionbytteren, mens de 2 øvrige peptider binder). 2. Peptidet vil vandre mod anoden (+), idet den N-terminale aminogruppe er positivt ladet, den C-terminale syregruppe er negativ og sidekæderne bidrager med 2 positive ladninger fra 1 Arg og 1 Lys samt 4 negative ladninger fra 2 Glu og 2 Asp. Altså har peptidet en nettoladning på -2 og vil trækkes mod anoden. 3. Lambert Beers lov: A = ε ⋅ c ⋅ l Hvor, A = absorptionen = 0,263 l = lysvejen i cm = 1 cm c = koncentration i mol/L ε = den molære absorptionskoefficient i L/(mol ⋅ cm) = 5100 dvs. 0,263 = 1 cm ⋅ c ⋅ 5100 L/(mol ⋅ cm) c = 0,0000516 mol/L 3 ml opløsning, 2 stk. tryptophan/peptid (0,003 L ⋅ 0,0000516 mol/L)/2 = 77,35 nmol

manan.dk

MEDICINSK BIOKEMI Aarhus Universitet

Maj 2010

Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Kandidateksamen MEDICINSK BIOKEMI MED KEMI

2

BELLEVUEHALLEN , VESTRE STRANDALLÉ 170, RISSKOV

Onsdag den 17. maj 2010, kl. 09:00 - 15:00 Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver. Som bilag er tilføjet en Tabel med navne på – og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner m/tom hukommelse. ”Metabolic Pathways”, 22nd Edition, Sigma-Aldrich, 2003, udleveres. På eksamensbordet er fremlagt kuverter til aflevering samt gult kladdepapir og trefarvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det trefarvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Der udleveres 2 kuverter. Originalbesvarelsen puttes i kuverten med SORT påskrift og lukkes. Besvarelsen på gennemslagspapir puttes i kuverten med RØD påskrift og lukkes. Begge kuverter afleveres lukket med det indhold, som eksaminanden ønsker bedømt. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – maj 2010 – side 2

Essayopgave Cancer

1.

Der forskes i microarray-hybridiseringsteknikken med henblik på at kunne bruge denne teknik til at diagnosticere visse former for cancer. Angiv hvorledes teknikken virker, og hvordan den kan anvendes til diagnosticering.

2.

Til kemoterapi bruges pyrimidinanaloger som fluorouridin, der omdannes til fluorodeoxyuridylat (FdUMP). Desuden benyttes folinsyreanaloger som aminopterin og metrotrexat. Hvilke metaboliske reaktioner påvirker de to grupper af stoffer, og hvordan virker de?

3.

Ras er et protoonkogen. Definer et protoonkogen og angiv hvordan Ras aktiveres og virker som protoonkogen.

4.

p53 er et tumorsuppressorgen. Definer et tumorsuppressorgen, og angiv hvordan p53 virker som tumorsuppressorgen.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – maj 2010 – side 3

Opgave 1 Proteiner kan separeres ved hjælp af ionbytningskromatografi. 1.

Forklar separationspricippet for isolering af proteiner ved hjælp af ionbytningskromatografi.

2.

Nævn mindst tre aminosyresidekæder der kan påvirke bindingen af et protein til en ionbyttersøjle og angiv sidekædernes ladning ved pH 7.

Analyse af to forskellige proteiner ved hjælp af gelfiltrering under to forskellige betingelser giver følgende resultater for den kvaternære struktur:

3.

Buffer, pH 7.4

Buffer, pH 7.4

100 mM NaCl

500 mM NaCl

Protein A

Tetramer

Monomer

Protein B

Tetramer

Tetramer

Forklar – med basis i de observerede data – hvilke interaktioner der stabiliserer den kvarternære struktur i proteinerne A og B

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – maj 2010 – side 4

Opgave 2 Lipidkatabolisme i leveren 1.

Når leverceller optager langkædede fedtsyrer med henblik på katabolisering, skal fedtsyren aktiveres og transporteres over den indre mitochondriemembran. Beskriv aktiveringen og transporten, og angiv de energimæssige forhold herved. Beskrivelsen af transporten må gerne være i form af en skitse.

2.

En betragtelig del af levercellers iltforbrug går til dannelse af brintperoxid. Hvilket organel er det vigtigste sted for dannelsen af brintperoxid, og hvilke typer fedtsyrer kan være substrat for dannelsen?

3.

Under faste/sult vil leveren danne forøgede mængder ketonstoffer. Forklar kort hvorfor.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – maj 2010 – side 5

Opgave 3 1.

Hvordan og hvornår er glykogenolysen aktiveret i muskler?

2.

Angiv den hormon-uafhængige mekanisme til aktivering af glykogenolysen i muskler (tegn og forklar).

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – maj 2010 – side 6

Opgave 4

1.

Angiv hvorledes biologisk aktivt vitamin D syntetiseres ud fra 7-dehydrocholesterol.

2.

Redegør for de kompensatoriske mekanismer som indtræder ved vitamin D mangel.

3.

Redegør for mindst tre relevante biokemiske parametre som vil kunne anvendes til at sandsynliggøre diagnosen vitamin D mangel.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – maj 2010 – side 7

OPGAVE 5 Betragt strukturerne af de to kønshormoner, testosteron og androsteron, som angivet nedenfor.

1.

Beskriv ændringen i funktionelle grupper ved omdannelse af testosteron til androsteron, og angiv hvilken klasse af kemiske reaktioner disse ændringer tilhører.

2.

Hvor mange chirale centre har testosteron molekylet?

3.

Angiv om testosteron er et polært eller et upolært molekyle – og hvorvidt det kan forventes at være opløseligt i serum.

Efter syntese af testosteron i testiklerne sendes det ud i plasma, hvor det kan cirkulere til væv hvor det skal anvendes. Efter optagelse i vævet omdannes testosteron til dihydrotestosteron ved hjælp af enzymet 5- -reductase, hvorved affiniteten til den nukleare androgen receptor mere end fordobles.

4.

Angiv de to proteiner der findes bundet til testosteron i plasma.

manan.dk

Bilag.

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – maj 2010 – side 8

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – maj 2010 – side 9

Svar til Essayopgave 1.

Microarray-hybridiseringsteknikken er baseret på en plade, der har tusindvis af definerede felter (heraf array). En robot kan specifikt identificere hvert enkelt felt, hvortil et givet stykke enkeltstrenget DNA immobiliseres. Således kan pladen fyldes op med DNA sekvenser (skal være antisense), der repræsenterer alle transkripter indeholdt i et givet væv. Hybridisering med en blanding af fluorescensmærkede prober, og en efterfølgende maskinel aflæsning, vil oplyse hvilke sekvenser på pladen der er hybridiseret til. Når microarray bruges til diagnosticering af cancer, skal man kende en række markørproteiner, hvor de korresponderende transkripters ekspressionsniveauer er radikalt ændret i en specifik tumortype i forhold til tilsvarende raskt væv. Der tages en biopsi fra tumoren, hvorfra mRNA isoleres og tilbagetransskriberes til cDNA. cDNA'et mærkes eksempelvis med rød fluorescens. Tilsvarende laves cDNA fra raskt væv, men dette mærkes med grøn fluorescens. Der hybridiseres med begge prober til en plade med DNA, der repræsenterer det væv der undersøges. Efterfølgende kvantitativ aflæsning af hybridiserede prober vil vise hvilke transkripter, der er markant op eller nedreguleret i tumoren.

2.

Cancerceller er hurtigt prolifererende celler og har derfor brug for en optimal deoxyribonukleotidproduktion til syntese af DNA. Et vigtigt trin i syntesen af deoxyribonukleotider er dannelsen af TMP (også kaldet dTMP) ud fra dUMP. I denne proces flytter enzymet thymidylatsynthase en methylgruppe fra N5,N10 -methylentetrahydrofolat til dUMP. Fluorouridine omdannes i kroppen til fluorodeoxyuridylat (FdUMP). FdUMP danner en kovalent binding til thymidylatsynthase, men i modsætning til det normale dUMPthymidylat kompleks, kan dette kompleks ikke modtage en methylgruppe fra N5,N10methylen-tetrahydrofolat. Thymidylatsyntasens binding til FdUMP er irreversibel og enzymet går til grunde (FdUMP kaldes også en "suicide inhibitor"). Folinsyreanaloger (eks. Aminopterin og Methotrexat) virker ligeledes ved at hæmme trinnet fra dUMP til TMP. Folinsyreanaloger binder med meget større affinitet (ca. 1000 gange) til dihydrofolat-reductase, hvorved syntesen fra dihydrofolat til tetrahydrofolat hæmmes. Når produktionen af TMP hæmmes, vil der opstå et underskud af TTP, som er en af de 4 deoxyribonukleotider der bruges til DNA syntese, og hurtigt prolifererende celler vil derfor gå til grunde.

3.

Et proteoonkogen er et proliferativt gen, der ved mutation kan omdannes til et onkogen, hvorved celler transformerer til cancerceller. Onkogener er dominante og er ofte en del af en signalkaskade, der får celler til at proliferere. Ras tilhører gruppen af monomeriske GTPaser og er en del af en signalkaskade. Initialt binder en ligand (typisk en vækstfaktor) til to ens tyrosinkinase-receptorkæder som derved bliver i stand til at autofosforylere deres cytoplasmatiske domæner. De forforylerede haler binder en række såkaldte adapterproteiner, heriblandt Grb2 som på sin kæde kan binde Sos. Sos er en guanidin exchange factor der udskifter GDP med GTP på Ras. Herved opnår Ras kinaseaktivitet, og sætter gang i den mitogen-aktiverede protein kinase (MAPK) kaskade. MAPK kaskaden går fra Ras til Raf (MAPKKK) til Mek (MAPKK) og til Erk (MAPK) og proteinerne i denne kaskade er alle kinaser. Aktiveret Erk

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – maj 2010 – side 10

translokerer til kernen, hvor det kan fosforylere og aktivere transskriptionsfaktorer, der er involveret i DNA syntese og celledeling. 4.

Et tumorsuppressorgen er et gen, hvis produkt er med til at beskytte celler mod at proliferere uhæmmet og derved transformere til cancerceller. De er normalt recessive og er ofte involveret i kontrol af cellecyklus. p53 er et protein, der kan monitorere skader på DNA. Ved DNA skader i mindre omfang, inducerer p53 transkription af p21 (som er en cyclin-afhængig kinaseinhibitor også kaldet WAF1). p21 inaktiverer bl.a. Rb og påvirker en række cyclin-afhængige kinase (CDK) komplekser. Celle-cyklussen stoppes i S-fasen indtil skaderne er repareret. Ved større DNA skader kan p53 mediere apoptose.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – maj 2010 – side 11

Svar til opgave 1 1.

Ved ionbytningskromatografi benyttes det at proteiner er ladede partikler. Ladningerne bæres af den N-terminale aminogruppe, den C-terminale syregruppe samt en række ioniserbare aminosyresidekæder (se nedenstående). Et proteins pI-værdi svarer til den pH-værdi hvor proteinets totale/samlede ladning er 0. Ved pH-værdier forskellig fra pI vil nettoladningen således være forskellig fra 0 og proteinet vil derfor være ladet. Ved anionbytningskromatografi immobiliseres der en positiv struktur (f.eks. diethyl aminoethyl, DEAE) til en søjlematrix. Denne struktur binder proteiner, som har en negativ ladning ved den benyttede pH-værdi. Ved kationbytningskromatografi vil der til søljematricen være immobiliseret en struktur med negativ ladning (f.eks. carboxymethyl, CM). Denne struktur vil binde proteiner, der er positivt ladet ved den benyttede Phværdi. Proteiner der er bundet til søjlematricen kan efterfølgende elueres ved at ændre bufferens ionstryke (f.eks. stigende gradient af NaCl) eller ved at ændre Ph-værdien af bufferen, således at ladningerne på aminosyresidekæderne neutraliseres og derved eliminerer bindingen til ionbytteren.

2.

De aminosyresidekæder der kan påvirke bindingen til en ionbytter er de ioniserbare aminosyrer (ladning ved Ph 7 angivet i parentes) Asparginsyre (Pks 4; negativ ladning) Glutaminsyre (Pks 4; negativ ladning) Histidin (Pks 6; overvejende neutral) Cystein (Pks 9; neutral) Tyrosin (Pks 10; neutral) Lysin (Pks 10; positiv ladning) Arginin (Pks 12; positiv ladning) For Pksværdier kan der henvises til bilag i opgavesættet samt Table 2.3 i Baynes/Dominiczak, 3. udgave side 9

3.

Ved at forøge koncentrationen af ioner (NaCl) i en opløsning kan man – som ved ionbytning – forstyrre de ioniske interaktioner, som i nogle proteiner stabiliserer den kvaternære struktur. Protein A: Proteinet er en tetramer ved 100 Mm NaCl men bestemmes til at være en monomer ved 500 Mm NaCl. Det kan altså konkluderes at proteinets kvaternære struktur et opretholdt af ioniske interaktioner i proteinet. Protein B: Proteinets kvaternære struktur ændres ikke ved at forøge ionstyrken af bufferen. Det kan derfor konkluderes at proteinets kvaternære struktur ikke er opretholdt af ioniske interaktioner. Det er derfor sandsynligt at interaktion imellem hydrofobe områder spiller en væsentlig rolle for opretholdelse af den kvaternære struktur. I mindre hyppige tilfælde

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – maj 2010 – side 12

kan den observerede kvaternære struktur ligeledes bibeholdes af intermolekylære disulfidbroer, som også kategoriseres som en del af proteinets kvaternære struktur.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – maj 2010 – side 13

Svar til opgave 2 1.

Aktivering af fedtsyren: Fedtsyre + CoASH + ATP → Acyl-CoA + AMP + PPi PPi + H2O → 2 Pi Aktivering koster altså omdannelse af 1 ATP til 1 AMP = 2 ATP (ud fra ADP). Transport: Acyl-CoA + carnitin → acyl-carnitin + CoASH Acyl-carnitin transporteres ind i matrix af carnitin-acyl carnitin translokase. Inde i matrix overføres acyl-gruppen til CoASH: Acyl-carnitin + CoASH → Acyl-CoA + carnitin Translokasen transporterer nu, ved antiport med acyl-carnitin, carnitin tilbage til mitochondriets intermembranøse rum. Der hverken dannes eller forbruges energi under transporten, da de energirige bindinger bevares.

2.

Det vigtigste sted for dannelse af brintperoxid er peroxisomerne, og substraterne for produktionen kan være fedtsyrer med lang eller meget lang kædelængde samt forgrenede fedtsyrer.

3.

Under faste/sult vil leverens ATP-forbrug til bl.a. gluconeogenese stort set kunne dækkes via produktion af FADH2 og NADH + H+ ved β-oxidation af fedtsyrer. Desuden er aktiviteten i citratcyclus (TCA cyclus) lav, fordi dets intermediater, især malat, bliver brugt til gluconeogenese. Disse forhold bevirker et overskud af acetyl-coA. Dette er uheldigt, da leveren skal bruge frit CoASH. Problemet løses ved, at acetylgrupperne bruges til ketonstofdannelse.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – maj 2010 – side 14

Svar til opgave 3 1. a) Fight or flight response kan startes af adrenalin via beta-adrenerge receptorer. b) Under muskelarbejde som er en hormon-uafhængig aktivering .

2. Der er to vigtige hormon-uafhængige mekanismer der aktiverer glykogenolysen i muskler. a) - Først influx af Ca2+ i musklerne efter nervestimulation. - Dette aktiverer Ca2+-calmodulin komplekset som aktiveres af fosforylase kinase. - Fosforylase kinase aktiverer glycogen phosphorylase: glykogenolysen starter b) Allosterisk aktivering af fosforylase af AMP. Under muskelarbejde. Muskler bruger ATP og AMP stiger fordi: ATP ADP+ Pi Myokinase katalyserer: 2ADP ATP+ AMP - AMP aktiverer fosforylase kinase. - Fosforylase kinase aktiverer glykogen phosphorylase: glykogenolysen sker - AMP hæmmer inhibitionen af fosfofructokinase(PFK-1) af ATP - PFK-1 er aktiveret og glykolysen sker.

1

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – maj 2010 – side 15

Svar til opgave 4 1.

I huden syntetiseres 7-dehydrocholesterol, der ved UV-bestråling omdannes til vitamin D3 (cholecalciferol). Vitamin D3 transporteres bundet til vitamin D-bindende protein (DBP) til leveren. Vitamin D3 kan også indtages med føden fra animalske produkter eller dannes ud fra vitamin D2 (ergocalciferol), der findes i visse planter. I leveren hydroxyleres vitamin D3 til 25-hydroxycholecalciferol, hvorefter det bundet til DBP transporteres til nyrerne og omdannes til den biologisk aktive metabolit 1,25dihydroxycholecalciferol, der er en central regulator af calcium stofskiftet.

2.

Funktionel vitamin D mangel medfører nedsat intestinal absorption af calcium og reduceret plasma-calcium. Dette stimulerer frigivelsen af PTH (sekundær hyperparathyroidisme), hvilket medfører øget calcium reabsorption i nyrerne og øget udskillelse af fosfat.

3.

25-hydroxycholecalciferol og/eller 1,25-dihydroxycholecalciferol↓, PTH ↑, fosfat ↓ (forklaring: se spm. 2). Mangel på aktivt vitamin D hæmmer knoglernes mineralisering ved at begrænse udbuddet af calcium og fosfat, og den efterfølgende hyperparathyroidisme vil desuden øge osteoklasternes knoglenedbrydning. Parametre der indikerer øget knogleomsætning vil følgelig være forhøjede; f.eks. alkalisk fosfatase, osteonectin, osteocalcin, hydroxyprolin og N- og C-terminal fragmenter af prokollagen.

manan.dk

Eksamen i Medicinsk Biokemi med Kemi 2 – maj 2010 – side 16

Svar til opgave 5 1.

Testosteron omdannes til androsteron ved reduktioner (C=O, C=C) i den første ring struktur, og en oxidation (af -OH) i den fem-leddede ring. Dvs ændringer tilhører reduktions- og oxidationsreaktioner.

2.

6 stk

* * * * * * 3.

Upolært (side 119 og 195 i kompendiet)

4.

SHBG (sex hormone-binding globulin), albumin (side 541 i Baynes)

manan.dk

MEDICINSK BIOKEMI Aarhus Universitet

December 2009

Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Kandidateksamen

B IOKEMI MED KEMI ÅBOG ADE 34

OG

WILLEMOESGADE 15

Onsdag den 2. december 2009, kl. 09:00 - 15:00 Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver. Som bilag er tilføjet en Tabel med navne på – og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner m/tom hukommelse. ”Metabolic Pathways”, 22nd Edition, Sigma-Aldrich, 2003, udleveres. På eksamensbordet er fremlagt kuverter til aflevering samt gult kladdepapir og trefarvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det trefarvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Der udleveres 2 kuverter. Originalbesvarelsen puttes i kuverten med SORT påskrift og lukkes. Besvarelsen på gennemslagspapir puttes i kuverten med RØD påskrift og lukkes. Begge kuverter afleveres lukket med det indhold, som eksaminanden ønsker bedømt. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2009 – side 2

Essayopgave Insulin og glukagon

1)

Angiv, hvordan aktivt insulin er opbygget, og hvordan det dannes ud fra sit primære translationsprodukt (brug gerne en figur). Angiv, på baggrund af svaret, hvordan man med en blodprøvemåling kan bestemme frigivelse af insulin fra pankreas uden at måle koncentrationen af selve det aktive hormon.

2a)

Angiv, hvordan binding af insulin til insulinreceptoren fører til intracellulær signalering.

2b)

Stimulering af insulinreceptoren fører til øget optagelse af glukose i en række væv. Angiv mekanismen og angiv 3 væv, hvor glukoseoptagelsen er uafhængig af insulin.

3)

Angiv insulins effekter på omsætning af glukose, fedt og aminosyrer i henholdsvis (i) lever-, (ii) muskel- og (iii) fedtvæv, og angiv de vigtigste regulerede enzymer.

4)

Angiv, hvordan glukagon via glukagonreceptoren medfører fosforylering af fosforylasekinase og glykogensyntase, og redegør kort for hvilken betydning dette har i leverceller.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2009 – side 3

Opgave 1

1)

Beskriv opbygningen og funktionen af et nukleosom.

2)

Hvordan hjælper histon acetylerende transferaser (HAT) med at øge tilgængeligheden for de generelle transkriptionsfaktorer i det pakkede nukleosom?

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2009 – side 4

Opgave 2 Aminosyrestofskifte 1)

Hvad forstår man ved, at en person er i kvælstofbalance? Angiv en persontype som typisk er i positiv kvælstofbalance, og en persontype som typisk er i negativ kvælstofbalance.

2)

Skitser, hvordan glutamat kan omdannes til glucose.

3)

Phenylketonuri er et af de hyppigst forekommende eksempler på en medfødt stofskiftefejl. Hvad er årsagen til sygdommen? Hvilke signalmolekyler kan forekomme i nedsat mængde ved denne sygdom?

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2009 – side 5

Opgave 3 β-Galaktosidase, der følger Michaelis-Menten kinetik, er under bestemte laboratoriebetingelser karakteriseret ved parametrene KM = 1 mM og Vmax = 10 mM/min for spaltningen af laktose. a)

Skitsér og forklar forløbet af en kurve der viser omsætningshastigheden af laktose katalyseret af β-galaktosidase som funktion af laktosekoncentrationen. Angiv KM og Vmax på kurven.

b)

Phenylethyl β-D-thiogalactopyranosid (PETG) er en kompetitiv inhibitor af βgalaktosidase. Tegn i samme koordinatsystem som ovenstående en kurve, der kvalitativt viser forløbet af spaltningen af laktose under indflydelse af inhibitoren.

c)

Definér, hvad der forstås ved en kompetitiv inhibitor, og skitsér en mulig model for hvordan inhibitoren binder sig til enzymet.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2009 – side 6

Opgave 4 von Willebrand faktor (vWF) spiller en central rolle for hæmostasen, og mangel på vWF kan derfor føre til alvorlig blødningstendens. Angiv og beskriv kort vWF’s centrale funktion i: a)

Den primære hæmostase (pladeaggregering)

b)

Den sekundære hæmostase (koagulationsfaktorkaskaden)

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2009 – side 7

Opgave 5 Kokain (benzoylmethyleconine, C17H21NO4) er et alkaloid isoleret fra bladene af kokabusken, Erythroxylon coca, der vokser i Sydamerika. Kokain stimulerer centralnervesystemet, undertrykker appetitten og skaber, hvad der er blevet beskrevet som en euforisk lykkefølelse og forøget energi. Skønt mest brugt som rusmiddel virker kokain også som bedøvelsesmiddel, hvortil det blev anvendt til øjen- og halskirurgi i 1800-tallet og tidligt i 1900-tallet. Strukturen af kokain er angivet nedenfor.

1)

Identificer de funktionelle grupper i kokain.

2)

Angiv strukturen af alle produkterne ved basisk hydrolyse af kokain.

3)

Hvor mange asymmetriske kulstofatomer findes der i kokain? Angiv disse med en cirkel eller en stjerne.

manan.dk

Bilag.

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2009 – side 8

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2009 – side 9

Svar til essayopgave 1) Insulin dannes som præproinsulin i pankreas’ -celler. I ER omdannes præproinsulin til proinsulin ved enzymatisk fraspaltning af signalpeptidet (de 24 N-terminale aminosyrer). Efter foldning og dannelse af stabiliserende disulfidbroer overføres proteinet til Golgi-apparatet. I den distale del af Golgi (trans-Golgi netværket, TGN) fraspaltes yderligere et internt peptidsegment, det såkaldte C-peptid eller connecting peptide, og derved opstår det ’færdige’ aktive insulin bestående af en - og en -kæde forbundet af to disulfidbroer. I forbindelse med insulins syntese dannes ækvimolære mængder af insulin og C-peptid, som begge kan måles i en blodprøve. Bestemmelse af C-peptidets blodkoncentrationen kan således anvendes som et mål for pankreas’ frigivelse af insulin; også når det drejer sig om patienter i behandling med eksogent insulin. 2a) Binding af insulin ’trækker’ insulinreceptordimerens to cytosolære -kæder (som er aktive tyrosinkinaser) tættere sammen, med det resultat at de fosforylerer hinanden (autofosforylering). Fosforyleringen skaber nye sites, som binder forskellige cytosolære (effektor) proteiner, der så igen fosforyleres (af -kæderne) – med en signaleringskaskade som resultat. 2b) Den insulinmedierede glukoseoptagelse (her tænkes især på optagelse af glukose i muskelog fedtvæv) skyldes primært, at aktivering af insulinreceptoren fører til en translokation af den insulin-sensitive GLUT4-type glukosetransportør fra intracellulære vesikler til plasmamembranen, hvor de kan facilitere transport af glukose fra ekstracellulærrummet til cytosolen. Glukosetransportørerne i hepatocytter, erythrocytter og i hjerneceller er insulin-uafhængige. 3) Insulin er et hormon, der overvejende stimulerer anaboliske processer som fører til deponering af glykogen og fedt. Desuden stimulerer insulin indirekte proteinsyntese ved at øge optaget af aminosyrer i vævene. (i) Lever: Insulin fremmer glukoseoptagelse og lagring af glukoseenheder. Stimulation af insulinreceptoren aktiverer enzymer, som fremmer optagelse og lagring af glukose, glykolyse samt syntese af fedtsyrer og triglycerider, mens ’modsatrettede’ enzymer hæmmes. Insulin stimulerer endvidere de nævnte processer ved at øge transkriptionen af en række gener, som koder for centrale enzymer: For optag og lagring af glukose gælder det glukokinase, fosfofruktokinase-1 og pyruvat kinase; i glykolysen opreguleres syntesen af fruktose-2,6bisfosfat, som aktiverer fosfofruktokinase-1, men hæmmer den glukoneogenesefremmende fruktose-1,6-bisfosfatase; og endelig fremmes fedtsyresyntese fra glukose gennem aktivering af acetyl CoA karboxylase (defosforylering af enzymet fører til aktivering) og opregulering af fedtsyresyntase enzymet. Carnitin-slusen hæmmes af malonyl-CoA, og -oxidationen hæmmes, mens eksport af nysyntetiserede fedtsyrer i VLDL-partikler favoriseres. (ii) Muskelvæv: Insulin stimulerer optagelsen af glukose og har samme effekt på glukosemetabolismen og glykogensyntesen som i lever. Insulin øger det cellulære optag af aminosyrer, hvorved opbygning af protein stimuleres. Fedtsyreoptagelsen stimuleres ved aktivering af lipoproteinlipasen. (iii) Fedtvæv: I fedtvæv stimulerer insulin lipoproteinlipasen (endothelceller) og derved optagelsen af fedtsyrer fra blodet. Samtidig mindskes glukagons aktivering af den hormonsensitive fedtvævslipase, og lipolyse hæmmes. Endelig stimuleres glukoseoptagelsen, glykolysen og dermed dannelsen af glycerolfosfat, der er nødvendig i forbindelse med dannelse af triglycerider. 4) Glukagon er et hormon, der overvejende stimulerer kataboliske processer. Sekretionen af glukagon fra pankreas’ -celler øges som respons på faldende koncentration af glukose i blodet. Hensigten er at signalere til leveren, at glukose skal frigives til blodbanen for at

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2009 – side 10

genoprette normalt blodsukker. Glukagon binder på overfladen af hepatocytter til en transmembran glukagonreceptor. Glukagonreceptorer er på intracellulær side af plasmamembranen koblet til G-proteiner. I resting state er G koblet til GDP. Idet glukagon bindes til receptoren, udbyttes GDP med GTP, og G -subunit-GTP løsrives. G -subunit-GTP aktiverer nu enzymet adenylyl-cyklase, der er associeret med plasmamembranen. Aktiv adenylyl-cyklase kan omdanne ATP til cyklisk AMP (cAMP) under fraspaltning af pyrofosfat. Herefter aktiveres Protein Kinase A (PKA) enzym, ved at cAMP binder til de regulatoriske enheder i enzymet, hvorefter de katalytiske enheder frigives som aktive enzymenheder. Aktivt PKA enzym kan herefter gå i gang med at fosforylere forskellige proteiner under forbrug af ATP, heriblandt fosforylasekinase (aktiv i fosforyleret tilstand) og glykogen syntase (inaktiv i fosforyleret tilstand). Fosforylasekinase kan i aktiv (fosforyleret) tilstand fosforylere glykogenfosforylase, hvorefter glykogenolysen sættes i gang. Glukoseenheder frigives ved glykogenolyse fra leveres glykogenlager til blodbanen. OBS: Hvis angivet med kursiv, kræves informationen ikke i den fuldstændige besvarelse

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2009 – side 11

Svar til opgave 1 1)

Nukleosomets centrale enhed består af histonproteinerne kaldet H2A, H2B, H3 og H4. Der er to af hver. Heromkring er der viklet ca. 200 DNA basepar, svarende til 2 omgange (coils). Histonproteinet H1 stabiliserer komplekset ved at binde sig på ydersiden af nukleosomet. DNA's pakning omkring nukleosomer øger DNA's pakningstæthed med ca. syv gange og muliggør, at den regelmæssige kromatinstruktur i de enkelte kromosomer kan dannes.

2)

Histoner består af ca. 20 % basiske aminosyrer, hvilket formidler den effektive tætte pakning med det polynegative DNA. HAT's kan acetylere sidekæden på lysiner og argininer, hvorved sidekædens positive ladning neutraliseres. Herefter "løsnes grebet" om det bundne DNA og der bliver adgang til promoterregioner for de generelle transkriptionsfaktorer.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2009 – side 12

Svar til opgave 2 1.

Ved kvælstofbalance er den mængde kvælstof, der indtages med kostens proteiner, den samme, som den mængde kvælstof der udskilles fra kroppen. Positiv balance ses hos børn i vækst og hos rekonvalescenter. Negativ balance ses hos fastende, sultende og hos dårligt kontrollerede diabetikere. (Et eksempel på hver type balance er tilstrækkelig besvarelse.)

2.

Glutamat omdannes først til α-ketoglutarat – I citratcyclus (TCA cyclus) omdannes α-ketoglutarat til oxaloacetat – Oxaloacetat omdannes til malat, som transporteres ud af mitochondrierne – I cytosol omdannes malat tilbage til oxaloacetat, som igen omdannes til PEP – PEP gluconeogeneres til glucose (2 PEP-molekyler bliver til 1 glucosemolekyle)

3.

Sygdommen skyldes nedsat aktivitet af enzymet phenylalanin hydroxylase. Enzymet katalyserer omdannelsen af phenylalanin til tyrosin, hvorfor der vil blive dannet meget mindre tyrosin, som er nødvendig for syntese af catecholaminerne (dopamin, noradrenalin og adrenalin).

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2009 – side 13

a) Reaktionshastigheden af en enzymkatalyseret proces, der følger Michaelis-Menten kinetik, afhænger af substratkoncentrationen og nærmer sig Vmax når substratkoncentrationen bliver høj (hyperbolsk kurve). Ved meget høje substrat koncentrationer er reaktionen 0. orden – dvs. den er konstant og uafhængig af substratkoncentrationen idet enzymet er mættet. Vi har her maksimal reaktionshastighed = Vmax. Ved meget lave substratkoncentrationer er reaktionen 1. orden – dvs. hastigheden er proportional med substratkoncentrationen. Her er mængden af substrat begrænsende for katalysehastigheden og der er proportionalitet mellem substratkoncentration og hastighed. KM er substratkoncentrationen hvor hastigheden er Vmax/2, dvs. hvor enzymet er halvt mættet. (KM er et mål for enzymets affinitet for substratet.) a) og b) V (mM/min)

Vmax = 10 mM/min

+ PETG (kompetitiv inhibitor)

Begge kurver nærmer sig asymptotisk Vmax

(KM’) KM = 1 mM

[Laktose] (mM)

b) Forløbet af spaltningen af laktose under indflydelse af PETG inhibitoren er vist med en stiplet kurve i ovenstående figur. For en kompetitiv inhibitor er Vmax uændret mens KM’ øges. c) Et enzym kan inhiberes kompetitivt af molekyler der i kemisk struktur er meget lig substratet (substratanaloger). Disse vil konkurrere med substratet om at binde i enzymets substratbindende site (active site). Den kompetitive reversible hæmmer udelukker altså substratet fra det active site og dermed vil den tilsyneladende KM’ for reaktionen med inhibitor øges, idet der skal flere substratmolekyler til for at opnå en halvmætning af enzymet - dvs. enzymet har tilsyneladende lavere affinitet for substratet. Substrat

Kompetitiv inhibitor

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2009 – side 14

Svar til opgave 4 a)

Når der opstår skade på et blodkar, blottes det subendoteliale væv, som cirkulerende vWF derefter binder til. vWF binder samtidigt til et protein på thrombocytmembranen (gpIb/IX) og denne binding fungerer som et anker, der er afgørende for at thrombocytten ikke bliver ’revet med’ af blodstrømmen. Uden vWF bliver den primære hæmostase altså væsentligt svækket.

b)

En meget stor del af Faktor VIII er i blodet bundet til vWF. Når vWF, som beskrevet ovenfor, bindes til det subendoteliale væv, følger Faktor VIII altså med og bliver på den måde opkoncentreret på skadestedet, hvor den spiller en altafgørende rolle som accelerator for dannelsen af Faktor Xa. Mangel på vWF kan af samme årsag nærmest få karakter af Faktor VIII mangel.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2009 – side 15

Svar til opgave 5

1)

1 amin, 1 aromatisk ring og 2 estre

2)

3)

Der er 4 (fire) asymmetriske kulstofatomer i kokain.

manan.dk

MEDICINSK BIOKEMI Maj 2009

Aarhus Universitet

Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Kandidateksamen

B IOKEMI MED KEMI Mandag den 18. maj 2009, kl. 09:00 - 15:00 Skøjtehallen, Gøteborg Allé 9 Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver. Som bilag er tilføjet en Tabel med navne på – og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner m/tom hukommelse. ”Metabolic Pathways”, 22nd Edition, Sigma-Aldrich, 2003, udleveres. På eksamensbordet er fremlagt kuverter til aflevering samt gult kladdepapir og trefarvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det trefarvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Der udleveres 2 kuverter. Originalbesvarelsen puttes i kuverten med SORT påskrift og lukkes. Besvarelsen på gennemslagspapir puttes i kuverten med RØD påskrift og lukkes. Begge kuverter afleveres lukket med det indhold, som eksaminanden ønsker bedømt. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2009 – side 2

Essayopgave

Glykoproteiner er proteiner med en eller flere kovalent-koblede kulhydratsidekæder.

1.

Forklar hvordan glykoproteiner adskiller sig fra proteoglykaner. Angiv typerne af kulhydratsidekæder i glykoproteinerne, redegør for deres overordnede strukturelle opbygning samt forklar hvad der betinger kulhydratkædernes diversitet/forskellighed.

2.

Beskriv syntesen af en kompleks oligosakkarid-sidekæde i et glykoprotein.

3.

Angiv fire funktioner som knytter sig til kulhydratkæderne og giv en kortfattet beskrivelse af de nævnte funktioner.

4.

Definer et lektin og forklar hvordan det kan anvendes til proteinoprensning i laboratoriet.

5.

Galaktosæmi er karakteriseret ved ophobning af galaktose i kroppens celler som følge af en af flere mulige medfødte enzymdefekter. Defekter i galaktose-1-P-uridyl transferase (galaktosæmi type-I) og UDP-galaktose 4-epimerase (galaktosæmi-type III – meget sjælden) kan begge forårsage lidelsen. Redegør for de metaboliske konsekvenser af fejlfunktion for hvert af enzymerne, og forklar hvorfor galaktosæmi type-III er sværest at behandle, og derfor anses for den mest alvorlige.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2009 – side 3

Opgave 1 L-dopa som bruges til behandling af patienter med Parkinson’s sygdom, hvor der er destruktion af dopamin-producerende nerveceller, kan omdannes til den vigtige neurotransmitter dopamin ud fra nedenstående process:

1.

L-dopa fremstilles i celler ud fra en aminosyre – hvilken? Skitser reaktionen.

2.

Marker asymmetriske kulstofatom(er) i L-dopa og dopamin, samt forklar hvorfor Log D-dopa ikke kan forventes at have samme fysiologiske funktion.

Omdannelsen af L-dopa til dopamin foregår i hjernen. Efter administration transporteres L-dopa ved hjælp af en aminosyretransporter over blod-hjernebarrieren, hvorefter L-dopa omdannes til dopamin som lindrer sygdommen.

3.

Hvorfor kan patienterne ikke behandles med dopamin direkte?

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2009 – side 4

Opgave 2

1.

Giv en kort beskrivelse af parathyroideahormons (PTH) molekylære struktur og dets processering.

2.

Angiv PTHs rolle i nyrerne.

3.

Redegør for hovedpunkterne i PTHs induktion af intracellulær signalering via cAMP og angiv to eksempler på enzymatisk aktivitet som bringer signaleringen til ophør.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2009 – side 5

Opgave 3

Iron-Respons Elementet (IRE) er en hårnåle-struktur der findes lokaliseret på mRNA'et for henholdsvis transferrinreceptoren og ferritin H-kæden. Ved lavt cellulært niveau af jern antager Iron-Respons Element Binding-Protein (IRE-BP) en konformation således at det binder IRE og derved påvirker translationen af transferrinreceptoren og ferritin H-kæden. 1.

Hvordan ønskes koncentrationen af transferrinreceptoren og ferritin H-kæden reguleret ved en lav cellulær jernkoncentration og hvorfor?

2.

Hvor på mRNA'et kodende for henholdsvis transferrinreceptoren og ferritin H-kæden findes IRE og hvordan reguleres translationen af disse proteiner når IRE-BP binder til IRE?

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2009 – side 6

Opgave 4

Omsætning af kemisk energi, i form af ATP, er grundlaget for musklernes virkningsmekanisme. 1.

Angiv den molekylære baggrund for kontraktionen i tværstribet muskulatur.

2.

Angiv den molekylære baggrund for rigor mortis.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2009 – side 7

Opgave 5

Nedenstående plots skitserer et enzymkinetisk eksperiment med et enzym, der følger MichaelisMenten kinetik. Michaelis-Menten og Lineweaver-Burk ligningerne er anført i figurerne.

Lineweaver-Burk Plot

10

0,50

8

0,40

1/V 0 (s/  M)

V0 ( M/s)

Michaelis-Menten Plot

6 4 2

0,30 0,20 0,10

0 0

5

10

15

20

25

[S]0 (M)

0,00 -0,50

-0,25

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1/[S]0 (M -1)

1.

Beskriv i ord begreberne KM og Vmax.

2.

Angiv værdierne af KM og Vmax ved aflæsning på figurernes fuldt optrukne linjer.

3.

De stiplede linjer er opnået i tilstedeværelse af en inhibitor. Hvilken type inhibitor er der tale om?

manan.dk

Bilag.

Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2009 – side 8

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2009 – side 9

Svar til Essayopgave 1.

Glykoproteiner har korte sukkerkæder (maks. 20 sukkerenheder), de er forgrenede, og indeholder i modsætning til proteoglykaner ingen gentagne disakkarid-sekvenser. Der skelnes mellem to overordnede grupper af kulhydratsidekæder afhængigt af om sukkerkæderne er bundet til glykoproteinet via en hydroxylgruppe (O-bundet) eller med en N-glykosidbinding (N-bundet). O-bundne sukkersidekæder er koblet til en serin eller threonin i proteinet, og de er oftest korte, forgrenede og negativt ladet grundet en terminal sialsyre. I kollagen findes desuden en speciel form for O-bundet sukker, hvor et disakkarid er bundet til hydroxylysin. Endelig kan cytoplasmatiske proteiner i visse tilfælde have en enkelt O-bundet aminosukker (N-acetylglucosamin) fastgjort til serin. De N-bundne kulhydratsidekæder, er koblet til en asparagin, der følger konsensussekvensen Asn-X-Ser/Thr, og de indeholder alle en kerne bestående af to N-acetylglukosaminer samt tre mannoser. Såfremt der er tale om en high-mannose form, er der til kernen koblet yderligere op til 6 mannoser. Komplekse oligosakkarider kan have op til fire forskellige sukkerkæder bundet til de tre mannoser, og kæderne afsluttes oftest med en sialsyre. Afhængigt af antallet af sidekæder angives oligosakkaridet som værende mono-, bi-, tri- eller tetraantennært. Diversiteten i kulhydratsidekæderne betinges af a) antallet og sekvensen af hexoserne, b) glykosidbindingen mellem de enkelte hexoser (to sukkere kan danne mange forskellige disakkarider), og c) antallet af antenner.

2.

Ved endoplasmatisk reticulum (ER) kobles en modificeret transmembran fedtsyre benævnt dolichol-fosfat via en pyrofosfatbinding successivt med 2 x Nacetylglukosaminer, 9 x mannose og 3 x glukose. Hvert koblingstrin kræver sin specifikke glykosyltransferase. De tre terminale glukose-rester genkendes af et enzym, der flytter hele oligosakkaridet fra fedtsyren over til en asparagin i proteindelen, der er under samtidig translation ind i ER. De tre terminale glukoserester fraspaltes efterfølgende af hver sin glykosidase, og glykoproteinet eksporteres dernæst fra ER til Golgi-apparatet. Her reduceres antallet af mannoser fra 9 til 3 ved hjælp af specifikke mannosidaser. Parallelt hermed udbygger glykosyltransferaser (GlcNac, Gal og Sialyl transfereaser) oligosakkaridet med de antenner og sukkere, som kendetegner det færdige glykoprotein.

3. a)

Under nysyntesen af N-bunde glykoproteiner, sikrer tre terminale glukoserester, at en oligosakkaryltransferase i ER overfører oligosakkaridet fra dolikol-fofat til proteindelen af det kommende glykoprotein.

b)

Protein-foldning: I endoplasmatisk reticulum kobles 9 mannose- og herefter 3 glukosemolekyler til proteinkæden. Efter fraspaltning af to af de tre terminale glukosemolekyler vil den tilbageblevne sukker binde sig til chaperonerne calnexin og calreticulin hvorved foldning af proteinet stimuleres. Foldes proteinet korrekt transporteres det efter fraspaltning af glukosen videre til Golgi. Bliver proteinet derimod ikke foldet korrekt vil det nedbrydes i ER.

c)

Lysosomal sortering: Sortering af lysosomale enzymer fra Golgi til lysosomet kræver, at en eller flere af de terminale mannosemolekyler omdannes til mannose-

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2009 – side 10

6-fosfat. Processen sker via kobling af N-acetylglykosamin-1-fosfat og efterfølgende fraspaltning af N-acetylglukosamin. Det mannose-6-fosfatberigede glykoprotein sorteres herefter til lysosomerne via binding til en mannose-6-fosfat receptor i Golgi. d)

Øger opløseligheden og stabiliserer secernerede proteiner: Da oligosakkarider indeholder mange hydrofile OH-, COOH- og aminogrupper vil vandopløseligheden af et protein oftest øges efter glykosylering. Oligosakkarider beskytter desuden glykoproteiner med proteolytisk nedbrydning i ekstracellulærvæsken, formodentlig fordi glukosyleringen hindrer enzymernes adgang til proteindelen.

e)

Cellegenkendelse: F.eks. i forbindelse med en inflammation skal leukocytter forlade blodbanen og invadere det beskadigede væv. Dette sker bl.a. ved at den immunkompetente celle udtrykker et glykoprotein på celleoverfladen, der kan binde til et lektin (definition i besvarelse til spm. d) i karvæggen. Herved bremses leukocytten og penetrationen af karvæggen faciliteres.

f)

Antigen-antistof reaktioner: Visse antistoffer genkender specifikt sukkerdelen af et glykoprotein. Eksempelvis er glykoproteiner vigtige antigener ved bestemmelse af ABO-blodtype.

g)

Muciner indeholder multiple O-bundne oligosakkaridsidekæder. Da disse er negativt ladede, grundet den terminale sialsyre, vil sidekæderne frastøde hinanden og derved hindre en tæt proteinfoldning. Dette resulterer i, at glykoproteinerne optager mere plads og virker smørende og beskyttende.

4.

Lektiner er proteiner, der specifikt binder til kulhydratstrukturer. Lektiner kan anvendes til oprensning af glykoproteiner med en given sukkermodifikation ved hjælp af affinitetskromatografi. Lektinet kobles kovalent til et søjlemateriale og en affinitetssøjle pakkes. En proteinopløsning indeholdende proteinet med den specifikke sukkermodifikation påføres søjlen. Efter vask af søjlen kan glykoproteiner med sukkermodifikationen, mod hvilket lektinet er rettet, elueres fra søjlen.

5.

Ved galaktosæmi type-I (funktionel mangel på galaktose-1-P-uridyl transferase) kan galaktose indtaget med kosten i form af eksempelvis laktose ikke omdannes fra galaktose-1-fosfat til UDP-glukose. Dette fører til ophobning af toksiske galaktosemetabolitter. Ved en defekt i UDP-galaktose 4-epimerase (galaktosæmitype III) er epimeriseringen mellem UDP-galaktose og –glukose kompromitteret, og både omdannelsen af galaktose til glukose og den omvendte reaktion er blokeret. Type-I galaktosæmi kan behandles ved at undgå galaktose i kosten, idet UDPgalaktose til eksempelvis glykosylering af proteiner kan dannes ud fra glukose. Type-III galaktosæmi er betydeligt alvorligere, da den med kosten tilførte glukose ikke kan omdannes UDP-galaktose. Man vil derfor - udover at akkumulere toksiske galaktosemetabolitter - ikke være i stand til at producere normalt glukosylerede glykoproteiner.

Tekst i kursiv: Kan næppe forlanges selv i optimal besvarelse.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2009 – side 11

Svar til Opgave 1

1.

Tyrosin

2. *

Ingen asymmetriske kulstofatomer i dopamin. L- og D-dopa er stereoisomere omkring det asymmetriske kulstofatom og vil derfor have forskellige steriske bindingsegenskaber.

3.

Man skal behandle med L-dopa da dette kan passere blod-hjernebarrieren og komme ind i hjernen. Behandling med dopamin vil være nytteløs da stoffet ikke er en aminosyre og derfor ikke kan transporteres ind i hjernen.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2009 – side 12

Svar til Opgave 2

1.

PTH syntetiseres som et prohormon (90 aminosyrer) og frigives efter enzymatisk fraspaltning af et kort propeptid. Det aktive hormon (84 aminosyrer) kan efterfølgende yderligere spaltes i et N-terminalt (aminosyrerne 1-34) og et C-terminalt (aminosyrerne 35-84) peptid, hvoraf kun det første er aktivt.

2.

PTH aktiverer 1-hydroxylasen som hydroxylerer 25-hydroxy-vit D til det aktive hormon 1,25 dihydroxy vit-D. PTH fremmer endvidere resorptionen af Ca++ og udskillelsen af fosfat.

3.

TH binder til en G-protein associeret receptor (’seven-pass’). Receptorkomplekset aktiverer G-proteinets α-kæde, som dernæst aktiverer en adenylatcyklase til produktion af cAMP. I cytosolen bindes cAMP til de regulatoriske elementer (subunits) af PKA, hvorved enzymatisk aktivt PKA frigøres. Binding til adenylatcyklasen aktiverer α-kædens latente GTP-ase aktivitet (hvorved αkæden konverteres til sin inaktive form) og cAMP hydrolyseres af fosfodiesteraser.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2009 – side 13

Svar til Opgave 3

1.

Når der er en lav jernkoncentration skal cellen helst have opreguleret transferrinreceptoren, da denne er involveret i cellens jernoptag. Tilsvarende skal ferritin helst nedreguleres da dette proteinkompleks er en af cellens måder at opbevare jern på.

2.

IRE hårnåle strukturen findes 3' for den kodende region af transferrinreceptoren. Binding af IRE-BP vil være med til at stabilisere mRNA'et således at det nedbrydes langsommere. Dette resulterer i en øget translation af transferrins mRNA. På mRNA for ferritin H-kæden findes IRE derimod 5' mærke for den kodende region. Binding af IRE-BP hæmmer det ribosomale translations system i at virke optimalt, hvorved ferritin H-kæden nedreguleres.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2009 – side 14

Svar til Opgave 4

1.

Calcium koncentrationen er meget lav i muskelcellers sarcoplasma (10-7 M), men stiger hurtigt ca. 100 gange ved nervestimulation. Muskelcellen responderer på nerveimpulsen ved depolarisation af sarcolemma, hvilket fører til frigivelse af calcium fra sacroplasmisk reticulum (SR) gennem calciumkanaler til sacroplasmaet. Den højere calcium koncentration medfører binding af calcium til troponinkomplekset, som består af 3 proteiner: Tn-T, Tn-I og Tn-C. Komplekset er associeret med aktinfilamenterne via tropomyosin. Calcium-binding til Tn-C inducerer konformationsændringer i troponinkomplekset, der blotlægger myosinbindings-områderne på aktinfilamenterne. Myosin, med tilknyttet ADP og fosfat, bindes til aktinfilamenterne og under frigivelse af ADP og fosfat vipper myosinhovederne og trækker derved aktin- og myosin-filamenterne sammen. Myosin frigøres fra aktinfilamenterne ved binding af ATP. Ved efterfølgende hydrolysering af ATP til ADP og fosfat vipper myosinhovedet tilbage i den oprindelige stilling og myosinhovedet er igen klar til interaktion med aktinfilamenterne. Myosins ATPase aktivitet fortsætter sålænge den høje calciumkoncentrationen opretholdes. Ved ophør af nerveimpulsen lukkes calciumkanalerne i SR membranen og calcium-koncentrationen i sarcoplasma sænkes ved at SR-calciumATPasen pumper calcium tilbage i SR, hvorved kontraktionen ophører.

2.

Efter dødens indtrædelse ændrer forholdet mellem ADP og ATP sig hurtigt. Myosin forbliver bundet til actin, idet der ikke er ATP tilstede til at dissociere myosinhovederne fra actinfilamenterne. Interaktionen mellem actin og myosin er derforuden mulig fordi den lave ATP koncentration tillader Ca2+ at være tilstede i cytoplasmaet, hvorved blokeringen af binding mellem actin og myosin ikke forhindres.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2009 – side 15

Svar til Opgave 5

1.

Ved en given enzymkoncentration er Vmax den maksimale initiale reaktionshastighed når alle enzymer har bundet substrat (mættet), dvs. når [ES] = [E]total Michaelis konstanten, KM, er substratkoncentrationen hvor hastigheden er ½Vmax, dvs. hvor enzymet er halvt mættet. KM er et mål for enzymets affinitet for substratet (lav KM = høj substrataffinitet og høj KM = lav substrataffinitet).

2.

Michaelis-Menten plottet: Det ses at Vmax = 8 μM/s og at substratkoncentrationen ved halv mætning (Vmax/2 = 4 μM/s) er 2 μM. Altså Km = 2 μM.

Af Lineweaver-Burk plottet : KM findes ved skæringen med x-aksen: -1/ KM = -0,50 μM-1  Km = 2 μM. Vmax findes ved skæringen med y-aksen: 1/Vmax = 0,125 s/μM  Vmax = 8 μM/s.

Lineweaver-Burk Plot

Michaelis-Menten Plot 10

Vmax

0,40

1/V 0 (s/  M)

V0 ( M/s)

8

0,50

6 4

0,20

-1/KM

2

0,10

0

0,00 -0,50

0

KM

5

10

15

[S]0 (M)

3.

0,30

20

25

-0,25

1/Vmax 0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1/[S]0 (M -1)

Idet Vmax er uændret og KM stiger i tilstedeværelse af inhibitoren (lavere affinitet for substratet) er der tale om en kompetitiv inhibitor. (Af Michaelis-Menten og Lineweaver-Burk plottene ses at Vmax er uændret med og uden inhibitor (V´max = 8 μM/s). K´M ses ved halv mætning (Vmax/2 = 4 μM/s) at være 4 μM.)

manan.dk

MEDICINSK BIOKEMI Aarhus Universitet

December 2008

Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Kandidateksamen

B IOKEMI MED KEMI Onsdag den 3. december 2008, kl. 09:00 - 15:00 Åbogade 34, indgang B, bygn. 5344 Trøjborg, Willemoesgade 15 Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver. Som bilag er tilføjet en Tabel med navne på – og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner m/tom hukommelse. ”Metabolic Pathways”, 22nd Edition, Sigma-Aldrich, 2003, udleveres. På eksamensbordet er fremlagt kuverter til aflevering samt gult kladdepapir og trefarvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det trefarvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Der udleveres 2 kuverter. Originalbesvarelsen puttes i kuverten med SORT påskrift og lukkes. Besvarelsen på gennemslagspapir puttes i kuverten med RØD påskrift og lukkes. Begge kuverter afleveres lukket med det indhold, som eksaminanden ønsker bedømt. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2008 – side 2

Essayopgave

IMMUNAPPARATET 1.

Komplementkaskaden Redegør for komplementkaskadens igangsættelse og forløb, herunder de forskellige pathways, faktoraktivering og den resulterende generering af biologisk aktive peptider og proteinkomplekser.

2.

Antigenpræsentation og genkendelse. a. Angiv årsagen til at ubeslægtede individer stort set aldrig er ens mht. vævstyper. b. Beskriv MHC/HLA molekylernes molekylære struktur, deres opbygning og funktion, herunder forskellene (funktionelt og molekylært) på HLA-I og HLA-II. Anfør hvilke celletyper der udtrykker de forskellige molekyler.

3.

Antistoffer a. Beskriv den overordnede antistofstruktur herunder placeringen af de antigen- og komplementbindende områder samt hinge-regionen. Angiv baggrunden for antistoffers inddeling i forskellige klasser/typer og for deres funktion i forbindelse med B-celleaktivering. b. Beskriv genetisk rekombination og redegør med få ord for forskellen på den diversitet der opstår gennem rekombination på den ene side og loci med mange allele gener på den anden. c. Angiv de to vigtigste trin i aktivering af B-cellers antistofproduktion, herunder hvilken rolle T-cellernes antigengenkendelse spiller.

4.

Signalmolekyler og receptorer Ligesom bl. a. PDGF, signalerer cytokiner i stor udstrækning via receptorer med et enkelt transmembrant segment. Beskriv kort princippet bag både denne form for signaltransduktion og bag signaltransduktion medieret via de såkaldte ”seven-pass” receptorer.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2008 – side 3

Opgave 1

Glukosestofskiftet reguleres meget præcist af flere hormoner 1.

Angiv hvordan glukagon og adrenalin stimulerer leverens mobilisering af glukose på signalniveau.

2.

Kortisol øger frigivelse af glukose fra leveren i forbindelse med faste. Angiv den molekylære virkningsmekanisme.

3.

Væksthormon (GH) har udover dets vækstfremmende effekt også en vigtig rolle i reguleringen af glukosekoncentrationen i plasma. Angiv hormonets effekt på glukosestofskiftet og forklar, hvordan GHRH og somatostatin kan henholdsvis stimulere og hæmme frigivelsen af GH begge via adenylatcyklase

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2008 – side 4

Opgave 2

Hæmoglobin 1.

Beskriv kort hvordan CO og CO2 påvirker binding af O2 til hæmoglobin.

2.

Hæmoglobin nedbrydes især i makrofager. Angiv hvilke metabolitter der dannes (vand og gasser undtaget) og beskriv hvordan to proteiner i plasma spiller en rolle for to af metabolitternes videre skæbne og angiv kort denne.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2008 – side 5

Opgave 3

Type 1 kollagen er et af kroppens dominerende proteiner og giver styrke til bl.a. sener.

1.

Skørbug udløses ved mangel på ascorbat (Vit. C). Angiv den enzymatiske baggrund for skørbug og den molekylære effekt af ascorbatmangel på kollagen.

2.

En speciel type krydsbindinger dannes mellem modificerede lysinrester i kollagenkæder, som herved bidrager til styrken af kollagenet. Angiv det ansvarlige enzym, hvad lysinresten omdannes til og hvilke typer bindinger som kan opstå.

3.

Ved forøget nedbrydning af kollagen kan der i urinen måles en øget forekomst af metabolitter fra kollagen. Angiv disse.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2008 – side 6

Opgave 4

1.

Biologiske membraner er opbygget af phospholipider herunder phosphoglycerider. Angiv den skematiske opbygning af phosphoglycerider og forklar hvorfor disse er amfifatiske strukturer.

2.

Beskriv hvilke intermolekylære bindinger der stabiliserer membranstrukturen og forklar hvorledes membranfluiditeten (lateral bevægelse af lipiderne) påvirkes af forøgelse af: a. Antallet af umættede kulstofbindinger i phosphoglyceriderne. b. Længden af den alifatiske carbonkæde.

3.

Trans-membranale proteiner, som f.eks. receptorer, benytter ofte -helix strukturen som membrangennemtrængende strukturelement. Redegør for de intermolekylære interaktioner som understøtter placeringen af denne struktur i membranen og angiv et fællestræk for de aminosyrer som kan forventes at indgå i en sådan -helix.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2008 – side 7

Opgave 5 Under forhold med lav koncentration af glukose i plasma går kroppen over til de novo syntese af glukose, idet glukoneogenesen igangsættes. Selvom muskler kan nedbryde glykogen, kan de ikke frigøre glukose til blodbanen i så store mængder, at plasma glukosekoncentrationen øges. 1.

Hvorfor kan muskler ikke frigøre glukose i signifikante mængder til blodbanen?

2.

Muskler kan imidlertid bidrage til glukoneogenese ved at frigøre en metabolit, som senere vil bruges i leveren i den såkaldte Cori cyklus. Hvilken metabolit drejer det sig om?

3.

Tidligt i gluconeogenesen dannes i mitochondriet et produkt, som skal overføres til cytosol, før den videre pathway kan fortsætte. Dette produkt kan imidlertid ikke krydse den mitochondrielle membran. Hvilket produkt er der tale om og hvordan bliver det overført til cytosol?

manan.dk

Bilag.

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2008 – side 8

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2008 – side 9

Svar til Essayopgave 1. Komplementaktivering kan forløbe ad tre veje (pathways): (i)Den klassiske, som udløses når antigenbundet IgG (eller IgM) via sin Fc-del binder C1q; (ii) den alternative som kan aktiveres af f.eks. lipopolysakkarider i gram-negative bakteriers cellevæg; og (iii) den tredje ”mannose binding ligand (MBL) pathway”, som igangsættes via mannose (eller andre kulhydrater) som findes cellevægen på svampe, bakterier og vira. Ad. (i) Efter binding af C1q til antistof sker aktivering af C1r og s, som efterfølgende aktiverer faktorerne C2 og 4 som så aktiverer den centrale faktor C3. Faktor C3 medierer til sidst dannelsen af det såkaldte ”membran attack complex” . Komplekset som består af faktorerne C5 – C9, gennemtrænger den angrebne celles væg og danner en åben kanal mellem cellens indre og omgivelserne, med det resultat at cellen dør. Ad. (ii). Den alternative vej fører gennem aktivering af faktorerne B, D og P før C3 aktiveres og dødskomplekset dannes. Ad. (iii). Stimulation via MBL resulterer umiddelbart i aktivering af C4 og 2 og fortsætter derefter som beskrevet ovenfor (under i). Komplementkaskaden minder på mange måder om det vi kender fra koagulation. Faktorerne findes på inaktiv form i opløsning, men mobiliseres til (celle)overfladen hvor den enkelte faktor aktiveres ved enzymatisk kløvning. Efter kløvningen bliver det største fragment, som nu er en aktiveret serin protease, siddende på overfladen, mens det mindre fragment frigives til omgivelserne. Det enzymatisk aktive fragment kløver og aktiverer næste faktor i forløbet, mens de små fragmenter fungerer som opsoniner (fremmer fagocytose), anaphylatoksiner (stimulerer mastcellers degranulering) og kemotaksiner (tiltrækker immunkompetente celler). 2. (a) Vævstypeantigenerne, dvs. de såkaldte human leucocyte associated (HLA) antigener, kodes af tre HLA-I loci (A,B og C) og seks HLA-II loci (DR, DQ og DP som hver består af et α og et β-kæde locus). Hver for sig indeholder disse loci så stort et antal allele gener, at pratisk taget ingen (udover enæggede tvillinger) har den samme kombination af gener. (b) HLA-I molekyler udtrykkes på alle kroppens celler. Det enkelte molekyle består af en lang transmembran α-kæde (det egentlige HLA-antigen) og det noget mindre β2-microglobulin (som ikke udviser polymorfi). α-kæden udgøres af tre beslægtede ekstracellulære domæner hvoraf de to mest N-terminale (α1 og α2) danner en peptidbindende grube hvis vægge formes af to αhelixer mens parallelle β-strenge (β-strands) danner bunden. Det som skiller én HLA-I type fra en anden er variationen af aminosyrer i α1 og -2. Klasse II molekylerne udtrykkes på et begrænset antal celler primært monocyt/makrofager og B-celler. De er heterodimerer og består af to transmembrane kæder (α og β), som hver indeholder to domæner, henholdsvis α1 og α2 og β1 og β2. De N-terminale domæner α1 og β2 danner sammen en peptidbindende grube svt. klasse-I molekylernes. 3. (a) Hvert antistof består af to ens lette og to ens tunge kæder som v.h.a. disulfidbroer er bundet sammen til en dimer af heterodimerer. De tunge kæder kan være af typen α(1-2), , , (1-4) eller,  mens de lette er enten kappa eller lambda. De antigenbindende områder udgøres af de variable N-terminale domæner (et fra den tunge og et fra den lette kæde) i hver heterodimer. Hinge-regionen, som bibringer antistofmolekylet fleksibilitet, dannes af midtdelen af de to tunge kæder, mens den komplementbindende region er lokaliseret til de tunge( og μ) kæders C-terminale del. De fleste antistoffer findes i cirkulation som soluble proteiner, men en mindre del fungerer som antigenspecifikke receptorer på de enkelte B-celler. De sidste har et transmembranalt segment og et cytosolært domæne i forlængelse af hver af de to tunge kæder.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2008 – side 10

(b) Hvert antistof kodes af flere sammenbragte genstykker. De tunge kæder er sammensat af fragmenter fra såkaldte genbokse, dvs. Vh(variable), Dh (diversity), Jh (joining) og Ch (constant) for de tunge kæders vedkommende og tilsvarede Vl,Jl og Cl for de lette kæder. Hver enkelt genboks forekommer i mange ”allele” udgaver, men i modsætning til almindelige allele gener som kun nedarves et af gangen i et givet locus, indeholder B-cellers arvemasse flere ”allele” varianter af hver bokstype. Under B-cellens modning fastlægges koden for et specifikt antistof gennem tilfældig selektion af en enkelt repræsentant for hver genbokstype. De udvalgte genfragmenter (én D, én V osv) kobles til sidst sammen (rekombineres) og fastlægger derved den endelige kodende sekvens for den givne B-celles antistof. Da udvælgelsen af genfragmenterne er randomiseret vil stort set alle B-celler ende med at producere forskellige antistoffer. Genetisk rekombination resulterer m.a.o. først og fremmest i diversitet indenfor det enkelte individ, mens traditionelle loci med flere allele gener primært er årsag til interindividuel diversitet. (c) B-cellen stimuleres i første omgang når et antigen genkendes af/binder til dens Bcellereceptor (transmembrane antistof). Det andet (sekundære) stimulus modtages fra helper Tceller som via T-cellereceptoren aktiveres af B-cellens præsentation af HLA-bundet peptid. 4. Signaltransduktion via ’single-pass’ receptorer kræver medvirken af mere end en receptorkæde. Receptorkædernes cytoplasmatiske domæner er aktive enzymer (kinaser, fosfataser) eller er associerede til enzymer. Når liganden bindes bringer den to eller flere forskellige sådanne receptorkæder i nærkontakt med det resultat, at de udsættes for hinandens enzymatiske aktivitet f. eks. fosforylering, og på den måde danner bindingssites for cytosolære interaktionspartnere (adaptormolekyler) som danner basis for signaleringskaskader inde i cellen. Signalering gennem ’seven-pass’ eller trimer-G-protein koblede receptorer kræver derimod kun medvirken fra en enkelt receptorkæde. Efter ligandbinding omarrangeres receptorens cytoplasmatiske segmenter så de nu bliver i stand til at binde G-proteinet, som derefter frigiver sin α-kæde. α-kæden aktiverer i anden omgang en adenylatcyklase eller en lipase som genererer de nødvendige second-messengers for fortsat intracellulær signalering.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2008 – side 11

Svar til Opgave 1

1.

Glucagon og adrenalin binder begge til G-proteinkoblede receptorer. Glucagon stimulerer herved adenylatcyklasen, der resulterer i dannelse af cAMP, aktivering af proteinkinase A, fosforylering og hæming af glycogen syntasen. Samtidig aktiverer glucagon fosforylasekinasen, der ultimativt øger glykolyse via glycogen fosforylase. Adrenalin stimulerer fosfolipase C, hvilket resulterer i dannelse af IP3, frigivelse af Ca++ til cytosol, aktivering af calmodulin kinase, og via fosforylasekinasen yderligere simulation af glycogen fosforylasen. DAG og aktivering af PKC kan sandsynligvis forstærke denne signalvej.

2.

Kortisol er et steroidhormon, der faciliterer mobiliseringen af glukose ved stimulation af nuklære receptorer og øget gentranskription af de glykoneogenetiske enzymer. Kortisols effekt er indirekte, idet hormonet ikke regulerer aktiviteten af enzymerne ved fosforylering, men derimod sikrer at mængden af dem er tilstrækkelig høj, til at glukoneogenese kan forløbe effektivt. Kortisol har således en permissiv effekt på glukoneogenesen.

3.

Væksthormon inducerer insulin-resistens i de perifere væv, hvorved forsyningen af glukose til hjernen øges. GHRH er koblet til et G-protein kompleks, der øger aktiviteten af adenylatcyklasen. I modsætning hertil stimulerer somatostatin G-proteiner, der hæmmer aktiviteten af adenylatcyklasen.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2008 – side 12

Svar til Opgave 2

1.

CO bindes som O2 til hæmdelen af hæmoglobin med langt højere affinitet. CO udkonkurrerer derved O2’s binding til hæmoglobin, som i praksis får mindre iltbindingskapacitet. CO2 bindes til globindelen af hæmoglobin (ikke protonerede N-terminale aminogrupper) og bindingen har allosterisk effekt, hvor affiniteten (men ikke kapaciteten) for O2 nedsættes (højreforskydning af iltbindingskurven).

2.

Globindelen nedbrydes til aminosyrer og hæmdelen omdannes til Fe3+ og bilirubin (biliverdin er mellemprodukt). Fe3+ bindes i plasma til transferrin under dannelse af Fe3+transferrin (holotransferrin) som kan optages af receptorer i celler, hvorefter Fe3+ kan genbruges i ny hæmsyntese. Bilirubilin bindes til albumin, hvorefter det optages i hepatocytter, hvor bilirubin konjugeres bl.a. med glucoronat og udskilles i galden, hvor det omdannes til urobilin/stercobilin, som udskilles i urin og fæces.

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2008 – side 13

Svar til Opgave 3

1.

Ascorbat er en nødvendig kofaktor for hydroxylaserne, som hydroxylerer lysin og prolin i kollagen. Den manglende hydroxylering forhindrer at prokollagen kan O-glykolyleres normalt og herved forhindres normal foldning og dannelse af funktionelt kollagen.

2.

Lysin oxidase katalyserer en omdannelse af lysin til allysin (ved en oxidativ deaminering. Ikke krav). Allysinresterne muliggør en nonenzymatisk dannelse af kovalente krydsbindinger mellem allysinrester og mellem allysin- og lysinrester.

3.

Ved en øget kollagennedbryding forekommer en øget udskillelse af aminosyrer, som findes specifikt eller i øget mængde i kollagen. Det drejer sig om hydroxyprolin, hydroxylysin, allysin og krydsbindingsprodukterne mellem allysiner eller mellem allysin og lysin (som fx lysinonorleucine. Ikke krav).

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2008 – side 14

Svar til Opgave 4

1.

Phosphoglycerider er komponeret af en central glycerol enhed hvortil der er esterificeret to fedtsyrekæder samt en phosphatgruppe. Denne phosphatgruppe er ydermere derivatiseret med en amino alkohol (choline, ethanolamin, serin). De to fedtsyrekæder udgør en hydrofob del af phosphoglycerider mens den derivatiserede phosphatgruppe udgør den hydrofile del. En struktur der indeholder både hydrofobe og hydrofile strukturer betegnes amfifatisk.

2.

Membranstrukturen stabiliseres hovedsageligt af hydrofobe interaktioner imellem fedtsyre enhederne (den hydrofobe effekt). En mindre del udgøres af den hydrofile del a. Umættede fedtsyrer i phosphoglyceridet (cis-konfiguration) introducerer et knæk i den alifatiske kæde og derfor reduceres de hydrofobe interaktioner imellem fedtsyrerne. Derfor forøges membranfluiditeten. b. Antallet af hydrofobe interaktioner forøges og derfor forøges de intermolekylære bindinger og membranfluiditeten reduceres.

3.

Der findes to hydrofile elementer af peptidkæden som ikke kan forenes med det hydrofobe miljø i membranen: De polariserede bindinger i peptid-backbone (nitrogen, carbonyloxygen) samt den enkelte aminosyresidekæde. For at være membrankompatibel etableres hydrogenbindinger imellem de enkelte atomer (carbonyloxygen samt NH-gruppen) i α-helix strukturen. De enkelte aminosyrerester sidder på ydersiden af α-helix’en og skal derfor være af hydrofob/non-polær karakter (Gly, Cys, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Pro, Phe, Trp, Tyr (side10 – Baynes/Dominiczak))

manan.dk

Eksamen i Biokemi med kemi – december 2008 – side 15

Svar til Opgave 5 1.

Glukosetransporteren kan kun transportere ikke-fosforyleret glukose til og fra blodbanen (over cellemembranen). Når muskler udfører glykogenolyse er endeproduktet glukose-6P. Defosforylering af glukose-6-P sker ikke i muskelceller, da muskelceller mangler glukose-6-phosphatase.

(En lille del ikke-fosforyleret glukose frigives ved spaltning af -1-6 bindinger i glykogen. Denne reaktion katalyseres af Glykogen debranching enzyme (bifunktionelt enzym; her bruges -1,6 glukosidase enzymaktiviteten). Dette ikke-fosforylerede glukose kan frigives til blodbanen fra muskelceller, men det er ikke nok til at medvirke til at regulere plasma koncentrationen af glukuse.) 2.

Muskler kan bidrage til den endogene glukose produktion ved at frigive laktat, der er endeproduktet i anaerob glykolyse. Laktat kan transporteres til leveren, hvor det kan indgå som substrat i glukoneogenese og blive omdannet til glukose.

3.

Produktet er oxaloacetat, som bruger malat/oxaloacetat shuttlen for at krydse den mitochondrielle membran. Oxaloacatet omdannes til malat vha. den mitochondrielle malate dehydrogenase. Malat kan exporteres til cytosolen, hvor den igen omdannes til oxaloacetat katalyseret af den cytosolære malat dehydrogenase.

manan.dk

MEDICINSK BIOKEMI Aarhus Universitet

Maj 2008

Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Kandidateksamen

B IOKEMI MED KEMI Onsdag den 14. maj 2008, kl. 09:00 - 15:00 Bellevuehallen, Vestre Strand Allé 170, Risskov Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver. Som bilag er tilføjet en Tabel med navne på – og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner m/tom hukommelse. ”Metabolic Pathways”, 22nd Edition, Sigma-Aldrich, 2003, udleveres. På eksamensbordet er fremlagt kuverter til aflevering samt gult kladdepapir og trefarvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det trefarvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Der udleveres 2 kuverter. Originalbesvarelsen puttes i kuverten med SORT påskrift og lukkes. Besvarelsen på gennemslagspapir puttes i kuverten med RØD påskrift og lukkes. Begge kuverter afleveres lukket med det indhold, som eksaminanden ønsker bedømt. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2008 – side 2

Essayopgave

Enzymer

1.

Giv en funktionel beskrivelse af enzymer, herunder hvordan man måler og angiver en enzymmængde.

2.

Giv et forslag til oprensning og isolering af et opløseligt enzym fra hjertevæv ved anvendelse af kendte separationsmetoder (antag f.eks. at enzymet har en molekylvægt på 140 kD og et isoelektrisk punkt på 5,4).

3.

Giv en beskrivelse af kendte mekanismer til ændring af enzymaktivitet, herunder: a. ændring af koncentration af substrat eller produkt , når Michaelis-Menten kinetik gælder b. ændring af totalkoncentration af enzym. c. ændring af enzymets katalytiske effekt.

4.

a. b.

Angiv de unikke enzymer i gluconeogenese ud fra laktat, som adskiller sig fra glycolysen. Gør rede for regulationen af enzymerne i omdannelsen af fructose-1,6bisphosphat til fructose-6-phosphat og i omdannelsen af fructose-6phosphat til fructose-1,6-bisphosphat i leveren.

Michaelis-Menten ligningen: v =

Vmax ! [ So ] K m + [ So ]

Enheder for: Units µmol min-1; Katal mol sek-1

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2008 – side 3

Opgave 1

1.

Angiv, hvordan hormonet glukagon som respons på faldende niveau af sukker i blodet sætter en kaskade, der starter med aktivering af adenylyl-cyklase, i gang, og hvordan dette resulterer i mobilisering af sukker fra hepatocytternes sukkerlager til blodet.

2.

Angiv, hvordan ovenfor nævnte kaskade af reaktioner fører til, at der sker en samtidig aktivering af glykogenfosforylase og deaktivering af glykogensyntase, og angiv, hvorfor dette er relevant.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2008 – side 4

Opgave 2

Extracellulær matrix og proteolyse.

1. I extracellulær matrix findes forskellige typer af polymere proteiner. Angiv den type af enzymatisk reaktion, som er fælles for omdannelsen af prokollagener og fibrinogen fra soluble forstadier til insoluble polymerer og beskriv kort processen som herved starter polymeriseringen. 2. Den extracellulære matrix forankrer cellerne og giver bl.a. vævet styrke og elasticitet. Angiv kort opbygningen af fibronektin og angiv mindst 2 typer af domæner og deres funktion. Angiv hvad integriner er og hvordan de vekselvirker med den extracellulære matrix.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2008 – side 5

Opgave 3

Angiv to centrale funktioner i den aktiverede thrombocyt som bygger på thrombocytmembranens indhold af fosfoglycerolipider og redegør kortfattet for de to funktioner med udgangspunkt i fosfoglycerolipidets struktur.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2008 – side 6

Opgave 4

Som det er de fleste bekendt, er alkohol et organisk opløsningsmiddel, der påvirker hjernen. Leveren påtager sig opgaven med at eliminere alkoholen fra organismen. 1. 2. 3..

Angiv de enzymatiske processer der fører til alkoholforbrænding i leveren. Redegør for energiomsætningen i leveren under ethanoloxidation. Redegør for fedtsyreomsætningen i leveren under ethanoloxidation.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2008 – side 7

Opgave 5

Nogle sygdomme er associeret med en polymorfi, der giver anledning til ændrede restriktionsites (eks. visse former for seglcelleanæmi). Med udgangspunkt i nedenstående figur, ønskes en beskrivelse af hvordan disse sygdomme kan diagnosticeres ved brug af RFLP (restriction fragment length polymorphism) teknikken. 1,2 kb Beta Globin genet 5' (raskt gen)

0,2 kb 3'

MstII

MstII

MstII

CCTGAGGAG

1,4 kb Beta Globin genet 5' (gen med polymorfi)

3'

MstII

MstII CCTGTGGAG

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2008 – side 8

Bilag.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2008 – side 9

Svar til Essayopgave

1. Enzymer er specifikt katalyserende proteiner (her ses bort fra visse former for RNA). Som andre katalysatorer udøver enzymer deres virkning på reaktionshastigheden, idet enzymer øger den hastighed, hvormed en reaktion forløber mod ligevægtstilstanden, men de ændrer ikke ligevægtskoncentrationerne og ændrer dermed ikke Keq. Enzymernes specificitet som katalysatorer kan karakteriseres dels ved den såkaldte substratspecificitet og dels ved reaktionsspecificiteten. Substratspecificiteten refererer til, at et enzym kun bindes til og derefter reagerer med ganske bestemte forbindelser eller en begrænset gruppe af forbindelser. Reaktionsspecificitet refererer til, at et enzym kun katalyserer en bestemt reaktion med de pågældende substrater, dvs. reaktionen forløber entydigt uden sidereaktioner. Enzymer er proteiner, der kan være opbygget af en eller flere subunits. Det aktive sæde er det sted i enzymmolekylet, hvor substratet eller substraterne bindes, og hvor den katalytiske proces foregår. I den katalytiske proces kan der indgå cofaktorer. Herudover kan der i enzymmolekylet findes specifikke bindingssæder for forbindelser, der på forskellige måder påvirker/ regulerer enzymets katalytiske aktivitet. Enzymmængden kan angives i mol substrat omdannet pr. tidsenhed under kendte måleomstændigheder (So, pH, temperatur) Substratkoncentrationen (So) skal være høj, således at enzymets aktive sæde(r) er mættet med substrat(er), og enzymet katalyserer maksimalt. Enzymenheder kan være units, der angiver µmol substrat omdannet pr. min. eller katal, der angiver mol substrat omdannet pr. sek. 2. Hjertevævsprøven findeles og homogenises i bufferopløsning med fast pH og lav temperatur. Derefter centrifugeres prøven ved passende hastighed, således at uopløseligt vævsmateriale precipiterer. Supernatanten indeholdende opløselige proteiner kan herefter sættes på en søjle indeholdende gelmateriale, der adskiller på grundlag af molekylstørrelse. Ved almindelig gelkromatografi (Sephadex) vil proteiner med højest molekylvægt elueres først. Søjlen kan forinden og/eller efterfølgende ”kalibreres” med proteiner med kendte molekylvægte. Fraktionerne med mol.vægt omkring de 140 kD kan derefter samles, og underkastes yderligere oprensning ved ionbytningskromatografi. Det kan f.eks. være en anionbytter. De samlede fraktioner fra gelkromatografi dialyseres forinden mod vand og/eller en buffer ved pH 7. Ved pH 7 vil enzymet have en negativ nettoladning og kan dermed bindes til anionbytteren. Derefter kan de enkelte proteiner elueres fra søjlen ved enten gradvist at sænke pH eller øge saltkoncentrationen i elueringsbufferen. Påvisning af enzymet i de enkelte fraktioner skal foregå ved bestemmelse af dets aktivitet (jvf ovenfor). Oprensningen kan følges ved elektroforese f.eks. SDS polyakrylamid gelektroforese, hvor der samtidig køres standardproteiner med kendt molekylvægte. Enzymoprensningen kan følges ved at måle den specifikke aktivitet f.eks. i units pr mg protein, som burde stige efterhånden som enzymet bliver oprenset. 3. a. Regulation (støkiometrisk regulation) af enzymaktiviteten kan foregå ved en ændring af substratkoncentrationen(erne) og - i tilfælde af reversible reaktioner - også ved en ændring af produktkoncentrationen(erne). Regulationens "følsomhed" er afhængig af, i hvilket koncentrationsinterval ændringerne i [So] ligger. For ændringer i [So], der er mindre end eller af samme størrelsesorden som Km vil denne regulations "følsomhed" være betydeligt større end hvis intervallets [So]-værdier er betydeligt større end det pågældende enzyms Km. b. Alle organismens proteiner, og dermed også enzymerne, findes i en mængde

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2008 – side 10

(koncentration), der er et resultat af en kontinuerligt forløbende syntese og nedbrydning. Enzymkoncentrations-regulationen kan derfor ske ved en ændring af enten syntesehastigheden og/eller nedbrydningshastigheden (steady-state tilstanden). Sådanne ændringer kan formidles af hormoner eller på anden måde, men foregår i modsætning til støkiometriske og modulatoriske regulationer (se nedenfor) relativt langsomt (timer til dage). c. Allosterisk regulation foreligger, når der sker ændring af det enkelte enzymmolekyles katalytiske aktivitet som følge af en eller anden påvirkning. Ved denne form for regulation ændres enzymets specifikke (molekylære) aktivitet, i reglen ved ændringer i det modulerede enzymmolekyles konformation og dermed i det aktive sæde. Sådanne allosteriske påvirkninger kan ske ved binding af en ligand (effektor, modulator) til enzymet. Bindingen er reversibel og som regel noncovalent. Hvis bindingen af modulator øger enzymaktiviteten, kaldes den for en aktivator, hvis den hæmmer kaldes den en inhibitor. Allosterisk regulerede enzymer er ofte oligomerer, evt. multienzymer med et antal katalytiske subunits. De katalytiske subunits kan findes i former med forskellig katalytisk aktivitet, og der kan herske en ligevægt mellem dem. Aktivatorers/inhibitorers tilstedeværelse forskyder denne ligevægt. Derved ændres enzymets Km (også kaldet S0.5 i oligomere enzymer) eller Vmax eller der sker en ændring i både Km (S0.5) og Vmax. Ændring af et enzyms katalytiske aktivitet kan også ske ved ændringer af visse kovalente strukturer i enzymet, i reglen som et resultat af en anden enzymkatalyseret proces. Eksempler på kovalente ændringer (modulationer) er 1) phosforylering/dephosforylering af visse OHgrupper i en række enzymer og 2) specifik partiel proteolyse af enzymer, f.eks. fordøjelsesenzymer og koagulationsenzymer. 4. a. Ved gluconeogenese i leveren omdannes laktat til glucose gennem en række trin, der både involverer mitokondrielle og cytosoliske enzymer. I glycolysen, hvor glucose omdannes til laktat, er der tre irreversible kinase reaktioner, der involverer enzymerne : Glucokinase (GK) phosphorfructokinase-1 (PFK-1) og pyruvat kinase (PK). For at omgå disse tre irreversible reaktioner i gluconeogenesen bruger leveren fire unikke enzymer: pyruvat carboxylase (PC) i mitokondrier, phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) i cytosol, fructose-1,6-bis phosphatase (Fru-1,6-BPase) og glucose-6-phosphatase (Glc-6-Pase). b. Phosphofructokinase (PFK-1) og dets regulation i lever I lever reguleres glycolyse og gluconeogenese hovedsaglig af phosphorylering/dephosphorylering af enzymer under kontrol af glucagon og insulin. Det primære kontrolpunkt er PFK-1 og fructose-1,6bis phosphatase (Fru-1,6-BPase) begge allosteriske enzymer. Fru-2,6-BP er en aktivator for PFK-1 og en inhibitor for Fru-1,6-BPase. Fru-2,6-BP syntese er katalyseret af et bifunktionelt enzym, PFK2/Fru-2,6-BPase, som har både kinase og phosphatase aktivitet. Under indflydelse af glucagon har PFK-2/Fru-2,6-BPase phosphatase aktivitet (phosphoryleres) og reducerer niveauet af Fru-2,6-BP, hvilket på samme tid nedsætter stimulationen af PFK-1 (glycolysen) og ophæver inhibitionen af Fru1,6-BPase (gluconeogenesen). Når glucose optages i leveren efter et måltid vil insulin aktivere dephosphorylering af PFK-2/Fru-2,6-BPase således at dets PFK-2 aktivitet vender tilbage, hvilket resulterer i højere Fru-2,6-BP og dermed aktivering af PFK-1 og inhibition af Fru-1,6-BPase (mere forenklet svar på spørgsmålet kan også akcepteres).

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2008 – side 11

Svar til Opgave 1

1.

Glukagon binder på overfladen af hepatocytter til en transmembran glukagon receptor. Glukagon-receptorer er på intracellulær side af plasmamembranen koblet til G-proteiner. I resting state er Gα koblet til GDP. Idet glukagon bindes til receptoren, udbyttes GDP med GTP, og Gα-subunit-GTP fraspaltes. Gα-subunit-GTP aktiverer nu enzymet adenylyl-cyklase, der er associeret med plasmamembranen. Aktiv adenylyl-cyklase omdanner ATP til cyklisk AMP (cAMP) under fraspaltning af pyrofosfat. Herefter aktiveres ellers inaktivt Protein Kinase A (PKA) enzym, ved at cAMP binder til de regulatoriske enheder i enzymet, hvorefter de katalytiske enheder frigives som aktive enzymenheder. Aktivt PKA kan herefter gå i gang med at fosforylere forskellige proteiner under forbrug af ATP, heriblandt enzymer involveret i mobilisering af glukose fra glykogen.

2.

Glykogenfosforylase aktiveres ved fosforylering, mens glykogensyntase deaktiveres ved fosforylering. Da disse processer kører sideløbende sikres, at glykogenolyse kun kører, mens syntesen af glykogen samtidig er hæmmet, således at glukose frisættes fra hepatocytterne men ikke bliver genindbygget i glykogen.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2008 – side 12

Svar til Opgave 2

1. Prokollagen og fibrinogen er begge soluble sekretoriske proteiner, som af specifikke proteaser får fraspaltet N- og C-terminale domæner efter sekretionen. Det er thrombin som spalter fibrinogen. Herved vil fibrin monomerer og tropokollagen molekylerne associere lateralt via hydrofobe interaktioner og herved danne fibre, som efterfølgende forstærkes af kovalente bindinger. 2. Fibronektin er et extracellulært glycoprotein, som er opbygget af en række domæner. De forskellige domæner muliggør forskellige typer af bindinger som fx binding til heparin, kollagen, fibrin og celler. Den cellulære binding formidles af et specifikt binding motiv, (en såkaldt RGD-sekvens (ikke et krav)), som også findes i andre typer af extracellulære proteiner. Herved kan formidles interaktioner mellem celler og extracellulære proteiner, fx visse kollagener og elastin, der ikke indeholder cellulære bindingsdomæner. Integriner er transmembrane proteiner som binder extracellulære proteiner til extracellulær siden og cytoskelettet på den cytoplasmatiske side. De binder extracellulære proteiner som indeholder integrin bindingsmotiv (fx af typen RGD).

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2008 – side 13

Svar til Opgave 3

Binding af koagulationsfaktorerne II, VII, IX og X; syntese og frigivelse af thromboxan (TXA).

Fosfoglycerolipider er sammensat af glycerol som ved kulstofatom 1 og 2 er bundet til fedtsyrer og ved kulstofatom 3 er bundet til fosfat som på sin side danner bro til en såkaldt 'hovedgruppe'. De almindeligste hovedgrupper er cholin, serin og etanolamin. Når fosfoglycerolipider med hovedgruppen serin (fosfatidylserin) eksponeres på overfladen af thrombocytmembranen, binder serin til Ca++ (faktor IV) som samtidig fungerer som bindingssted for de karboxylerede koagulationsfaktorer II, VII, IX og X. Fedtsyrer bundet til kulstofatom er ofte polyumættede og især fosfatidylkolin indeholder hyppigt arachidonat i denne position. Når thrombocytten aktiveres, f.eks. ved kollagenbinding, stimuleres fosfolipase A2's aktivitet i membranen og arachidonat frigives for efterfølgende at omdannes (ved cyclooxygenaser) til thromboxan (TXA2). Thromboxanen frigives og fremmer derved thrombocyttens og de omgivende pladers aggregation (auto/parakrint stimulation).

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2008 – side 14

Svar til Opgave 4

1.

Ethanol omsættes i leveren af alkohol-dehydrogenase til acetaldehyd, aldehyddehydrogenase omdanner acetaldehyd til acetat, der aktiveres til acetyl-Coenzym A. Ved begge reaktioner reduceres cofaktoren NAD+ til NADH. Oxidationen af alkohol medfører derfor et forhøjet niveau af NADH i levercellerne og lav konc. af NAD+. Et cytokrom P450 enzym kompleks bidrager desuden i mindre omfang til oxidation af alkohol.

2.

Det forhøjede niveau af NADH fører til omdannelse af pyruvat og oxaloacetat til henholdsvis laktat og malat under forbrug af NADH. Dette bremser glukoneogenesen. Den forhøjede konc. af laktat medfører risiko for laktatacidose. Hvis leverdepotet af glykogen tømmes, hvilket ofte sker for alkoholikere, er der risiko for hypoglykæmi.

3.

Hypoglykæmi medfører stigende [glukagon] og faldende [insulin], hvilket fører til lipolyse i fedtvæv og øget tilførsel af albuminbundne fedtsyrer til leveren. Da fedtsyreoxidation i mitokondrier kræver NAD+ og resulterer i dannelse af NADH, bremses oxidationen af fedtsyrerne pga. højt NADH-niveau. Fedtsyrerne indsættes i stedet i triacylglyceroler og eksporteres fra leveren i VLDL-partikler, en proces der fortsætter efter at ethanoloxidationen er ophørt. Ved længerevarende alkoholmisbrug nedsættes leverens evne til at danne VLDL-partikler og medfører derfor ophobning af triacylglyceroler i leveren.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – maj 2008 – side 15

Svar til Opgave 5

En polymorfi vil i få tilfælde give anledning til, at et eksisterende restriktions-site ødelægges eller omvendt, at der dannes et nyt restriktions-site på et bestemt sted i et gen. Bruges en probe der hybridiserer til det genomiske DNA tæt på polymorfien, vil en sådan polymorfi i mange tilfælde kunne afsløres ved Southern Blotting. I eksemplet med beta-globin genet (afledt af figur 34.14 i Baynes) findes der tre sites i det raske gen der genkendes af Mst II enzymet. Kløvning af genomisk DNA med dette Mst II vil give anledning til to stykker DNA fra beta-globin genet med en given størrelse når det adskilles på en agarosegel (samt en masse andre fragmenter fra resten af genomet). Vælges en probe der hybridiserer til DNA'et i 0,2 kb fragmentet, vil en autoradiografi fra et Southern blot med genomisk DNA fra en rask person resultere i et 0,2 kb bånd (fra begge alleler). Hvis en polymorfi ødelægger det midterste MstII site på den ene allel, vil et Southern blot med samme probe resultere i to bånd, et på 0,2 kb (fra den raske allel) og et bånd på 1,4 kb (fra den allelen med polymorfien).

manan.dk

MEDICINSK BIOKEMI Aarhus Universitet

December 2007

Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Kandidateksamen

B IOKEMI MED KEMI Onsdag den 5. december 2007, kl. 09:00 - 15:00 Aulaen og Benjaminhallen, Åbogade 34

Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver. Som bilag er tilføjet en Tabel med navne på - og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner m/tom hukommelse. ”Metabolic Pathways”, 22nd Edition, Sigma-Aldrich, 2003, udleveres. På eksamensbordet er fremlagt kuverter til aflevering samt gult kladdepapir og trefarvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det trefarvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Der udleveres 2 kuverter. Originalbesvarelsen puttes i kuverten med SORT påskrift og lukkes. Besvarelsen på gennemslagspapir puttes i kuverten med RØD påskrift og lukkes. Begge kuverter afleveres lukket med det indhold, som eksaminanden ønsker bedømt. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – december 2007 – side 2

Essayopgave

Calcium og knoglemetabolisme Calcium har betydning for en række vigtige fysiologiske processer i organismen og er underlagt en nøjagtig regulation, hvor bl.a. knoglevæv bliver brugt som reservoir i forbindelse med calciumhomeostasen. 1.

Beskriv hvilke former og koncentrationer plasmacalcium befinder sig i, og angiv hvilken, der er underlagt kontrol. Beskriv endvidere niveauet for den cytosolære calciumkoncentration i ustimulerede celler.

2.

Beskriv hvordan calciumkoncentrationen i plasma reguleres hormonelt, og beskriv kortfattet to af hormonernes generelle cellulære virkningsmekanismer.

3.

Beskriv kortfattet tre biokemiske eller fysiologiske funktioner som calcium deltager i.

4.

Beskriv tre årsager til ændring i koncentrationen af plasmacalcium, heraf mindst én der giver anledning til hypercalcæmi og mindst én der giver anledning til hypocalcæmi, og forklar mekanismen i hvert af tilfældene.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – december 2007 – side 3

Opgave 1

Kokain og noradrenalin har nedenstående strukturformler:

1.

Aftegn kokains struktur og markér funktionalgrupperne med pile og navngiv dem. Markér eventuelle asymmetriske kulstofatomer med * (stjerne).

2.

Kokain hydrolyseres ved kogning i 1 M saltsyre. Opskriv strukturformler for hydrolyseprodukterne.

3.

Den viste (formelle) struktur af noradrenalin er kun lidt opløselig i vand, men derimod meget mere opløselig både i (svagt) sure opløsninger og i stærkt basiske opløsninger (pH > 12). Forklar dette forhold (f.eks. vha. reaktionsligninger eller strukturformler).

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – december 2007 – side 4

Opgave 2

Aminosyrer og protein generelt 1.

Serin (C3H7NO3,105 Da) er en aminosyre med flere roller: a) angiv to eksempler på to forskellige former for posttranslationelle proteinmodifikationer, hvori serin indgår. b) angiv to forskellige lipidstrukturer hvor serin indgår og beskriv kortfattet hvorledes.

2.

Ved aminosyresyntese ud fra serin forsøger man i to aminosyrekoblingstrin at lave et tripeptid bestående af tre seriner. Man frygter imidlertid, at der i andet trin ved en fejl har været en forurening af serin med cystein (C3H7NSO2, 121 Da). Det syntetiserede tripeptid udsættes efterfølgende for oxiderende omstændigheder, hvorefter den nøjagtige masse bestemmes (ved såkaldt massespektometri). Hvilken masse vil du måle i tilfælde af forurening. Det forudsættes, at de bestemte masser af peptidernes atomer er præcis 1, 12, 14, 16 og 32 for henholdsvis H, C, N, O og S. Peptiderne antages at være på fuldt protoneret form.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – december 2007 – side 5

Opgave 3

Cancer skyldes en kombination af mutationer der tilsammen ophæver den normale regulation af cellecyklus. 1.

Definer begreberne proto-oncogen og tumorsupressor gen, og forklar hvorfor cancer oftest udløses af mutationer i et proto-oncogen.

2.

Ca. 30 % af alle tumorer indeholder en aktiverende mutation i GTPasen Ras. Forklar funktionen af Ras når vækstfaktoren PDGF inducerer celledeling i den raske organisme.

3.

Nævn ét eksempel på en tumor-supressor og redegør for proteinets normale virkningsmekanisme.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – december 2007 – side 6

Opgave 4

1.

Opskriv en ligning for reaktionen katalyseret af glucose-6-fosfatase og angiv reaktionens organmæssige lokalisation. Patienter med den arvelige von Gierke’s sygdom har ingen eller stærkt nedsat aktivitet af glucose-6-fosfatase.

2.

Beskriv kort hvilke kulhydratstofskifteveje som primært vil være kompromitterede ved von Gierke’s sygdom, og forklar hvorledes en patient vil være påvirket heraf.

3.

Patienterne har øget risiko for at udvikle metabolisk acidose. Hvorfor?

4.

Også lipidstofskiftet er kompromitteret ved von Gierke’s sygdom. Angiv en forklaring herpå.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – december 2007 – side 7

Opgave 5

Nukleotid-polymeraser indgår i omsætningen af det genetiske materiale ved replikations- og transkriptions-processerne. 1.

Beskriv kædeforlængelsesprocessen der karakteriserer disse enzymers katalytiske aktivitet.

2.

DNA-polymerase, RNA-polymerase, polyA-polymerase og revers transkriptase er nukleotid-polymeraser der katalyserer kædeforlængelse. Gør rede for disses enzymers krav til nukleotider, primere og skabeloner.

3.

Hvilken egenskab karakteriserer DNA-polymerase enzymer, der anvendes til PCR (polymerase chain reaction)?

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – december 2007 – side 8

Bilag

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – december 2007 – side 9

Svar til Essayopgave

1. Plasmakoncentrationen af calcium er ca. 2,2-2,6 mM og fordeler sig på tre former. Ca. 40% er bundet til plasmaproteiner, først og fremmest albumin. Ca. 10% er bundet komplekst til organiske anioner, specielt citrat og fosfat, mens ca. 50% findes som frit, ioniseret calcium. Det er den frie ioniserede calciumkoncentration, der reguleres nøje indenfor snævre grænser. Den cytosolære calciumkoncentration i en hvilende, ustimuleret celle er ca. 0,1 μM. 2. Koncentrationen af ioniseret calcium i plasma reguleres af tre hormoner: parathyreoideahormon (PTH), 1,25-dihydroxycholecalciferol og calcitonin. Syntese og sekretion af PTH, der er et peptidhormon, stimuleres af et fald i plasmakoncentrationen af calcium. I målcellerne bindes PTH til en receptor koblet til G protein. Ved binding til receptoren stimuleres adenylatcyclase resulterende i øget dannelse af cAMP i målcellerne. PTH øger koncentrationen af calcium ved direkte virkning på knoglevæv og nyrer og indirekte virkning på tarmen (via 1,25-dihydroxycholecalciferol, se senere). I knoglevæv stimuleres osteoclastaktiviteten indirekte via osteoblaster, hvilket medfører resorption af hydroxyapatit og dermed afgivelse af calcium (og fosfat) til blodet. I nyrerne har PTH flere funktioner idet det fremmer reabsorptionen af calcium, dvs. urinens indhold af calcium falder. Endvidere mindsker PTH reabsorptionen af fosfat, dvs. urinens indhold af fosfat stiger. Endelig stimulerer PTH aktiviteten af 1α hydroxylasen i nyretubuli hvorved 25hydroxycholecalciferol hydroxyleres til 1,25-dihydroxycholecalciferol. 1,25-dihydroxycholecalciferol (1,25(OH)2D3) er et steroidhormon, der dannes i nyrerne og som har effekter i tarmepithelceller og i knoglevæv. 1,25(OH)2D3 bindes til en cytoplasmatisk receptor som andre steroidhormoner. Ligand-proteinkomplekset transporteres til kernen, hvor det virker som transkriptionsfaktor og inducerer genekspression. I tarmen stimulerer hormonet dannelsen af carrierproteiner og forøger dermed den aktive transport af calcium og fosfat over den luminale membran. I knoglevæv stimulerer 1,25(OH)2D3 osteoclasternes resorption af knoglevæv. Calcitonin er et peptidhormon, der dannes i de parafollikulære celler i gld. thyreoidea. Calcitonins præcise biologiske rolle er ukendt, men sekretionen stimuleres af en stigning i koncentrationen af calcium i serum. Calcitonin antages at hæmme osteoclasternes knogleresorption. 3. Calcium har adskillige biologiske funktioner. Calcium er nødvendig i forbindelse med blodkoagulationen, ved muskelkontraktion, ved exocytose af neurotransmittere og af en række hormoner (bl.a. insulin). Ved binding af calcium til calmodulin reguleres en række enzymers aktivitet. Desuden deltager calcium i sekretionsprocessen og har betydning for neuromuskulær irritabilitet. Vedr. blodkoagulation Calcium formidler etableringen af en nødvendig lokal koncentrationsforøgelse ved læsionsstedet af de gamma-carboxylerede koagulationsfaktorer (II, VII, IX og X). Calcium danner 2 kompleksbindinger til fosfatidylserin i thrombocytmembranen og 2 kompleks-bindinger til de 2 carboxylatgrupper i Gla i koagulationsfaktorerne. Herved fikseres koagulationsfaktorerne til de aggregerede thrombocytter. Vedr. muskelkontraktion (tværstribet muskulatur) Stigende cytosolær calcium (fra sarcoplasmatisk reticulum) medfører binding til troponin (Tn-

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – december 2007 – side 10

C) i troponin-tropomyosin komplekset. Troponin (Tn-I) blokerer i hvile for binding mellem actin og myosin-hovedet, men efter binding af calcium ændrer troponin konformation og blokeringen bortfalder. Vedr. exocytose af neurotransmittere I hviletilstanden er neurotransmitterholdige vesikler bundet til microtubuli. Når aktionspotentialet (depolarisering) når nerveenden, åbnes calciumkanaler, og indstrømmende calcium medierer exocytose af neurotransmitteren, der diffunderer til receptorer i den postsynaptiske membran og formidler den videre effekt. 4. Blandt årsagerne til hypercalcæmi kan nævnes: 1) primær hyperparathyroidisme, 2) malign sygdom (med syntese af parathyroidea-hormon relateret protein, PTHrP) og 3) Vitamin D forgiftning. Primær hyperparathyroidisme er en relativ hyppig endokrin sygdom ofte karakteriseret ved tilstedeværelsen af et PTH syntetiserende solitært adenom, der ikke reguleres ved negativ feed-back. Malign sygdom med syntese af PTHrP: Ved en række maligne sygdomme syntetiseres HTPrP, der har PTH-lignende aktivitet i N-terminalen og herved kan give anledning til hypercalcæmi. Vitamin D forgiftning kan forårsages af et højt indtag af Vitamin D analoger, der hydroxyleres i position 1 eller position 1 og 25 med øget intestinal absorption af calcium til følge. Blandt årsager til hypocalcæmi kan nævnes: 1) primær hypoparathyreoidisme, 2) vitamin D-mangel og 3) pseudohypoparathyreoidisme. Primær hypoparathyreoidisme kan skyldes atrofi af gld. parathyreoideae eller utilsigtet fjernelse af disse i forbindelse med thyreoideaoperation eller anden kirurgi på halsen. Resultatet af nedsat sekretion af PTH er nedsat osteoclastaktivitet, nedsat calcium- og fosfatabsorption fra tarmen og faldende calciumkoncentration i plasma. Vitamin D-mangel som følge af for ringe tilførsel med føden er usædvanlig på en normal vesteuropæisk kost, og skyldes snarere malabsorption af fedt (tyndtarmslidelse) eller for ringe udsættelse for ultraviolet lys (ældre institutionaliserede, indvandrere der bærer traditionel klædedragt). Pseudohypoparathyroidisme skyldes typisk en genetisk defekt, der giver anledning til endorgan resistance overfor PTH (fx en defekt i en regulatorisk subunit af G-protein komplekset som hindrer stimulering af adenylatcyklasen).

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – december 2007 – side 11

Svar til Opgave 1

1.

carboxylsyre ester

amin

*

*

carboxylsyre ester

* * 2. -

Cl

H +

H

+

H

+

CH3OH

H 3. Syre reagerer med aminogruppen i noradrenalin og danner derved et ammonium salt, som er lettere opløseligt

+ 3

Base reagerer med de to hydroxylgruper, som sidder på den aromatiske struktur (phenoler). De bliver derved negativt ladede (phenolat ion), og dermed lettere opløseligt

-O -O

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – december 2007 – side 12

Svar til Opgave 2

1a. Serin indgår i O-glykosyleringer og fosforyleringer af proteiner. 1b. Serin kan indgå i fosfolipider, hvor det er bundet til fedtsyrebundet glycerol via en fosfoesterbinding. Serin er også en del af sfingolipider, hvor det udgør skelettet for binding af fedtsyrer og sfingomyelin. 2.

Da der i sidste trin kan kobles enten en serin eller en cystein vil der laves to peptider, SerSer-Ser og Ser-Ser-Cys. På grund af de oxiderende omstændigheder vil sidstnævnte forventes at kunne dimerisere til (Ser-Ser-Cys)2 pga af oxidation af cysteiner og dannelse af disulfidbroer. Da peptidbinding mellem aminogrupper og carboxylgrupper sker under fraspaltning af H2O (18 Da) og disulfidkobling under oxidation medfører fjernelse af en proton (1 kDa) fra hver Cys er de bestemte masser: Ser-Ser-Ser : 3x105 (Ser) – 2x18(H2O) + 1 (protoneret N-terminal) = 280 Da (Ser-Ser-Cys)2: 4x105(Ser)+ 2x121(Cys) – 4x18(H2O) – 2x1(H) + 2x1 (2 proteonerede Nterminaler) = 590 Da. I tilfælde af inkomplet oxidering af cysteinerne vil der også findes Ser-Ser-Cys = 2x105(Ser)+ 121(Cys) – 2x18(H2O) + 1 (proteoneret N-terminal) = 296 Da (spørgsmål anses dog som fuldt besvaret, hvis de to førstnævnte udregnede masser er beregnet).

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – december 2007 – side 13

Svar til Opgave 3

1.

Et proto-oncogen koder for et protein som fremmer cellevækst og celledeling i den raske organisme. Et tumor-supressor gen koder for et protein, der skal hindre celleproliferation. Udsættes et proto-oncogen for en aktiverende mutation omdannes det til et oncogen, der vil stimulere cellulær transformation. Mutationen er dominant. I modsætning hertil skal begge alleler være inaktiveret i et tumor-supressor gen for at stimulere cellulær transformation. Da sandsynligheden for at få to mutationer i samme gen er relativt ringe, er de fleste cancerfremmende mutationer beliggende i et proto-oncogen.

2.

Binding af PDGF til PDGF-R fører til dannelse af en funktionel dimer, hvorved receptorernes cytoplasmatiske haler autofosforyleres. Det monomeriske G-protein RasGDP rekrutteres til fosforyleret PDGF-R via adapterproteinerne Grb2 og Sos, og GDP udskiftes med GTP. Ras-GTP starter herefter en kaskade af kinaser (bl.a. MAP-kinaser) der fremmer transkriptionen og resulterer i øget celledeling. Signaleringen stoppes ved at adaptoproteinet GAP stimulerer GTPase-aktiviteten af Ras, GTP hydrolyseres til GDP og Ras omdannes til sin inaktivere form.

3.

Retinoblastom proteinet (Rb) er en tumor-supressor. Rb binder til en transkriptionsfaktoren E2F og inaktiverer denne. I forbindelse med celledeling - eksempelvis som følge af stimulation med PDGF – fosforyleres Rb, dets inhibition af E2F forsvinder og transkriptionen af gener der skal føre cellen ind i S-fasen kan finde sted. En anden tumor-supressor er p53, der aktiveres ved skade på genomet. p53 øger aktiviteten af en cyklin kinase inhibitor, der forhindrer Rb i at blive fosforlyeret. Herved vil Rb til stadighed binde transkriptionsfaktoren E2F og hæmme overgangen til S-fasen. Er stimulationen af p53 meget kraftig, kan p53 desuden stimulere den programmerede celledød (apoptose).

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – december 2007 – side 14

Svar til Opgave 4

1.

Glucose-6-fosfat + H2O → glucose + Pi Reaktionen foregår primært i leveren (mindre del i nyrer og tarm).

2.

Glycogenolyse og gluconeogenese. Patienter vil være hypoglycæmiske efter meget kort tids faste, d.v.s. deres [blodglucose] vil ligge under normalområdet. Hypoglycæmi resulterer i sult, træthed og irritabilitet.

3.

Ved faste vil glycogenolyse hos raske personer resultere i frigivelse af glucose fra leveren til blodbanen. Hos patienter med von Gierke´s sygdom kan glucose-6-fosfat ikke defosforyleres og frigives. Metabolitten omsættes derfor ved glycolyse, hvilket resulterer i øget produktion af laktat. Dette forværres af, at laktat, der er et gluconeogenetisk forstadie, også vil akkumulere som følge af den kompromitterede gluconeogenese.

4.

Hypoglycæmi → lav insulin/glucagon ratio og høj adrenalin → aktivering af hormonsensitiv lipase og mobilisering af fedt → forhøjet koncentration af frie fedtsyrer. (De frie fedtsyrer omdannes til VLDL-partikler i leveren og efterfølgende til LDL, hvorfor patienterne også er hypercholesterolæmiske)

Tekst i kursiv: Kan næppe forlanges selv i optimal besvarelse.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – december 2007 – side 15

Svar til Opgave 5 1.

Kædeforlængelsesprocessen foretages af nukleotid-polymeraser ved tilkobling af nukleotider til en eksisterende 3´ ende. De tilkoblede nukleotider er komplementære til skabelonen. Syntesen foregår i 5´ mod 3´ retningen, uder fraspaltning af pyrofosfat, idet der skabes en fosfordiester-binding mellem nukleotidernes riboserester, fra kulstofatom nr. 5 i det indkomne nukleotid til kulstofatom nr. 3 i den allerede syntetiserede streng. Skabelonstrengen aflæses i 3´ mod 5´ retningen.

2.

DNA-polymeraser tilkobler deoxyribonukleotider til en 3´ ende under anvendelse af en DNA skabelon, DNA-polymeraser kan ikke starte de novo syntese fra en skabelon, men er afhængige af en fri 3´ende i form af en RNA- eller DNA-primer til initering af replikationen. RNA syntese udføres af RNA-polymeraser ved anvendelse af en DNA skabelon. Syntesen initeres de novo, dvs. uden en primer, der anvendes ribonukleotider ved kædeforlængelsen. Posttranskriptionel 3´modifikation af mRNA ved syntese af en polyA-hale, katalyseres af en polyA-RNA-polymerase ved anvendelse af ATP og uden brug af en skabelon. Revers transkriptase kan anvende retroviralt RNA eller mRNA som skabelon og skal, som DNA-polymeraser, have en fri 3` som udgangspunkt for syntese af en komplementær DNA streng. En polyT primer kan anvendes når mRNA anvendes som skabelon.

3.

ENZYM

Skabelon

DNA-polymerase RNA-polymerase polyA-polymerase Reverse transkriptase

DNA DNA ingen RNA

Riboukleotider/ Deoxyriboukleotider DeoxyriboRiboRiboDeoxyribo-

Primer Nødvendig Ikke nødvendig Nødvendig (3´af mRNA) Nødvendig

DNA-polymeraser der anvendes til PCR er termostabile. (Ifølge Baynes-Dominiczak er telomerase en skabelon uafhængig polymerase/ligase der påsætter hexamere oligonukleotider på kromosomernes 3´ender. Dette er forkert, telomerase er en revers transkriptase idet enzymet anvender en RNA skabelon, som er en integreret del af enzymet).

manan.dk

MEDICINSK BIOKEMI Aarhus Universitet

Juni 2007

Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Kandidateksamen

B IOKEMI MED KEMI Onsdag den 6. juni 2007, kl. 09:00 - 15:00 Bellevuehallen

Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver. Som bilag er tilføjet en Tabel med navne på - og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner m/tom hukommelse. ”Metabolic Pathways”, 22nd Edition, Sigma-Aldrich, 2003, udleveres. På eksamensbordet er fremlagt kuverter til aflevering samt gult kladdepapir og trefarvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det trefarvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Der udleveres 2 kuverter. Originalbesvarelsen puttes i kuverten med SORT påskrift og lukkes. Besvarelsen på gennemslagspapir puttes i kuverten med RØD påskrift og lukkes. Begge kuverter afleveres lukket med det indhold, som eksaminanden ønsker bedømt. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2007 – side 2

Essayopgave Musklernes omsætning af kemisk energi, i form af ATP, til bevægelse er grundlaget for deres virkningsmekanisme. 1)

Beskriv kontraktionsmekanismen for tværstribet og glat muskulatur.

2)

Gør rede for energiomsætningen i muskler ved overgang fra hvile til hårdt arbejde og ved længerevarende arbejde.

3)

Beskriv laktatproduktionen i muskler og gør rede for de enzymatiske reaktioner i gluconeogenesen, der adskiller sig fra glycolysen.

4)

Forklar den molekylære baggrund for rigor mortis.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2007 – side 3

Opgave 1 Ethylenglycol, CH2OH-CH2OH, der bl.a. benyttes til frostsikring af kølervæske, er giftigt, da det i leveren oxideres med coenzymet NAD til oxalsyre (ethandisyre) – der som Ca2+-salt kan udfældes i nyrerne. 1)

Skriv den støkiometrisk afstemte reaktionsligning for oxidation af ethylenglycol med NAD og angiv strukturformel for den kvantitativt dominerende ionform af oxalsyre ved henholdsvis pH 3 og pH 7.

Ovennævnte reaktion forløber via et mellemprodukt, glyoxal (ethandial). 2)

Skriv strukturformlen for glyoxal ved pH 7.

Propylenglycol, CH3-CHOH-CH2OH, der bl.a. benyttes som fugtsubstans i medicinal- og levneds-middelindustrien, er ugiftigt, da det i leveren oxideres med NAD til pyrodruesyre (2-oxopropansyre). 3)

Skriv den støkiometrisk afstemte reaktionsligning for oxidation af propylenglycol med NAD og angiv strukturformel for den kvantitativt dominerende ionform af pyrodruesyre ved henholdsvis pH 4 og pH 7.

Oxalsyre pKS1 1,27; pKS2 4,27 . Pyrodruesyre pKS 2,49.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2007 – side 4

Opgave 2 Hæmoglobin spiller en central rolle for gastransporten i organismen. 1)

Definer et holoprotein, et apoprotein og en prostetisk gruppe og beskriv hæmoglobins opbygning.

2)

Angiv de allosteriske modulatorer som regulerer hæmoglobins affinitet for ilt, og angiv hvordan de reagerer med hæmoglobin proteinet.

3)

Skitser iltmætningskurven for hæmoglobin og angiv hvordan de enkelte allosteriske modulatorer påvirker kurven. Angiv hvad der forstås ved Bohr effekten.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2007 – side 5

Opgave 3 En rapport udarbejdet af Danmarks Fødevareforskning fastslår, at vitamin D mangel i den danske befolkning er mere udtalt end hidtil antaget. 80% af befolkningen over 65 år får for lidt D-vitamin i forhold til de gældende anbefalede doser, og næsten halvdelen af alle bloddonorer lider af mangel på vitamin D. Det anbefales derfor at berige udvalgte fødemidler med vitamin D. 1)

Angiv hvorledes biologisk aktivt vitamin D syntetiseres ud fra 7-dehydrocholesterol.

2)

Redegør for de kompensatoriske mekanismer som indtræder ved vitamin D mangel.

3)

Redegør for mindst tre relevante biokemiske analyser som vil kunne anvendes til diagnostik af vitamin D mangel.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2007 – side 6

Opgave 4 1)

Hvad betinger påsætning af N-bundet kulhydrat på asparagin rester (’residues’) i proteiner under syntese i endoplasmisk reticulum (ER) og hvad omfatter denne proces i ER.

2)

I laboratoriet har man i en laboratoriekultur af celler i genomet indsat et gen, som koder for et glykoprotein. Cellerne syntetiserer og frigiver nu glykoproteinet til cellernes ekstracellære medium. Med henblik på, at cellerne skal syntetisere et glykoprotein uden N-bundet kulhydrat ændrer man nu genet i alle de codons, der koder for de asparagin rester, som vides at binde kulhydrat. De pågældende codons koder nu for alanin i stedet. Det muterede gen indsættes på ny i cellerne af en ny cellekultur. Man finder nu, at cellerne syntetiserer proteinet uden kulhydrat, men det nedbrydes imidlertid hurtigt intracellulært uden at frigives til det ekstracellulære medium. Giv mulige forklaringer herpå.

3)

Hvad er et lektin og giv et eksempel herpå med angivelse af det biologiske formål.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2007 – side 7

Opgave 5

Fedtsyresyntese 1)

Dannelse af malonyl CoA i cytosol er en forudsætning for fedtsyresyntese. Beskriv hvordan malonyl CoA dannes og nævn det enzym, som katalyserer reaktionen.

2)

Enzymet, som katalyserer dannelsen af malonyl CoA, er vitamin-afhængigt. Hvilket vitamin kræver enzymet?

3)

Under de rette betingelser polymeriserer enzymet, som ellers foreligger som inaktive protomerer, til en aktiv polymer. Beskriv disse betingelser, og nævn hvilket hormon, der kan aktivere enzymet.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2007 – side 8

Bilag

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2007 – side 9

Svar til Essayopgave 1) Calcium koncentrationen er meget lav i muskelcellers sarcoplasma (10-7 M), men stiger hurtigt ca. 100 gange ved nervestimulation. Muskelcellen responderer på nerveimpulsen ved depolarisation af sarcolemma, hvilket fører til frigivelse af calcium fra sacroplasmisk reticulum (SR) gennem calciumkanaler til sacroplasmaet. Den højere calcium koncentration medfører binding af calcium til troponinkomplekset, der består af 3 proteiner: Tn-T (tropomyosin-bindende), Tn-I (inhibitorisk subunit) og Tn-C (calcium-bindende). Komplekset er associeret med aktinfilamenterne via tropomyosin. Calcium-binding til Tn-C inducerer konformationsændringer i troponinkomplekset, der blotlægger myosin-bindings-områderne på aktinfilamenterne. Myosin, med tilknyttet ADP og fosfat, bindes til aktinfilamenterne og under frigivelse af ADP og fosfat vipper myosinhovederne og trækker derved aktin- og myosin-filamenterne sammen. Myosin frigøres fra aktinfilamenterne ved binding af ATP. Ved efterfølgende hydrolysering af ATP til ADP og fosfat vipper myosinhovedet tilbage i den oprindelige stilling og myosinhovedet er igen klar til interaktion med aktinfilamenterne. Myosins ATPase aktivitet fortsætter sålænge den høje calciumkoncentrationen opretholdes. Ved ophør af nerveimpulsen lukkes calciumkanalerne i SR membranen og calcium-koncentrationen i sarcoplasma sænkes, ved at SR-calcium-ATPase aktivitet pumper calcium til tilbage i SR, hvorved kontraktionen ophører. Glatte muskelceller har ikke troponin-C. Forhøjet calcium i sarcoplasma medfører calcium-calmodulin aktivering af myosin-letkæde-kinase. Fosforyleret myosin kan binde til aktinfilamenter (modsat ikke fosforyleret myosin), hvorved myosinhovedet vipper og ATPase aktivitet stimuleres som hos tværstribede muskelceller. 2) Creatinfosfat fungerer som et hurtigt mobiliserbart energilager i muskelcellerne, idet fosfatgruppen kan overføres til ADP af creatinkinase. Hvilende muskler har et højt indhold af creatinfosfat og ATP. Ved voldsom muskelaktivitet forbruges ATP hurtigt og omdannes til ADP. Den stigende ADP koncentration medfører nye ligevægts koncentrationer af creatin, creatinfosfat, ATP og ADP. De nye ligevægts koncentrationer katalyseres af creatinkinasen. Creatinfosfaten kan derved, i kort tid, holde en næsten konstant koncentration af ATP. Under hvile genopbygges ATP koncentrationen og creatinkinasen katalyserer overførslen af fosfat fra ATP til creatin, således at også creatinfosfatniveauet genoprettes. Det høje ADP niveau i en hårdt arbejdende muskel bruges til yderligere ATP syntese, idet en fosfatgruppe overføres fra ADP til ADP, medførende dannelse af ATP og AMP. Reaktionen katalyseres af adennylat-kinase (myo-kinase). Ved længerevarende muskelaktivitet nedbrydes glycogen til glucose i muskelcellerne. Glucosen indgår i ATP produktionen via glycolyse, citronsyrecyklus og oxidativ fosforylering. Fosforylasekinase er det centrale enzym i stimuleringen af glycogen-nedbrydningen, enzymet fosforylerer og aktiverer derved det glycogen-nedbrydende enzym fosforylase. Fosforylasekinase stimuleres af følgende: 1) Den forhøjede cytosolære calcium koncentration aktiverer fosforylasekinasen via et calcium-calmodulin kompleks; 2) ATP-forbruget medfører en højere AMP koncentration, som allosterisk stimulerer fosforylasekinasen. Desuden stimuleres det centrale glycolyseenzym fosfofructokinase (PFK-1) både af AMP og det lavere ATP niveau i arbejdende muskler; 3) Adrenalin stimulerer, via beta-adrenerge receptorer, adenylat-cyklase og dermed dannelse af cAMP. Dette stimulerer PKA (protein kinase A) til fosforylering af fosforylasekinase, som derved yderligere aktiveres. Ved fortsat muskelaktivitet overgår ATP produktionen gradvist til beta-oxidation af fedtsyrer, mobiliseret fra fedtvæv.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2007 – side 10

3) Ved hårdt muskelarbejde er ATP produktionen ved oxidativ fosforylering begrænset af ilttilførselen. ATP produktionen øges yderligere ved anaerob glycolyse, idet pyruvat reduceres til laktat og udskilles til blodet. Energiudbyttet ved anaerob glycolyse er dog begrænset i forhold til aerob omsætning af glucose. Laktat føres til leveren og omdannes til glucose, via pyruvat, ved følgende 4 gluconeogenese-specifikke trin: a)

Pyruvat carboxyleres til oxaloacetat ved hjælp af ATP og pyruvat-carboxylase i mitochondrier.

b)

Oxaloacetat reduceres til malate, overføres til cytosolen og oxideres tilbage til oxaloacete. Herefter decarboxyleres og fosforyleres oxaloacetat til PEP (fosfoenolpyruvat) ved hjælp PEP-carboxy-kinase. PEP omsættes via reversible trin i glycolysen til fructose-1,6-bisfosfat.

c)

Fructose-1,6-bisfosfat defosforyleres af fructose-1.6-bisfosfatase til fructose-6-fosfat. Fructose-6-fosfat isomeriseres via det reversible trin glycolysen til glucose-6-fosfat.

d)

Glucose-6-fosfat defosforyleres af glucose-6-fosfatase til glucose.

4) Efter dødens indtrædelse ændrer forholdet mellem ADP og ATP sig hurtigt. Myosin forbliver bundet til actin, idet der ikke er ATP tilstede til at dissociere myosinhovederne fra actinfilamenterne. Interaktionen mellem actin og myosin er derforuden mulig fordi den lave ATP koncentration tillader Ca2+ at være tilstede i cytoplasmaet, hvorved blokeringen af binding mellem actin og myosin ikke forhindres.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2007 – side 11

Svar til Opgave 1

1)

2)

3)

CHO CHO

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2007 – side 12

Svar til Opgave 2 1)

Et holoprotein er et protein, som i sin funktionelle tilstand består af en protein-del (apoproteinet) med en prostetisk gruppe bundet til apoproteinet. Den prostetiske gruppe er en cofaktor, som ikke er et peptid. Hæmoglobin er et tetramert protein, der består af 4 globin subunits. Det er en såkaldt heterodimer der består af 2 ens alfa-kæder og 2 ens andre kæder. Den almindeligst forekommende er med beta2-kæder, men ved nyfødte findes en betydelig mængde som gamma-kæder. I hver subunit er bundet et hæmmolekyle, som er en organisk forbindelse der koordinerer et jernatom. Jernet skal være på ferroform for at kunne binde ilt.

2)

Hæmoglobins affinitet for ilt reguleres negativt af en række allosteriske modulatorer. 2,3difosfoglycerat (DPG) i erythrocytten virker ved at 1 molekyle BPG reversibelt reagerer med hele hæmoglobinmolekylet og herved sænker iltaffiniteten. CO2 kan bindes til en aminogruppen i hver globinkæde så der dannes en carbaminogruppe, og herved sænkes affiniteten for ilt. H+ ioner protonerer sidekæder på visse aminosyrer og herved sænkes hele hæmoglobinmolekylets affinitet for ilt.

3)

Som vist på kurven vil de 3 allosteriske modulatorer DPG, H+ og CO2 bevirke en højreforskydning af iltmætningskurven. Det betyder, at der til et givet ilttryk vil være mindre ilt bundet til hæmoglobin og skyldes at regulatorerne sænker iltaffiniteten. Bohr effekten er det fænomen, at iltaffiniteten er sensitiv for pH niveauet.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2007 – side 13

Svar til Opgave 3 1)

7-dehydrocholesterol omdannes ved UV-bestråling til vitamin D3 (cholecalciferol) i huden. Vitamin D3 transporteres bundet til vitamin D-bindende protein (DBP) til leveren. Vitamin D3 kan også indtages med føden fra animalske produkter eller dannes ud fra vitamin D2 (ergocalciferol), der findes i visse planter. I leveren hydroxyleres vitamin D3 til 25-hydroxycholecalciferol, hvorefter det bundet til DBP transporteres til nyrerne og omdannes til den biologisk aktive metabolit 1,25-dihydroxycholecalciferol, der er en central regulator af calcium stofskiftet.

2)

Funktionel D-vitaminmangel medfører nedsat intestinal absorption af calcium og reduceret plasma-calcium. Dette stimulerer frigivelsen af PTH (sekundær hyperparathyroidisme), hvilket medfører øget calcium reabsorption i nyrerne og øget udskillelse af fosfat.

3)

25-hydroxycholecalciferol og/eller 1,25-dihydroxycholecalciferol ↓, PTH ↑, fosfat ↓ (forklaring: se spm. 2). Mangel på aktivt D-vitamin hæmmer knoglernes mineralisering ved at begrænse udbuddet af calcium og fosfat, og den efterfølgende hyperparathyroidisme vil desuden øge osteoklasternes knoglenedbrydning. Parametre der indikerer øget knogleomsætning vil følgelig være forhøjede; f.eks. alkalisk fosfatase, osteonectin, osteocalcin, hydroxyprolin og N- og C-terminal fragmenter af prokollagen.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2007 – side 14

Svar til Opgave 4 1)

N-bundet kulhydrat bindes til asparagin rester som indgår i en specifik konsensussekvens (N-X-S/T, specifik sekvens ikke pensum) i protein. Initialt påsættes glucose, mannose (forgrenende) og N-acetylglucosamin ’en bloc’ fra glycosyleret dolichol bundet i ER membranen. Herefter trimmes kulhydratet (fjernelse af glucose rester) inden glykoproteinet overføres til Golgi for videre processering af proteinets kulhydratdel.

2)

En mulig forklaring er, at pga de manglende N-bundne kulhydrater binder proteinet ikke til ER proteinerne calreticulin og calnexin, som er vigtige for den korrekte foldning af proteinet. Ukorrekt foldet eller ufoldet protein kan undergå intracellulær nedbrydning i stedet for at frigives fra cellen til omkringliggende medium. Abnorm foldning kan også være en direkte konsekvens af den ændrede aminosyresekvens, som forekommer, efter udskiftning af asparaginer med alanin.

3)

Et lektin er et protein som binder kulhydrat. Et eksempel er selektin på overfladen af endothelceller. Selektin binder Lewis X- kulhydratstrukturen på leukocytter, hvilket er vigtigt for tiltrækning af leukocytter og for leukocytters penetration af endothelcellelaget i forbindelse med inflammation.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2007 – side 15

Svar til Opgave 5 1)

Malonyl CoA dannes i cytosol, og malonyl CoA syntese er en betingelse for, at fedtsyresyntese kan forløbe. Malonyl CoA dannes ved carboxylering af acetyl CoA katalyseret af acetyl CoA carboxylase. Undervejs forbruges HCO3- og ATP. Acetyl CoA + HCO3- + ATP → ADP + Pi + Malonyl CoA På Metabolic Pathways er det angivet, at reaktionen katalyseres af Malonyl CoA decarboxylase. Det er ikke dette svar, vi beder om, men den studerende får point for det, fordi det står på Metabolic Pathways.

2)

Biotin.

3)

I en situation, hvor kroppen er rig på energi og rig på byggesten (højt blodsukker), vil niveauet af citrat være højt. Dette stimulerer dannelsen af aktive enzym polymerer udfra inaktive protomerer. I en sådan situation vil niveauet af insulin ligeledes være højt. Acetyl CoA carboxylase aktiveres af insulin.

manan.dk

MEDICINSK BIOKEMI Aarhus Universitet

Januar 2007

Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Kandidateksamen

B IOKEMI MED KEMI Onsdag den 10. januar 2007, kl. 09:00 - 15:00 Atletion, Stadion Allé 70, Aarhus C.

Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver. Som bilag er tilføjet en Tabel med navne på - og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner m/tom hukommelse. ”Metabolic Pathways”, 22nd Edition, Sigma-Aldrich, 2003, udleveres. På eksamensbordet er fremlagt et gult omslag påtrykt DET SUNDHEDSVIDENSKABELIGE FAKULTET samt gult kladdepapir og trefarvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det trefarvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Der udleveres 2 kuverter. Originalbesvarelsen puttes i kuverten med SORT påskrift og lukkes. Besvarelsen på gennemslagspapir puttes i kuverten med RØD påskrift og lukkes. Begge kuverter afleveres lukket med det indhold, som eksaminanden ønsker bedømt. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – januar 2007 – side 2

Essayopgave

a)

Giv en kort redegørelse for thyroideavævets opbygning, og beskriv dannelsen af jodholdige hormoner, fra optagelse af jod i follikelcellerne til det fuldt aktive hormon.

b)

Beskriv den overordnede regulation af hormonproduktionen i thyroidea, herunder de væsentligste signalmolekylers funktion og struktur (størrelse, sammensætning).

c)

Follikelcellerne stimuleres til hormonsyntese via en type receptorer, mens dens egne joderede hormoner binder til en anden type receptorer i de perifere væv. Beskriv generelt de to receptortyper og giv en kort beskrivelse af deres virkningsmekanismer/signaleringsveje, herunder evt. væsentlige second messengers.

d)

Mangel på joderede thyroideahormoner tidligt i livet kan føre til alvorlige lidelser. Nævn to og gør kort rede for den funktionelle baggrund.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – januar 2007 – side 3

Opgave 1

Phospholipider udgør en vigtig strukturel komponent af cellemembranen. Desuden er phospholipider involveret i adskillige centrale biologiske processer. a)

Forklar to mekanismer hvorved thrombocytternes phospholipider kan fremme hæmostasen.

b)

Phospholipider spiller også en central rolle ved det inflammatorisk respons. Som antiinflammatorisk behandling anvendes aspirin (acetylsalicylsyre) og andre non-steroide antiinflammatoriske stoffer (NSAIDs) samt cortisol og derivater heraf. Forklar den principielle virkningsmekanisme for disse to stofgrupper.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – januar 2007 – side 4

Opgave 2

Cancer kan opstå ved en række mutationer i DNA, som vil forårsage fejl i DNA-strukturen. Cancerceller er bl.a. karakteriseret ved, at de er i stand til at dele sig uhæmmet, så en af behandlings-strategierne er, at hæmme celledelingen med kemoterapi (cellegifte). a)

Angiv tre eksempler på fejl, der kan opstå i DNA-strukturen, enten spontant eller som følge af fysisk eller kemisk påvirkning.

b)

Forklar kort hvordan cellen, til en vis grad, kan eliminere mutationer i DNAstrukturen.

c)

Forklar den mekanisme, der er ansvarlig for, at folat-analoger (folic acid analogs, antifolates), fx methotrexate kan anvendes til at hæmme celledeling.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – januar 2007 – side 5

Opgave 3 Muskelkontraktionen igangsættes af en stigning i den cytosolære Ca2+-koncentration. Beskriv de Ca2+-medierede mekanismer, med angivelse af de involverede proteiner, som fører til myosinhovedets binding til actin i: a)

skeletmuskulatur.

b)

glat muskulatur.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – januar 2007 – side 6

Opgave 4 Til en person indgives intravenøst 1,00 mL vandig opløsning, der indeholder 5 mg af et 131Imærket protein, A, med en specifik aktivitet på 8000 cpm mg-1. Efter fem minutter udtages en blodprøve fra personen og umiddelbart efter isoleres 5,00 mL plasma med en radioaktivitet på ialt 80 cpm. Gennem forskellige oprensningsprocedurer renfremstilles nu protein A fra plasmaprøven. Otte døgn efter injektionen bestemmes den specifikke aktivitet af det oprensede protein A til 12 cpm mg–1. a.

Beregn koncentrationen af protein A i personens plasma i mg L-1. Det forudsættes, at det indgivne protein er jævnt fordelt i hele plasmavolumen - og kun dér, og at det ikke metaboliseres eller udskilles indenfor de fem minutter. Halveringstiden T1/2 = 8 døgn for 131I

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – januar 2007 – side 7

Opgave 5

Mennesket har glucosedepot, i form af glycogen, i lever og muskler. Nedbrydningen af glycogen, glycogenolyse, er en flertrins enzymatisk proces, der involverer brydning af både α1→4- og α1→6-glycosidbindinger. a)

Skitser den enzymatiske proces hvorved glucoseenheder mobiliseres fra glycogen.

b)

Nedbrydningen af glycogen resulterer i to forskellige glucoseprodukter. Angiv de to produkter og angiv det produkt der er i støkiometrisk overskud (hovedproduktet).

c)

Enzymet phosphoglucomutase findes både i lever- og muskelceller. Leverceller, men ikke muskelceller, har desuden enzymet glucose-6-phosphatase. Hvilke reaktioner katalyserer disse to enzymer, og hvorfor findes glucose-6-phosphatase kun i leverceller?

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – januar 2007 – side 8

Bilag

DE 20 AMINOSYRER - VED PH 7,4

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – januar 2007 – side 9

Svar til Essayopgave

a)

De T3 og T4 producerende celler er arrangeret i et enkelt cirkulært lag omkring det kolloidholdige lumen. Cellernes apikale membran er foldet i mikrovilli og vender ind mod kolloidet, mens den basale membran vender ud mod stroma (interstitiet væv) og dets netværk af kapillærer. Den laterale membran knytter cellerne sammen via tight junctions. Follikelcellerne syntetiserer thyroglobulin, et glykoprotein bestående af to ens 300 kDa kæder som er knyttet sammen af disulfidbindinger. Efter foldning i ER glykosyleres proteinet (både i ER og Golgi), hvorefter det i trans-Golgi pakkes i vesikler og efterfølgende frigives fra den apikale membran til lumen (10-25 % af kolloidet udgøres af thyroglobulin). Jodid optages via en ATP forbrugende transporter i basalmembranen. De optagede ioner diffunderer til den apikale membran, hvor de indgår i joderingen af thyroglobulin. Joderingen sker v.h.a. thyroideaperoxidasen som binder både ionen og en tyrosin i thyroglobulin og medierer kobling af jod til fenylringen i tyrosin under dannelse af MIT i position 3 eller 5. DIT dannes ved yderligere en jodering af MIT. Peroxidasen formidler efterfølgende overførsel af en joderet fenylring fra en DIT eller MIT til en anden DIT eller MIT, under dannelse af en jodothyronin og en dehydroalaninrest. Jodothyroniner, med to jod på den inderste ring og mindst en i den yderste, kan blive til aktivt hormon. Thyroglobulin indeholder 120 tyrosiner, men hvert molekyle leverer ikke mere en ca. 3 T4 og mindre end et T3. Den endelige frigivelse af hormon sker ved at follikelcellen fagocyterer kolloid indeholdende joderet thyroglobulin. Proteinet nedbrydes efterfølgende hydrolytisk i lysosomerne. De fraspaltede iodothyrosiner (herunder T3 og T4) frigives endelig via cellernes basalmembran til blodbanen. Det primære hormon er T3, som har højest affinitet for T3/T4 receptoren. T4 omdannes til T3 gennem 5’-deiodasen, som findes i de perifere væv som er mål for hormonet.

b)

Produktionen af T3 og T4 reguleres via den hypothalamo-hypofysære thyroid akse. Hypothalamus producerer det modificerede tripeptid TRH, som virker på receptorer i adenohypofysen og stimulerer produktion af TSH. TSH er ligesom FSH og LH et to-kædet glykoprotein (~28 kDa). α-kæden (der er meget lig α-kæderne i FSH og LH) er nødvendig for molekylets funktion, men det er β-kæden som formidler den specifikke binding til receptorer på folikkelcellerne. TSH stimulerer folikkelcellernes vækst og opregulerer stort set alle trin i produktionen af T3 og T4. Niveauet af T3 og T4 virker tilbage på de TSHproducerende celler, hvor de hæmmer den TRH inducerede TSH syntese. Der er med andre ord tale om negativ feed-back. En lav serumkoncentration af T3 og T4 medfører mindre hæmning og mere TSH, mens høje T3 og T4 koncentrationer har den modsatte effekt.

c)

TSH (og TRH) signalerer via membranreceptorer mens T3 (T4) binder til nukleære (cytosolære) receptorer. (1) TSH-receptoren er et typisk seven-pass molekyle som er koblet til et trimert G-protein. Binding af ligand gør receptoren i stand til at binde Gproteinets α-kæde som dermed bliver i stand til at frigive GDP og i stedet binde GTP. Efter GTP binding går α-kæden solo og interagerer så typisk med en membranbundet adenylylcyklase (AC) og/eller en lipase (LP). Kompleksdannelsen stimulerer AC til cAMP produktion og cAMP aktiverer proteinkinase A. Kompleksdannelse med LP medfører spaltning af plasmamembranens fosfoglycerolipider under dannelse af bl.a. IP3 og DAG som efterfølgende medfører frigivelse af Ca++ og aktivering af calmodulin og proteinkinase C. I begge tilfælde følger et akut respons. (2) Nukleære/cytosolære receptorer indeholder

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – januar 2007 – side 10

et DNA-bindende område, et transkriptionselement og et ligandbindende område. I fravær af ligand er DNA-binding hyppigst hæmmet af et inhibitorisk protein. Når receptoren binder en ligand, fraspaltes det inhibitoriske protein hvorefter receptoren kan binde til DNA og starte transkription af gener. Responset er derfor ikke akut, men indtræder efter timer eller døgn. d)

I månederne før og efter fødslen er hjernevævets (neuronernes) vækst og differentiering afhængigt af stimulation fra T3/T4. Mangel på hormon medfører derfor irreversibel retardering. T3/T4 stimulerer endvidere produktionen af væksthormon som på sin side bestemmer produktionen af somatomediner (IGF I og II). IGF I er afgørende for ekspansion af chondrocytter i epifyseskiverne og mangel på T3/T4 (og dermed på væksthormon og IGF-I) i barndommen medfører derfor vækstretardering (dværgvækst).

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – januar 2007 – side 11

Svar til Opgave 1

a)

Under koagulationen vil visse phospholipider, eksempelvis phosphatidylserin, blive eksponeret på de aktiverede thrombocytters cellemembran. Phospholipiderne sikrer, at koagulationsfaktorerne opkoncentreres på thrombocytternes overflade hvorved koagulationen accelereres betydeligt. Fedtsyren arachidonat, der er det kvantitativt vigtigste substrat for syntesen af eicosanoider, kan frigives fra cellemembranens phospholipider ved phospholipase A2medieret hydrolyse. Arachidonat kan i thrombocytterne omdannes til thromboxan A2 (TXA2), der virker fremmende på thrombocyternes aggregation.

b)

Arachidonat er udgangspunktet for syntesen af eicosanoiderne, der inkluderer thromboxaner, prostacykliner, prostaglandiner og leukotriener. Specielt prostaglandiner og leukotriener medierer inflammatoriske reaktioner såsom rødme, varme, ødem og smerte. I farmakologske doser inhiberer aspirin og andre NSAIDs cycklooxygenasen, der omdanner arachidonat til PGG2, det første trin i syntesen af thromboxaner, prostacykliner og prostaglandiner (men ikke leukotriener). Cortisol og derivater heraf hæmmer derimod aktiviteten af PLA2, således at arachidonat ikke kan frigives fra cellemembranens phospholipider. Da arachidonat også kan omdannes til leukotriener uafhængigt af cyclooxygenasen, vil behandling med cortisol derfor hæmme syntesen af alle eicosanoiderne, dvs. både thromboxaner, prostacykliner, prostaglandiner og leukotriener.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – januar 2007 – side 12

Svar til Opgave 2

a)

Fejl i DNA-strukturen kan fx opstå som følge af: Forkert N-baseparring under replikationen. Spontan deaminering af N-baser (C og A). Spontan depurinering (G og A). Mutationer opstået som følge af oxidativ påvirkning af DNA (fx 8-oxoG). Ændringer induceret af ultraviolet lys (dimerisering af T). Alkylering af DNA induceret af carcinogener.

b)

Cellen har DNA-reparationsenzymer, der til en vis grad kan genkende ”forkert” DNA, fjerne ”forkert” DNA, nysyntetisere DNA og ligere DNA sammen igen (excision repair).

c)

Folat-analoger kan hæmme celledeling ved at hæmme syntesen af TTP (i lærebog lejlighedsvist angivet som dTTP), der benyttes til syntese af DNA-strengen under replikationen. Syntesen af dTTP foregår ved methylering af dUMP med methylen tetrahydrofolat (N5-,N10-methylen tetrahydrofolat) som methylgruppe-donor. Methylen tetrahydrofolat (N5-,N10-methylen tetrahydrofolat) omdannes herved til dihydrofolat og det dannede dTMP fosforyleres to gange med ATP til dTDP henholdsvis dTTP. Under DNA-syntesen indbygges dTTP i DNA-strengen under fraspaltning af pyrofosfat. Det dannede dihydrofolat skal reduceres til tetrahydrofolat af et enzym (dihydrofolat reduktase), som igen ved en enzymkatalyseret reaktion (serin hydroxymethyl transferase) omdannes til methylen tetrahydrofolat (N5-,N10-methylen tetrahydrofolat). Folat-analoger hæmmer dihydrofolat reduktasen, hvorved omdannelsen af dihydrofolat til tetrahydrofolat hæmmes. Herved hæmmer folatanalogerne syntesen af dTTP og dermed syntesen af DNA. Celledelingen bremses som følge af den hæmmede DNA syntese. (Ved vurdering af opgavebesvarelsen lægges vægt på funktion snarere end på detaljeret navngivning).

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – januar 2007 – side 13

Svar til Opgave 3

a)

I hvile blokerer troponin (Tn-I) for bindingen mellem actin og myosinhovedet. Stigende cytosolær Ca2+ medfører at Ca2+ bindes til Tn-C, som ændrer konformation, hvorved blokeringen bortfalder hvilket tillader myosinhovedet at binde til actin.

b)

Glatte muskelceller indeholder ikke troponin. Ved en stigning i den cytosolære Ca2+koncentration bindes Ca2+ til calmodulin, som ændrer konformation. Ca2+-calmodulin komplekset aktiverer derefter myosin light chain kinase, der fosforylerer myosinhovedets lette kæder. Herefter bindes myosinhovedet til actin.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – januar 2007 – side 14

Svar til Opgave 4

a.

Bestemmelse af plasmavolumen gøres på 5 min - henfald kan ignoreres. Før blanding: radioaktivitetskoncentration = 5 mg × 8000 cpm mg–1 i 1 mL = 40000 cpm mL–1 Efter blanding: radioaktivitetskoncentration = 80 cpm i 5 mL = 16 cpm mL–1 Samme totale radioaktivitet før og efter: 40000 cpm mL–1 × 1 mL = 16 cpm mL–1 × (volumen + 1 mL)

volumen =

40000 cpm- 16 cpm = 2499 mL 16 cpm mL-1

Bestemmelse af proteinkoncentration foretages 8 døgn - henfald kan ikke ignoreres. efter 1 × T1/2 måles 12 cpm mg–1 Korrektion for henfald: 12 cpm mg–1 × 2 = 24 cpm mg–1 ved start Før blanding: total radioaktivitet = 5 mg × 8000 cpm mg–1 Efter blanding: total radioaktivitet = (A + 5 mg) × 24 cpm mg–1 Samme totale radioaktivitet før og efter:

A=

40000 cpm- 5 × 24 cpm = 1661,6 mg 24 cpm mg -1

Plasmakoncentration 1661,6 mg i 2490 mL = 667,3 mg L–1

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – januar 2007 – side 15

Svar til Opgave 5

a.

(Glycogen) Phosphorylase [EC 2.4.1.1] Katalyserer det første trin, brydning af α1→4-glycosidbindinger indtil der er 3-4 glucoseenheder tilbage i en forgrening. Debranching Enzyme [EC 2.4.1.25 og 3.2.1.33] Katalyserer de næste to trin. Først udnyttes enzymets transglycosylase (transferase)aktivitet [EC 2.4.1.25] til at flytte 2-3 glucoseenheder til en i nærheden liggende α1→4 kæde. I det sidste trin udnyttes enzymets 1,6-glucosidase-aktivitet [EC 3.2.1.33] til at fjerne den sidste glucoseenhed i en forgrening (brydning af en α1→6-glycosidbinding).

b.

Produktet af (glycogen) phosphorylase-aktiviteten er glucose-1-phosphat. Produktet af debranching enzymes 1,6-glucosidase-aktivitet er frit glucose. Glucose-1-phosphat er i stort støkiometrisk overskud, kun ca. 10 % frigives som frit glucose.

c.

Phosphoglucomutase [EC 5.4.2.2] katalyserer omdannelsen af glucose-1-phosphat til glucose-6-phosphat, som så direkte kan indtræde i glycolysen. Imidlertid er leverens hovedformål med glycogenolyse ikke egen energiproduktion, men derimod at levere glucose til ekstrahapatiske væv, især hjerne og muskler. Phosphoryleret glucose kan ikke transporteres ud af cellen, så leverceller benytter glucose-6-phosphatase [EC 3.1.3.9] til at omdanne glucose-6-phosphat til glucose, som så frigives til blodet via GLUT-2. Formålet med muskelcellers glycogenolyse er udelukkende egen energiproduktion, og de har derfor ikke brug for glucose-6-phosphatase.

manan.dk

MEDICINSK BIOKEMI Aarhus Universitet

Juni 2006

Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Kandidateksamen

B IOKEMI MED KEMI Tirsdag den 6. juni 2006, kl. 09:00 - 15:00 Skøjtehallen, Gøteborg Allé, 8200 Århus N.

Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver. Som bilag er tilføjet en Tabel med navne på - og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner. ”Metabolic Pathways”, 22nd Edition, Sigma-Aldrich, 2003, udleveres. På eksamensbordet er fremlagt et gult omslag påtrykt DET SUNDHEDSVIDENSKABELIGE FAKULTET samt gult kladdepapir og trefarvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det trefarvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Der udleveres 2 kuverter. Originalbesvarelsen puttes i kuverten med SORT påskrift og lukkes. Besvarelsen på gennemslagspapir puttes i kuverten med RØD påskrift og lukkes. Begge kuverter afleveres lukket med det indhold, som eksaminanden ønsker bedømt. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2006 – side 2

Essayopgave

1.

Beskriv oprindelsen af kroppens cholesterol og dets association med lipoproteiner i plasma (beskriv i den forbindelse den generelle opbygning af et lipoprotein). Angiv hovedruter for den lipoprotein-medierede ekstracellulære cholesterol transport og angiv hvilke anvendelser stoffet har.

2.

Forklar hvordan regulatoriske mekanismer kan begrænse cellens indhold af cholesterol ved høje niveauer af cholesterol i plasma. Giv et eksempel på hvordan et regulatorisk enzym i dette system kan udnyttes til behandling af patienter med hypercholesterolæmi.

3.

En række genetiske sygdomme påvirker kroppens lipoprotein-sammensætning. Giv begrundede forslag til hvad du vil forvente med hensyn til cholesterol i LDL og HDL ved gen-inaktiverende mutationer i gener for a. b. c. d. e.

LDL receptoren LCAT (lecithin cholesterol acyltransferase) Ikke-hormon sensitiv lipoprotein lipase CETP (cholesterol-ester transfer protein) CERP (cholesterol efflux regulating protein - også kaldet ABCA1 el. ABC1)

4.

Forøget optagelse af cholesterol i karvæggen kan medføre arterielle plakdannelser, som senere kan udløse plakruptur (revnedannelse i karvæggen) og lokal trombedannelse, f.eks. i coronararterier. Forklar hvordan reaktioner i plasma kan bidrage til denne trombedannelse og beskriv en enzymatisk behandling til fjernelse af en sådan trombe.

5.

Forklar kortfattet hvordan man ved a) centrifugering og b) kromatografi kan kan adskille HDL og LDL fraktionen i plasma fra hinanden i intakt form i en væskefase.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2006 – side 3

Opgave 1

Jernomsætning a.

Angiv en række intracellulære proteiner, hvor jern er en vigtig komponent.

b.

Angiv hvordan jernioner transporteres i blodplasma og hvordan optagelsen i cellerne foregår. Beskriv herunder ionens videre skæbne.

c.

Angiv en patologisk tilstand, der opstår som følge af jernmangel og giv eksempler på hvordan denne tilstand kan opstå.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2006 – side 4

Opgave 2

Den intracellulære transport af glycoproteinet aminopeptidase N (et fordøjelsesenzym lokaliseret til plasmamembranen) er blevet undersøgt i tyndtarmepithelceller. Ved homogenisering af tyndtarmen og efterfølgende subcellulær fraktionering er aminopeptidase N blevet oprenset fra endoplasmatisk reticulum (ER), post-Golgi transportvesicler (TV) og plasmamembranen (PM). Det oprensede protein fra de tre fraktioner er herefter analyseret sammen med størrelsesmarkører ved SDS-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE). Inden påsætning af prøverne på gelen er proteinerne blevet reduceret (brydning af –S-S- bindinger). Resultatet er vist i Fig. 1.

Fig. 1 a.

Angiv de mekanismer, der ligger til grund for at aminopeptidase N findes i ER fraktionen.

b.

Hvad kan forklare at aminopeptidase N båndet fra ER-fraktionen har en vandring, der er forskellig fra båndet i TV- og PM-fraktionen?

c.

Angiv kortfattet syntesested og foldningssted for henholdsvis et cytosolært protein, et kerneprotein og et mitochondrieprotein.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2006 – side 5

Opgave 3

Ovenstående forbindelse er et vigtigt biologisk oxidationsmiddel: Nicotinamid-adenin-dinucleotid – kaldet NAD (eller NAD+). a.

Angiv navn på funktionalgrupperne, mærket 1-4.

b.

Angiv funktionalgrupper, hvortil der kan bindes en proton.

c.

Markér hydrolyserbare bindinger (tegn formlen af, og angiv med pile).

d.

Skriv de dominerende strukturformler ved pH 7,2 for de forbindelser, der dannes ved fuldstændig hydrolyse af NAD.

e.

I egenskab af oxidator bindes en hydridion (dvs. :H– ) til pyridiniumringen i parastilling (4-positionen) til N+. En efterfølgende delokalisering af elektroner resulterer i neutralisation af N-atomet. Skitsér strukturen af reduktoren NADH.

pKs-værdier: Ammoniumion Phosphorsyre Phosphorsyrediestere Phosphorsyremonoestere

9,3 2,2 ca 1 ca 1

7,2 ca 6

12,4

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2006 – side 6

Opgave 4

a.

Angiv anvendelsen af glykogenlageret i muskelvæv.

b.

Muskelceller kan opbygge deres eget glykogenlager udfra glukoseenheder. Efter et kulhydratrigt måltid med følgende højt blodsukker sker denne indbygning af glukose i glykogen. Forklar, hvorledes glukosen kommer ind i muskelcellerne, og hvordan insulin spiller en afgørende rolle herfor.

c.

Angiv anvendelsen af glykogenlageret i leveren, og forklar hvordan denne anvendelse adskiller sig fra anvendelsen af glykogenlageret i muskelvæv.

d.

Angiv det enzym, der gør leveren speciel hvad angår anvendelsen af glykogenlageret i leveren, samt enzymets funktion. Angiv desuden det hormon, der styrer forbruget af glykogenlageret i leveren, samt hvorfor hormonet ikke virker på muskelceller.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2006 – side 7

Opgave 5

Ved kræftsygdomme spiller oncogener en stor rolle a.

Definer et onkogen, et protoonkogen og relationen mellem dem.

a.

Forklar hvordan en vækstfaktorreceptor kan omdannes til et onkogen.

c.

Beskriv hvordan ras fungerer i intracellulær signalering og hvordan ras-genet kan blive til et onkogen.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2006 – side 8

Bilag

DE 20 AMINOSYRER - VED PH 7,4

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2006 – side 9

Svar til Essayopgave

1.

Kroppen cholesterol stammer dels fra kosten og dels fra egensyntese ud fra acetyl-CoA. Cholesterol er hydrofobt og transporteres primært af lipoprotein partikler dvs chylomikroner, VLDL, LDL og HDL. Lipoproteinerne har forskellige størrelse og sammensætning men har den samme generelle struktur. Partiklerne er runde med en enkeltlaget fosfolipid-membran hvori er indlejret cholesterol og apolipoproteiner. Fosfolipiderne danner et hydrofobt indre i partiklen, og der er i denne kerne pakket triglycerider og cholesterolestre. LDL er den mest cholesterol-rige partikel og indeholder som de øvige både cholesterol i esterificeret og ikke-esterificeret form. Cholesterol i chylomikroner stammer fra kostens cholesterol optaget i tarmen og transportes primært til leveren. VLDL stammer fra leveren og i plasma tilføres det cholesterol ester fra HDL og omdannes til LDL som optages i stort set alle væv inklusive leveren. HDL cholesterol stammer især fra de ekstrahepatiske væv og bliver i form af cholesterolester overført til VLDL eller optaget i især leveren (og steroidproducerende væv ). Cholesterol er i ikke-esterificeret form en essentiel strukturel komponent af biologiske membraner. Endvidere er det bl.a. udgangspunkt for syntese af steroidhormoner (mineralo- og glukocorticoider, mandlige og kvindelige kønshormoner), galdesyrer og vitamin D.

2.

Ved en høj kolesterol koncentration i plasma er der oftest tale om en forhøjet koncentration af LDL, hvortil den største del af cholesterol er associeret. Dette vil alt andet lige medføre en øget optagelse af LDL i cellerne. En stigning i cholesterolindholdet i cellerne vil imidlertid hæmme ekspression af LDL receptoren på celleoverfladen og hæmme egensyntese af cholesterol ved hæmning af HMG-CoA reduktasen. Begge dele vil begrænse stigningen i den intracellulære cholesterol/cholesterolester koncentration. Hæmning af HMG-CoA reduktasen kan induceres af bestemte lægemidler (f.eks statiner). Syntesen af cholesterol nedsættes hermed, hvorved plasmaniveuaet af LDL cholesterol falder.

3. a)

b)

c)

d)

e)

Ved defekt funktion af LDL-receptorer vil cellernes optagelse af LDL være nedsat omend ikke fuldstændigt (optagelse af LDL sker også via andre scavenger receptorer) og koncentrationen af LDL-cholesterol i plasma vil derfor være forøget. HDL cholesterol vil ikke direkte være påvirket. LCAT er enzymet der katalyserer esterificering af cholesterol i HDL. HDL vil derfor primært indeholde ikke-esterificeret cholesterol og overførsel af cholesterolestre til VLDL vil også være nedsat. Man må derfor forvente nedsat HDL og LDL cholesterol. Lipoprotein lipasen findes på endoteloverfladen og har som primær funktion at katalysere hydrolyse af triglycerider. Ved defekt funktion af lipoprotein lipasen vil det forventes, at triglyceridniveauet i plasma øges, men det vil ikke have en væsentlig effekt på HDL og LDL cholesterol. CETP er vigtig for overførsel af cholesterolestre fra HDL til VLDL. Ved defekt CETP funktion vil derfor forventes øget plasma HDL cholesterol og et fald i plasma VLDL/LDL cholesterol. CERP/ABCAI er vigtig for efflux af cholesterol fra cellen til apolipoproteinA1/HDL. Ved defekt CERP/ABCA1 protein vil der forventes nedsat HDL cholesterol (både ikke-

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2006 – side 10

esterificeret og esterificeret). Pga nedsat overførsel til VLDL forventes LDL-cholesterol også at være nedsat. 4.

Ved vævsblotlæggelse som f.eks en plakruptur vil der blotlægges/frigives vævsfaktor (tromboplastin) som ved aktivering af koagulationsfaktor VII, vil føre til aktivering af faktor X (og IX). Faktor X vil spalte protrombin til trombin som vil omdanne fibrinogen til fibrin samt aktivere transglutaminase som stabiliserer (krydsbinder) fibrin. Endvidere bidrager trombin til aktiveringen af trombocytter, hvis aggregation også spiller en rolle i trombedannelsen. Koagulatet i en trombe kan behandles med en plasminogen aktivator som omdanner plasminogen til det aktive enzym plasmin. Plasmin nedbryder herpå fibrin til mindre nedbrydningsprodukter, hvorved koagulatet og dermed tromben opløses.

5.

HDL og LDL har forskellige densitet (HDL>LDL), størrelse (LDL>HDL) og masse LDL>HDL). På basis af forskel i masse og densitet kan lipoproteinerne derfor separeres ved henholdsvis ultracentrifugering og isopyknisk (gradient eller vægtfyldegrænse/flotation) centrifugering. Kromatografisk separaration kunne være gelfiltrering, hvor lipoproteiner pga af den forskellige størrelse vil vandre med forskellig hastighed (de største partikler vandrer hurtigst) i en søjlematriks. Ved eluering vil LDL derfor forventes at eluere før HDL.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2006 – side 11

Svar til Opgave 1

a.

Jern er en vigtig komponent i hæmproteinerne, myoglobin, hæmoglobin og cytochromer.

b.

I blodbanen transporteres jernioner som Fe3+ bundet til transferrin. Transferrin bindes til en receptor på celleoverfladen og trænger ind i cellen ved endocytose. Jernet benyttes til syntese af hæmproteiner eller oplagres i cellen bundet til ferritin eller hæmosiderin.

c.

Jernmangel fører til anæmi. Jernmangel opstår hvis jerntabet, der er ureguleret, er større end jernabsorptionen. Herved vil jerndepoterne blive tømt og mængden af jernholdige proteiner mindskes. Jernmangelanæmi kan være ernæringsmæssigt betinget (nedsat dannelse af hæmoglobin) eller fremkomme som følge af blødning (øget tab af hæmoglobin).

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2006 – side 12

Svar til Opgave 2

a.

Translationen af et plasmamembranprotein begynder i cytosol med dannelse af en Nterminal signalsekvens. Straks den er syntetiseret bindes en signal recognition particle (SRP) hertil, hvorved syntesen midlertidigt stopper. Herefter bindes SRP til SRPreceptoren på endoplasmatisk reticulum og ved genoptagelse af syntesen indsættes plasmamembranproteinet i membranen på endoplasmatisk reticulum.

b.

Det kan forklares ved N- og O-glykosylering, som finder sted i ER og Golgi-apparatet.

c.

Cytosolære proteiner syntetiseres og færdigfoldes, evt. ved hjælp af chaperoner i cytosol. Kerneproteiner syntetiseres og færdigfoldes, evt. ved hjælp af chaperoner i cytosol og transporteres herefter færdigfoldede ind i kernen. Enkelte mitochondrieproteiner syntetiseres i mitochondrien kodet af det mitochondrielle DNA, mens hovedparten af mitochondrieproteinerne syntetiseres i cytosol, transporteres gennem mitochondriemembranen i ufoldet tilstand, hvorefter de foldes, evt. ved hjælp af chaperoner i mitochondrien.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2006 – side 13

Svar til Opgave 3

a-c.

b.

Grupperne i ovenstående figur mærket (svag base) kan binde en proton.

c.

Hydrolyserbare bindinger er i ovenstående figur mærket med en pil.

d.

(Navne - fordres ikke: ammonium, nikotinat, ribose, dihydrogenphosphat og monohydrogenphosphat (i lige koncentrationer, da pH = pKs2), adenin)

e.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2006 – side 14

Svar til Opgave 4

a.

Glykogenlageret i muskelcellerne skal fungere som et lager af brændstofmolekyler forbeholdt muskelcellerne. (Muskelcellerne kan ikke afgive glukose til blodet. Glukose indbygget i glykogen beliggende i muskelvæv kan derfor kun afvendes af muskelvævet).

b.

Insulinkoncentrationen i blodet stiger i takt med en stigende blodglukosekoncentration. Insulin inducerer, at glukose-transportøren GLUT-4 mobiliseres til overfladen af muskelcellerne fra beliggenhed i intracellulære vakuoler. Ved eksponering på overfladen af muskelcellerne, kan GLUT-4 tillade adgang for glukose ind i muskelcellerne.

c.

Anvendelsen af glykogenlageret i leveren er helt anderledes end anvendelsen af glykogenlageret i muskelvæv. Glukosen fra glykogenlageret i leveren kan selvfølgelig forbrændes og skaffe leveren energi, men meget vigtigere er leverens evne til at frigive glukose til blodet i tilfælde af faldende blodglukose-koncentration (signaleret af glucagon). Her adskiller leveren sig altså væsentligt fra muskelvæv, der jo ikke kan frigive glukose til blodet.

d.

I leveren findes enzymet: glukose-6-fosfatase, som ikke findes i muskelceller. Dette enzym kan spalte fosfat af glukose-6-fosfat, hvorefter glukose kan forlade levercellerne til blodcirkulationen. (Bemærk, at fosforylerede glukoseintermediater ikke kan krydse plasmamembraner, hvorfor fraspaltningen af fosfat er helt essentiel). Glucagon virker via glucagonreceptorer på overfladen af levercellerne og signalerer til levercellerne, at blodglukosekoncentrationen er faldende, og at levercellerne skal frigive glukose til blodet.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2006 – side 15

Svar til Opgave 5

a.

Et onkogen er et gen, hvori aktiverende mutationer fremmer kræftudvikling ved at fremme celledeling eller hæmme apoptose. Et protoonkogen er det normale ikke-muterede onkogen.

b.

Vækstfaktorreceptorer vil dimerisere efter binding af en vækstfaktor og herved få aktiveret deres intracellulære tyrosinkinase aktivitet. Derved præsenteres fosfotyrosiner, som kan binde SH2-domæne-holdige faktorer og efterfølgende initiere intracellulære signalkaskader. Mutationer i vækstfaktorreceptorer, der gør dem konstitutivt aktive, vil kunne gøre receptorgenet til et onkogen, for eksempel ved at gøre tyrosinkinasen konstitutivt aktiv.

c.

Ras er et monomert G-protein, som er aktivt når det har bundet GTP. Aktivering af vækstfaktorreceptorer kan bevirke, at en exchange faktor (sos, skal ikke kunnes) aktiveres og udskifter GDP med GTP. GTP-ras vil nu aktivt bidrage til intracellulær signalering ved at fremme kinase aktivitet i den mitogen aktiverede kinase signalvej. Ras aktiviteten vil ophøre når ras’ endogene GTPase aktivitet har hydrolyseret det bundne GTP. Denne aktivitet kan fremmes af faktorer (gap, skal ikke kunnes). Mutationer kan konvertere ras genet til et onkogen, hvis de gør ras konstitutivt aktivt, for eksempel ved at ophæve den endogene GTPase aktivitet.

manan.dk

MEDICINSK BIOKEMI Aarhus Universitet

Januar 2006

Det sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Kandidateksamen

B IOKEMI MED KEMI Onsdag den 11. januar 2006, kl. 09:00 - 15:00 Atletion, Stadion Allé 70, Aarhus C.

Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver.

Som bilag er tilføjet en Tabel med navne på - og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner. På eksamensbordet er fremlagt et gult omslag påtrykt DET SUNDHEDSVIDENSKABELIGE FAKULTET samt gult kladdepapir og tre-farvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det tre-farvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2006 – side 2

Essayopgave.

Hæmostase og thrombose Et intakt kredsløb er vigtigt for transport af ilt, kuldioxid, næringsstoffer, mineraler, metaboliter og hormoner mellem organerne. Ved læsion af karbanen indtræder et hæmostatisk respons, hvorved blødningen standses, så massivt blodtab forhindres. Under normale omstændigheder kontrolleres processen så thrombose undgås. a. Redegør for hvordan thrombocytterne aktiveres ved karlæsion og beskriv, hvilken rolle de spiller i den initiale del af hæmostasen. Forklar herunder hvorfor acetylsalicylsyre (aspirin) kan bruges som forebyggende middel mod thrombose. b. Beskriv hvordan koagulationsprocessen aktiveres in vivo og forløber til dannelse af fibrin-koaglet. c. Redegør for virkningen af antithrombin (antithrombin III), protein C, protein S og tissue factor pathway inhibitor (TFPI). d. Redegør for hvordan det fibrinolytiske system aktiveres og inaktiveres. e. Redegør for hæmningen af koagulationen in vivo og/eller in vitro med warfarin (Kvitaminantagonist), heparin, EDTA og citrat. f. Giv en forklaring på at malabsorption kan medføre øget blødningstendens.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2006 – side 3

Opgave 1.

a.

Skriv den støkiometrisk afstemte reaktionsligning for fuldstændig forsæbning (basisk hydrolyse) af denne forbindelse.

b.

Carboxylsyregruppen, med gruppen Rc, tænkes erstattet af en phosphorsyregruppe. Skriv strukturformlen for denne forbindelse ved pH 7.4

c.

Til den i spørgsmål b. dannede forbindelse kobles henholdsvis 2-aminoethanol og serin (2-amino-3-hydroxypropansyre) med en esterbinding. Skriv strukturformlerne for disse to forbindelser ved pH 7.4

pKs-værdier: Ethanammoniumion Ethansyre, eddikesyre Phosphorsyre Phosphorsyrediestere Phosphorsyremonoestere Serin (sureste form)

10,63 4,76 2,15 7,20 ca. 1 ca. 1 ca. 6 2,20 9,30

12,38

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2006 – side 4

Opgave 2.

Det har vist sig, at HDL (high density lipoprotein) partikler indeholdende cholesterolestre giver et betydeligt bidrag til optagelsen af cholesterol i Leydig celler. a. Beskriv hvordan HDL skiver (discs) fyldes med cholesterolestre. b. Forklar hvordan syntese og sekretion af testosteron er reguleret i Leydig celler. c. Testosteron kan betegnes som et pro-hormon hvad angår androgen virkning i visse væv. Giv eksempler på sådanne væv, angiv hvordan det aktive hormon dannes, og forklar dets principielle virkningsmekanisme i målceller.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2006 – side 5

Opgave 3.

Thyroidea stimulerende hormon (TSH), kortisol og platelet derived growth factor (PDGF) binder til funktionelt forskellige receptorer. Giv en kort beskrivelse af de respektive receptortyper og skitser principperne i deres effektorfunktioner.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2006 – side 6

Opgave 4.

a.

Hvordan kan det forklares, at immunsystemet kan danne mere end 108 forskellige antistoffer, når det er estimeret, at det humane genom indeholder ca. 25.000 gener?

b.

Oprensede IgG antistoffer analyseres ved SDS-PAGE (natrium-dodecyl-sulfat polyacrylamid-gel-elektroforese) under henholdsvis reducerende og ikke-reducerende betingelser. Forklar princippet i SDS-PAGE og de forventede resultater af analyserne af IgG. 

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2006 – side 7

Opgave 5.

a.

En høj insulinkoncentration (høj insulin/glukagon ratio) øger fedtvævets optag af glukose. Glukosen har en helt central funktion i fedtcellerne. Beskriv denne funktion og forklar, hvorfor samme funktion er mindre vigtig i leveren.

b.

I leveren fremmer en høj insulin/glukagon ratio aktiviteten af acetylCoA karboxylase og (i det mindste indirekte) af citratlyase, mens β-oxidation hæmmes. Forklar de to enzymers funktion, hvordan β-oxidationen hæmmes, og hvorfor det sidste er hensigtsmæssigt i den givne situation.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2006 – side 8

Bilag.

DE 20 AMINOSYRER - VED PH 7,4

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2006 – side 9

Svar til Essayopgave.

a. Ved karlæsion blottes subendotheliale kollagenfibre, hvorved thrombocytterne aktiveres med eksponering af membranreceptorer. Thrombocytterne adhærerer herved til kollagen, direkte med receptoren glycoprotein Ia-IIa (GPIa-IIa) (ikke nævnt i bogen) og indirekte med receptoren glycoprotein Ib-IX (GPIb-IX) efter binding af von Willebrandfaktor (vWF). Aggregation af thrombocytterne på læsionsstedet foregår med membranreceptoren glycoprotein IIb-IIIa (GPIIbIIIa) efter binding af fibrinogen eller vWF. (Detaljeret redegørelse for receptornavne og virkning kræves ikke). Aktiveringen medfører endvidere tømning af indholdet i granula og frigivelse af de karkontraherende stoffer serotonin og thromboxan A2, der medvirker til at formindske blodtabet samt præsentation af faktorbindende, negativt ladede fosfolipider (eks.: fosfatidylserin) på thrombocytmembranens overflade. Aktiveringen af thrombocytten med eksponering af membranreceptorerne foregår delvis via aktivering af cyklooxygenasen og hermed syntese af thromboxan A2. Acetylsalicylsyre inhiberer cyklooxygenasen og hæmmer derved dannelse af thromboxan. b. Koagulationsprocessen starter når blodet efter en karlæsion kommer i kontakt med subendotheliale celler og dermed med vævsfaktor (tissue factor (TF), thromboplastin, faktor III), der udtrykkes af alle celler undtagen endothelceller og blodceller. Faktor VII, en koagulationsfaktor i plasma, bindes dels til vævsfaktor (III) og dels til den negativt ladede fosfolipidoverflade på thrombocytterne formidlet af Ca2+. Den nu aktive faktor VII (VIIa) katalyserer en begyndende omdannelse af både faktor X til Xa og faktor IX til IXa. Faktor Xa katalyserer derefter omdannelsen af prothrombin (II) til thrombin (IIa). Thrombin har en central rolle i koagulationsprocessen idet den bl.a. omdanner faktor VIII til VIIIa, der som cofaktor for faktor IXa medvirker til betydelig acceleration af omdannelsen af X til Xa. Endvidere katalyserer thrombin dannelse af uopløselige fibrinmonomerer fra det opløselige plasmaprotein fibrinogen og aktiverer transglutaminase (faktor XIII), der danner covalente bindinger mellem de enkelte fibrinmonomerer. c. For at sikre at koagulationsprocessen hurtigt fører til dannelse af en lokalt afgrænset hæmostatisk prop, der er i stand til at standse blødningen uden at okkludere karret helt, findes en række hæmmere af koagulationsprocessen, nemlig tissue factor pathway inhibitor (TFPI), antithrombin (III), protein C og protein S. TFPI bindes til vævsfaktor (III)/faktor VIIa komplekset og blokerer for yderligere aktivitet i den eksterne pathway. Antithrombin (III) har i sig selv en svag inhibitorisk effekt overfor thrombin, men ved binding til heparin øges hæmningen af thrombin og en række andre aktive koagulationsfaktorer, især Xa og IXa. Thrombin omdanner i starten cofaktorer, fx VIII til deres aktive forbindelser, og fremmer dermed koagulationsprocessen, men thrombin aktiverer også efter binding til membranproteinet thrombomodulin, protein C. Aktivt protein C, i kompleks med sin cofaktor protein S, nedbryder selektivt de aktiverede cofaktorer (Va og VIIIa). Thrombin hæmmer derved sin egen dannelse (negativt feedback). d. I det fibrinolytiske system aktiveres plasminogen til plasmin af plasminogenaktivatorer (PA, herunder tPA som produceres i endothelceller og uPA). Plasmin nedbryder fibrinkoaglet til fibrindegraderingsprodukter (FDP). Det fibrinolytiske systems aktivitet reguleres af plasminogen aktivator inhibitor type 1 (PAI-1), der inaktiverer PA, og α2-antiplasmin, der inaktiverer plasmin.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2006 – side 10

e. In vivo kan koagulationsprocessen hæmmes af K-vitamin antagonister (f.eks. warfarin), der hæmmer den posttranslatoriske carboxylering af visse glutamylsidekæder i en række proteiner, der syntetiseres i leveren, bl.a. koagulationsfaktorerne II, VII, IX og X. Heparin bindes til antithrombin (III) og potenserer dennes hæmning af ikke alene thrombin men også en række af de øvrige aktiverede koagulationsfaktorer. EDTA og citrat kan ikke benyttes in vivo, da de danner kompleks med Ca2+-ionerne, hvorved den ekstracellulære koncentration af Ca2+ nedsættes med fatale konsekvenser til følge, bl.a. øget risiko for tetani. In vitro kan EDTA og citrat anvendes, da de danner kompleks med Ca2+-ionerne, hvorved de hæmmer koagulationsprocessen. Heparin kan også anvendes in vitro, da det bindes til antithrombin (III), og komplekset hæmmer visse aktive faktorer. K-vitamin antagonisterne kan ikke bruges, da deres virkning er at hæmme dannelsen af visse koagulationsfaktorer i leveren. f. Ved kompromitteret lipidabsorption som følge af galdestase med deraf følgende mangel på galdesalte i tarmen eller ved visse malabsorptionssyndromer kan opstå mangel på bl.a. fedtopløselige vitaminer, herunder vitamin K. Vitamin K er cofaktor ved den posttranslatoriske carboxylering af glutamylsidekæder i den N-terminale del af en række proteiner i leveren, bl.a. koagulationsfaktorerne II, VII, IX og X. Ved mangel på vitamin K er der derfor en øget blødningstendens.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2006 – side 11

Svar til Opgave 1.

     

a. 

   

b. og c. 

   

 

 

 

 

 

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2006 – side 12

Svar til Opgave 2. a.

HDL dannes især i leveren som lipidfattige skiver, der optager cholesterol afgivet fra perifere celler. Derefter esterificeres cholesterolet ved en proces katalyseret af Lecithin:Cholesterol Acyl-Transferase (LCAT). (De nu sfæriske partikler (HDL-3) kan afgive en del af cholesterolestrene i bytte for triglycerider katalyseret af Cholesterol Ester Transfer Protein (CEPT)).

b.

Testosteron syntetiseres fra cholesterol, der er frigivet fra cholesterolestre katalyseret af cholesterol esterase eller evt. nysyntetiseret i cellerne. Det hastighedsbegrænsende trin ligger (som for cortisol) tidligt i syntesevejen, fortrinsvis ved omdannelsen af cholesterol til pregnenolon katalyseret af P450SCC (desmolase, CYP11A1), der stimuleres som følge af binding af LH til LH receptoren (og deraf følgende aktivering af adenylat cyklase). Leydig cellernes enzymer sørger nu for omdannelse af pregnenolon til testosteron, der diffunderer ud af cellen. Syntesehastigheden er på denne måde bestemmende for sekretionshastigheden.

c.

Eksempler er penis, scrotum, prostata, hårfollikler, hvor testosteron reduceres til dihydrotestosteron (DHT) (katalyseret af 5α-reduktase). DHT bindes som testosteron til en cytosolær receptor, hvorefter komplekset bindes til chromatin og fungerer som en transkriptionsfaktor. DHT er mere effektivt end testosteron, sandsynligvis fordi det binder med højere affinitet til den cytosolære receptor.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2006 – side 13

Svar til Opgave 3.

TSH binder til en G-protein associeret membranreceptor. Receptorer af denne type har syv transmembrane segmenter og en cytoplasmatisk C-terminal hale. Efter receptor:ligand interaktion binder receptoren et trimert G-protein, hvis α-kæde dissocierer, udskifter associeret GDP med GTP, og aktiverer specifikke membranassocierede enzymer (adenylat cyclase og/eller fosfolipase(r)). Aktivering af enzymerne fører derefter til generering af second messengers som cAMP og IP3 (for TSH drejer det sig om cAMP). Kortisolreceptoren tilhører gruppen af intracellulære (cytoplasmatiske eller nukleære) receptorer. Liganden diffunderer gennem cellemembranen og binder til receptoren inde i cellen. Binding ændrer receptorens konformation og gør den i stand til at entre nukleus hvor receptor:ligand komplekset binder til DNA og starter transkription af specifikke gener. PDGF-receptoren er en enkeltkædet membranreceptor med ét transmembrant segment og en cytoplasmatisk hale med tyrosinkinaseaktivitet. Binding af PDGF samler to receptorkæder til en homodimer og aktiverer dermed tyrosinkinaseaktiviteten. Resultater er fosforylering og aktivering af en række motiver i receptorhalen og dermed rekruttering og eller aktivering af forskellige adaptormolekyler (f.eks. Grb2) og enzymer (f.eks. GAP), som igangsætter den cytosolære signaleringskaskade (f.eks. via RAS og MAP-kinaser).

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2006 – side 14

Svar til Opgave 4.

a.

Forklaringen er genetisk rekombination, som er baseret på at både heavy (H) og light (L) chains i antistoffer er stykket sammen af variable og konstante gendomæner. De variable domæner i både H og L chains er kodet af en række gensegmenter, to for L chain (Variable og Junctional) og tre for H chain (Variable, Diversity og Junctional). Eksempelvis har heavy chain et stort antal loci (51 V segmenter, 27 D segmenter og 6 J segmenter), der ved omarrangering af genet (genetisk rekombination) kombineres til et gen, der er specifikt for den enkelte B celle. Dette kobles så ved RNA splejsning sammen med det konstante domæne. Denne form for rekombination af gener giver i sidste ende mulighed for at generere en stor mængde af specifikke antistoffer.

b.

SDS-PAGE er en metode hvor proteiner separeres efter størrelse i en acrylamid gel. Da det negativt ladede SDS binder til proteinerne relativt til deres størrelse, vil de i et elektrisk felt bevæge sig mod plus polen. I acrylamid gelen vil de små proteiner vandre hurtigst. Antistoffer (herunder IgG) består af to ens heavy chains og to ens light chains. Deres respektive molekylevægt er ca. 50 kDa og ca. 23 kDa. Disse 4 kæder er bundet kovalent med disulfid bindinger, og en ikke-reducerende gel vil derfor kun give et bånd på ca. 146 kDa. Under reducerende betingelser vil disulfid bindingerne brydes, og SDS gelen vil derfor vise to bånd på henholdsvis 23 kDa og 50 kDa.

 

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2006 – side 15

Svar til Opgave 5.

a.

Modsat levervæv er fedtvæv ikke i stand til at fosforylere glycerol. Når insulin/glukagon ratioen er høj optager fedtvævet betydelige mængder fedtsyrer til oplagring. Fedtet oplagres primært som triglycerider. Da vævet ikke selv kan syntetisere den nødvendige glycerolfosfat ud fra glycerol er fosfotrioser fra glykolysen en afgørende forsyningskilde.

b.

Citratlyasen spalter citrat under gendannelse af acetylcoA og karboxylasen omdanner acetylcoA til malonylcoA – det første trin i fedtsyresyntesen. De to enzymer danner med andre ord basis for leverens syntese og eksport af fedtsyrer i ’overskudssituationer’ (f.eks. måltider).   En høj insulin/glukagon ratio og malonylcoA hæmmer i forening ’carnitinslusen’ (carnitintransferasen/CPTy, dannelsen af acylcarnitin) og dermed adgang til mitochondrierne og β-oxidationen. Logikken er naturligvis at man i overskudssituationer producerer fedt til eksport og opbevaring (i fedtvæv) og ikke til forbrænding. 

manan.dk

MEDICINSK BIOKEMI Aarhus Universitet

Juni 2005

Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Kandidateksamen

B IOKEMI MED KEMI Onsdag den 15. juni 2005, kl. 09:00 - 15:00 Skøjtehallen, Gøteborg Allé, 8200 Århus N.

Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver. Som bilag er tilføjet en Tabel med navne på - og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner. På eksamensbordet er fremlagt et gult omslag påtrykt DET SUNDHEDSVIDENSKABELIGE FAKULTET samt gult kladdepapir og trefarvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det trefarvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2005 – side 2

Essayopgave

Hæmoglobin

1.

Beskriv strukturen af myoglobin og hæmoglobinerne HbA1 og HbF samt vigtige interne bindinger i disse proteiner.

2.

Beskriv kort iltbindingen til HbA1 og HbF samt angiv hvordan allosteriske modulatorer påvirker bindingen. Beskriv kort hvorledes ophold i områder med lav ilttension på kort og lang sigt vil påvirke blodets iltmætning og iltbindingskapacitet.

3.

Nævn eksempler på sygdomme, som beror på genetisk betingede forhold, som påvirker hæmoglobins fysisk-kemiske egenskaber eller som påvirker det enzymatiske apparat for hæms syntese. Forklar kort for sidstnævnte omstændighed, hvordan forhold vedrørende regulation af hæmsyntesen medvirker til sygdommen.

4.

Beskriv hæms katabolisme og forklar kort hvilke metaboliske produkter af hæm der kan ses forøget i plasma ved nedenstående tilstande. Nævn for disse et protein (syntetiseret i leveren) som typisk vil have markant ændret plasma koncentration, og som kan være en af de parametre man måler ved undersøgelse af årsag til gulsot (icterus). Forklar kort hvorfor proteinerne har ændret plasma koncentration. a. Øget destruktion af erytrocytter i blodet (hæmolyse). b. Obstruktion af galdeveje.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2005 – side 3

Opgave 1

Triglycerid i serum bestemmes ved først at hydrolysere triglyceriderne med lipase, og derpå bestemme glycerol-koncentrationen ved en enzymatisk spektrofotometrisk metode. Til 2,000 mL af en reaktionsblanding, indeholdende enzymerne lipase, glycerolkinase, pyruvatkinase og lactatdehydrogenase foruden en katalytisk mængde af ATP samt overskud af phosphoenolpyruvat og NADH2, sættes en 20 µL serumprøve. Absorptionen af reaktionsblandingen før tilsætning af serumprøven var 0,315 ved 365 nm. Efter tilsætning af serumprøven falder absorptionen til 0,115 (slutværdi). Absorptionen af 1,000 mol L–1 opløsning af NADH2 ved 365 nm er 3,4 x 103. Ved alle målinger anvendes kuvetter med 1 cm lysvej. 1.

Skriv reaktioner, der viser, hvordan man kan koble hydrolyse af triglycerid til et forbrug af NADH2.

2.

Beregn koncentrationen af triglycerid i serumprøven. Angiv resultatet i mol/L.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2005 – side 4

Opgave 2

Under langvarig faste syntetiserer leveren glucose i gluconeogenesen, og glucosen eksporteres til blodet, hvormed det sendes til ekstrahepatiske væv.

1.

Angiv gluconeogenesens subcellulære lokalisering og angiv de metabolitter, som leveren anvender i gluconeogenesen, og som bidrager med kulstofskelettet til glucose.

2.

Mens gluconeogenesen forløber, dækker leveren sit energibehov ved fedtforbrænding. Dette fører til en stærkt øget mængde mitochondrielt acetyl CoA i levercellerne. Beskriv – evt. med angivelse af reaktionsskemaer – hvorledes dette er med til at fremme gluconeogenesen. De vigtigste enzymer i denne forbindelse skal nævnes.

3.

Beskriv hvad leveren gør med den overskydende mængde af mitochondrielt acetyl CoA, og hvorledes dette kan medvirke til at nedsætte de ekstrahepatiske vævs behov for, at leveren syntetiserer glucose i gluconeogenesen.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2005 – side 5

Opgave 3

1.

Angiv 3 aminosyrer, hvorfra kan dannes hormoner/neurotransmittere ved decarboxylering af α-carboxylgruppen som eneste eller sidste led i syntesen, og angiv de fra aminosyrerne dannede produkter.

2.

Beskriv de væsentligste virkninger af mindst to af disse hormoner/neurotransmittere.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2005 – side 6

Opgave 4

Proteinkodende geners ekspression er underkastet en lang række af regulatoriske trin. Det første trin er initieringen af transkriptionen, der bl.a. involverer et antal cis-acting og trans-acting elements. 1.

Giv en kortfattet beskrivelse af de elementer, der er involveret i transkriptionsinitieringen og giv herunder eksempler på cis- og trans-acting elements.

2.

Forklar kort hvordan steroidhormoner kan øge transkriptionen af et steroidfølsomt gen.

3.

Angiv tre trin, hvori et gens ekspression principielt kan reguleres efter transkriptionsstart (posttranskriptionelt) til det færdige funktionsduelige protein.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2005 – side 7

Opgave 5

1.

Hvor og hvordan optages calcium i mave-tarmkanalen?

2.

Nævn to biologiske markører for øget osteoblastaktivitet og deres funktion in vivo (hvis den er kendt).

3.

To patienter, A og B, lider af funktionel hypoparathyroidisme, selvom de begge er i stand til at syntetisere normalt PTH. Før behandling har A en meget lav koncentration af magnesium og PTH i serum, mens B har en meget høj PTH koncentration og et normalt serum-magnesium. Efter intravenøs indgift af eksogent PTH stiger A’s udskillelse (urin) af fosfat og cAMP akut, mens B’s udskillelse er uændret. Foreslå og begrund en årsag til de to patienters lidelser.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2005 – side 8

Bilag

DE 20 AMINOSYRER - VED PH 7,4

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2005 – side 9

Svar til Essayopgave

1. Myoglobin er et enkeltkædet protein (ca 150 aminosyre langt – længde ikke pensum), som binder den prostetiske gruppe hæm. Proteindelen består primært af alpha-helix strukturer. Hydrofobe aminosyrer danner en hydrofob ’lomme’, hvortil hæm bindes. Hæmmolekylet består af en porfyrinring med en komplekst bundet ferroion (Fe2+). Alle humane hæmoglobiner herunder HbA og HbF er tetrameriske proteiner bestående af fire subunits, som hver har strukturel lighed med og samme størrelse som myoglobin. HbA1 består af to alpha- og to betaunits og HbF af to alpha- og to gammasubunits. Hver subunit er i kontakt med de tre andre subunits. Bindingerne mellem subunits er non-kovalente (hydrogenbindinger og elektrostatiske bindinger). Hver subunit binder hæm, som er identisk med hæmmolekylet i myoglobin. 2. O2 bindes til Fe2+ i hæm, dvs der kan bindes fire iltmolekyler per hæmoglobin. Bindingen af O2 medfører konformationelle forandringer i hæmoglobin, herunder ændring af subunitsbindinger og positionering samt hæmmolekylernes orientering. Dette øger iltaffiniteten, hvilket ses af oxyhæmoglobins dissociationskurve, som har en sigmoid form (binding af ilt til hæmoglobin plottet som funktion af den partielle ilttension). Allosteriske modulatorer er H+, CO2 og DPG, som bindes til hæmoglobin. Disse modulatorer inducerer konformationelle ændringer (allosteriske effekter) som nedsætter affiniteten af O2 til hæmoglobin, og fører til en højreforskydning af oxyhæmoglobins dissociationskurve. HbF adskiller sig fra HbA1 ved at have en højere affinitet for O2. Dette skyldes især, at DPG bindes med lavere affinitet til HbF end til HbA1. En lav ilttension medfører alt andet lige en mindre iltmætning af hæmoglobin. Der sker dog momentant en stimulation af respirationen, hvorved pCO2 falder og pH stiger, hvilket venstreforskyder oxyhæmoglobins dissociationskurve og bidrager til øget iltaffinitet og iltmætning. På kort sigt er hæmoglobin koncentrationen og dermed iltbindingskapaciteten uændret. På længere sigt vil en lavere ilttension inducere en øget syntese af DPG, som nedsætter hæmoglobins iltaffinitet og dermed faciliterer afgivelsen af O2 til vævene. Ved ophold ved lav ilttension induceres endvidere sekretion af erytropoitin i nyrene, hvorved erytropoiesen stimuleres, og koncentrationen af hæmoglobin og dermed iltbindingskapiciteten stiger. 3. Ved seglcelleanæmi og forskellige andre hæmoglobinopatier er der mutationer i genet for hæmoglobin, hvilket ændrer primærstrukturen af hæmoglobin. Dette kan forårsage ændringer i hæmoglobinets opløselighed, iltbindingsevne (og erytrocyttens stabilitet – ikke pensum). Ved mutationer eller andre defekter i enzymkodende gener der regulerer syntesen af hæm, vil ineffektive eller defekte enzymer føre til ophobning af porfyrinmellemprodukter i syntesevejen (sygdommen porfyri). Porfyrin syntetiseres ud fra glycin og succinylCoA, hvor hæm hæmmer aktiviteten af det regulerende enzym (aminolevulinat syntase – enzymnavn er ikke pensum). Hvis syntesen af hæm er hæmmet, er denne negativ feedback regulation mindre effektiv, hvilket øger syntesen af det ophobede mellemprodukt.

4. Hæm stammer primært fra hæmoglobin i aldrende erytrocytter, som optages og nedbrydes i mononukleære celler. Hæm omdannes til biliverdin (enzym hæm oxygenase – enzymnavn er

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2005 – side 10

ikke pensum) og derpå til bilirubin (enzym biliverdin reduktase – enzymnavn er ikke pensum).. Bilirubin er et gult ikke vandopløseligt molekyle som transporteres til leveren ved hjælp af albumin, hvortil bilirubin bindes. Den fortsatte metabolisme af bilirubin sker i leveren (hepatocytter), hvor bilirubin primært konjugeres med glucoronat til bilirubin-diglucoronid, som er vandopløseligt og udskilles i galden. I tarmen omdannes bilirubin-diglucoronid af bakterier til stercobilinogen/urobilinogen som herpå oxideres til stercobilin/urobilin. Dette slutprodukt udskilles enten direkte med fæces eller afgives til blodet, hvorefter det via nyrene udskilles i urinen eller via leveren til galden. a. Ved øget destruktion af erytrocytter vil der ske en øget hæmmetabolisme og dermed bilirubin produktion. Blodets koncentration af ukonjugeret bilirubin vil derved stige, og hvis denne koncentration kommer over et vist niveau, vil der optræde gulfarvning (icterus) af huden. I blodet vil haptoglobin koncentrationen falde, da haptoglobin binder hæmoglobin og herefter omsættes. b. Ved obstruktion af galdevejene vil udskillelsen af konjugeret bilirubin være kompromitteret, og konjugeret bilirubin vil udskilles til blodet, hvor det vil være markant forhøjet. Galdegangsepitelet vil være påvirket og der vil være lækage til blodet af forskellige proteiner herunder enzymer som basisk (alkalisk) fosfatase og gamma-glutamyl transferase. Disse vil derfor have en forhøjet koncentration i plasma.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2005 – side 11

Svar til Opgave 1

1.

Af nedenstående skema ses, at hydrolyse af 1 triglycerid medfører oxidation af 1 NADH2.

2.

I reaktionsblandingen er der overskud af phosphoenolpyruvat og NADH2, hvorfor slutpunktmålingen skyldes det overskydende NADH2 efter fuldstændig hydrolyse af triglycerid. ∆ Absorption = 0,315 – 0,115 = 0,200 ∆ [NADH2]

=

0,200

ved 1 cm lysvej

= 5,882 × 10 mol L–1 –5

−1

3400 mol L

eller 5,882 × 10 mol L–1 × 0,00202 L = 1,188 × 10–7 mol NADH2 omsat i reaktionsblandingen eller 1,188 × 10–7 mol triglycerid i 20 µL serum –5

[Triglycerid] =

1,188 × 10−7 mol −6

20 × 10

L

= 5,94 × 10–3 mol L–1

i serum

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2005 – side 12

Svar til Opgave 2

1. Gluconeogenese foregår fortrinsvis i leveren. Gluconeogenese foregår dels i cellernes mitochondrier, og dels i cellernes cytosol. Leveren forsynes med kulstofskeletter via lactat, aminosyrer (primært alanin) og glycerol. 2. En øget mængde mitochondrielt acetyl CoA vil hæmme pyruvat dehydrogenase, der katalyserer omdannelsen af pyruvat til acetyl CoA i mitochondrierne. Pyruvat kan eksempelvis dannes udfra lactat og visse aminosyrer, som jo netop er udgangspunktet for gluconeogenesen. En øget mængde mitochondrielt acetyl CoA vil samtidig aktivere pyruvat carboxylase, der katalyserer omdannelsen af pyruvat til oxaloacetat. Dette er netop første skridt på vejen fra pyruvat hen mod glucose i gluconeogenesen. Herved fremmer den fedtforbrænding, der forsyner levercellerne med energi og som er strengt nødvendig, mens leveren syntetiserer glucose i gluconeogenese, netop gluconeogenesen. Reaktionerne ses i lærebogens figur 13.3:

Pyruvat + CoA + NAD → Acetyl CoA + NADH2 + CO2 (katalyseres af pyruvat dehydrogenase, der hæmmes af acetyl CoA)

Pyruvat + CO2 + ATP + H2O → Oxaloacetat + ADP + Pi + 2H+ (katalyseres af pyruvat carboxylase, der aktiveres af acetyl CoA). 3. Leveren bruger det overskydende acetyl CoA til at syntetisere ketonstoffer. Disse syntetiseres udelukkende i leveren. Leveren kan dog ikke selv katabolisere disse stoffer, hvorfor de eksporteres til ekstrahepatiske væv. Her spaltes de atter i de acetyl CoA enheder, de er opbygget af, og disse acetyl CoA enheder kan så forbrændes i TCA cyklus og hermed bidrage til energiproduktionen i de ekstrahepatiske væv. Dette nedsætter samtidigt behovet for glucose som brændstofmolekyle. Eksempelvis kan hjernen, der ellers er storforbruger af glucose, bruge ketonstoffer som brændstof. Dette er vigtigt, idet behovet for nedbrydning af muskelproteiner til aminosyrer (som kan anvendes i gluconeogenesen) derved holdes nede.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2005 – side 13

Svar til Opgave 3

1. a. b. c. d.

Glutamat decarboxyleres til GABA Histidin decarboxylers til histamin Tyrosin decarboxyleres til dopamin (efter forudgående hydroxylering) Tryptofan decarboxyleres til serotonin/5-hydroxytryptamin (efter forudgående hydroxylering).

2. a. b.

c.

GABA er den mest udbredte inhibitoriske transmitter i hjernen, hvor den opererer både via ionotrope og metabotrope receptorer. Dopamin styrer som hypothalamisk hormon sekretionen af prolactin ved at hæmme dettes syntese og sekretion. Der er adskillige dopaminerge nerver i CNS, herunder især i basalganglier. Aktivering af dele af det dopaminerge system er forbundet med lystfornemmelse. (Manglende funktion af dopaminerge nerver kan medføre Parkinsons syge). Serotonin er en væsentlig transmitter i hjernen og har bl.a betydning for stemningslejet.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2005 – side 14

Svar til Opgave 4

1. Cis-acting elements er DNA motiver, der er lokaliseret på samme DNA streng som det gen, der skal transkriberes. Transkriptionsinitieringen er betinget af, at RNA polymerase II bindes til promoterregionen (cis-acting) i den rigtige orientering. Promoterregionen indeholder en række sekvensmotiver, fx TATA boksen, CAAT boksen og GC boksen (alle cis-acting). Til disse elementer bindes de generelle transkriptionsfaktorer (trans-acting elements) bl.a. TBP (TATA bindende protein) og sørger for den rigtige orientering af RNA polymerase II.

2. I cytosol findes steroidhormon receptorer. Det steroide hormon bindes til en steroidhormon receptor og danner en transkriptionsfaktor. Komplekset af hormon og receptorprotein transporteres til nucleus og bindes til et regulatorisk område på DNA’et (steroid responselement) hvorfra genets transkription aktiveres ved øgning af antallet af transkriptionsinitieringer pr. tidsenhed.

3. Efter transkriptionsinitieringstrinnet kan et gens ekspression principielt reguleres ved: a. splejsningstrinnet hvorved præ-mRNA omdannes til mRNA b. substitution af N-baser (RNA editering) c. transporten af mRNA fra nucleus til cytosol d. mRNA stabilitet e. translationsinitieringstrinnet f. modifikation af proteinet (posttranslatorisk modifikation)

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2005 – side 15

Svar til Opgave 5

1. Calcium optages aktivt i duodenum via en energikrævende og 1,25 vit.D reguleret transport. I jejunum og ileum sker optagelsen ved passiv diffusion. Derudover er der et mindre passivt optag fra colon. 2. a.

b.

c.

Knoglespecifik alkalisk fosfatase, som syntetiseres af osteoblasterne, tjener til at hydrolysere pyrofosfat. Derved fjernes pyrofosfatens hæmmende virkning på dannelsen af hydroxyapatit. N- og C-terminale prokollagen ekstensionsmolekyler. Aktivering af osteoblaster medfører en øget kollagensyntese. Kollagen syntetiseres med N- og C-terminale propeptider, som i modsætning til det mature kollagen er normalt glykosyleret og uden den karakteristiske GlyX-Y sekvens. Propeptiderne indgår derfor ikke i kollagenmolekylets typiske tripelhelix og forhindrer dannelsen af mikrofibriller, mens proteinet stadig befinder sig i cellens syntesevej. Propeptiderne fraspaltes først når molekylet har forladt cellen og de fraspaltede N- og C-terminale peptider frigives derfor til omgivelserne sideløbende med maturt kollagen. Osteocalcin, hvis præcise funktion ikke er kendt.

3. A’s lave serumniveauer af magnesium og PTH kombineret med et normalt respons på eksogent PTH er foreneligt med nedsat frigivelse af PTH p.g.a. magnesiummangel. B’s høje (kompensatoriske) serumkoncentration af PTH og den manglende stigning i urin-cAMP efter eksogent PTH, passer med en receptordefekt i målorganet.

manan.dk

MEDICINSK BIOKEMI Aarhus Universitet

Januar 2005

Det sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Kandidateksamen

B IOKEMI MED KEMI Onsdag den 12. januar 2005, kl. 09:00 - 15:00 Atletion, Stadion Allé 70, Aarhus C.

Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver.

Som bilag er tilføjet en Tabel med navne på - og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner. På eksamensbordet er fremlagt et gult omslag påtrykt DET SUNDHEDSVIDENSKABELIGE FAKULTET samt gult kladdepapir og tre-farvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det tre-farvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2005 – side 2

Essayopgave.

Fordøjelse, absorption og metabolisme af triglycerider (triacylglyceroler) Besvarelsen skal indeholde redegørelser for: 1.

Fordøjelse, absorption og afgivelse af triglycerider (TG) til blodbanen, samt for de hormoner, der er vigtige for fordøjelsen af oralt indtaget TG.

2.

Forekomst og metabolisme af TG i blodet i den postprandiale fase efter et større måltid med ca. 35% af energien i fedt – herunder for hormonal regulering af metabolismen.

3.

Metabolisme af TG i organismens fedtdepoter i den postabsoptive fase (6-12 timer efter måltidet) – herunder for hormonal regulering.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2005 – side 3

Opgave 1.

Nedenstående forbindelser anvendes som sødemidler i madvarer.

a.

Markér de bindinger, der kan brydes ved hydrolyse.

b.

Skriv strukturformler for produkterne efter sur hydrolyse (pH 1).

c.

Hvilket sødemiddel bør ikke indtages af personer, der lider af Phenylketonuri (også kaldet PKU eller Føllings sygdom)? Begrund svaret.

d.

Angiv mulige nedbrydningsprodukter, der kan forekomme i urinen hos de under (c.) nævnte personer, hvis de alligevel indtager det pågældende sødemiddel.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2005 – side 4

Opgave 2.

Aktiviteten af lactatdehydrogenase (LDH) i en serumprøve kan bestemmes ved at måle de initiale reaktionshastigheder ved to forskellige koncentrationer af pyruvat, idet den LDHkatalyserede reaktion kan antages at følge Michaelis-Menten kinetik: Michaelis-Menten ligningen: V0 =

Vmax × [S]0 KM + [S]0

Til 2 kuvetter (med 1,00 cm lysvej) hver indeholdende 2,90 mL fosfatbuffer, hvori er opløst pyruvat og NADH2, sættes 0,100 mL af serumprøven. Umiddelbart efter blanding måles ved 340 nm de initiale ændringer i reaktionsblandingernes absorption som funktion af tid (∆A340 min–1). Det oplyses, at en NADH2-opløsning med koncentrationen 1,00 mol L–1 har en absorption ved 340 nm på 6300, når lysvejen er 1 cm. Samhørende værdier af pyruvatkoncentrationer og ∆A340 min–1 er: pyruvatkoncentration

∆A340 min–1

0,20 mmol L–1 0,30 mmol L–1

– 0,036 – 0,042

a.

Skriv ligning for den LDH-katalyserede reaktion.

b.

Beregn KM og Vmax for LDH i prøveopløsningen (kuvetten).

c.

Beregn LDH-aktiviteten i serum – som µmol L–1 min–1.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2005 – side 5

Opgave 3.

a.

Beskriv kortfattet opbygningen af et ekstracellulært glycoprotein (N-bundet kulhydrat), og hvordan kulhydratdelen af et sådant glycoprotein dannes.

b.

Forklar - med henvisning til kulhydratdelens specifikke funktioner - hvorfor lysosomale enzymer er glycoproteiner.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2005 – side 6

Opgave 4. Hæmoglobin er en tetramer, der normalt består af to ens α-kæder og to ens β-kæder. β-globin genet koder for β-kæden i det normale hæmoglobin. Nedenfor er vist et stykke af genet omkring promoterregion og startkodon. DNA sekvensen i dette stykke er analyseret for tilstedeværelsen af fire restriktionsendonukleasesites, MstII, EcoRI, EcoRV og BamHI. Genkendelsessekvenserne for disse enzymer er: MstII: CCTNAGG (hvor N angiver, at det kan være hvilken som helst af de fire nukleotider, A, G, C eller T); EcoRI: GAATTC; EcoRV: GATATC og endelig BamHI: GGATCC. Det nedenfor viste fragment af det normale β-globin gen indeholder således kun seks sites, hvor en af disse fire restriktionsendonukleaser kan kløve DNA'et som angivet på skitsen af den kodende streng. Tallene angiver hvor mange nukleotider, der er mellem hvert restriktionssite.

Seglcelleanæmi skyldes en enkelt mutation i den transkriptive del af genet, hvor en A er muteret til T i den 6. codon. Det tilsvarende DNA stykke (kodende streng) hos en patient med seglcelleanæmi er således identisk med DNA stykket hos normale bortset fra denne A til T mutation som angivet nedenfor.

a.

Giv forslag til en RFLP-analyse ("restriction fragment length polymorphism"), hvormed man kan diagnostisere seglcelleanæmi. Besvarelsen skal indeholde hvilke(t) restriktionsendonuklease(r), der skal anvendes, forslag til probens omtrentlige placering på DNA-stykket samt størrelse(n) af de(t) fragment(er), der ses ved analysen hos en normal person, hos en heterozygot samt hos en homozygot.

b.

Til hæmoglobinets normale funktioner hører reversibel binding af O2 og CO2. Hvordan bindes disse to forbindelser til hæmoglobinmolekylet?

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2005 – side 7

Opgave 5.

Hurtigt voksende celler har brug for rigelig forsyning af TTP (deoxyribothymidintrifosfat) til syntese af DNA. Disse cellers følsomhed over for inhibition af TTP syntese kan derfor udnyttes ved behandling af cancer. a.

Gør rede for omdannelsen af dUMP til TMP.

b.

Beskriv hvorledes syntesen af TTP specifikt kan inhiberes ved anvendelse af substrat analoger.

c.

Hvilke bivirkninger medfører inhibition af TTP syntese ved cancerbehandlıng?

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2005 – side 8

Bilag.

DE 20 AMINOSYRER - VED PH 7,4

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2005 – side 9

Svar til Essayopgave.

1. Hydrolyse af TG starter i beskedent omfang i mundhulen, katalyseret af lipase i spyt. I ventriklen fortsætter hydrolysen (stadig beskeden) katalyseret af gastrisk lipase. Ventriklens peristaltik og det forhold, at de frigivne fedtsyrer fungerer som "surfactanter", fører til dannelse af en fedtemulsion. Fosfolipider og fedtsyrer indtaget i kosten sammen med TG understøtter denne proces. Lipid emulsionen injiceres som sur chymus til duodenum, hvor hovedparten af fordøjelsen fınder sted på grund af sekretion af såvel galdesalte som pancreatisk lipase. Galdesalte er flade molekyler med en hydrofob og en hydrofil side og lægger sig derfor på overfladen af de emulgerede lipiddråber, hvor de forankrer pancreatisk lipase samt en co-lipase, der er nødvendig for katalytisk aktivitet. I duodenum og videre i jejunum hydrolyseres TG fortrinsvist til fedtsyrer og monoacylglycerol (2-MAG). Galdesalte på overfladen af lipiddråber er i ligevægt med frie galdesalte, der danner miceller med hydrolyseprodukter og fosfolipider (blandingsmiceller). Micellerne (ca. 50 nm) med galdesaltene og fedtstoffernes hydrofıle grupper vendende udad er vandopløselige og kan diffundere igennem den vandhinde ("unstirred layer"), der omgiver enterocytter. Fra micellerne afgives fedtsyrer og monoacylglycerol, der diffunderer ind i enterocytterne. Kort- og mellemkædede fedtsyrer (mindre end C12) afgives til v. porta, mens langkædede fedtsyrer og monoacylglycerol genopbygges til TG i enterocytter. Sekretionen af galde stimuleres af cholecystokinin, der også stimulerer sekretion af pancreas lipase. Cholecystokinin sekretionen stimuleres af fedtsyrer i chymus. Sekretion af vand og hydrogencarbonat, der er nødvendig for etablering af det alkaliske pH i tarmen, stimuleres af sekretin, hvis væsentligste sekretionsstimulus er den sure chymus. Den vigtigste "pathway" for resyntese af TG i enterocytter involverer 2-MAG og de langkædede fedtsyrer, idet en mindre del syntetiseres de novo fra glycerol (fosfatidsyre-pathway). Acyl-CoA syntetiseres i enterocytter, katalyseret af acyl-CoA synthase. Resyntese af TG sker i forbindelse med det ru endoplasmatiske reticulum, hvor der desuden sker syntese af apolipoprotein B48 (apoB48). Den secernerede partikel, chylomicronen, består overvejende af TG og cholesterolestere i den centrale del, fosfolipider og cholesterol på overfladen, samt apoB48, der er vundet omkring partiklen. Andre lipofile stoffer følger med, herunder lipofile vitaminer. Chylomicroner secerneres til Iymfen og når blodbanen via ductus thoracicus.

2. I blodet passerer de TG-rige chylomicroner endothelceller, eksempelvis i fedtvæv, med lipoprotein lipase (LpL) bundet til proteoglycaner på celleoverfladen. LpL (med hjælpeproteiner) hydrolyserer en del af TG, og partiklen kaldes nu en chylomicron-rest (remnant). Samtidig forsynes partiklens overflade med apolipoproteiner, herunder apoE, via udveksling med andre lipoproteiner. Chylomicron-resten kan nu binde sig til endocytiske receptorer som LDL-receptor (apoB100 / E receptor), og hovedparten optages i leveren ved receptor-medieret endocytose. Chylomicronrester "cleares" på denne måde ret hurtigt, og leveren tilføres TG, der sammen med nysyntetiseret TG indgår i VLDL secerneret fra leveren.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2005 – side 10

De til blodet afgivne langkædede fedtsyrer bindes til og transporteres af serum albumin. En del bliver oxideret f.eks. i skeletmuskulatur og hjerte. I den postprandiale fase bliver en betydelig del optaget i fedtvæv og forestret til TG via glycerol-3-fosfat dannet fra glukose. De TG-rige VLDL partikler secerneret fra leveren leverer fedtsyrer til forskellige væv. Det sker, som for chylomicronrester, efter hydrolyse af TG medieret af LpL (evt. hepatisk lipase), under dannelse af VLDL-rester (evt. betegnet IDL). VLDL og VLDL-rester indeholder en række apolipoproteiner, hvoraf de vigtigste er apoB100 og apoE. Efterhånden som VLDL rester formindskes, får apoB 100 og apoE den rette konformation for binding til LDL-receptoren, og en del optages i leveren. Andre partikler når at blive næsten tømt for TG (og mister apoE), og de betegnes nu som LDL partikler, hvis hovedfunktion er at levere cholesterol/cholesterolestre til perifere væv. En stor del optages imidlertid i leveren via apoB100 og LDL receptoren, hvilket sammen med optagelsen af VLDL-rester kan betragtes som et "overflow" system, der yder en vis beskyttelse mod høje LDL koncentrationer i blodet. Sideløbende hermed optages noget TG i væv, specielt leveren, ad anden vej. Det sker ved, at HDL (rige på cholesterolestre - såkaldt HDL3; disse er dannet fra "tomme" HDL skiver (præbeta HDL)), der optager cholesterol fra perifere væv, hvorefter dette esterifıceres af LCAT) udveksler cholesterolestre med TG i VLDL og VLDL-rester (samt chylomikroner og deres rester). Denne proces er faciliteret af CETP*. Det nu TG-holdige HDL (HDL2) optages under indvirken af specifikke receptorer fortrinsvist i leveren. Insulin er det afgørende hormon i den postprandiale fase, mens koncentrationerne af glucagon og andre anti-insulinære hormoner er lave. Insulinsekretionen stimuleres af stigning i blodglukose efter måltidet og af visse tarmhormoner. De centrale insulinvirkninger af betydning i TG metabolisme er øget udtryk af LpL, øget produktion af VLDL samt øget optagelse af glukose eksempelvis i fedtceller, hvilket faciliterer dannelse af depot TG. På denne måde kommer sammensætningen af fedtsyrer i fedtcellernes TG til i væsentlig omfang at reflektere de med kosten indtagne fedtsyrer.

3. Den postabsorptive fase er karakteriseret ved en høj glucagon / insulin ratio, hvilket medfører stimulering af den hormonsensitive lipase i fedtceller. Samtidig nedsættes fedtcellernes glukose permeabilitet (nedsættelse af Glut4 i plasmamembranen), og dermed dannelse af glycerolfosfat til forestring. Hydrolysen af TG fører til afgift af fedtsyrer der, med albumin som transportvehikel, optages og oxideres eksempelvis i skeletmuskulatur og hjerte. Det fra fedtvævet frigivne glycerol yder - sammen med laktat og alanin / glutamin fra muskler - et væsentligt bidrag til gluconeogenese i leveren, der er ansvarlig for ca. 30% af leverens afgift af glukose og dermed for opretholdelse af blodsukkeret. Ketogenese i leveren, der forårsages af relativt lave koncentrationer af oxaloacetat i mitochondrierne og dæmpning af TCA cyclus samtidig med et stort tilbud af acetyl-CoA, er endnu minimal, og det samme gælder gluconeogenese i nyrerne.

*) Note: CETP ikke nævnt i målfortegnelsen.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2005 – side 11

Svar til Opgave 1.

a.

b.

c.

Aspartam må ikke indtages af personer med Phenylketonuri (Føllings sygdom). Aspartam spaltes i organismen til asparaginsyre (Asp) og phenylalanin (Phe). Ved nedsat aktivitet af enzymet phenylalaninhydroxylase kan Phe ikke metaboliseres som normalt via tyrosin, hvorfor der ophobes Phe og unormale katabolitter (se d.), og der kan eventuelt opstå mangel på tyrosin.

d.

Navnet Phenylketonuri refererer til unormale katabolitter af phenylalanin: phenylpyruvat (fenylpyrodruesyre) og phenyllactat (fenylmælkesyre).

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2005 – side 12

Svar til Opgave 2. Pyruvat + NADH2 → Lactat + NAD

a.

LDH katalyserer den reversible reaktion:

b.

pyruvatkoncentration ∆A340 min–1

∆[NADH2] mol L–1 min–1

V0 mol L–1 min–1

0,20 mmol L–1 0,30 mmol L–1

– 5,714 × 10–6 – 6,667 × 10–6

5,714 × 10–6 6,667 × 10–6

– 0,036 – 0,042

Michaelis-Menten ligningen: V0 =

Vmax =

5,714 × 10−6 2,00 × 10

Løsninger: c.

−4

Vmax × [S]0 KM + [S]0

omformes til: Vmax =

× (K M + 2, 00 ×10 −4 ) =

6,667 × 10−6 −4

3,00 × 10

V0 × (KM + [S]0) [S]0

× (K M + 3, 00 ×10 −4 )

KM = 1,49 × 10–4 mol L–1 & Vmax = 9,97 × 10–6 mol L–1 min–1

I kuvetten er enzymaktivitets-koncentrationen af LDH altså: 9,97 × 10–6 mol L–1 min–1 og LDH aktiviteten derfor: 9,97 × 10–6 mol L–1 min–1 × 0,003 L = 2,99 × 10–8 mol min–1 LDH stammer udelukkende fra 0,100 mL serum LDH aktivitets-koncentration i serum:299 µmol L–1 min–1

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2005 – side 13

Svar til Opgave 3.

a.

Denne type glycoproteiner har kulhydratgrupper koblet til N i amid(side)gruppen af asparaginylrester, hvor sidstnævnte indgår i en bestemt kort aminosyresekvens ("konsensussekvens" N-X-S/T). Kulhydratgruppen er knyttet til asparaginylgruppen via et specifikt saccharid (N-acetylglucosamin). Herudover består kulhydratet af en kæde af forskellige saccharider som f.eks. mannose, galactose, sialsyre og N-acetylgalactosamin. Forgrening af kæden ses hyppigt ved mannoserester. Syntese af N-glycosidbundne oligosaccharider starter med sammenkoblingen af saccharider og sacchariderivater, katalyseret af enzymer knyttet til endoplasmatisk reticulum, hvorefter heterosaccharidet "en bloc" bindes til asparaginylgruppen af det relevante protein. Efter partielle specifikke enzymkatalyserede hydrolyser af saccharidgrupperne overføres glycoproteinet til Golgi apparatet, hvor den endelige modifikation / maturation finder sted.

b.

Lysosomale enzymer har en speciel kulhydratstruktur, hvor en terminal mannoserest er fosforyleret. Dette genkendes af en specifik receptor (mannose-6-fosfatreceptor), som transporteres i vesikler mellem Golgi-apparat og endosomer/lysosomer. I Golgi-apparatet genkender receptoren enzymer med mannose-6-fosfat, hvorved enzymerne transporteres til lysosomer. Pga. det lave pH i endosomer/lysosomer afkobles enzymerne og forbliver i lysosomerne, hvorimod receptoren vender tilbage til Golgi-apparatet.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2005 – side 14

Svar til Opgave 4.

a.

A til T mutationen er lokaliseret i et MstlI site (site E) således, at det normale β-globin gen har tre MstII sites (site A, E og F - se skitse), mens seglcelle β-globin genet kun har to MstII sites (site A og F). Der vælges en DNA probe, der ligger upstream i forhold til mutationen (dvs imellem site A og site E). DNA'et fra personerne kløves med MstII og separeres på en agarosegel, der anvendes til Southern blotting. Proben mærkes med radioaktivitet (evt. en syntetisk DNA probe mærket i 5' enden med polynukleotidkinase). Proben vil hybridisere til et fragment på 1,2 kb hos en normal og til et 1,4 kb fragment hos en homozygot. En heterozygot vil have begge fragmenter. For at udføre analysen skal der således benyttes MstII, men analysen kan suppleres med EcoRI eller EcoRV hvorved fragmenterne bliver 0,8 kb (normal) og 1 kb (homozygot) henholdsvis 0,5 kb (normal) og 0,7 kb (homozygot). Endelig kan proben placeres mellem site E og F og give fragmenter på 0,2 kb (normal) og 1,4 kb (homozygot). Sidstnævnte kan evt være kortere ved at supplere med EcoRI (1 kb) eller EcoRV (0,7 kb). Besvarelser, der inkluderer PCR amplifikation i stedet for Southern blotting, vil også kunne accepteres.

b.

Hver globinenhed indeholder en hæmgruppe bestående af en porphyrinring med en komplekst bundet Fe2+ ion, hvortil O2 reversibelt kan bindes. En mindre del af den i vævene dannede CO2 kan reversibelt bindes til en aminogruppe (globinets N-terminal) under dannelse af en carbaminogruppe.

manan.dk Eksamen i Biokemi med Kemi – januar 2005 – side 15

Svar til Opgave 5.

a.

Enzymet thymidylatsyntase katalyserer, under dannelse af en kovalent binding til substratet (dUMP), overførslen af en methylgruppe til dUMP fra methyl-donoren N5, N10-methylentetrahydrofolat. Ved afgivelsen af methylgruppen fra N5, N10-methylentetrahydrofolat dannes dihydrofolat.

b.

Thymidylat-syntase inhiberes af fluorodeoxyuridin, efter fosforylering bindes dette substrat kovalent til enzymet i det aktive sæde. Enzymet inaktiveres herved irreversibelt ("selvmordsinhibition"), idet fluor-atomet forhindrer overførslen af methylgruppen fra N5, N10-methylentetrahydrofolat. Folat-analoger (methotrexat, aminopterin) bindes meget stærkt til dihydrofolatreduktase, hvorved dannelse af tetrahydrofolat ved reduktion af dihydrofolat forhindres, hvilket standser gendannelse af N5, N10-methylentetrahydrofolat fra tetrahydrofolat.

c.

Hæmning af TTP-syntese rammer alle hurtigt voksende celler i organismen, hvilket bl.a. medfører hårtab og nedsat produktion af blod- og epithelceller.

manan.dk

MEDICINSK BIOKEMI Aarhus Universitet

Juni 2004

Det sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Kandidateksamen

B IOKEMI MED KEMI Onsdag den 16. juni 2004, kl. 09:00 - 15:00 Skøjtehallen, Gøteborg Allé, 8200 Aarhus N.

Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver. Som bilag er tilføjet tabel med navne og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner. På eksamensbordet er fremlagt et gult omslag påtrykt DET SUNDHEDSVIDENSKABELIGE FAKULTET samt gult kladdepapir og trefarvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det trefarvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2004 – side 2

Essayopgave.

Udviklingen af en velfungerende organisme er betinget af en nøjagtig replikation og vedligeholdelse af cellernes DNA. Dette er en fundamental forudsætning for, at genernes ekspression sker i overensstemmelse med vævenes behov. Gør rede for de centrale enzymatiske processer, der fører til: a.

Replikation af DNA i kernen.

b.

Reparation af beskadiget DNA i kernen.

c.

Dannelse af proteiner. Der skal skelnes mellem processer i kerne og i cytoplasma; men posttranslatoriske processer skal ikke medtages.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2004 – side 3

Opgave 1.

I proteinaseinhibitoren, α2-makroglobulin (α2M), indgår der en særlig kovalent binding, som er involveret i α2M's aktivitet som proteinaseinhibitor. Denne specielle kovalente struktur er ikke et primært resultat af den ribosomale translation. Nedenfor vises et udsnit af α2M's kovalente struktur.

a.

Angiv primærstrukturen af det viste udsnit af α2M fra N- til C-terminal.

b.

Hvilke aminosyrer i det viste udsnit af α2M bidrager til den særlige kovalente binding, som ellers sjældent forekommer i proteiner?

c.

Hvilke funktionelle grupper i det viste udsnit af α2M kan udvise syre- eller baseegenskaber?

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2004 – side 4

Opgave 2. En stamopløsning af et enzym med kendt KM indeholder 1500 IU mL–1 (1 IU = 1 µmol min–1). Den enzymkatalyserede reaktion følger Michaelis-Menten kinetik: V0 =

Vmax × [S]0 K M + [S] 0

og

KM = 10–5 mol L–1

a.

20 µL af denne enzymstamopløsning tilsættes en blanding, indeholdende substrat og alle øvrige relevante reagenser. Efter fortynding til 1,000 mL er den initiale substratkoncentration 0,100 mol L–1. Beregn initialhastigheden i denne reaktionsblanding.

b.

Forklar (evt. ved beregning), at initialhastigheden i en reaktionsblanding med samme enzymmængde og samme volumen, men initial substratkoncentration på 0,005 mol L–1, bliver den samme som i reaktionsblandingen i spørgsmål a.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2004 – side 5

Opgave 3.

a.

Under en langvarig faste øges både forbrændingen af fedtsyrer og produktionen af ketonstoffer i leveren. Forklar - med angivelse af relevante reaktioner - hvordan den samtidige stigning i gluconeogenesen kan virke fremmende på ketogenesen.

b.

I et ekstrahepatisk væv - specielt muskler - hæmmes glycolysen under faste. Forklar - med angivelse af relevante reaktioner - hvordan den forøgede fedtsyreforbrænding bidrager til at hæmme glycolysen i ekstrahepatisk væv.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2004 – side 6

Opgave 4.

Dannelse af disulfidbinding, glycosylering, sulfatering, phosphorylering og hydroxylering er velkendte elementer i modifikationen af ny-translaterede proteiner. For enkelte proteiner gælder det endvidere, at nogle bestemte aminosyresidegrupper skal undergå specifikke kemiske modifikationer, før proteinet kan udfylde sin endelige funktion. a.

Nævn tre eksempler på sådanne modificerede aminosyresidegrupper og angiv i hvilke proteiner, de forekommer - ét protein for hvert eksempel er tilstrækkeligt.

b.

Gør rede for de nævnte modifikationers betydning for de respektive proteiners funktion.

c.

Giv eksempler på kliniske forhold, der kan opstå, hvis de angivne aminosyrer ikke modificeres i normalt omfang.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2004 – side 7

Opgave 5.

a.

Beskriv to eksempler på specifikke bindingsfunktioner af sacchariddelen(e) i glycoproteiner og forklar deres biologiske betydning.

b.

Angiv hvilke typer af enzymer, der er nødvendige for nedbrydning af proteoglycaner, og forklar hvorfor en genetisk betinget mangel på eller manglende funktion af et af disse enzymer medfører sygdom.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2004 – side 8

Bilag.

DE 20 AMINOSYRER - VED PH 7,4

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2004 – side 9

Svar til Essayopgave.

a. DNA-syntese katalyseres af DNA-polymeraser. Disse enzymer er karakteriserede ved deres evne til at tilkoble dNTP-nukleotiderne til en eksisterende 3'-ende ved at aflæse og indsætte de komplementære nukleotider til DNA-skabelonen (DNA-template). DNA-syntesen foregår i retningen 5' mod 3'. Ved replikationens startpunkt (origin) adskilles de to DNA-strenge, hvorefter en RNA-primase katalyserer dannelsen af en kort komplementær RNA-kæde (primer) på begge strenge. Disse RNA-kæders 3'-ender er udgangspunkt for den egentlige DNA-replikation. Fra replikationens startpunkt udgår der en replikationsgaffel til hver side. Fra hver af disse gafler replikeres begge strenge samtidigt ved en kontinuerlig henholdsvis en diskontinuerlig replikationsproces (førende til »leading« henholdsvis »lagging strand«). Ved den kontinuerlige DNA-syntese syntetiseres en ubrudt DNA-streng fra den lille RNA-kæde i startpunktet. Ved den diskontinuerlige replikationsproces (gen)startes fra de små RNA-kæder, der er dannet ved RNA-primase i replikationsgaffelen for hver ca. 200 baser. En DNA-polymerase udfylder stykkerne mellem RNA-kæderne (Okazaki fragmenter), hvorefter de små RNA-kæder borthydrolyseres og erstattes med dNTP-nukleotider, og til sidst forbindes DNA-kæderne ved hjælp af DNA-ligaser. Adskillige andre proteiner indgår også i DNA-polymerasekomplekset, bl.a. helicaser og SSB (»single strand binding«) proteiner. Disse hjælpeproteiner inducerer strukturændringer, så DNAskabelonkæden blotlægges for DNA-polymeraserne. Atter andre enzymer som topoisomeraser (ikke pensum) udløser rotationsspændinger foran replikationsgaffelen ved brydning henholdsvis gendannelse af phosphodiesterbindinger i DNA-strengene. (I Baynes & Dominiczak beskrives desuden forlængelser af telomerer med hexamere enheder ved hjælp af telomeraseenzymet, hvilket ikke er korrekt). DNA-polymerasekomplekset varetager desuden korrektioner af eventuelle replikationsfejl under DNA-syntesen, idet de forkert indsatte nukleotider fjernes ved en 3' mod 5' deoxyribonukleaseaktivitet, hvorefter DNA-syntesen forsætter.

b. Enzymsystemer afsøger til stadighed DNA for fejl, der måtte være opstået tilfældigt eller ved fysisk-kemiske påvirkninger (f.eks. stråling). Fejlene korrigeres ved, at den beskadigede base eller et mindre stykke DNA omkring læsionsstedet borthydrolyseres. En DNA-polymerase indsætter herefter den eller de manglende komplementære baser til den ubeskadigede streng, hvorefter en DNA-ligase knytter den sidst indsatte base til resten af DNA-strengen.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2004 – side 10

c. I kernen formidler RNA-polymeraser dannelse af RNA-transkripter i retningen 5' mod 3' ved at bruge den ikke-kodende (antisense) DNA-streng som skabelon (template). Disse RNA-polymeraser genkender veldefinerede startsteder for transkription. De kan - i modsætning til DNA-polymeraser - starte polymerisering de novo, dvs. uden en allerede eksisterende 3'-terminal. De transkriptive processer fører til dannelse af hnRNA. Fra denne pulje dannes der ved posttranskriptionelle processer ribosomalt RNA, tRNA og forstadier til mRNA. Sidstnævnte påsættes en 5'-hætte og 3'-polyA hale. Ved splejsningsreaktioner fjernes introns fra dette forstadium til mRNA, og det modne mRNA - alene bestående af exons samt hætte og hale overføres til cytoplasmaet. mRNA er udgangspunkt for de translatoriske processer, der fører til dannelse af proteiner fra aminosyrer. Ved translationen indgår foruden mRNA også ribosomer (såvel frie som bundne til endoplasmatisk reticulum) samt tRNA. Ribosomerne er komplekse strukturer, opbygget af ribosomalt RNA og proteiner, der katalyserer proteinsyntesen. Ved enzymkatalyse kobles tRNA-molekylerne til deres respektive aminosyrer og formidler via anticodon i tRNA kobling til den genetiske kode (codons), som er indeholdt i mRNA.

Translationen af et mRNA initieres ved, at 40S-ribosomdelen binder et Met-tRNA i dets P-site, hvorefter dette kompleks bindes til 5'-hætten og derefter »glider« mod 3'-enden, indtil komplekset møder et AUG startcodon. 60S-ribosomdelen bindes herefter til 40S delen, hvorefter syntesen af peptidkæden indledes ved, at en aminoacyl-tRNA specifik for den efterfølgende codon bindes i A-site på 40S-ribosomdelen. Den første aminosyre (Met - siden den voksende peptidkæde) i P-site overføres herefter til aminoacyl-tRNA i A-site under dannelse af en peptidbinding mellem C-terminalen i den overførte aminoacyl-tRNA og N-terminalen i aminoacyl-tRNA i A-site. (Processen katalyseres af en peptidyltransferase). Ribosomet »flyttes« én codon frem (formidlet af elongeringsfaktor-2 (EF-2)), hvorved det tomme tRNA i P-site fjernes, og peptidyl-tRNA i A-site flyttes til P-site. Processen gentages, indtil et stopcodon (UAA, UAG, UGA) eksponeres for A-site, hvorefter en termineringsfaktor bindes til denne position. Dette afbryder translationen, og peptidet hydrolyseres fra peptidyl-tRNA og frigøres dermed fra ribosomet.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2004 – side 11

Svar til Opgave 1.

a & b.

Thiolesterbinding mellem sidegrupperne fra Cys (nr. 2) og Glu (nr. 5). c.

I det viste udsnit forekommer kun en carboxylsyregruppe fra Glu (nr. 4).

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2004 – side 12

Svar til Opgave 2.

a.

De 20 µL enzymstamopløsning - med enzymkoncentrationen 1500 IU mL–1 - fortyndes i reaktionsblandingen til 1,000 mL. Derved bliver Vmax i reaktionsblandingen: 1500 × 10 −6 molmin−1 −3

Vmax =

10 L 10

−3

× 20 × 10−6 L

L

= 30 mmol min–1 L–1

... og V0 i reaktionsblandingen: V0 =

30 × 10−3 mol min−1 L−1 × 0,100 molL−1 10 −5 molL−1 + 0,100 mol L−1

= 30 mmol min–1 L–1

altså V0 = Vmax, - fordi [S]0 >>> KM

b.

I denne reaktionsblanding er [S]0 >> KM, hvorfor V0 ≈ Vmax, hvilket også fremgår af: V0 =

30 × 10−3 mol min−1 L−1 × 0,005 molL−1 10 −5 molL−1 + 0,005 molL −1

= 29,9 mmol min–1 L–1

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2004 – side 13

Svar til Opgave 3.

a.

Under faste er fedtvævslipasen aktiveret. Den betydelige tilførsel af fedtsyrer til leveren giver anledning til en kraftig forøgelse af den mitochondrielle β-oxidation, hvilket fører til en stigning i koncentrationen af acetyl-coA ledsaget af en betydelig energiproduktion. Acetyl-coA kan indgå i citratcyklus ved dannelse af citrat. Men den videre omdannelse af citrat (egentlig isocitrat) er hæmmet af den rigelige energi fra β-oxidationen af fedtsyrer (i form af FADH2, NADH2 & ATP) samt den meget lave koncentration af oxaloacetat (og malat), der indgår i gluconeogenesen. Den resulterende ophobningen af acetyl-coA fører i stedet til ketogenese.

b.

I ekstrahepatisk væv vil den øgede mængde af citrat i mitochondrierne »flyde over« i cytosol og dér hæmme phosphofructokinasen og dermed hæmme omdannelsen af Fru-6-P til Fru-1,6-P2. I mitochondrierne vil den øgede mængde af acetyl-coA (fra β-oxidation af fedtsyrer) hæmme pyruvatdehydrogenasen og dermed dannelse af acetyl-coA fra glycolysens pyruvat. Endelig vil den øgede produktion af ATP hæmme både pyruvatdehydrogenasen og (i cytosol) pyruvatkinasen. (supplement til besvarelsen)

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2004 – side 14

Svar til Opgave 4.

a.

Oxidativ deaminering af lysinsidegrupper fører til reaktive aldehyder (som allysin) i prokollagen og elastin. Carboxylering af glutamatsidegrupper fører til γ-carboxyglutamatsidegrupper (Gla) i blodkoagulationsfaktorerne II, VII, IX og X samt i protein C og S. Iodering og æterbinding mellem tyrosinsidegrupper fører til tri- og tetraiodthyroniner i thyroglobulin.

b.

De oxidativt deaminerede lysinsidegrupper er udgangspunkt for dannelsen af de fiberstabiliserende kovalente tværbindinger (som desmosin) i elastin og kollagen. γ-Carboxyglutamatsidegrupper er afgørende for, at blodkoagulationsfaktorerne II, VII, IX og X samt protein C og S, via Ca2+ og phosphatidylserin, kan bindes til thrombocyt- og cellemembraner på koagulationsstedet. Dannelsen af iodthyroniner er en forudsætning for produktion af thyreoideahormonerne T3 og T4.

c.

Mangel på de deaminerede lysinsidegrupper (allysiner) kan føre til deformering af knogler og led samt kar-aneurismer. Mangel på γ-carboxyglutamatsidegrupper vil medføre øget blødningstendens. Mangel på T3 og T4 kan medføre trætheds- og kuldefornemmelse, vægtstigning og manglende koncentrationsevne hos voksne - samt føre til retardering (hos nyfødte) og manglende længdevækst hos børn.

manan.dk Eksamen i Biokemi med kemi – juni 2004 – side 15

Svar til Opgave 5.

a.

Sacchariddelen af adskillige lysosomale enzymer (mannose-6-phosphatgrupper på N-linked oligosaccharider, »targeting signal«) bindes til en receptor, der sørger for transport fra Golgi-apparatet til lysosomer. En manglende bindingsfunktion fører til, at lysosomer ikke kan nedbryde komplekse proteoglycaner og forskellige komplekse lipider. Dette resulterer i sygdom (»I-cell disease«). Sacchariddelen af et glycoprotein på leukocytters overflade bindes til et protein på endothelceller. Resultatet er, at leukocytterne »ruller« langs endothelcellerne, hvorved deres passage igennem monolaget af endothelceller lettes.

b.

Proteolytiske enzymer (proteinaser), glycosidaser og sulfataser i lysosomerne. Manglende funktion af et af disse enzymer medfører, at proteoglycaner ikke kan nedbrydes på normal måde. I stedet akkumuleres de i lysosomerne, hvilket kan skade cellefunktioner og resultere i mucopolysaccharidoser (»lysosomal storage disease«).

manan.dk

Vintereksamen 2003/2004, Biokemi

Essayopgave Hæmostase Besvarelsen skal indeholde: 1. En redegørelse for de processer, der fører til standsning af blødning ved karlæsion. 2. En redegørelse for virkningen af antithrombin (III) og protein C/S på koagulation. 3. En forklaring på, hvorfor malabsorption kan medføre øget blødningstendens.

manan.dk

Vintereksamen 2003/2004, Biokemi

Forslag til besvarelse af essayopgave 1. Ved hæmostase, eller hæmostatisk respons, forstås den spontane standsning af blødning efter læsion af et blodkar og er resultatet af et samspil mellem en række komponenter/mekanismer. I løbet af få sekunder indtræder en reflektorisk vasokonstriktion af karrene i området omkring skaden. Samtidig hermed adhærer blodpladerne til subendothelialt væv, idet membranreceptoren glycoprotein Ib (GPIb), via von Willebrand faktor frigivet fra endothelceller, bindes til blottede subendotheliale kollagenfibre. Dette medfører en generel aktivering af thrombocytterne, som bl.a. fører til aktivering af membranreceptoren glycoprotein IIb-IIIa (GPIIb-IIIa), der via binding til fibrinogen fører til thrombocytaggregation på læsionsstedet, idet thrombocytterne bindes til hinanden. Aktiveringen medfører endvidere præsentation af koagulationsfremmende, negativt ladede fosfolipider (eks.: fosfatidylserin, PIP2) på thrombocytmembranens overflade og frigørelse af indholdet i granula, bl.a. de karkontraherende stoffer serotonin og thromboxan A2, der yderligere medvirker til at formindske blodtabet. Imidlertid er dette relativt løse agregat af thrombocytter ikke i stand til at standse blødningen fuldstændigt, og thrombocytproppen bliver derfor forstærket ved dannelse af et netværk af fibrintråde, der i løbet af nogle minutter er så tæt, godt hjulpet af aggregerede thrombocytter og indfangede erythrocytter, at blødningen standser. Dannelsen af fibrintrådene er resultatet af selve koagulationsprocessen, som afsluttes med dannelse af det aktive enzym thrombin, der omdanner det opløselige plasmaprotein fibrinogen til uopløselige fibrinmonomerer, der spontant associerer ende til ende og side til side i et tredimensionalt netværk. Dette netværk, sammenkoblet af non-covalente kræfter, forstærkes efterhånden ved dannelse af covalente bindinger mellem de enkelte fibrinmonomerer, katalyseret af transglutaminase (faktor XIII). Koagulationsprocessen in vivo starter når blodet efter en karlæsion kommer i kontakt med subendotheliale celler og dermed med dels membranfosfolipider, dels vævsfaktor (tissue factor (TF), vævsthromboplastin), et integralt membranprotein, der udtrykkes af alle celler undtagen endothelceller. Faktor VII, en præformeret koagulationsfaktor i plasma, bindes til dels vævsfaktoren og dels den negativt ladede fosfolipidoverflade på thrombocyttterne, sidstnævnte binding formidles via Ca2+. Den nu aktive faktor VII (VIIa) katalyserer en begyndende omdannelse af både faktor X til Xa og faktor IX til IXa. Faktor Xa katalyserer derefter omdannelsen af en mindre mængde, prothrombin til thrombin, hvorefter scenen er sat for en kraftig acceleration af thrombindannelsen. Imidlertid forløber disse initiale processer kun i et kort tidsrum, idet et plasmaprotein, tissue factor pathway inhibitor (TFPI), sammen med allerede dannet faktor Xa, bindes til faktor VIIa-TFkomplekset og blokerer for yderligere aktivitet. Den mindre mængde thrombin er dog tilstrækkelig til at omdanne faktor XI til XIa, der omdanner mere IX til IXa. Desuden omdanner thrombin faktor VIII til VIIIa, der som cofaktor for faktor IXa medvirker til acceleration af omdannelsen af X til Xa. Og endelig, da thrombin også omdanner faktor V til Va, der virker som cofaktor for faktor Xa, sker der til sidst en eksplosiv omdannelse af prothrombin til thrombin. Thrombin katalyserer så dannelsen af de tidligere omtalte fibrinmonomerer, ligesom thrombin også aktiverer transglutaminasen. 2. For at sikre at koagulationsprocessen fører til dannelse af en hurtig, lokalt afgrænset hæmostatisk prop, der er i stand til at standse blødningen uden at

manan.dk

Vintereksamen 2003/2004, Biokemi

okkludere karret helt, findes en række hæmmere af koagulationsprocessen, nemlig antithrombin (III), protein C og protein S. Antithrombin (III) har i sig selv en svag inhibitorisk effekt overfor thrombin, men ved binding til endogene glycosaminoglycaner på endothelcellernes overflade øges affiniteten kraftigt over for thrombin og en række andre aktive koagulationsfaktorer, især Xa og IXa. Som tidligere nævnt omdanner thrombin i starten cofaktorerne V og VIII til deres aktive forbindelser, men thrombin aktiverer også, især efter binding til det integrale membranprotein thrombomodulin, protein C til aktivt protein C. Aktivt protein C, i kompleks med sin cofaktor protein S, nedbryder selektivt de aktiverede cofaktorer Va og VIIIa. Thrombin hæmmer derved sin egen dannelse (negativt feedback). 3. Ved kompromitteret lipidabsorption som følge af galdestase med deraf følgende mangel på galdesalte i tarmen eller ved visse malabsorptionssyndromer opstår mangel på bl.a. fedtopløselige vitaminer, herunder vitamin K. Vitamin K er cofaktor ved den posttranslatoriske carboxylering af visse glutamylsidekæder i den N-terminale ende af en række proteiner i leveren, bl.a. ovennævnte koagulationsfaktorer. Ved mangel på vitamin K fortsætter syntesen af disse koagulationsfaktorer, men i en non-carboxyleret og derfor inaktiv form, hvilket viser sig som en øget blødningstendens. En velegnet test til påvisning af mangel på K-vitaminafhængige koagulationsfaktorer er prothrombintiden (PT) som i sagens natur er forlænget ved mangel på vitamin K.

manan.dk

Vintereksamen 2003/2004, Biokemi

Nr. 1 Nedenfor er vist strukturen af de enkelte intermediater i citratcyklus. a) Navngiv intermediaterne (A-H). b) Angiv de reaktioner (1-8), hvor der foregår en oxidation og angiv, hvilken gruppe der bliver oxideret og hvilken coenzym/prostetisk gruppe der er oxidator. c) Opskriv den reaktion, hvori der foregår en substratfosforylering. d) Forklar hvorledes enzymaktiviteten i reaktion 3 er reguleret.

manan.dk

Vintereksamen 2003/2004, Biokemi

Svar til nr. 1 a) citrat isocitrat alfa-ketoglutarat succinyl-coA succinat fumarat malat oxaloacetat b) Reaktion 3: en (sekundær) alkohol til en keton: NAD+ Reaktion 4: en oxo gruppe (aldehyd fremkommet efter decarboxylering) til en carboxylgruppe; NAD+ Reaktion 6: en mættet forbindelse (-CH2CH2-) til en umættet forbindelse (CH=CH-); FAD Reaktion 8: en (sekundær) alkohol til en keton; NAD+ c) Reaktion 5:

d) Trin 3 er katalyseret af enzymet isocitrat dehydrogenase. Enzymet aktiveres (allosterisk) ved stigning i ADP koncentrationen (når cellen har brug for energi) og enzymet hæmmes ved stigning i ATP og NADH koncentrationerne (når cellen ikke har brug for energi).

manan.dk

Vintereksamen 2003/2004, Biokemi

Nr. 2 Ketoacidose kan have flere årsager. Tre personer (A-C) har af forskellige grunde udviklet en lettere ketoacidose og blodprøver viser henholdsvis: En markant forhøjet blodglucosekoncentration (A); en lav blodglucosekoncentration (B); en lav blodglucosekoncentration ledsaget af en forhøjet koncentration af serumlaktat (C). Redegør kort for en mulig årsag til de enkelte personers ketoacidose og giv i den forbindelse en forklaring på de observerede niveauer af glucose og laktat i blodet.

Svar a) Person A’s tilstand er forenelig med en ubehandlet diabetes. Mangel på insulin (mindsket insulin/glukagon ratio) hæmmer forbruget af glucose og fremmer gluconeogenese, hvilket resulterer i en øget blodglucosekoncentration. Samtidig stimuleres (via aktivering af lipase) frigivelsen af frie fedtsyrer fra fedtvæv og fedtsyrerne optages i leveren. Da aktiviteten af acetylcoA carboxylase er reduceret på grund af lav insulin/glukagon ratio, vil koncentrationen af malonylcoA være lav, hvilket fører til mindsket hæmning af carnitin-acyl-transferase. Fedtsyrerne overføres derfor i stort antal til leverens mitochondrier hvor de forbrændes eller omdannes til ketonstoffer. b) Person B’s tilstand er forenelig med langvarig (5-6 uger) faste. Blodglucosekoncentrationen er selvsagt lav og dermed også insulinniveauet. Glukagon er relativt høj og dets effekt fremmes yderligere af en øget produktion af glukokortikoider. Den ændrede insulin: glukagon ratio medfører som angivet ovenfor en væsentlig øget forbrænding af fedtsyrer og produktion af ketonstoffer. c) Person C’s tilstand er forenelig med en kombination af faste og alkoholmisbrug. Omsætningen af alkohol i leveren medfører en øget produktion af NADH2 som ophobes da “aflastning” gennem forbrug (og produktion) af ATP er uændret. Fasten inducerer gluconeogenese, men den høje koncentration af NADH2 vil medføre at pyruvat og oxaloacetat anvendes til produktion af henholdsvis lactat og i nogen grad malat (dvs. til forbrug af NADH2 i stedet for til syntese af glucose.) Resultatet er udtalt hypoglykæmi og et stigende serumlaktat.

manan.dk

Vintereksamen 2003/2004, Biokemi

Nr. 3 a) Der er forskel på hvorledes 5'-phosphoribosyl pyrophosphat (PRPP) indgår i de novo syntese af purin- og pyrimidinnucleotider. Beskriv denne forskel og benævn det primære purinnucleotid samt det primære pyrimidinnucleotid? b) Et af de fire 2'-deoxyribonucleotider som findes i DNA, kan ikke syntetiseres ved en “simpel” reduktion af ribonucleotiderne, men må undergå en ekstra modifikation. Hvilket deoxyribonucleotid er der tale om og hvori består modifikationen? c) Angiv hvilke grundstrukturer DNA er sammensat af og beskriv hvilke typer kovalente bindinger som benyttes til at sætte disse grundstrukturer sammen (brug et polynucleotid som eksempel og ikke et frit mononucleotid). Angiv desuden hvilke(n) type binding(er) der er vigtig for den dobbeltstrengede DNA struktur samt hvor den/de forekommer.

Svar a) I de novo syntesen af IMP, som er det primære purinnucleotid, syntetiseres basen på PRPP. Derimod tilkobles PRPP først efter pyrimidinringen er syntetiseret i de novo syntesen af UMP, som er det primære pyrimidinnucleotid. (Orotidin monofosfat accepteres som korrekt svar). b) Syntesen af dTMP (= TMP i lærebogen) sker ved methylering af dUMP med N5N10-metylen-tetrahydrofolat som både metylgruppe-donor og reduktant. c) DNA består af phosphorsyre, 2'-deoxyribose samt purinbaser (adenin og guanin) og pyrimidinbaser (cytosin og thymin). Phosphorsyren er bindeled mellem deoxyriboserne via en phosphodiester binding, mens baserne er bundet til deoxyriboserne med en N-glycosid binding. Den dobbeltstrengede DNA struktur gør brug af H-bindinger mellem de komplementære baser A og T samt G og C, samt hydrofobe bindinger mellem de “stablede” H-forbundne basepar.

manan.dk

Vintereksamen 2003/2004, Biokemi

Nr. 4 a) Forklar, med henvisning til albumins isoelektriske punkt (over eller under 7.4), hvorfor en væsentlig del af serum calcium (totalcalcium) er proteinbundet under normale omstændigheder. b) Forklar den ændring i serum Ca2+ (frit), der ses efter akut hyperventilation, samt kliniske tegn i forbindelse hermed. c) Redegør for to omstændigheder, der trods normalt serum Ca2+ (frit) er forbundet med ændringer i serum calcium (totalcalcium).

Svar a) Albumin, der findes i høj koncentration i blodet, binder calcium fordi dets nettoladning er negativ ved pH 7,4 og altså har en pI værdi mindre end 7.4. Albumin er således hovedansvarlig for den proteinbundne fraktion (ca. 45%). b) Ved øgning af blodets pH som ved akut hyperventilation øges antallet af negative ladninger på albumin (og andre proteiner), og fraktionen af calcium bundet til albumin stiger. Det nedsatte serum Ca2+ medfører øget neuromuskulær irritabilitet (på grund af øget Na+-permeabilitet i nervemembraner), og kontraktioner kan eksempelvis udløses af let slag på nervus facialis. c) Dehydrering medfører øget serum albumin og øget serum calcium, fordi en større fraktion er bundet til albumin samtidig med at Ca2+ holdes konstant. Omvendt medfører nedsat serum albumin nedsat serum calcium. Dette kan eksempelvis ses ved langvarig sult/fejlernæring eller ved sygdomme, der medfører betydeligt tab af albumin (f.eks. nyresygdomme) eller nedsat albumin syntese (f.eks. leversygdomme). Langvarige ændringer i blodets pH kan også anføres.

manan.dk

Vintereksamen 2003/2004, Biokemi

Nr. 5 Et firma har haft held med at fremstille transgene får, der i deres mælk udskiller et humant rekombinant protein med telomerase aktivitet. I en storm vælter gærdet, som adskiller de transgene får fra ikke-transgene får på nabolandmandens mark, hvorved de to fårehold blandes. De transgene får skal nu findes og ledelsen har bestemt at det skal ske ved hjælp af Southern blotting. Beskriv princippet for udførelse af denne teknik og hvilke informationer den giver. Alle relevante molekylære og cellebiologiske værktøjer er til rådighed. Svar Southern blot er en DNA-DNA hybridiseringsmetode. Dvs. en metode der bruges til at verificere tilstedeværelsen af et bestemt stykke DNA. I dette tilfælde gælder det om at verificere det DNA som koder for det humane protein der findes i de transgene fårs genom. - Genomisk DNA isoleres fra fårene og skæres i mindre stykker ved brug af en eller flere kendte restriktionsenzymer. - Herefter separeres DNA’et efter størrelse ved hjælp af dets negative ladning på en agarosegel, sammen med en kendt størrelses markør. - DNA’et i gelen denatureres og overføres til en membran/filter. - Membranen inkuberes med et stykke radioaktivt enkeltstrenget DNA (en probe) som indeholder komplimentær sekvens til det stykke DNA som vi ønsker at påvise. - Hvis DNA’et stammer fra et transgent får, vil der ske en hybridisering mellem DNA’et på membranen og proben. Proben vil kunne visualiseres ved autoradiografi.

manan.dk

Sommereksamen 2003, Biokemi

Essayopgave Leverfunktioner (udvalgte eksempler) Besvarelsen skal indeholde: 1. En beskrivelse af de processer, der fører til degradering af hæm til bilirubindiglucuronid og udskillelse af stercobilin/urobilin. 2. En beskrivelse af den generelle reaktionssekvens for hydroxylering (monooxygenering), katalyseret af cytochrom P450-systemet, og den videre skæbne af de hydroxylerede produkter. 3. En redegørelse for etanoloxidation og de metaboliske ændringer som følge af etanolforgiftning, samt en beskrivelse af cytochrom P450 enzymers betydning for hastigheden for etanoloxidation.

manan.dk

Sommereksamen 2003, Biokemi

Forslag til besvarelse af essayopgave 1. Hæm findes som prostetisk gruppe i såkaldte hæmoproteiner, f.eks. hæmoglobin, myoglobin og cytochromer. Ved nedbrydningen af hæm dannes forskellige galdefarvestoffer som udskilles med galden og i mindre mængder med urinen. Første trin i nedbrydningen er en oxidativ spaltning af ringstrukturen til biliverdin, en lineær tetrapyrrol, efterfulgt af en reduktion til bilirubin. En væsentlig del af denne bilirubinproduktion foregår i extrahepatiske væv (reticuloendothelialt system) og bilirubin, der er fedtopløseligt, må derfor transporteres til leveren bundet til albumin. I leveren bindes/konjugeres bilirubin med 1 eller 2 glucuronalgrupper (fra UDPglucuronat) og dette bilirubinglucuronid er så vandopløseligt, at det kan føres med galden ud i tarmen. I tarmen fraspaltes glucuronat igen ved hydrolyse, og katalyseret af tarmbakteriers reduktaser bliver bilirubin reduceret til urobilinogen, som er farveløst. Det meste urobilinogen udskilles med fæces efter først at være blevet oxideret til forskellige urobiliner/stercobiliner, som i modsætning til urobilinogen er farvede produkter og giver fæces den brune farve. En mindre mængde urobilinogen reabsorberes fra tarmen og føres med vena porta tilbage til leveren, der igen udskiller det med galden, men noget oxideres til urobiliner, der via det store kredsløb udskilles med urinen. 2. Mange biologisk aktive forbindelser, både forbindelser dannet i organismen (f.eks. hormoner) og forbindelser tilført udefra (farmaka, giftstoffer) er så apolære, at de har vanskeligt ved at blive elimineret fra organismen, med mindre de ved kemisk modifikation omdannes til mere polære stoffer, der kan udskilles med urin og/eller galde. De kemiske modifikationer omfatter især oxidationsreaktioner og konjugeringsreaktioner. Mange oxidationsreaktioner foregår med molekylær ilt efter følgende skema: RH + O2 + NADPH2

ROH + H2O + NADP+

Reaktionen kaldes også en hydroxylering eller monooxygenering og katalyseres i leverens endoplasmatiske reticulum af en række cytochrom P450 enzymkomplekser, der alle er karakteriserede ved at udvise lav substratspecificitet. Disse enzymkomplekser består dels af enzymet NADPH2-cytochrom P450 reduktase, der indeholder to riboflavingrupper, dels af cytochrom P450 proteinet, der binder substratet og molekylær ilt. Riboflavingrupperne overfører de to elektroner fra NADPH2, en af gangen, til jernatomet i cytochrom P450, og ved processen indbygges det ene iltatom i substratet RH under dannelse af ROH, men det andet iltatom reduceres til H2O. De på denne måde hydroxylerede produkter kan udskilles som sådanne eller gøres endnu mere polære ved konjugering med glucuronat (fra UDP-glucuronat) eller sulfat (fra PAPS). 3. Etanol omsættes hovedsageligt i leveren, hvor det oxideres til acetat, der afgives til blodet og forbrændes i extrahepatiske væv til CO2 og vand efter aktivering til acetylcoA. I cytosol katalyserer alkohol dehydrogenase reaktionen: alkohol + NAD+

acetaldehyd + NADH2

manan.dk

Sommereksamen 2003, Biokemi

og i mitochondrier katalyserer aldehyd dehydrogenase reaktionen: acetaldehyd + NAD+ + H2O

acetat + H+ + NADH2

Det er karakteristisk for omsætningen af etanol, i modsætning til omsætningen af mange andre forbindelser, at hastigheden for etanoloxidation er uafhængig af etanolkoncentrationen i væskefasen. Det er således ikke enzymernes katalytiske kapacitet (Vmax), der er begrænsende for etanoloxidationens hastighed. Forklaringen på den stort set konstante oxidationshastighed hænger sammen med leverens ATP-omsætning/forbrug. Ved oxidation af etanol til acetat dannes 2 NADH2 pr. etanol. Den hastighed, hvormed NADH2 kan dannes ved denne oxidation, overskrider langt hastigheden for levervævets forbrug af redox-elektroner i respirationskæden, dvs. overskrider langt det NADH2-behov, der er for leverens ATP-produktion. Da den samlede koncentration af NAD+ + NADH2 ikke ændres, nås der hurtigt ved etanolforbrænding en steadystate tilstand, hvor NAD+-forbruget og NADH2-produktionen er lige store, men ligevægten mellem NAD+ og NADH2 er kraftigt forskudt mod NADH2 ved etanolforbrænding. [NAD+] bliver således begrænsende faktor for hastigheden for etanolforbrænding. Dette høje NADH2/NAD+-forhold får vide konsekvenser for metabolismen af andre forbindelser i leveren. Alle processer, der forbruger NADH2 og producerer NAD+ vil forløbe med øget hastighed, mens alle andre processer, der forbruger NAD+ og producerer NADH2, vil blive hæmmet. Således vil ligevægten mellem pyryvat og lactat forskydes mod lactat, evt. førende til lactatacidose, ligevægten mellem oxaloacetat og malat forskydes mod malat og ligevægten mellem diydroxyacetonefosfat og glycerol-3-fosfat forskydes mod glycerol-3-fosfat. Dette fører til, at koncentrationerne af de vigtigste gluconeogenetiske substrater pyruvat, oxaloacetat og dihydroxyacetonefosfat bliver meget lave, dvs. gluconeogenesen bremses. Er leverglycogendepotet lille eller tømt, vil etanolforbrænding derfor kunne føre til hypoglycæmi. Dette nedsætter insulin/glucagon ratio, hvilket fører til øget aktivitet af den hormonfølsomme fedtvævslipase, med efterfølgende øget tilførsel af fedtsyrer til leveren. Da fedtsyrers oxidation også indebærer forbrug af NAD+, hæmmes oxidationen, og fedtsyrerne esterificeres til triacylglyceroler og dermed stigende fedtindhold i leveren, evt. førende til fedtlever. Hos personer med et vedvarende og stort alkoholforbrug kan hastigheden for etanoloxidation øges, fordi etanol kan inducere dannelse af enzymer tilhørende cytochrom P450 systemet, det såkaldte MEOS-system, der katalyserer følgende reaktion: etanol + O2 + NAD(P)H2

acetaldehyd + NAD(P)+ + H2O

Den dannede acetaldehyd oxideres som tidligere af aldehyd dehydrogenase til acetat. Det fremgår af dette skema, at etanoloxidation ved hjælp af MEOS-systemet ikke bidrager/bidrager mindre til det høje NADH2/NAD+-forhold, og derfor ikke i så udtalt grad får de samme metaboliske konsekvenser, som den “normale” etanolforbrænding.

manan.dk

Sommereksamen 2003, Biokemi

Nr. 1 Strukturformlerne for retinol og opsin ser således ud:

I besvarelsen af opgaven kan følgende summariske strukturformler også anvendes:

Nedenfor er vist nogle reaktionsveje for organismens omsætning af retinol. Retinol dehydrogenering dehydrogenering

Retinal (all trans)

Retinoinsyre

isomerisering

11-cis-Retinal kondensation

Imin

dannet mellem 11-cis-Retinal og en lysin-sidegruppe i membranproteinet Opsin (vist ovenfor)

a. Angiv strukturformler for 1) Retinal 2) Retinoinsyre 3) 11-cis-Retinal 4) Iminen b. 1) Angiv næringskilder til retinol. 2) Angiv hvordan retinol deponeres. 3) Beskriv de vigtigste roller, som retinoiderne (retinol og -derivater) har i organismen og angiv symptomer på mangel på vitamin A.

manan.dk

Sommereksamen 2003, Biokemi

Svar til nr. 1: a.

b. 1) Næringskilder er spinat, gulerødder og andre grønsager, hvori der findes carotener (betacaroten oxideres til retinal). 2) Retinol deponeres som retinylpalmitat i leveren. 3) Retinoiderne (A-vitamin) har betydning for epithelcellers differentiering og vækst, hvorfor der ved A-vitamin mangel i denne forbindelse vil vise sig epithelcelleforandringer. Retinoiderne har, som anført i reaktionsskemaet ovenfor, betydning for synet. Kondensation af 11-cis-retinal og opsin giver en imin (rhodopsin), der efter en lysininduceret (energi) cis til trans isomerisering spaltes i opsin og trans-retinal og anledning til nerveimpuls. A-vitamin mangel symptomer i denne forbindelse er natteblindhed.

manan.dk

Sommereksamen 2003, Biokemi

Nr. 2 Der foreligger følgende oplysninger: 1. Man anbefaler ekstra folinsyre til unge kvinder, som planlægger eller forventer graviditet, men der er også betænkelighed ved at udstrække denne ekstra tilførsel til en hel befolkning, fordi ekstra indtag af folinsyre kan maskere mangel på vitamin B12 hos nogle. 2. Mangel på vitamin B12 påvirker både nukleinsyre- og lipidomsætningen; sidstnævnte fordi en ophobning af methylmalonat hæmmer normal fedtsyresyntese, hvilket kan kompromittere myelineringen af nervebaner. Vurdér følgende opfordring (pressemeddelelse). “Madvarer bør tilsættes folinsyre for at mindske antallet af børn, der fødes med rygmarvsbrok”! a. Forklar hvorledes ekstra folinsyre kan maskere mangel på vitamin B12 (cobalamin) med angivelse af relevante funktioner af folinsyre og vitamin B12. b. Ville en samtidig tilsætning af vitamin B12 til madvarer løse problemet med maskering af mangel på vitamin B12?

Svar a. Mangel på vitamin B12 får følgende konsekvenser (i. & ii): i. Overførsel af methylgruppe fra methyl-H4-folat til homocystein blokeres. Derved “fanges” en betydelig del af folinsyre som ubrugeligt methyl-H4-folat. Den resulterende mangel på folinsyre påvirker DNA-omsætningen og udtrykker sig som anæmi; men denne mangeltilstand kan dog overvindes ved ekstratilførsel af folinsyre, hvilket viser sig ved en normalisering af blodbilledet. (Endvidere “fanges” en betydelig del af methionin som homocystein, hvilket kan udløse en sekundær mangel på methionin til proteinsyntese, som varigt skader nervesystemet). ii. Isomerisering af methylmalonyl-coA til succinyl-coA blokeres. En resulterende ophobning af methylmalonat hæmmer normal fedtsyresyntese, hvilket kompromitterer vedligeholdelse af nervesystemets membraner. Altså: Ekstra tilførsel af folinsyre kan medføre en normalisering af blodbilledet, der ellers ville være påvirket af B12-mangel. Derved kan varige senskader på nervesystemet udvikle sig. b. Nej! For oftest beror udvikling af peniciøs anæmi på en defekt optagelse af vitamin B12, hvilket kan skyldes defekt sekretion af “intrinsic factor” (IF) i maven eller en kronisk skade på tarmvæv. I begge tilfælde vil øget tilførsel af vitamin B12 være nærmest nytteløs.

manan.dk

Sommereksamen 2003, Biokemi

Nr. 3 Tre proteiner (A, B og C) indgår i en signaleringsvej, som medfører aktivering af et bestemt genregulatorisk protein. Protein A er et sekretorisk protein, der fungerer som ligand. Protein B er et plasmamembranprotein, med flere membrandomæner. Protein C er et intracellulært protein. Ved bindingsforsøg er det påvist, at N-terminalen af protein B kan binde til protein A og Cterminalen af protein B kan binde til protein C. 1. Skitser placeringen af protein B i plasmamembranen med angivelse af N- og C-terminal. Skitsen skal også vise protein B’s interaktion med henholdsvis protein A og C. Det skal fremgå, hvad der er extra- og intracellulær side. 2. Angiv hvor i cellen protein A, B og C syntetiseres, samt hvorledes de transporteres til deres funktionssteder. 3. Angiv kortfattet, hvordan cis-acting og trans-acting elementer samvirker ved initiering af transkriptionen af et proteinkodende gen og forklar hvordan frekvensen af transcriptionsinitieringen kan reguleres.

manan.dk

Sommereksamen 2003, Biokemi

Svar til nr. 3 1.

2. Protein A og B syntetiseres på ribosomer bundet til det endoplasmatiske reticulum og under translokationen indsættes protein B i ER membranen mens protein A frigives til ER lumen. Herfra transporteres proteinerne i vesikler til celleoverfladen via Golgi komplekset og ved exocytose frigives protein A til ekstracellulærvæsken mens protein B indsættes i plasmamembranen. Protein C syntetiseres af ikke membranbundne ribosomer i cytosol. 3. Et proteinkodende gen indeholder en promoterregion (cis-acting element) hvortil generelle transkriptionsfaktorer (trans-acting elements) samles og bindes. Disse sørger for at orientere RNA polymerase II korrekt, således at transkriptionen af genet kan starte. Hastigheden for initieringen kan reguleres ved, at andre gen-regulatoriske proteiner (trans-acting elements) bindes til genregulatoriske områder (cis-acting elements) kaldet enhancers eller silencers, der henholdsvis øger eller hæmmer initieringen af transkriptionen.

manan.dk

Sommereksamen 2003, Biokemi

Nr. 4 a. Beskriv den generelle struktur af proteoglycaner og af heparin. b. Beskriv virkningen af heparin på blodets koagulation og forklar virkningsmekanismen.

Svar a. Proteoglycaner består af en protein-del og en glycosaminoglycan-del, som er karakteriseret ved gentagne enheder af disaccharider. Disse enheder består typisk af en hexuronsyre og en hexosamin, der er bibragt negativ ladning som følge af N-acetylering eller sulfatering. Hele glycosamin-delen er således stærkt negativt ladet. Heparin er glycosaminoglycan-delen af et proteoglycan af heparansulfat-typen. b. Heparin er en antikoagulans. Det bindes til og aktiverer antithrombin, hvorved det prokoagulatoriske thrombin samt faktorerne IXa og Xa inaktiveres.

manan.dk

Sommereksamen 2003, Biokemi

Nr. 5 Et plasmamembranprotein er blevet isoleret og underkastet partiel hydrolyse. Herefter er nedenstående proteinfragment blevet oprenset og karakteriseret.

1. Det antages, at en del af det pågældende proteinfragment er forankret i membranen. Skitser/forklar hvordan fragmentet kan være lokaliseret i forhold til plasmamembranen? (Begrund svaret). 2. Vil proteinfragmentet vandre mod anoden (+) eller katoden (-) ved elektroforese ved pH 7,0? (Begrund svaret). Mængden af proteinfragment blev målt ved spektrofotometri på basis af dets indhold af tryptofan. I en cuvette med lysvej på 1,00 cm måltes en absorption på 0,253 ved 280 nm. Tryptophan har en molær absorptionskoefficient ved 280 nm på 5100 mol-1 × l × cm-1. Der var ialt 4,00 ml proteinfragmentopløsning. 3. Hvor mange mikromol proteinfragment blev der isoleret?

Svar 1. Den N-terminale del af peptidet kan eventuelt være forankret i membranen (flere hydrofobe aminosyrer) og resten af peptidet, med S-S binding of kulhydrater, findes på ydersiden. 2. Mod anoden (+), i sidekæderne er der 1 positiv ladning fra Lys og 4 negative ladninger fra 2 Asp, 1 Glu og 1 NANA. 3. Abs = 1 × c × abs. koefficient 0,253 = 1 × c × 5100 c = 0,0000496 mol/l 4 ml opløsning, 6 Trp 4 ml / 6 × 0,0000496 mol/l = 0,033 mikromol

manan.dk

Vintereksamen 2002/2003, Biokemi

Essayopgave Glucosehomeostase Besvarelsen skal indeholde: 1. En beskrivelse af glucosehomeostasen efter indtagelse af et kulhydratrigt måltid, herunder en beskrivelse af relevante hormoners og vævs rolle i denne sammenhæng. 2. En redegørelse for glucosehomeostasen i den postabsorptive fase, dvs. 6-12 timer efter sidste måltid. 3. En redegørelse for glucosehomeostasen under forløbet af en længerevarende faste. Besvarelsen skal indeholde en beskrivelse af de vigtigste adaptative ændringer på hormon- og enzymniveau.

manan.dk

Vintereksamen 2002/2003, Biokemi

Forslag til besvarelse af essayopgave 1. Efter indtagelse af et kulhydratrigt måltid vil blodglucosekoncentrationen stige væsentligt, hvorfor insulinsekretionen vil blive stimuleret, mens sekretionen af glucagon, adrenalin og cortisol vil blive hæmmet. Da insulin er et hormon, der fremmer anaboliske processer, vil der ske en øget deponering af energireserver i form af glycogen og fedt - og omvendt - en hæmning af disses katabolisme. I levervæv vil der således foregå en øget glycogenese, øget glycolyse, øget fedtsyresyntese og en øget indbygning af de nysyntetiserede fedtsyrer som triacylglyceroler i VLDL, der eksporteres til fedtvævet, mens gluconeogenesen og en eventuel ketonstofproduktion vil blive hæmmet/stoppet. I muskelvæv vil der ske en øget optagelse af glucose via insulin-stimuleret GLUT-4 og øget deponering af den optagne glucose som glycogen. Der er imidlertid en øvre grænse for, hvor meget glucose der kan deponeres som glycogen i muskelvæv, idet glycogensyntasen hæmmes af glycogen selv, når glycogenpartiklerne har nået en vis størrelse. I fedtvæv vil der også ske en øget optagelse af glucose via insulinstimuleret GLUT4, lipoproteinlipasen vil blive stimuleret førende til øget optagelse af fedtsyrer (fra VLDL) som sammen med glycerol-3-fosfat (dannet ud fra glucose) vil føre til øget triacylglycerolsyntese. Samtidig vil insulin hæmme den hormonfølsomme fedtvævslipase. Konklusion: i blodet vil koncentrationen af glucose altså være relativt høj umiddelbart efter måltidet, for derefter i løbet af nogle timer (den postprandiale fase) at falde tilbage til fasteniveauet (3,5-5,5 mM) som holdes relativt konstant selv ved længerevarende faste (se 3.). 2. I den postabsorptive fase (6-12 timer efter sidste måltid) vil glucosekoncentrationen i blodet som nævnt forblive relativt konstant trods tendensen til fald i koncentrationen som følge af den fortsatte forbrænding af glucose i extrahepatiske væv, især nervevæv og erythrocytter. Pancreas vil reagere på den faldende blodglucosekoncentration ved at nedsætte insulinsekretionen fra $-cellerne og øge glucagonsekretionen fra "-cellerne. Dette vil i leveren føre til en hæmning af glycogensyntesen og en stigning i glycogenolysen, således at størstedelen af glucose i blodet i denne fase stammer fra leverglycogen og resten fra gluconeogenese. Efterhånden som fasten skrider frem og leverglycogendepotet som følge heraf mindskes (efter 16-24 timer) vil bidraget fra gluconeogenesen øges. Pancreasresponset vil blive forstærket af den øgede afgift af adrenalin fra binyremarven, en afgift som i sig selv er betinget af et centralt nervøst respons på fasten (tendens til hypoglycæmi). Binyremarvens adrenalinsekretion vil desuden blive faciliteret af den øgede cortisolsekretion fra binyrebarken. Den øgede cortisolafgift vil ligeledes være forårsaget af et centralt nervøst respons på fasten (hypoglycæmien) og vil være medieret af en øget frigivelse af ACTH fra hypofyseforlappen. Det voksende bidrag fra gluconeogenesen skyldes de nævnte ændringer i hormonkoncentrationerne, som stimulerer centrale gluconeogenetiske enzymer (pyruvat carboxylase, PEP-carboxykinase, fructose1,6-bisfosfatase og glucose-6-fosfatase), mens de samtidig hæmmer glycogensyntese og glycolyse. Gluconeogenesen foregår først og fremmest i leveren og i mindre omfang i nyrerne og sker ud fra lactat, glycerol og visse aminosyrer som alanin og glutamin, sidstnævnte især i nyrerne. Lactat stammer hos personer i hvile især fra anaerob glycolyse i erythrocytter, aminosyrerne tilføres fra extrahepatiske væv, først og fremmest muskler og tarmceller, mens glycerolet stammer fra spaltningen af triacylglyceroler i fedtvævet (også stimuleret af de ændrede hormonkoncentrationer, se nedenfor).

manan.dk

Vintereksamen 2002/2003, Biokemi

3. Efter ca.1 døgns faste har gluconeogenesen således overtaget hovedrollen som leverandør af glucose til extrahepatiske væv og kunne teoretisk fortsætte hermed i flere dage/uger, men et sådant scenarium ville medføre katastrofale konsekvenser for organismen som helhed. De fleste af organismens væv kan som bekendt få en væsentlig del af deres energiforbrug dækket ved fedtsyreforbrænding, men hjernevæv er en undtagelse herfra, idet dette væv vanskeligt/ikke kan optage fedtsyrer fra blodet i et for energiforsyningen betydende omfang. Aminosyrer, der anvendes til gluconeogenese, stammer fra vævsproteiner, først og fremmest muskelproteiner, da der ikke findes egentlige aminosyre/proteindepoter, og hvis hjernevævet alene skulle dække sit energiforbrug under fasten ved glucose og aminosyreforbrænding, måtte der ske en samtidigt forløbende gluconeogenese ud fra vævsproteiner af en sådan størrelse, at det hurtigt ville få fatale følger. Det er derfor en fordel, at hjernevæv under en længerevarende faste adapteres til at dække en del (over halvdelen) af sit energiforbrug ved ketonstofforbrænding. Den stigende ketonstofproduktion i leveren under en længerevarende faste er et resultat af det øgede glucagon/insulin ratio, der dels bevirker en øget mobilisation af fedtsyrer fra fedtvævet (på grund af aktivering af den hormonfølsomme lipase) med stigende koncentration af fedtsyrer i plasma til følge, dels bevirker en øget transport af fedtsyrer ind i levermitochondrier (på grund af nedsat aktivitet af acetylcoA carboxylase, der fører til nedsat koncentration af malonylcoA og dermed nedsat hæmning af carnitin-acyl-transferaser). Den øgede $-oxidation af fedtsyrerne fører til øget produktion af acetylcoA, der omsættes til ketonstoffer og forbrændes i extrahepatiske væv, først og fremmest muskler og hjernevæv. Selv om erythrocytter helt og hjernevæv delvist er afhængig af en vedvarende tilførsel af endogent produceret glucose, vil man på grund af ovennævnte metaboliske adaptationer være i stand til at opretholde en tilstrækkelig høj glucosekoncentration i blodet i flere måneder, afhængigt af fedtdepoternes størrelse.

manan.dk

Vintereksamen 2002/2003, Biokemi

Nr. 1 Glutathion er sammensat af de tre aminosyrer glutaminsyre (2-aminopentandisyre), cystein og glycin i den nævnte rækkefølge. Strukturformlerne ved neutralt pH er anført i nævnte rækkefølge:

a. Skriv strukturformlen for glutathion ved pH 7.4, idet det kan oplyses at bindingen fra glutaminsyre involverer 5-carboxylsyregruppen. Karakteriser de to indgående bindinger. b. Angiv glutathions rolle i organismen, og opskriv mindst to reaktioner, hvori glutathion indgår. Navngiv også de (to) indgående enzymer.

Svar: a.

betegnes herefter: GSH

b. GSH er involveret i adskillige antioxidant systemer specielt i RBC, da den indeholder en SH- gruppe som bl.a. kan inaktivere H202ved at reducere H202 til H20 eller kan gendanne cystein-SH grupper i proteiner og enzymer og holde dem på den funktionelle reducerede tilstand, hvis de er blevet oxideret til cystiner (cystein dannet disulfider). 1) Glutathion peroxidase katalyserer reduktionen af H202 (og andre peroxider) dannet i cellerne og samtidig bliver GSH oxideret til GSSG glutathion peroxidase

H2O2 + 2 GSH

2 H2O + GSSG

2) Gendannelsen af den reducerede form af GSH katalyseres derefter med glutathion reduktase: glutathion reduktase

GSSG + NADPH2

2 GSH + NADP+

(3) GSH kan medvirke ved inaktiveringen af den skadelige forbindelse methylglyoxal til laktat samt medvirke ved andre biotansformationer (detoksifikationsreaktioner)).

manan.dk

Vintereksamen 2002/2003, Biokemi

Nr. 2 ApoB er et protein der indgår i lipoprotein komplekser, som transporterer bl.a. kolesterol rundt i blodet. ApoB findes i to former. En som produceres i leveren og består af 4536 aminosyrer, og en som produceres i tarmen og består af 2152 aminosyrer.

a) Hvordan kan man bestemme størrelsesforskellen mellem de to proteiner? mRNA for de to proteiner har samme størrelse og er dannet fra det samme gen. Forskellen i størrelsen af proteinerne skyldes, at tarmen indeholder et sekvensspecifikt enzym (cytidin deaminase) der omdanner én cytosin til uracil i ApoB mRNA'et. Cytidin deaminasen binder specifikt til nedenstående sekvens, der koder for aminosyrerne 2149 til 2158. 2149 2150 2151 2152 2153 2154 2155 2156 2157 2158 ACA UAU AUG AUA CAA UUU GAU CAG UAU AUU Thr Tyr Met Ile Gln Phe Asp Gln Tyr Ile b) Hvordan kan cytidin deaminase-aktiviteten forklare, at ApoB fra tarmen består af netop 2152 aminosyrer? Celler fra patienter som lider af arvelig forhøjet kolesterol niveau i blodet (familiær hyperkolesterolæmi) optager mindre kolesterol end tilsvarende celler fra raske. c) Giv en eller flere mulig(e) forklaring(er) på, hvorfor celler fra patienter med arvelig hyperkolesterolæmi optager mindre LDL-kolesterol.

manan.dk

Vintereksamen 2002/2003, Biokemi

Svar til nr. 2: a) Størrelsesforskellen mellem de to proteiner kan analyseres ved en simpel gelelektorforese (SDSPAGE) såfremt man har de to proteiner i oprenset form. Findes proteinerne i vævsekstrakter kan størrelsesforskellen analyseres udfra et Western Blot, ved anvendelse af specifikke antistoffer rettet mod de to proteiner. b)

2149 2150 2151 2152 2153 2154 2155 2156 2157 2158 ACA UAU AUG AUA CAA UUU GAU CAG UAU AUU Thr Tyr Met Ile Gln Phe Asp Gln Tyr Ile UAA stop

Koden for Gln (position 2153) er CAA. Ved deaminering af cytidin dannes et stopkodon (UAA), som bevirker at ApoB48 kun bliver 2152 aminosyrer langt. c) Kolesterol bliver optaget af cellerne vha. receptor medieret endocytose, så mulige forklaringer kunn være: ingen ekspression af receptor, ingen binding af lipoprotein komplekser til receptor, ingen internalisering af lipoprotein/receptor komplekserne.

manan.dk

Vintereksamen 2002/2003, Biokemi

Nr. 3 Ved galactosæmi som følge af mangel på Gal-1-fosfat uridyl-transferase akkumuleres galactose og Gal-1-fosfat i vævene. Høje koncentrationer af Gal-1-fosfat hæmmer enzymet fosfoglucomutase. Beskriv, hvorledes denne hæmning kan medvirke til udvikling af hypoglykæmi og ikterus hos nyfødte med Gal-1-fosfat uridyltransferase mangel. Begrund svaret og anfør de for besvarelsen relevante reaktionsskemaer.

Svar

Hypoglycæmi: ved hæmning af fosfoglucomtase, der katalyserer processen glucose-6-fosfat ø glucose-1-fosfat vanskeliggøres mobilisationen af glucosylgrupper fra leverglycogen og dermed ses tendens til hypoglycæmi. Icterus: ved hæmning af fosfoglucomutase nedsættes syntesen af UDP-glucuronat via UDPglucose. Nedsat UDP-glucuronat fører til nedsat afgiftningsfunktion i leveren, bl.a. af bilirubin og dermed ophobning af (ukonjugeret) bilirubin i vævene.

manan.dk

Vintereksamen 2002/2003, Biokemi

Nr. 4 a. Forklar hvordan en vækstfaktor kan medføre aktivering af Ras og beskriv de væsentligste elementer i den kaskade, der kan føre til aktivering af transkriptionsfaktorer med det resultat, at cellen indtræder i S-fasen. b. Giv en mulig forklaring på at stoffer, der hæmmer DNA syntesen, kan anvendes i behandlingen af forskellige kræftformer.

Svar a. Vækstfaktor-induceret fosforylering af tyrosinrester i vækstfaktor-receptorens cytoplasmatiske del (herunder krydsfosforylering, fordi binding af vækstfaktoren medfører dimerisering af receptoren) medfører binding af et adaptor protein, et protein der stimulerer Ras GDP/GTP udveksling, samt membran-associeret Ras-GDP. Det dannede Ras-GTP igangsætter en kaskade af proteinkinaser, der ender i den til cellekernen translokerede Mitogen Aktiverede Protein Kinase. Fosforylering af transkriptionsfaktorer (aktivering af “early” og “late genes”) fører til dannelse af et cyklin, og cyklin-CDK kompleks medfører (hyper)fosforylering af retinoblastom proteinet. Dermed bortfalder hæmningen af den genaktivering, der er bestemmende for overgang til S-fase. b. Kræftceller bringes til stadighed over G0/G1 tærsklen og i S-fase, eksempelvis ved ovenstående mekanisme, og er derfor afhængige af DNA syntese. I modsætning hertil er normale celler ofte i G0 fase (hvilken fraktion afhænger af celletypen) og er derfor ikke afhængige af DNA syntese.

manan.dk

Vintereksamen 2002/2003, Biokemi

Nr. 5 Aktiviteten af lactatdehydrogenase i en serumprøve kan bestemmes ved at måle hastigheden for reduktion af pyruvat ved to forskellige koncentrationer. Til 2 kuvetter (med 1,000 cm lysvej) indeholdende 2,90 mL phosphatbuffer med pyruvat (i forskellig koncentration) og NADH2 sættes 0,10 mL af serumprøven. Umiddelbart efter måles, ved 340 nm, de initiale ændringer i reaktionsblandingernes absorption som funktion af tid ()A340min-1). Samhørende værdier af pyruvatkoncentrationer og )A340min-1 er: pyruvatkoncentration: 0,20 mmol L-1 0,30 mmol L-1

)A340min-1 -0,036 -0,042

En NADH2-opløsning med koncentrationen 1,00 mol L-1 har en absorption ved 340 nm på 6300, når lysvejen er 1 cm. Endvidere antages den LDH-katalyserede reaktion at følge Michaelis-Menten kinetik. a. Beregn KM og Vmax for LDH i prøveopløsningen (kuvetten). b. Beregn LDH-aktiviteten (:mol L-1 min-1) i serumprøven.

manan.dk

Svar til nr. 5

Vintereksamen 2002/2003, Biokemi

manan.dk

Sommereksamen biokemi, 17. juni 2002

Essayopgave Huntingtons sygdom (HD) er en nedarvet neurodegenerativ sygdom. Mutationen som forårsager HD findes i genet for proteinet Huntingtin og er en ekspansion i antallet af trinukleotid sekvensen CAG som koder for glutamin. Hos raske individer findes der 15 til 30 CAG repeats inde i genet for Huntingtin. Hvis genet derimod indeholder ca. 40 eller flere af disse CAG repeats vil personen udvikle sygdommen Huntington. Jo længere polyglutamin sekvensen er i proteinet Huntingtin (dvs. hvor mange gange CAG sekvensen er repeteret i genet) des tidligere vil individet udvikle sygdommen. Det skal oplyses, at hele DNA sekvensen af genet for Huntingtin kendes. Sekvensen i den kodende streng omkring CAG repeatene ser således ud: 5' . . . AAG TCC TTC CAG (CAG)x CAG CAA CAG CCG CCA . . . 3' x = 15-30 gange hos raske individer x = 40-100 gange i syge individer 1. Definer punktmutation, insertion, deletion og frameshift-mutation. Hvilken type mutation giver anledning til dannelse af sygdomsfremkaldende Huntingtin? 2. Det viste sekvensudsnit af genet for Huntingtin er den kodende streng (også kaldet sense strengen). Skriv sekvensen for den komplementære DNA streng (også kaldet skabelon eller antisense streng) samt det tilsvarende stykke mRNA, der opnåes efter transcription. 3. Definer cis-acting og trans-acting elements og brug termerne til at forklare, hvorledes RNA polymerasen bindes til DNA strengen, før transcriptionen finder sted. 4. Beskriv hvordan man kan bruge PCR til at diagnostisere Huntington’s sygdom. Det skal fremgå, om man kan bruge denne metode til at give et overblik over antallet af CAG repeatene eller om metoden kun resulterer i svaret ‘normalt/ikke normalt’ gen. Som hjælp kan det anføres, at brugen af agarose-gelelektroforese indgår i metoden.

Forslag til besvarelse 1. Punktmutation: En enkelt base på DNA strengen er ændret. Insertion: Den oprindelige DNA sekvens har fået indbygget en eller flere nye baser. Deletion: Den oprindelige DNA sekvens har mistet en eller flere baser. Frameshift-mutation: frameshift-mutationen er et resultat af insertions eller deletions mutationer som medfører en ændret læseramme og dermed en hel anden primær protein sekvens, for den del af proteinet der kodes af DNA sekvensen der ligger downstream for mutationen (C-terminalt i proteinet). Insertion eller deletion af henholdsvis 3, 6, 9, ... (sammenhængende) baser osv. resulterer dog ikke i frameshift (men nok i en ændret aminosyresekvens).

manan.dk

Sommereksamen biokemi, 17. juni 2002

Mutationen der findes i huntingtin er en insertionsmutation. 2. Kodende: 5' . . . AAG TCC TTC CAG (CAG) x CAG CAA CAG CCG CCA . . . 3' 3' . . . TTC AGG AAG GTC (GTC) x GTC GTT GTC GGC GGT . . . 5' Skabelon: mRNA: 5' . . . AAG UCC UUC CAG (CAG) x CAG CAA CAG CCG CCA . . . 3' 3. Cis-acting elements er de DNA sekvensmotiver som kan binde de proteiner der kontrollerer transcriptionsprocessen. Der er altså tale om promoter-, enhancer- og respons elementer. Trans-acting elements er de specifikke elementer (hovedsagelig proteiner) der interagerer med cis-acting elements. Til gruppen af trans-acting elements hører en række transcriptonsfaktorer som er nødvendige for at eukaryote RNA-polymeraser kan bindes til DNA’et. Et eksempel på en transcriptionsfaktor (Fig. 32.2 i bogen) er TATA-binding protein (TBP) som binder sig til TATA bokse (et cis-acting element) på DNA’et. Dette resulterer i en rekruttering af andre transcriptionsfaktorer der i fællesskab kan styre RNA polymerasen på plads så transcriptionen kan starte ved et defineret punkt. 4. Da genet der koder for Huntingtin proteinet kendes er det muligt at vælge et sæt primere på hver sin side af den repeterede CAG sekvens. En PCR-kørsel med disse primere med genomisk DNA som template vil resultere i to stykker dobbeltstrenget DNA (et fra hvert sit allele gen) med hver sin givne længde. Da DNA indeholder en negativ ladning på fosfat gruppen mellem hver ribose, vil det ved en agarose-gelelektroforese vandre mod den positive pol, således at de små stykker vandrer hurtigst. Ved brug af passende DNA størrelsesmarkør er det muligt at analysere længderne af det DNA der er blevet opformeret og dermed at udtale sig om ca. hvor mange CAG repeats der er.

manan.dk

Sommereksamen biokemi, 17. juni 2002

Nr. 1 a. Karakteriser de bindinger, der brydes og dannes i følgende reaktion:

b. Hvilken af de angivne energirige bindinger er mest energirig, når det kan oplyses at ovenstående reaktion har en positiv ændring i Gibbs’ frie energi ()GE’ > 0)? c. Giv eksempler på hvor og under hvilke forhold reaktionen forløber mod højre og hvor og under hvilke forhold den kan forløbe mod venstre.

Svar: a. Der brydes en fosforsyreanhydrid binding i ATP mellem beta og gamma afmærkningerne. Der dannes en blandet anhydridbinding mellem carboxylsyre og fosforsyre i position 1 i phosphoglycerat der så bliver til 1,3 bisphosphoglycerat. b. Da ændringen i Gibbs frie energi er positiv, vil det sige, at en ligevægt vil være forskudt til venstre (eller: når alle reagerende forbindelser i begyndelsen forekommer i lige store koncentrationer, vil reaktionen forløbe mod venstre). (Den viste (koblede) reaktion kan betragtes som summen af to delreaktioner: 1) ATP = ADP + Pi og 2) 3-phosphoglycerat +

manan.dk

Sommereksamen biokemi, 17. juni 2002

Pi = 1,3 bisphosphoglycerat. Den samlede ændring i Gibbs frie energi er summen af ændringen i Gibbs frie energi af de to delreaktioner. Ændringen i Gibbs frie energi i delreaktion 1) er negativ. Da den samlede Gibbs frie energi er positiv, må Gibbs frie energi for delreaktion 2) være mere positiv end delreaktion 1) er negativ!) Det vil sige, at der er mest energi i den blandede anhydridbinding (carboxylsyre og fosforsyre) i position 1, da den driver ligevægten mod venstre. c. I forbindelse med gluconeogenese, f.eks. i leveren, forløber den viste reaktion mod højre, mens reaktionen forløber mod venstre i forbindelse med glycolyse i erythrocytter og muskler.

manan.dk

Sommereksamen biokemi, 17. juni 2002

Nr. 2 Den nedenfor viste fedtsyre kaldes Eicosapentaensyre (EPA) og kan strukturelt karakteriseres ved symbolet: C-20:5 )5,8,11,14,17.

EPA, som indgår i syntesen af eicosanoider (ex.: prostaglandiner og thromboxaner), er en såkaldt betinget essentiel fedtsyre og karakteriseres derfor også ved den såkaldte ‘T-‘ eller ‘n‘nomenklatur. a. Til hvilken familie, angivet ved ‘T-‘ eller ‘n-‘, hører denne fedtsyre? b. Vis med angivelse af relevante reaktionstyper og medvirkende reaktanter/substrater, at EPA kan dannes udfra den essentielle fedtsyre, linolensyre, der kan karakteriseres ved symbolet: C-18:3 )9,12,15.

Svar: a.

T-3 familien eller n-3 familien

b. linolensyre 9

Forestring med coenzym A (kræver ATP)

9

Desaturering med O2 og NADH2

9 9 9 9

Elongering med Malonyl-coA (kræver ATP) reduktion med NADPH2 elimination af vand reduktion med NADPH2

9

Desaturering med O2 og NADH2 EPA

manan.dk

Sommereksamen biokemi, 17. juni 2002

Nr. 3 a. Efter dødens indtræden opstår efter et stykke tid en karakteristisk stivhed (rigor mortis) af musklerne. Giv en kort biokemisk beskrivelse af de forhold i sarcomeret som bidrager hertil. b. Myosin molekylet har to hængselsregioner (‘hinge regions’). Hvad er betydningen af denne struktur? c. Nævn et andet eksempel på et molekyle, som også har en hængselsregion, og nævn hvor regionen er placeret i dette molekyle.

Svar: a. Ved celledød er energiproduktion og ATP dannelse ophørt, hvilket bl.a. medfører at Ca2+ATPasen i sarcoplasmisk reticulum bliver inaktiv. Den lave koncentration af Ca2+ i sarcoplasma kan derfor ikke opretholdes. Binding af Ca2+ til troponin-C og efterfølgende konformationsændringer af troponin-komplekset og tropomyosin fører til at aktin blotter sine bindingssteder for myosin-ADP. Myosin og aktin bindes og aktin- og myosinfilamenterne kan nu ikke længere glide frit i forhold til hinanden. b. Funktionen af hængselsregionerne er at skabe fleksibilitet, så myosinhovedet kan vinkles forskelligt i forhold til resten af myosinmolekylet. Denne konformationsændring er nødvendig for bevægelsen af myosinfilamentet langs aktinfilamentet og dermed også for selve muskelkontraktionen. c. Hængselsregioner findes f.eks. også i immunglobuliner, hvor der er en hængselsregion i den tunge (H) kæde i Fc regionen.

manan.dk

Sommereksamen biokemi, 17. juni 2002

Nr. 4 Fire anæmi-patienter har behov for en blodtransfusion. De fire har blodtyperne 0, A, B og AB, men kun fuldblod af typen B er til rådighed. Med henblik på at undgå transfusionskomplikationer (antistofmedieret lysering af erythrocytter): a. Hvilke af patienterne kan modtage donorblodet i form af fuldblod og hvilke i form af vasket erythrocytkoncentrat? b. Kan man forestille sig, at eventuelle ‘uegnede’ recipienter kunne hjælpes gennem en enzymatisk forbehandling af donorerythrocytter? Begrund svarene.

Svar: a. Patienten med blodtype B vil naturligvis kunne modtage transfusion i form af fuldblod. Patienten med type AB er ganske vist ‘universel recipient’, men da donorfuldblodet indeholder anti-A som kan lysere recipientens egne erythrocytter, må infusion af vasket erythrocytkoncentrat være langt at foretrække. b. Patienterne med type 0 og A har naturligt forekommende antistoffer mod B og kan derfor ikke modtage donorblodet (hverken som fuldblod eller erythrocytkoncentrat). Forbehandling af vaskede erythrocytter med glykosidase (galactosidase) kan imidlertid fjerne den ekstra sukkerenhed (galactose) som påsat H-substans udgør blodtypen/antigenet B. Derved bliver kun H-substans tilbage og erythrocytterne er så at sige konverteret til type 0 (universel donortype) og kan gives til både type-0 og -A patienterne.

manan.dk

Sommereksamen biokemi, 17. juni 2002

Nr. 5 a. Beskriv hvordan sekretionerne af FSH og LH reguleres under forløbet af menstruationscyklus. b. Angiv, med begrundelse, eventuelle ændringer af FSH og LH koncentrationer i blodet hos postmenopausale kvinder i forhold til koncentrationerne i den tidlige follikelfase hos fertile kvinder.

Svar: a. Det hypothalamiske stimulus er GnRH for begge hypofysære hormoner, idet frekvens og amplitude formodes at regulere FSH og LH sekretioner differentielt. Inhibin secerneret i ovarier inhiberer FSH selektivt. (Progesteron udøver negativt feed back på GnRH, står ikke i Baynes). Hos fertile kvinder udøver østradiol enten hæmmende (‘tonic mode’) eller stimulerende (‘surge mode’) feed back på hypothalamisk/hypofysært niveau. Positivt feed back kræver en høj østradiol koncentration vedligeholdt et par dage og ses lige før ovulationen. (Den resulterende LH top udløser ovulationen). b. Hos postmenopausale kvinder er østrogen koncentrationen reduceret, og nedsættelse af det negative feed back medfører høje FSH/LH koncentrationer. Da follikler ikke modnes, kan østradiol ikke give anledning til positiv feed back.

manan.dk

Sommereksamen 2001, Biokemi

Essayopgave Kommunikation mellem celler Besvarelsen skal indeholde: 1. En oversigt over forskellige måder, hvorpå celler kan kommunikere. 2. En beskrivelse af overførsel af signaler via G-protein-associerede hormonreceptorer.

dk

3. En beskrivelse af overførsel af signaler fra hormoner, der kan passere plasmamembranen. Besvarelsen må gerne suppleres med tegninger, der kommenteres.

an .

Forslag til besvarelse

1. Hos multicellulære organismer kræves kommunikation mellem celler for at koordinere deres metaboliske aktiviteter og for at regulere deres vækst og deling, altså at imødekomme organismens behov som en helhed. Cellekommunikation kan foregå på 3 principielt forskellige måder:

an

a. Signalering ved hjælp af secernerede molekyler:

(1) endokrint: endokrine celler secernerer efter påvirkning af specifikke stimuli kemiske substanser, der efter diffusion gennem interstitielvæsken transporteres med blodet til relevante målceller. Sådanne forbindelser er hormoner i klassisk forstand.

m

(2) parakrint: andre celler secernerer kemiske forbindelser, der påvirker målceller i umiddelbar nærhed af den secernerende celle, og disse forbindelser når målcellerne ved diffusion gennem interstitielvæsken. (3) autokrint: nogle celler secernerer molekyler, der påvirker den secernerende celle selv, idet der findes receptorer for disse molekyler på plasmamembranen. Dette ses f.eks. i forbindelse med differentieringen af ensartede celler i et væv eller i forbindelse med visse T-lymfocytters reaktion i forbindelse med antigen stimulation. (4) synaptisk: nerveceller secernerer neurotransmittere, der diffunderer over den synaptiske kløft til den postsynaptiske membran, der kan tilhøre en anden nervecelle, en muskelcelle eller kirtelcelle.

b. Kontaktsignalering via plasmamembranbundne molekyler: mange celler udtrykker på plasmamembranens yderside receptorer, der reagerer med signalerende molekyler bundet til overfladen af naboceller. Denne direkte celle-celle-interaktion ses f.eks. i forbindelse med differentieringen under den embryonale udvikling og i forbindelse med

manan.dk

Sommereksamen 2001, Biokemi

T-lymfocytters cellemedierede immunreaktion, hvor T-celle receptorer binder antigene fragmenter bundet til overfladen af en antigenpræsenterende celle. c. Signalering via gap junctions (kræves ikke). Gap junctions er direkte kanaler mellem to nabocellers cytoplasma. De dannes ved, at de to naboceller hver har syntetiseret 6 ens proteiner (connexins), der placeret transmembranalt danner en hul cylinder med en diameter, der tillader fri passage af ioner og små organiske molekyler med en molekylvægt op til ca. 1 kDa. Gap junctions’ permeabilitet kan reguleres, bl.a. af den cytosylære Ca2+-koncentration.

dk

2. Polære hormoner som f.eks. peptidhormoner og katekolaminer, der ikke kan diffundere gennem plasmamembranen, bindes på ekstracellulærsiden til membranbundne receptorproteiner i de respektive målceller. Dannelsen af hormon-receptorkomplekset fører til en konformationsændring i receptorproteinet, der transmitterer signalet videre ved enten interaktion med et eller flere effektormolekyler, f.eks. membranbundne enzymer eller ionkanaler, eller ved aktivering af receptorens cytoplasmatiske domæne, der kan udvise protein kinaseaktivitet.

m

an

an .

G-protein-koblede receptorer: Mange plasmamembranbundne receptorer, måske de fleste, transmitterer signalet videre ved binding til guanin-nucleotid-bindende proteiner, såkaldte G-proteiner. G-proteiner er plasmamembranbundne (cytosolære) heterotrimere proteiner, dvs. bestående af tre forskellige subunits, kaldet ", $ og (. Ved dannelse af hormon-receptorkomplekset induceres en konformationsændring i receptorens cytoplasmatiske domæne, der medfører binding til det, indtil nu, inaktive G-protein. Binding af G-protein til receptoren medfører fraspaltning af GDP fra "-kæden, som i stedet binder GTP og dissocierer fra $(-kæderne. Den GTPbindende "-kæde er dermed “aktiv” og igangsætter den videre signalering typisk gennem aktivering (binding) af adenylat cyclase eller fosfolipase C. Adenylat cyclase stimulerer dannelse af cAMP, der aktiverer protein kinase A, fordi de regulatoriske subunits dissocierer fra. Aktiv protein kinase A fosforylerer andre intracellulære regulerende proteiner (downstream signaling). Fosfolipase C hydrolyserer fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat (PIP2) til inositol-1,4,5trisfosfat (IP3) og diacylglycerol (DAG). IP3 diffunderer til endoplasmatisk reticulum (ER) og aktiverer/åbner Ca2+-kanaler i ER’s membran, hvilket fører til øget efflux af Ca2+ fra ER, hvor Ca2+-koncentrationen er betydeligt højere end i cytosolen. Den øgede Ca2+-koncentration forskyder ligevægten mellem calmodulin og Ca-calmodulin mod Ca-calmodulin og dermed forskydes også ligevægten mod dannelse af Ca-calmodulin-afhængige protein kinaser. DAG diffunderer lateralt i plsmamembranen og bindes til protein kinase C, der også binder Ca2+ og omdannes til sin katalytisk aktive form.

3. Fedtopløselige (hydrofobe) hormoner som steroider, vitamin D, thyreoideahormoner og retinoider (derivater af vitamin A) er på grund af deres hydrofobe egenskaber i stand til at passere plasmamembranen ved simpel diffusion. I den relevante målcelle bindes hormonet derefter til et cytosolært/evt. nucleært receptorprotein, der indeholder flere domæner bl.a. et ligandbindende domæne (= hormonbindende domæne), et DNA-bindende domæne og et transcriptionsregulerende domæne. Ved binding af hormonet til dets specifikke receptorprotein ændres konformationen af dette, således at komplekset bliver i stand til at binde sig til specifikke regulatoriske DNA-sekvenser og dermed ændre transcriptionshastigheden af bestemte gener, forskelligt fra hormon til hormon.

manan.dk

Vintereksamen 2000/2001, Biokemi

Essayopgave Syntese og sekretion af extracellulære proteiner Besvarelsen skal indeholde: 1. En beskrivelse af opbygningen af de vigtigste komponenter (hovedkomponenter) involveret i proteinsyntese (translationen) (gerne ved hjælp af skitser der kommenteres).

dk

2. En redegørelse for initiering, elongering og terminering af proteinsyntesen (gerne ved hjælp af skitser der kommenteres).

an .

3. En redegørelse for de modifikationer det primært syntetiserede protein undergår, inden den endelige afgivelse til det extracellulære rum.

Forslag til besvarelse

1. De vigtigste komponenter involveret i proteinsyntese er: a) ribosomer (ribosomale partikler), b) messenger RNA (mRNA) og c) transfer RNA (tRNA).

an

ad. a) ribosomer Det funktionelle ribosom består af 2 ribosomale partikler, der for de eukaryote ribosomers vedkommende betegnes 40 S og 60 S. Hver partikel består af én (40 S partiklen) eller flere (60S partiklen) ribosomale RNA-kæder og et antal proteiner. Ved sammenslutning af de 2 ribosomale partikler dannes det funktionelle ribosom, der betegnes 80 S, og som indeholder en kløft eller spalte, hvortil mRNA bindes. Herudover findes to specifikke bindingssteder eller sites, hvortil tRNA’er bindes (se senere).

m

ad b) mRNA Eukaryot mRNA dannes ud fra en større primær RNA-kæde, der undergår omfattende posttranscriptionelle modifikationsprocesser, bl.a.: påsætning af metylguaninnucleotid i 5’-enden (5’-hætte), forlængelse af 3’-enden med en polyAkæde og sidst men ikke mindst en fraspaltning af introner og sammensplejsning af exonerne til en sammenhængende sekvens i den færdige mRNA. Det færdigtproducerede, translationsaktive mRNA består således (nævnt i 5’ÿ3’-retningen) af 5’-hætten, et forstykke mellem 5’-hætten og startcodon, den translaterbare sekvens inklusive start-codon og stop-codon, et efterstykke mellem stop-codon og polyA-kæden og endelig polyA-kæden. ad c) tRNA tRNA-molekyler består af en relativt kort RNA-kæde, der er foldet sammen med korte dobbelthelices i 3 (eller 4) hårnålestrukturer og i de to ender af tRNA-kæden, således at molekylet ofte beskrives som en kløverbladsstruktur, der er mere

manan.dk

Syge- og reeksamen, sommer 2000, Biokemi

overskuelig end den mere korrekte L-formede struktur. I den ene ende af den Lformede struktur, svarende til RNA-kædens 3’-ende, bindes den til den pågældende tRNA specifikke aminosyre, og i den anden ende, svarende til anticodon-løkken, findes den såkaldte anticodon, en trinucleotidsekvens, der danner baseparring med en komplementær trinucleotidsekvens, codonsekvensen, i en antiparallelt forløbende mRNA-kæde. Sammenkoblingen mellem tRNA og aminosyre katalyseres af aminoacyl-tRNA syntetase, hvoraf der findes 20, en for hver af de 20 aminosyrer, der bruges ved proteinsyntesen. Hver af de 20 aminoacyl-tRNA syntetaser er således specifikke med hensyn til såvel den reagerende tRNA med sin specifikke anticodonsekvens som den tilkoblede aminosyre. Selv om der findes 61 forskellige codons, der koder for de 20 aminosyrer, er det nødvendige antal af forskellige tRNA’er mindre end 61 på grund af wobble-hypotesen.

m

an

an .

dk

2. Proteinsyntesen (translationsprocesserne) begynder i cytosolen, hvor de nødvendige komponenter er tilstede: de 2 ribosomale partikler, det nødvendige antal tRNA "ladet" med hver deres specifikke aminosyre, de forskellige mRNA-kæder (en for hvert protein hos eukaryoter), de nødvendige enzymer/hjælpefaktorer, GTP mm. Initieringen af proteinsyntesen starter med, at tRNAMet og eIF-2 sammen med GTP bindes til den lille ribosomale subunit (40 S), hvorefter dette kompleks bindes til 5’-enden af mRNA og bevæger sig langs mRNA-kæden, indtil komplekset når start-codon, AUG, der netop bindes til anticodon i tRNAMet. I det sidste trin i translationsstarten bindes den store ribosomale subunit (60 S) til komplekset samtidig med at eIF-2 og GDP + fosfat spaltes fra, så der nu er samlet det færdige translationsaktive ribosom med Met-tRNAMet placeret i ribosomets peptidyl-site (Psite) og med aminoacyl-site (A-site) parat til at modtage den næste aminoacyl-tRNA. Disse 2 sites er lokaliseret på overfladen af 40 S-ribosomdelen på en sådan måde, at de to tRNAanticodons nødvendigvis er bundet til 2 nabostillede codons i mRNA-kæden. Som første reaktion ved elongeringen bindes den korrekte aminoacyl-tRNA (bestemt af codon-anticodon baseparring) til det frie A site, katalyseret af elongeringsfaktor EF-1" og under hydrolyse af GTP. En peptidyltransferase, lokaliseret til 60 S-ribosomdelen, katalyserer herefter overførslen af peptidylgruppen fra peptidyl-tRNA i P-site (i første omgang kun methionin, men senere hele den voksende peptidkæde) til aminoacyl-tRNA i A-site, og peptidkæden er dermed forlænget med en aminoacylgruppe. Derefter fraspaltes den "tomme" tRNA fra Psite, og ribosomet flyttes 3 nucleotider hen ad mRNA-kæden i dennes 5’ÿ3’ retning, og den nu forlængede peptidyl-tRNA (der fortsat er bundet til sin codon) flyttes fra A-site til P-site i ribosomet. Dette reaktionstrin, der er katalyseret af proteinkomplekset EF-2, sker også under hydrolyse af GTP. Scenen er nu sat med henblik på, at den næste aminoacyltRNA kan bindes til det nu "tomme" A-site (en ny codon i mRNA er rykket frem, så den sidder ud for A-site) og translationen fortsætter, indtil A-site når en af de 3 stopkoder. Ingen aminoacyl-tRNA kan bindes til de 3 stopcodons, og i stedet vil et proteinkompleks, kaldet termineringsfaktor eller release factor (RF), bindes til A-site sammen med GTP. Herved ændres ribosomets peptidyltransferase til en hydrolase, der spalter peptidkæden fra dens tRNA og dermed fra ribosomet. Til sidst spaltes de 2 ribosomale partikler, tRNA og mRNA-kæden fra hinanden, og hele processen kan begynde forfra med den samme eller en anden mRNA. 3. Syntese af extracellulære proteiner starter som beskrevet ovenfor, dog med det særlige kendetegn, at der tidligt syntetiseres en særlig N-terminal signalsekvens bestående af 20-30 overvejende apolære aminosyrerester. Denne signalsekvens og ribosomet bindes derefter til et kompleks bestående af protein og RNA, kaldet en signal recognition particle (SRP). SRP

manan.dk

Vintereksamen 2000/2001, Biokemi

m

an

an .

dk

med tilhørende signalpeptid og ribosom bindes derefter til en SRP-receptor, et integralt membranprotein i ER-membranen, således at ribosomet forbliver bundet til ERmembranens yderside, mens signalpeptidet indsættes som en løkke i ER-membranen ved hjælp af en proteintranslokator. Mens disse processer finder sted, er den fortsatte translation af mRNA-kæden mere eller mindre stoppet. SRP fraspaltes nu og translationen fortsætter med det resultat at den voksende polypeptidkæde føres ind gennem translokatorkanalen. På et tidspunkt spaltes signalpeptidet fra ved hjælp af en signalpeptidase, og polypeptidkæden foreligger frit i ER’s lumen. Herefter transporteres polypeptidkæden gennem ER og Golgiapparat samtidig med, at den undergår forskellige posttranslatoriske modifikationer: foldninger ved hjælp af chaperoner, dannelse af disulfidbindinger, glycosyleringer, hydroxyleringer, carboxyleringer m.v. Til sidst pakkes det færdige protein i vesikler ved afsnøring fra Golgi-apparatet og secerneres til extracellulærrummet ved exocytose.

manan.dk

Sommereksamen 2000, Biokemi

Essayopgave Ca2+-omsætningen Besvarelsen skal indeholde: 1. En angivelse af den cytosolære og den totale extracellulære koncentration af Ca2+, samt en angivelse af, på hvilke former Ca2+ cirkulerer i plasma.

dk

2. En angivelse af mindst 3 biokemiske eller fysiologiske funktioner af Ca2+ i organismen. For 2 af de valgte eksempler gives en redegørelse for calcium-ionens funktion. 3. En redegørelse for den hormonelle regulation af koncentrationen af Ca2+ i plasma.

an .

4. En angivelse af mindst 2 årsager til hypocalcæmi. For hvert af de valgte eksempler gives en forklaring på hypocalcæmiens opståen.

Forslag til besvarelse

an

1. Den intracellulære koncentration af Ca2+ i en hvilende, ustimuleret celle er ca. 10-7 M, mens totalkoncentrationen i ECV er ca. 2,2-2,6 mM. I ECV findes calciumioner fordelt på 3 former: 1) ca. 50% bundet til plasmaproteiner, først og fremmest albumin, 2) ca. 5% bundet komplekst til organiske anioner, specielt citrat, 3) ca. 50% som frit, ioniseret calcium. Det er den frie Ca2+, der er biologisk aktiv, og som reguleres inden for meget snævre grænser hos det enkelte menneske (se punkt 3).

m

2. Ca2+ har mange biologiske funktioner, bl.a.: 1) nødvendig for blodkoagulation 2) medvirker ved muskelkontraktion 3) medierer exocytose af neurotransmittere og af en række hormoner (bl.a. insulin) 4) regulerer andre sekretoriske processer 5) regulerer i forbindelse med calmodulin en række enzymers aktivitet m.v. 6) af betydning for neuro-muskulær irritabilitet ad. 1) blodkoagulation Ca2+ formidler etableringen af en nødvendig lokal koncentrationsforøgelse ved læsionsstedet af de carboxylerede koagulationsfaktorer (f.eks. II, VII, IX og X) dvs. dannelse af et enzym-substrat kompleks. Ca2+ danner 2 kompleksbindinger til fosfatidylserin i thrombocytmembranen og 2 kompleks-bindinger til de 2 carboxylatgrupper i Gla i koagulationsfaktoren. Herved fikseres koagulationsfaktorerne til thrombocytproppen. (En korrekt tegning af ovennævnte accepteres).

manan.dk

Sommereksamen 2000, Biokemi

ad 2) muskelkontraktion (tværstribet muskulatur) Stigende cytosolær Ca2+ (fra sarcoplasmatisk reticulum) medfører binding til troponin (TN-C) i troponin-tropomyosin komplekset. Troponin (TN-I) blokerer i hvile for binding mellem actin og myosin-hoved, men efter binding af Ca2+ ændrer troponin konformation og blokeringen bortfalder. ad 3) Exocytose af neurotransmittere I hviletilstanden er neurotransmitter-holdige vesikler bundet til microtubuli. Når aktionspotentialet (depolarisering) når nerveenden, åbnes Ca2+-kanaler, og indstrømmende Ca2+ medierer exocytose af neurotransmitteren, der diffunderer til receptorer i den postsynaptiske membran og formidler den videre effekt.

dk

3. Koncentrationen af Ca2+ i plasma reguleres af 3 hormoner: parathyreoideahormon (PTH), 1,25-dihydroxycholecalciferol og calcitonin.

an .

Vedrørende PTH: ved fald i plasmakoncentrationen af Ca2+ stimuleres syntese og sekretion af aktivt PTH (1-34). PTH øger koncentrationen af Ca2+ ved direkte virkning på knoglevæv og nyrer og indirekte virkning på tarmen (via 1,25-dihydroxycholecalciferol, se senere). I knoglevæv stimuleres osteoclastaktiviteten, hvilket medfører resorption af hydroxyapatit og dermed afgivelse af Ca2+ (og fosfat) til blodet. I nyrerne har PTH flere funktioner: 1) PTH fremmer reabsorptionen af Ca2+, dvs. urinens indhold af Ca2+ falder, 2) PTH mindsker reabsorptionen af fosfat, dvs. urinens indhold af fosfat stiger og 3) PTH er nødvendig aktivator for hydroxyleringen af 25-hydroxycholecalciferol til 1,25-dihydroxycholecalciferol.

an

Vedrørende 1,25-dihydroxycholecalciferol (1,25(OH)2D3: 1,25(OH)2D3 er et steroidhormon, der som nævnt dannes i nyrerne og som har effekter i tarmepithelceller og i knoglevæv. I tarmen stimulerer hormonet dannelsen af carrierproteiner og forøger dermed den aktive transport af Ca2+ og fosfat over den luminale membran. I knoglevæv har 1,25(OH)2D3 betydning for såvel optagelse som afgivelse af Ca2+ og fosfat.

m

Vedrørende calcitonin: peptidhormon, der dannes i de parafollikulære celler i gld. Thyreoidea. Calcitonins præcise biologiske rolle er ukendt, men sekretionen stimuleres af en stigning i koncentrationen af Ca2+ i serum. Calcitonin antages at hæmme osteoclasternes knogleresorption.

4. Blandt årsager til hypocalcæmi kan nævnes: 1) primær hypoparathyreoidisme, 2) vitamin D-mangel og 3) pseudohypoparathyreoidisme. ad 1) Primær hypoparathyreoidisme: kan skyldes atrofi af gld. parathyreoideae eller utilsigtet fjernelse af disse i forbindelse med thyreoideaoperation eller anden kirurgi på halsen. Resultatet af nedsat sekretion af PTH er nedsat osteoclastaktivitet, nedsat Ca2+- og fosfatabsorption fra tarmen og faldende Ca2+-koncentration i plasma. ad 2) Vitamin D-mangel: vitamin D-mangel som følge af for ringe tilførsel med føden er usædvanlig på en normal vesteuropæisk kost, og skyldes snarere malabsorption af fedt (tyndtarmslidelse) eller for ringe udsættelse for ultraviolet lys (ældre institutionaliserede, indvandrere der bærer traditionel klædedragt). Symptomerne er hypocalcæmi, sekundær hyperparathyreoidisme med øget afgift af PTH.

manan.dk

Syge-og reeksamen, vinter 1999/2000, Biokemi

Essayopgave Replikation og reparation af DNA Besvarelsen skal indeholde: 1. En beskrivelse af replikationsprocessens start, samt en beskrivelse af de involverede enzymer og deres substrater.

dk

2. En beskrivelse af en replikationsgaffel, herunder en beskrivelse af den kontinuerlige og diskontinuerlige replikation.

an .

3. En angivelse af eksempler på spontane ændringer i DNA-strukturen og en beskrivelse af de kemiske processer, der finder sted ved reparation af DNA.

Forslag til besvarelse

m

an

1. Ved replikationens startpunkt adskilles de to DNA-kæder i et kort stykke af dobbelthelixen, således at der til hver af de to kæder kan bindes dels replikationsenzymer, dels "hjælpeproteiner", der katalyserer de efterfølgende opsnoninger af spiralstrukturen. Replikationen starter med binding af en RNA-polymerase, kaldet primase, der katalyserer syntesen af en kort RNA-kæde ud fra ribonucleotiderne ATP, GTP, CTP og UTP, der trinvis tilkobles og danner de komplementære basepar A-U og C-G langs med hver af de to eksisterende DNAenkeltstrenge. RNA-polymerasen kan i modsætning til DNA-polymerasen starte en polynucleotidsyntese ved at fiksere det første 5’-nucleotid til en eksisterende DNA-enkeltstrengs startpunkt, og så bygge videre i retningen 5’ÿ3’ i den nysyntetiserede RNA-kæde, mens den eksisterende DNA-enkeltstreng aflæses i retningen 3’ÿ5’. Kæderne bliver altså antiparallelle. Replikationsprocessen fortsætter ud fra denne RNA-kæde, ved at en DNA-polymerase overtager kædeforlængelsen, når RNA-kæden indeholder ca. 10 nucleotider. Substraterne for DNA-polymerasen er deoxyribonucleotiderne dATP, dGTP, dCTP og dTTP, der danner komplementære basepar med DNA-skabelonstrengen, hvorefter der dannes en fosfatesterbinding mellem det sidst indkomne nucleotids 5’-fosfatgruppe og den "frie" 3’-OH-gruppe i den voksende DNA-kæde. I tilfælde af "forkert" N-baseparring, f.eks. som følge af tantomeri, vil det forkert parrede nucleotid blive fjernet af DNA-polymerasens 3’ÿ5’-deoxyribonuclease, der registrerer og specifikt borthydrolyser (fra 3’-enden) de deoxyribonucleotider, hvis N-baseparring med den eksisterende DNA-enkeltstreng mangler eller afviger fra den autoriserede N-baseparring med A-T og G-C. DNA-polymerase og 3’ÿ5’deoxyribonuclease kan dermed tilsammen både katalysere DNA-kædeforlængelsen og kontrollere og rette opståede fejl i denne proces. 2. Den Y-formede struktur, der opstår, hvor den oprindelige DNA-dobbeltstreng deles op i to adskilte enkeltstrenge, kaldes en replikationsgaffel, og ud fra replikationens startpunkt bevæger de to replikationsgafler sig til hver side gennem dobbeltstrengen, efterhånden som

manan.dk

Syge-og reeksamen, vinter 1999/2000, Biokemi

an .

dk

replikationen skrider frem. Da kædeforlængelse altid foregår i retningen 5’ÿ3’, og antiparallelt til den eksisterende DNA-enkeltstreng, kan der kun foregå en kontinuerlig nucleotidkædesyntese fra startpunktet og frem til replikationsgaflen langs den ene af replikationsgaflens to DNA-enkeltstrenge. Denne nysyntetiserede DNA-enkeltstreng kaldes leading strand. Langs den anden af de to eksisterende DNA-enkeltstrenge, der i første omgang er "ubesat", må en nucleotidkædesyntese derfor forløbe i retning fra replikationsgaflen mod replikationsstartpunktet. Når den "ubesatte" del af DNA-enkeltstrengen er tilstrækkelig lang, vil en RNA-polymerase nær replikationsgaflen starte en RNA-kædesyntese i retning væk fra gaflen mod replikationsstartpunktet. En DNA-polymerase afløser herefter primasen, som beskrevet ovenfor, og en DNAkædesyntese fortsætter, indtil den når frem til den først syntetiserede RNA-kæde i startpunktet. En sådan kort DNA-kæde, med synteseretning væk fra replikationsgaflen, kaldes et Okazaki-fragment. Processerne gentager sig, når replikationsgaflen har frigjort endnu et stykke af den eksisterende DNA-enkeltstreng. Sammenkoblingen af Okazakifragmenterne til en sammenhængende DNA-kæde foregår ved at en 5’ÿ3’-RNAse først borthydrolyserer den korte RNA-kæde, hvorefter DNA-polymerasen forlænger Okazakifragmentet frem til den tidligere syntetiserede DNA-kæde, og til sidst sammenkobler en DNA-ligase de to ender. Denne diskontinuerligt syntetiserede DNA-kæde kaldes lagging strand.

m

an

3. Der sker til stadighed - spontant eller fremprovokeret af ydre påvirkninger - en række forskellige ændringer i cellernes DNA. Som eksempler kan nævnes: 1) forkerte N-baseparringer som følge af tantomerisationer i forbindelse med replikationen (er omtalt tidligere), 2) hydrolytisk deaminering af N-baserne, mens de sidder bundet i DNA, 3) hydrolytisk fraspaltning af N-baser, specielt purinbaser og 4) ændringer som følge af påvirkning af mutagene eller carcinogene forbindelser, herunder ioniserende stråling og UV-lys. Langt de fleste af disse ændringer består dog kun i kort tid, idet et system af "reparationsenzymer" er i stand til at finde og eliminere ændringerne, så den oprindelige DNA-struktur reetableres. Reparationsenzymerne afsøger til stadighed hele DNA-strukturen for fejl, der derefter rettes i det omfang reparationsenzymerne kan gøre det. Reparationen foregår efter følgende princip: lokalisering, eliminering og erstatning. Når fejlen er lokaliseret, f.eks. som en uregelmæssighed/fejl i DNA-sekvensen, vil en nucleotidase borthydrolysere den beskadigede base eller et mindre stykke DNA omkring læsionsstedet, hvorefter en DNA-polymerase indsætter det eller de manglende komplementære nucleotider og til sidst kobler en DNAligase 3’-OH-gruppen på det sidst indsatte nucleotid til 5’-fosfatgruppen i den i forvejen eksisterende DNA-kæde. Det er forståeligt nok af afgørende betydning, at den ene af DNAkæderne i et beskadiget område er intakt, så DNA-polymerasen kan syntetisere en korrekt komplementær erstatningskæde.

manan.dk

Vintereksamen 1999/2000, Biokemi

Essayopgave Pentose-fosfatvejen og dens betydning i stofskiftet Besvarelsen skal indeholde: 1. En beskrivelse ("definition") af pentose-fosfatvejen, herunder en angivelse af reaktionssekvensens intracellulære lokalisation, og en redegørelse for de metaboliske formål med reaktionssekvensen.

dk

2. En angivelse af NADPH-afhængige reaktioner i syntesen af fedtsyrer, cholesterol og steroide hormoner.

an .

3. En beskrivelse af NADPH’s betydning for reduktionen af glutathion, samt en redegørelse for betydningen af opretholdelse af en høj GSH/GSSG koncentrationsratio i cellerne, bl.a. i erythrocytter. 4. En beskrivelse af syntesen af 5-fosforibosyl-1-pyrofosfat (PRPP), herunder en redegørelse for regulationen af det katalyserende enzym.

Forslag til besvarelse

an

1. Pentose-fosfatvejen er en alternativ vej for katabolisering af glucose. Reaktionssekvensen falder i 2 dele: 1) glucose-6-fosfat ÿ pentose-5-fosfat med 2 redoxprocesser, der begge bruger NADP+ som coenzym (NADP+ ÿ NADPH).

m

2) pentose-5-fosfat ÿ fructose-6-fosfat og triose-fosfat ÿ tilbage til glycolysen.

Pentose-fosfatvejens enzymer findes udelukkende i cytosolen, og det producerede fructose-6-fosfat og triose-fosfat kan derfor direkte indgå i den glycolytiske omsætning. Pentose-fosfatvejen er i sig selv uden kvantitativ betydning for cellernes ATP-produktion. Pentose-fosfatvejens betydning for cellernes metabolisme ligger i det væsentlige i, at der for det første dannes ribose-5-fosfat, som bruges i cellernes nucleotidsyntese. Det er derfor sandsynligt, at alle nucleotidsyntetiserende celler kan omsætte glucose via denne vej. For det andet er pentose-fosfatvejen den kvantitativt vigtigste kilde til dannelse af NADPH, der indgår i mange extramitochondrielle reduktionsprocesser. I celler med særligt stort NADPH-forbrug vil en større del af glucose-6-fosfatomsætningen derfor kunne forløbe via pentose-fosfatvejen (se 2.).

manan.dk

Vintereksamen 1999/2000, Biokemi

2. Fedtsyre syntese: Fedtsyre syntase bruger 2 NADPH ved reduktion af en 3-ketoacylgruppe til en mættet acylgruppe i 2 reaktioner: 1) 3-ketoacyl + NADPH ÿ 3-hydroxyacyl + NADP+ og 2) 2-umættet acyl + NADPH ÿ mættet acyl + NADP+

dk

Da denne sekvens af reaktioner forløber 7 gange ved syntesen af palmitat (16 Catomer), bruges ialt 14 NADPH. Hertil kommer NADPH ved eventuel kædeforlængelse. Cholesterol syntese: HMGcoA reduktase forbruger 2 NADPH ved reduktion af HMGcoA til mevalonat (reduktion af en carboxylgruppe til en primær alkolgruppe). Steroidhormon syntese: Hydroxyleringsreaktioner i forbindelse med syntesen af visse steroide hormoner katalyseres af monooxygenaser (hydroxylaser) af cytochrom P450 klassen, der kræver NADPH som elektrondonor. 3. Reduktionen af oxideret glutathion til reduceret glutathion katalyseres af glutathion reduktase med NADPH som coenzym:

an .

GSSG + NADPH + H+ ÿ 2 GSH + NADP+

m

an

Reduceret glutathion (GSH) fungerer bl.a. som elektrondonor ("antioxidant") i den af glutathion peroxidase-katalyserede reaktion, der mindsker koncentrationen af H2O2 i cellerne. H2O2 dannes i cellerne først og fremmest ved oxidase-katalyserede reaktioner, men derudover dannes også en del ud fra superoxid (O2!). Superoxid-anionen dannes således ved oxidation med O2 af Hb(Fe2+) i hæmoglobin til Hb(Fe3+) i methæmoglobin. Superoxid dismutase katalyserer omdannelse af det dannede O2! til hhv. O2 og H2O2, hvorefter H2O2 fjernes ved hjælp af glutathion peroxidase, men O2! kan også reagere med H2O2 og danne det meget aggressive hydroxylradikal (OH!). Disse radikaler destruerer cellulære komponenter som f.eks. polyumættede fedtsyrer i cellemembraner og blodplasmas lipoproteiner ved at starte en kædereaktion af autooxidationer af disse fedtsyrer. Da pentose-fosfatvejen er den vigtigste kilde til NADPH-dannelse i erythrocytter, er pentosefosfatvejen af afgørende betydning for disse celler, og nedsat NADPH-dannelse kan føre til forøget destruktion af lipider i erythrocytmembranen med celledød og anæmi til følge. Endvidere vil tilstedeværelsen af reduceret glutathion være afgørende for opretholdelsen af visse enzymers og membranproteiners funktionelt vigtige HS-grupper på den reducerede form.

4. PRPP dannes ved pyrofosforylering af ribose-5-fosfat, som dannes i pentose-fosfatvejen. Katalyseret af PRPP syntetase fås: ribose-5-fosfat + ATP ÿ PRPP + AMP Ved syntesen af nucleotider såvel de novo (både purin- og pyrimidinnucleotider) som ud fra frie purinbaser, stammer nucleotidernes 5-fosforibosyldel fra PRPP. PRPP-syntesen er et flux-bestemmende trin i nucleotidomsætningen, og PRPP syntetasens aktivitet reguleres modulatorisk ved feed-back hæmning af mononucleotider som AMP, ADP, GMP, UTP m.fl.

manan.dk

Syge- og reeksamen sommer 1999, Biokemi

Essayopgave Lipider: fordøjelse, absorption og transport Besvarelsen skal indeholde: 1. En angivelse af de vigtigste lipider i kosten.

dk

2. En beskrivelse af hovedtrækkene i lipiders fordøjelse og absorption, herunder en angivelse af produkter for de af lipidspaltende enzymer katalyserede reaktioner samt en beskrivelse af funktionen af fedtsyreanioner og galdesalte i forbindelse med emulgeringen af fedt. 3. En beskrivelse af det enterohepatiske kredsløb af galdesalte og cholesterol, herunder galdesaltenes konjugering med aminosyrer.

an .

4. En angivelse af de forskellige transportformer af lipid i blodet og en inddeling af disse transportformer på grundlag af deres densitet samt en redegørelse for deres opbygning og funktion.

Forslag til besvarelse

an

1. Over 90% af en gennemsnitlig dansk kosts lipider er triacylglyceroler, mens resten udgøres af cholesterol, cholesterolestere, fosfolipider og fedtopløselige vitaminer. Kostens lipider udgør aktuelt 40-50% af energitilførslen.

m

2. Lipidernes fordøjelse omfatter hydrolyse af triacylglyceroler, katalyseret af lipaser, hvoraf pancreaslipase er den kvantitativt vigtigste. Lipaserne katalyserer hydrolysen af triacylglyceroler i 1- og 3-stillingen, hvorved der dannes frie fedtsyrer og 2-monoacylglycerol. Produkterne er svagt amfifile og deres apolære del opløses i fedtdråberne, mens de polære dele vender ud mod vandfasen. Dette starter emulgeringen af kostens fedtdråber. I duodenum fremmes emulgeringen yderligere af de med galden tilførte galdesalte, der er stærkt amfifile. Herefter fortsætter hydrolysen af triacylglycerolerne, og cholesterolestere hydrolyseres af cholesterolesterase til cholesterol og frie fedtsyrer, og fosfolipider hydrolyseres af fosfolipase A2 til lysofosfatider og frie fedtsyrer (spaltning af esterbindingen ved C-atom nr. 2 i glyceroldelen). Hydrolyseprodukterne fra lipidfordøjelsen danner på grund af deres svage amfifile egenskaber efterhånden såkaldte blandingsmiceller med de stigende mængder af tilførte galdesalte. Blandingsmicellerne diffunderer gennem vandhinden, der findes på tarmcellernes luminale overflade, hvorefter hydrolyseprodukterne sammen med frit cholesterol og fedtopløselige vitaminer, der er opløst i blandingsmicellernes indre, diffunderer over den luminale membran, specielt i duodenum og jejunum. Galdesaltene absorberes først i ileum (se ad 3.). 3. En betydelig del af cholesterol metaboliseres i leveren ved hydroxyleringer og oxidation til galdesaltene chenodeoxycholsyre og cholsyre. En del af disse konjugeres med glycin og

manan.dk

Syge- og reeksamen sommer 1999, Biokemi

taurin (sidstnævnte omdannelsesprodukt fra cystein) til de stærkt amfifile galdesalte glycoog taurocholat og glyco- og taurocheno-deoxycholat. Disse udskilles sammen med bl.a. cholesterol til tarmkanalen via galden, hvor de som nævnt anvendes ved emulgeringen og dannelsen af blandingsmiceller. Hovedparten (ca. 90%) af galdesaltene reabsorberes som nævnt i ileum, afgives til v. porta og returneres til leveren, hvorefter processen starter forfra. En del af den udskilte cholesterol, sammen med kostens cholesterol, omdannes mikrobielt til forskellige steroider, der ikke kan absorberes, mens resten delvist absorberes. Den ikke absorberede del udskilles med fæces, og sammen med ikke absorberede galdesalte repræsenterer dette en kvantitativ vigtig vej for cholesterolnedbrydning og -udskillelse fra organismen.

m

an

an .

dk

4. Efter resyntese af triacylglyceroler i tarmcellen indbygges disse sammen med de øvrige produkter fra lipidfordøjelsen, undtaget kortkædede fedtsyrer, i chylomikroner, der afgives ved exocytose til tarmens lymfekar. Disse lipoproteiner har et relativt højt indhold af triacylglyceroler i forhold til fosfolipid og protein, hvorfor deres densitet er lav. Deres vigtigste funktion er at transportere triacylglyceroler fra tarm til fedtvæv. Efter afgivelsen af størstedelen af triacylglycerolerne til fedtvævet optages chylomikronremnanterne med deres indhold ved receptormedieret endocytose i leveren. VLDL har ligeledes et relativt højt indhold af triacylglyceroler, men har et noget højere indhold af protein, fosfolipid og cholesterol end chylomikronerne, hvorfor deres densitet er noget højere. VLDL dannes i leveren og transporterer triacylglyceroler (kan stamme fra "overskuds"-kulhydrat eller fra fedtsyrer optaget fra blodet) og cholesterol fra lever til andre væv. Efter fjernelse af noget triacylglycerol fra VLDL interagerer disse med HDL (optager cholesterolestere, katalyseret af LCAT) og bliver selv via IDL omdannet til LDL, som har en højere densitet end VLDL. LDL optages dels i perifere væv, dels i leveren ved receptormedieret endocytose. HDL dannes i leveren som HDL-disks, skiveformede HDL-partikler, der består af aggregater af et fosfolipiddobbeltlag, hvortil er knyttet nogle apo-proteiner. Deres densitet er derfor højest af alle lipoproteiner. HDL-disks optager efterhånden mere og mere cholesterol, der diffunderer gennem extrahepatiske vævs plasmamembraner. De optages ligeledes i leveren ved receptormedieret endocytose.

manan.dk

Sommereksamen 1999, Biokemi

Essayopgave Proteinbehov og proteiners ernæringsmæssige værdi Besvarelsen skal indeholde: 1. En definition af behovet for proteintilførsel til mennesker, herunder en angivelse af de forhold, der har betydning for proteinbehovet.

dk

2. En angivelse af hvilke forhold, der er bestemmende for et proteins ernæringsmæssige værdi, herunder en beskrivelse af fremgangsmåden ved bestemmelse af et proteins chemical score, biologiske værdi og nettoproteinudnyttelse. 3. En forklaring på, hvorfor en mangel i kosten eller for lav indtagelse af en essentiel aminosyre fører til negativ N-balance.

an .

4. En angivelse af, hvilken betydning enzymdefekten ved sygdommen fenylketonuri har for patientens kostplan. Fenylketonuri er en arvelig sygdom karakteriseret ved mangel på fenylalanin hydroxylase.

an

P.S. Besvarelsen må gerne indeholde grafiske afbildninger.

Forslag til besvarelse

m

1. Ved proteinbehov for mennesker forstås behovet for tilførsel af specifikke mængder af (og forhold imellem) de essentielle aminosyrer og for tilførsel af total-N. Med det sidste menes, at det er ligegyldigt, om N-atomerne tilføres som ekstra aminosyre-N eller evt. som frie NH4+, da der ud fra disse N-kilder altid kan overføres N-atomer til andre C-skeletter, således at alle non-essentielle aminosyrer kan dannes. Proteinbehovet (under forudsætning af tilførsel af et idealt protein, se 2.) afhænger bl.a. af alder, køn og legemsstørrelse. Således har spædbørn et relativt langt større behov for proteintilførsel end raske voskne. Endvidere afhænger proteinbehovet af måltidshyppighed og af måltidernes sammensætning med hensyn til fordelingen af de energigivende næringsstoffer. Hvis f.eks. kulhydratindtagelsen er lav, skal der bruges flere aminosyrer til gluconeogenese, så blodglucosekoncentrationen bevares inden for normalområdet. Hvis måltidshyppigheden er sjælden, vil der ligeledes være forøget gluconeogenese fra aminosyrer. Hvis disse ekstra aminosyrer ikke er indeholdt i kostens proteiner, vil personen komme i negativ N-balance.

2. Et proteins ernæringsmæssige værdi afhænger af 1) aminosyresammensætningen, 2) fordøjeligheden og 3) det totale N-indhold. Bestemmelse af et proteins ernæringsmæssige værdi kan ske på to principielt forskellige metoder:

manan.dk

Sommereksamen 1999, Biokemi

a. ved kemisk analyse af indholdet af essentielle aminosyrer (chemical score). b. ved biologiske metoder, dvs. med anvendelse af forsøgspersoner eller forsøgsdyr (biologisk værdi eller nettoproteinudnyttelse). ad chemical score: ved denne metode udregnes for hver af de essentielle aminosyrer i det pågældende protein følgende ratio:

dk

gram essentiel aminosyre pr. 100 gram protein gram essentiel aminosyre pr. 100 gram referenceprotein Den aminosyre, der giver det laveste ratio, er den for proteinkvaliteten begrænsende (limiterende) aminosyre, og tallet angiver chemical score for det pågældende protein. ad biologisk værdi og nettoproteinudnyttelse: fremgangsmåden ved denne biologiske metode er følgende:

an .

a. En gruppe forsøgspersoner (eller -dyr) sættes på en proteinfri, men iøvrigt sufficient kost med hensyn til vand, salte, vitaminer og energi. Efter den indledende stærkt negative Nbalance stabiliserer denne sig i løbet af ca. 1 uge på ca. 0,3 mol N pr. døgn for voksne. b. Derefter tilføres gruppen gennem nogen tid en daglig, konstant, men i forhold til behovet, insufficient (suboptimal) mængde af testproteinet, og N-udskillelsen følges.

m

an

Har det tilførte protein en aminosyresammensætning, der nøjagtigt svarer til sammensætningen af de mistede vævsproteiner, vil al tilført protein kunne anvendes til genopbygning af vævsproteiner, og N-udskillelsen vil forblive uændret (ca. 0,3 mol N pr. døgn), hvis fordøjelse og absorption af testproteinet er fuldstændig. Har det undersøgte protein derimod en aminosyresammensætning (essentielle), der er forskellig fra de degraderede vævsproteiner, vil kun en vis mængde af de tilførte aminosyrer kunne anvendes til genopbygning af vævsproteiner. De overskydende aminosyrer vil blive kataboliseret, og N-udskillelsen vil stige. Endvidere vil en ufuldstændig fordøjelse og absorption medføre en forøgelse i fæces’ indhold af N. De undersøgte forhold kan nu anvendes til beregning af:

a.

den biologiske værdi (BV):

b.

nettoproteinudnyttelsen (NPU):

det i organismen retinerede N absorberet N det i organismen retinerede N indtaget N

NPU er altid mindre end eller lig med værdien for BV.

manan.dk

Sommereksamen 1999, Biokemi

dk

(Grafisk afbildning)

an .

3. Ved insufficient tilførsel af en af de essentielle aminosyrer (bare en enkelt) men tilstrækkelig tilførsel af total-N vil der opstå negativ N-balance. Dette kan forklares ved, at den pågældende essentielle aminosyre, der frigøres ved den kontinuerlige vævsproteinnedbrydning, i et vist omfang kan anvendes til syntese af andre N-forbindelser eller bliver kataboliseret/tabes med urinen. Dette vil umuliggøre nydannelse af vævsproteiner i normalt omfang, hvilket vil medføre, at andre aminosyrer end de pågældende essentielle vil blive i overskud og kataboliseret til carbamid og glucose/CO2 + H2O. Den negative N-balance vil stort set være af samme størrelse, uanset der mangler en eller flere essentielle aminosyrer i kosten, og være ca. 0,3 mol N pr. døgn.

m

an

4. På grund af enzymdefekten er denne person ikke i stand til at omdanne fenylalanin til tyrosin, hvorfor denne aminosyre nu bliver essentiel. Kostplanen må derfor indeholde tilstrækkelige mængder tyrosin.

manan.dk

Syge- og reeksamen , vinter 1998/99, Biokemi

Essayopgave Faste - måltid cyklus (starve - feed cycle) En person har fastet i 72 timer: 1. Beskriv det hormonelle respons på fasten m.h.t. de involverede hormoner, deres syntesested og deres regulation.

dk

2. Beskriv, hvordan de energidannende reaktionsveje i lever, muskler og fedtvæv reguleres af hormonerne. 3. Angiv karakteristiske ændringer i plasmas indhold af oxiderbare brændstofkomponenter hos den fastende person i forhold til en ikke-fastende, og gør rede for, hvilke væv der især optager/forbrænder de nævnte komponenter.

an .

Fasten ophører herefter med indtagelse af et solidt kulhydratrigt måltid.

4. Beskriv ændringerne i det hormonale respons som følge af fødeindtagelsen og baggrunden for disse ændringer.

an

5. Beskriv, hvordan de ændrede hormonkoncentrationer påvirker de energidannende reaktionsveje i lever, muskler og fedtvæv, og angiv karakteristiske ændringer i plasmas indhold af oxiderbare komponenter efter måltidet.

Forslag til besvarelse

Efter 72 timers faste vil glycogendepoterne i leveren være (næsten) tømte, og blodglucosekoncentrationen søges opretholdt ved gluconeogenese. Pancreas vil reagere på den faldende blodglucosekoncentration ved at hæmme insulinsekretionen fra $-cellerne og øge glucagonsekretionen fra A-cellerne. Pancreasresponset vil blive forstærket af den øgede afgift af adrenalin fra binyremarven, som i sig selv er betinget af et centralt nervøst respons på fasten (hypoglycæmien). Binyremarvens adrenalinsekretion vil desuden blive faciliteret af den øgede cortisolsekretion fra binyrebarken. Den øgede cortisolafgift vil ligeledes være forårsaget af et centralt nervøst respons på fasten (hypoglykæmien) og vil være medieret af en øget frigivelse af ACTH fra hypofyseforlappen.

m

1.

2.

Lever: Gluconeogenesen ud fra lactat, glycerol og aminosyrer, først og fremmest alanin, vil være kraftigt stimuleret, idet de nævnte ændringer i hormonkoncentrationerne stimulerer centrale gluconeogenetiske enzymer (pyruvat carboxylase, PEP-carboxykinase, fructose-1,6-bisfosfatase og glucose-6-fosfatase), mens de samtidig hæmmer glycogensyntese og glycolyse. Aminosyrerne (alanin) tilføres fra ekstrahepatiske væv, først og fremmest muskler og tarmceller, mens glycerolet stammer fra spaltningen af triacylglyceroler i fedtvævet (se nedenfor). Den store tilførsel af frie fedtsyrer til leveren overstiger langt leve-

manan.dk

Syge- og reeksamen , vinter 1998/99, Biokemi

rens behov for $-oxidation, således at der, sammen med de ændrede hormonelle betingelser, er skabt basis for en øget produktion af ketonstofferne acetoacetat og $-hydroxybutyrat. De producerede ketonstoffer afgives til blodbanen med henblik på forbrænding i ekstrahepatiske væv, først og fremmest hjerne og muskler. Ligeledes reeksporteres overskuddet af frie fedtsyrer, indbygget som triacylglyceroler i VLDL, tilbage til fedtvævet. Muskler: Glucoseoptagelsen er hæmmet af den lave insulinkoncentration og glycogendepotet vil være mere eller mindre depleteret. Det primære brændstof vil være fedtsyrer, som tilbydes i rigeligt mål. Glucoseforbrænding vil være mindre betydende, bl.a. fordi den øgede mængde acetylcoA fra $-oxidationen vil hæmme pyruvat dehydrogenasen. Cortisol vil fremme katabolismen af muskelproteiner, samt proteiner i andre væv, og de dannede aminosyrer vil afgives til blodbanen med henblik på gluconeogenese i leveren.

Af ovennævnte fremgår, at plasma hos en fastende person vil være karakteriseret ved at indeholde nedsatte mængder af glucose og øgede mængder af albuminbundne fedtsyrer, VLDL, ketonstoffer samt aminosyrer. De fleste væv vil forbrænde fedtsyrer, specielt lever og muskler. Hjernen vil forbrænde glucose (dannet ved gluconeogenesen i leveren), men også i stor udstrækning ketonstoffer (over halvdelen af energiforbruget kan dækkes af ketonstoffer). Muskelvæv forbrænder også ketonstoffer og en del af de frigivne aminosyrer.

an

3.

an .

dk

Fedtvæv: I fedtvævet vil der foregå en udtalt lipolyse katalyseret af den hormonregulerede fedtvævslipase, idet insulins hæmning er reduceret samtidigt med, at de øgede koncentrationer af noradrenalin og adrenalin (sammen med cortisol) vil inducere en aktivering af fedtvævslipasen. De frigivne fedtsyrer transporteres som albuminbundne fedtsyrer til en lang række væv, dog ikke hjerne, og forbrændes her. Den samtidigt med fedtsyrer frigivne glycerol transporteres til leveren med henblik på gluconeogenese. Glucoseoptagelsen i fedtvævet er reduceret på grund af den lave insulin, og syntesen af triacylglyceroler vil derfor være hæmmet.

m

4+5 Efter indtagelsen af det kulhydratrige måltid vil blodglucosekoncentrationen stige væsentligt, hvorfor insulinsekretionen vil blive stimuleret, mens sekretionen af glucagon, adrenalin og cortisol vil blive hæmmet. Da insulin er et hormon, der er udviklet til at fremme anaboliske processer, vil der ske en øget deponering af energireserver i form af glycogen og fedt samt stimulation af proteinsyntese - og omvendt - en hæmning af disses katabolisme. I levervæv vil der således foregå en øget glycogenese, øget glycolyse, øget fedtsyresyntese og en øget indbygning af de nysyntetiserede fedtsyrer som triacylglyceroler i VLDL, der eksporteres til fedtvævet, mens gluconeogenesen og ketonstofsyntesen vil blive hæmmet/stoppet. I muskelvæv vil der ske en øget optagelse af glucose og en øget deponering af den optagne glucose som glycogen. Nedbrydningen af muskelproteiner vil blive hæmmet/ophøre, og i stedet vil der indtræde en anabol tilstand med (gen)opbygning af muskelproteiner ud fra de med kosten tilbudte aminosyrer. I fedtvæv vil lipasen blive hæmmet af insulin som samtidig vil stimulere lipoproteinlipasen og optagelsen af glucose. Herved vil en øget mængde fedtsyrer og glycerolfosfat (dannet ud fra glucose) være til rådighed for triacylglycerolsyntese. I plasma vil glucosekoncentrationen være relativt høj umiddelbart efter måltidet for derefter at falde til normalniveauet på grund af insulinvirkningen. Koncentrationen af albuminbundne fedtsyrer og ketonstoffer vil falde til lave (postprandiale) værdier. Med

manan.dk

Syge- og reeksamen , vinter 1998/99, Biokemi

m

an

an .

dk

hensyn til koncentrationerne af VLDL og aminosyrer i plasma afhænger disse delvist af mængden af lipid og protein i det indtagne måltid.

manan.dk

Vintereksamen 1998/99, Biokemi

Essayopgave Muskelkontraktion Besvarelsen skal indeholde:

dk

1. En beskrivelse af muskelkontraktionens mekanisme, herunder de Ca2+-medierede mekanismer og en angivelse af de involverede proteiner i henholdsvis skeletmuskulatur og glat muskulatur. 2. En angivelse af dominerende, energigivende forbindelser i muskelvæv for personer i hvile og for personer under hårdt, kortvarigt muskelarbejde.

an .

3. En definition af iltgæld, og en beskrivelse af de kemiske processer, der er årsag til iltgælden.

Forslag til besvarelse

m

an

1. Skeletmuskulaturs kontraktion: I hvile danner myosinhovederne en vinkel på ca. 90E med myosinfilamentet (myosinhovederne er "energitiserede"). ATP, der er bundet til myosinhovederne, er hydrolyseret til ADP + fosfat, katalyseret af myosinhovedernes ATPase-aktivitet. På grund af den lave cytosolære koncentration af Ca2+ i hvile, ca. 10-7 M, vil der ikke være bundet Ca2+ til troponin-C, dvs. tropomyosin-troponin-komplekserne har en sådan konformation/struktur, at de blokerer for kontakt mellem myosinhoveder og aktin. Ved depolarisation af sarcolemma, inkl. T-tubuli, åbnes Ca2+-kanaler i sarcoplasmatisk reticulum (SR), og Ca2+ diffunderer til cytosol og bindes til TN-C i tropomyosin-troponin-komplekset, hvorved dette kompleks ændrer konformation, så aktin og myosinhoveder får mulighed for at komme i kontakt med hinanden. Fosfat spaltes fra myosinhovederne, og en konformationsændring i myosinskafterne fører til kontakt mellem myosin og aktin. ADP dissocierer fra myosinhovederne, og myosinhovederne vipper til ca. 45E i forhold til myosinskaftet. Herved rykkes aktinfilamenterne mod M-linien, og kontraktionen er begyndt. Herefter bindes ATP igen til myosinhovederne og kontakten mellem myosin og aktin ophører. ATP hydrolyseres og kontraktionen fortsætter, så længe Ca2+-koncentrationen er høj nok, dvs. ved fortsat stimulation. Efter ophør af depolarisationen lukkes Ca2+-kanalerne i SR, og den vedvarende aktive Ca-ATPase pumper Ca2+ tilbage til SR, og hviletilstanden indtræder. Glat muskulaturs kontraktion I glat muskulatur findes myosin, aktin og tropomyosin, men ikke troponin-I, -T eller -C. Endvidere har myosinhovederne i ikke-stimuleret glat muskulatur ingen ATPase-aktivitet. Regulationen af glat muskelvævs kontraktion og relaksation foregår ved, at myosinhovedernes ATPase aktiveres, henholdsvis inaktiveres. Aktivering af ATPasen og dermed initiering og vedligeholdelse af kontraktion sker, når en af de lavmolekylære polypeptider (p-

manan.dk

Vintereksamen 1998/99, Biokemi

light-chain myosin) i myosinhovedet bliver fosforyleret, mens defosforylering inaktiverer ATPasen, førende til relaksation. Efter depolarisation af sarcolemma diffunderer Ca2+ fra SR til cytosol og danner kompleks med calmodulin. Ca-calmodulin bindes til den inaktive myosinkinase, MKi, som derved aktiveres til MKa. MKa katalyserer fosforylering af plight-chain, der fører til aktivering af myosinhovedernes ATPase-aktivitet. Herefter foregår kontraktionen som beskrevet for skeletmuskulatur. Efter ophør af depolarisationen pumper Ca-ATPase Ca2+ tilbage til SR, Ca2+ dissocierer fra calmodulin, der frigøres fra myosinkinasen. En formentlig ureguleret fosfatase hydrolyserer fosfat fra p-light-chain myosin, og myosinhovedets ATPase inaktiveres. Herefter indtræder relaksation.

dk

2. I den hvilende muskel dækkes det relativt lave energiforbrug for det meste ved forbrænding af fedtsyrer, idet den tilsyneladende begrænsede hastighed for fedtsyreoptagelse i vævet er tilstrækkelig. Muskelvæv er i stand til at optage og forbrænde fedtsyrer med en hastighed, der op til en vis øvre grænse er tilnærmelsesvis proportional med fedtsyrekoncentrationen i blodet. Ved kortvarigt, hårdt muskelarbejde er ATP-forbrugshastigheden så stor, at kapaciteten for ATP-produktion ved oxidativ fosforylering overskrides, og muskelvæv må ty til "anaerob" ATP-produktion:

an .

a) creatin-fosfat + ADP ø creatin + ATP b) ADP + ADP ø ATP + AMP c) glycogen/glucose + ADP ÷ ATP + 2 lactat

Sidstnævnte proces er især stimuleret af den øgede koncentration af AMP, dannet ved b).

m

an

3. Efter det kraftige muskelarbejdes ophør skal depoterne af creatinfosfat og glycogen genopbygges, ligesom AMP skal omdannes til ADP og videre til ATP. Endvidere bliver en stor del af det dannede lactat omdannet til glucose i leveren. Alle de nævnte processer forbruger ATP, der fremskaffes ved oxidation af især fedtsyrer. Man kan derfor observere, at der er et øget iltforbrug i forhold til iltforbruget i hvile, nogen tid efter arbejdets ophør.

manan.dk

Syge- og reeksamen , sommer 1998, Biokemi

Essayopgave Jernomsætning Besvarelsen skal indeholde: 1. En angivelse af nogle forbindelser, i hvilke jern forekommer i kosten, og i hvilken form jern findes i disse forbindelser.

dk

2. En redegørelse for absorptionen af jernioner i tarmen, herunder hvorledes det samlede jernindhold i organismen reguleres. 3. En beskrivelse af transporten af jernioner i blodplasma og optagelsen af jernioner i cellerne.

an .

4. Eksempler på patologiske ændringer i organismens jernbalance, herunder årsager, symptomer og særligt udsatte befolkningsgrupper.

Forslag til besvarelse

an

1. Jern findes som hæm-bundne og non-hæmbundne jernioner, i størst mængde i brød (tilsat), kød og sild. Hæm- og hæminbundet jern optages som sådan, mens non-hæmbundet jern fradissocieres ved det lave pH i ventriklen og bindes til aminosyrer, succinat eller citrat. Jern, der skal absorberes, skal være på Fe2+, hvorfor Fe2+ må reduceres af kostkomponenter som f.eks. ascorbat og cystein.

m

2. I tarmepitelcellerne findes et proteinstof, apoferritin, som binder jernioner irreversibelt, og som sammen med det bundne jern tabes med fæces, når tarmcellen afstødes. Her reguleres organismens samlede jernindhold, idet der ved jernunderskud i organismen, dvs. hvis transferrinets (se 3.) mætningsgrad med jern er lav, syntetiseres mindre apoferritin, og flere af de optagne jernioner vil passere til blodbanen. Omvendt ved jernoverskud. 3. Efter optagelsen af jernionerne til blodbanen oxideres Fe2+ til Fe3+ af et enzym, ferrooxidase, for derefter at bindes til plasmaproteinet transferrin. Når jernionerne skal optages i en celle, bindes jern transferrin komplekset til en receptor på cellens overflade. Hele komplekset internaliseres og optages i lysosomerne. Det lave pH i lysosomerne muliggør reduktion af Fe3+ til Fe2+, der frigøres fra transferrinet. Receptor-transferrin komplekset vender tilbage til celleoverfladen, hvor transferrinet atter frigøres til blodplasmaet. 4. Hvis jerntabet, der er ureguleret, er større end jernabsorptionen, vil jerndepoterne blive tømt, og der opstår jernmangel, hvorved mængden af de jernholdige proteiner mindskes. Det vigtigste jernprotein er hæmoglobin, og det er derfor omkring dette stof de første symptomer på jernmangel opstår. Anæmi defineres som nedsat hæmoglobinmængde, men måles i praksis som nedsat hæmoglobinkoncentration eller nedsat hæmatokritværdi. Årsager til anæmi kan være 1) nedsat dannelse af hæmoglobin (nutritionelt eller f.eks.

manan.dk

Syge- og reeksamen , sommer 1998, Biokemi

m

an

an .

dk

nyresygdomme) eller 2) øget tab af hæmoglobin (blødninger, hæmolyse). Den hyppigste anæmiform er jernmangelanæmi og ses hos kvinder i den fertile alder, gravide og hos hurtigtvoksende børn; sjældnere hos mænd (ubehandlet mavesår). Den nutritionelt betingede jernmangelanæmi er sjældnere og ses hos spædbørn, der overgår fra kvindemælks- til komælksernæring på et tidligt tidspunkt, idet komælk kun har 10% af det jernindhold der er i kvindemælk. Endvidere er der en stor forskel på absorptionen af jern fra de to former for mælk. Hæmatokrit, hæmoglobinkoncentrationen og plasma-jern koncentrationen er alle nedsatte under jernmangelanæmi. Ved en stor jernindtagelse gennem flere år (hyppige blodtransfusioner eller umådeholden vindrikning) kan jern ophobes i leveren og pancreas førende til lever cirrose eller diabetes.

manan.dk

Sommereksamen 1998, Biokemi

Essayopgave Regulation af enzymaktivitet Besvarelsen skal indeholde: 1. En funktionel beskrivelse af enzymer, herunder en forklaring på begreberne substrat- og reaktionsspecificitet samt en definition af enheden for enzymmængde (enzymaktivitet).

dk

2. En redegørelse for reaktionshastighedens afhængighed af henholdsvis enzym- og substratkoncentration for reaktioner, hvis hastighed følger Michaelis-Menten kinetik.

an .

3. En beskrivelse af kendte mekanismer til ændring af enzymaktivitet, herunder: i. ændring af koncentration af substrat eller produkt ii. ændring af totalkoncentration af enzym iii. ændring af enzymets katalytiske effekt (modulatorisk regulation)

Forslag til besvarelse

m

an

ad 1. Enzymer er specifikt katalyserende proteinstoffer (her ses bort fra visse former for RNA). Som andre katalysatorer udøver enzymer deres virkning på reaktionshastigheden, idet enzymer øger den hastighed, hvormed en reaktion forløber mod ligevægtstilstanden, men de ændrer ikke ligevægtskoncentrationerne og dermed Keq. Enzymernes specificitet som katalysatorer kan karakteriseres dels ved den såkaldte substratspecificitet og dels ved reaktionsspecificiteten. Substratspecificiteten refererer til, at et enzym kun bindes til og derefter reagerer med ganske bestemte forbindelser eller en begrænset gruppe af forbindelser. Reaktionsspecificitet refererer til, at et enzym kun katalyserer en bestemt reaktion med de pågældende substrater, dvs. reaktionen forløber entydigt uden sidereaktioner. Enzymer er (globulære) proteiner, der kan være opbygget af en eller flere subunits med samme eller forskellig katalytisk funktion. Det aktive sæde er det sted i enzymmolekylet, hvor substratet eller substraterne bindes, og hvor den katalytiske proces foregår. Herudover kan der i enzymmolekylet findes specifikke bindingssæder for forbindelser, der på forskellige måder påvirker/ regulerer enzymets katalytiske aktivitet. Enheden for enzymmængde er Catal, dvs. mol substrat omdannet pr. sekund under kendte måleomstændigheder (So, pH, temperatur m.v.).

ad 2. For mange enzymer i organismen gælder følgende sammenhæng mellem reaktionshastigheden T enzymkoncentrationen E og substratkoncentrationen S:

manan.dk

Sommereksamen 1998, Biokemi

dk

hvor KE og Km er konstanter, der er karakteristiske for den pågældende reaktion under de givne omstændigheder. Hvis [So] (initiale koncentration) holdes konstant, reduceres ovennævnte udtryk til Vo = K @ [E], dvs. initialhastigheden Vo er proportional med enzymkoncentrationen. Værdien af K afhænger af den valgte værdi af [So] og for [So] 6 4K 6 KE. Dvs. for meget store substratkoncentrationer kan enzymets aktive sæde(r) anses for at være mættet med substrat(er), hvorfor KE @E også kaldes Vmax . Betragtes < som funktion af [S] alene i en række reaktionsblandinger med konstant [E], fås en hyperbolsk sammenhæng i overensstemmelse med

der viser, at med stigende [So] nærmer Vo sig en grænseværdi, Vmax der svarer til [So] 6 4. Km er en for enzymet karakteristisk konstant, der udtrykker noget om enzymets "bindingsaffinitet" overfor substratet(erne).

an .

ad 3. I overensstemmelse med ovennævnte kan enzymkatalyserede reaktioners hastigheder reguleres på følgende principielt forskellige måder:

an

i. Ved en ændring af substratkoncentrationen (erne) og - i tilfælde af reversible reaktioner - også ved en ændring af produktkoncentrationen(erne). Dette kaldes støkiometrisk regulation. Imidlertid vil den støkiometriske regulations' følsomhed" være afhængig af, i hvilket koncentrationsinterval (dvs. mindre end eller større end Km ændringerne i [S] ligger. For ændringer i [S], der er mindre end eller af samme størrelsesorden som Km vil den støkiometriske regulations ' følsomhed" være betydeligt større end hvis intervallets [S]-værdier er betydeligt større end det pågældende enzyms Km . I sidstnævnte tilfælde kan enzymaktiviteten ikke - eller kun i meget ringe grad - reguleres støkiometrisk.

m

ii. Ved en ændring i enzymkoncentrationen, dvs. en ændring i antallet of tilstedeværende enzymmolekyler. Alle organismens proteiner, og dermed også enzymerne, findes i en mængde (koncentration), der er et resultat of en kontinuerligt forløbende syntese og nedbrydning:

Enzymkoncentrations-regulationen kan derfor ske ved en ændring af syntesehastigheden og/eller nedbrydningshastigheden (steady-state tilstanden). Sådanne ændringer kan formidles af hormoner eller på anden made, men foregår i modsætning til støkiometriske og modulatoriske regulationer (se nedenfor) relativt langsomt (timer til dage). iii. Ved en ændring a f det enkelte enzymmolekyles katalytiske aktivitet som følge af en eller anden påvirkning. Dette kaldes modulatorisk regulation. Ved denne form for regulation ændres enzymets specifikke (molekylære) aktivitet, i reglen ved ændringer

manan.dk

Sommereksamen 1998, Biokemi

m

an

an .

dk

i det modulerede enzymmolekyles konformation og dermed i det aktive sæde. Sådanne modulatoriske påvirkninger kan ske ved binding af en ligand (modulator) til enzymet. Bindingen er reversibel og som regel non-covalent. Hvis bindingen af modulator øger enzymaktiviteten, kaldes den for en aktivator, omvendt en inhibitor. Den modulatoriske ændring kan også ske ved ændringer af visse covalente strukturer i enzymet, i reglen et resultat af en anden enzymkatalyseret proces. Eksempler på covalence modulationer er 1) fosforylering/defosforylering af visse HO-grupper i en række enzymers specifikke Beryl-, threonyl- og tyrosylgrupper og 2) specifik partiel proteolyse af enzymer, f.eks. fordøjelsesenzymer og koagulationsenzymer. Modulatorisk regulerede enzymer er ofte oligomerer, evt. multienzymer, og kan indeholde både katalytiske og regulatoriske subunits (allosteriske enzymer). De katalytiske subunits kan findes i to eller flere former med forskellig katalytisk aktivitet, og der hersker en eller anden ligevægt mellem dem. Aktivatorers/inhibitorers tilstedeværelse forskyder denne ligevægt. Derved ændres enzymets Km eller Vmax eller der sker en ændring i både Km og Vmax.

manan.dk

Syge- og reeksamen , vinter 1997/98, Biokemi (ny ordning)

Essayopgave Cholesterolmetabolisme 1. Angiv to principielt forskellige måder, hvorpå organismen kan øge indholdet af cholesterol. 2. Giv en (kort) beskrivelse af syntesen af mevalonat, herunder en angivelse af udgangsstof og cellulær lokalisation samt en redegørelse for regulationen af cholesterolsyntesen.

dk

3. Giv en beskrivelse af cholesterols transport i plasma. 4. Angiv de vigtigste udskillelsesprodukter fra cholesterolmetabolismen, samt giv en beskrivelse af den fysiologiske betydning af disse forbindelser og deres enterohepatiske kredsløb.

an .

5. Giv en klassifikation af de hormoner, hvis syntese cholesterol er udgangsstof for, herunder en angivelse af deres dannelsessted.

Forslag til besvarelse

ad 1. Cholesterol indtages dels med kosten (sammen med øvrige lipider), dels syntetiseres cholesterol de novo ud fra acetylcoA i et omfang, der er afhængigt af indtagelsen.

m

an

ad. 2. Syntesen af cholesterol foregår i næsten alle væv, men især levervæv, tarmmucosa og huden hører til de kvantitativt vigtigste producenter. Cholesterolsyntesens reaktioner foregår i endoplasmatisk reticulum og starter med, at der ud fra 3 acetylcoA dannes hydroxymetylglutarylcoA (HMGcoA). HMGcoA reduceres dernæst med NADPH2 til mevalonat, katalyseret af HMGcoA reduktase. Dette er samtidig det flux-bestemmende trin for hele sekvensen frem til cholesterol, idet enzymet er reguleret såvel modulatorisk som adaptatorisk. Til de modulatoriske mekanismer hører fosforylering/defosforylering, idet enzymet er inaktivt i sin fosforylerede form, og aktivt i sin defosforylerede form. Glucagon, der inducerer fosforylering via cAMP, hæmmer derfor enzymet, mens insulin, der inducerer defosforylering, øger aktiviteten af enzymet. Desuden hæmmer sekvensens slutprodukt, cholesterol, aktiviteten af HMGcoA reduktase. Dette er forklaringen på det under 1 nævnte forhold, at indtaget cholesterol hæmmer nysyntesen af cholesterol ved en negativ feedback-regulation af syntesen ud fra acetylcoA. Dvs. en øget tilførsel medfører en mindre syntese og omvendt.

manan.dk

Syge- og reeksamen , vinter 1997/98, Biokemi (ny ordning)

ad. 3. På grund af cholesterols apolaritet findes der praktisk taget intet frit cholesterol i plasma. Cholesterol er sammen med andre lipider som triacylglyceroler, fosfolipider m.v. associeret med specifikke proteiner, der "beklæder" større eller mindre aggregater af disse lipider, såkaldte lipoproteiner. Cholesterol, både frit og esterificeret, befinder sig sammen med apolære grupper i proteinerne og fosfolipider i den indre apolære del af lipoproteinerne, mens polære grupper i proteinerne og fosfolipiderne er orienteret mod den omgivende vandfase med det resultat, at lipoproteinerne er opløselige i blodplasma.

an

an .

dk

ad. 4. I modsætning til de øvrige lipider kan cholesterol ikke nedbrydes fuldstændigt til CO2 + H20. I stedet sker den kvantitativt dominerende del af eliminationen ved, at cholesterol enten udskilles direkte med galden og fra tarmmucosa til tarmindholdet eller ved, at cholesterol først omdannes til galdesalte i leveren, hvorefter disse også udskilles med galden. Ca. 90% af de med galden udskilte galdesalte tilbageabsorberes i ileum, mens den resterende del udskilles med fæces, ca. 1 mmol/døgn. Mængden af den med fæces direkte udskilte cholesterol, inklusive bakterielle omdannelsesprodukter heraf, er af samme størrelsesorden. Galdesalte, der er stærkt amfifile forbindelser, spiller en vigtig rolle ved lipiders fordøjelse og absorption. I duodenum fremmer de med galden tilførte galdesalte emulgeringen af de partielt hydrolyserede fedtdråber yderligere, hvorefter pancreaslipase m.fl. enzymer fortsætter nedbrydningen. Hydrolyseprodukterne fra lipidfordøjelsen danner efterhånden sammen med stigende mængde tilførte galdesalte såkaldte blandingsmiceller, der er i stand til at diffundere gennem den vandhinde, der findes på tarmcellernes luminale overflade. Fra blandingsmicellerne diffunderer hydrolyseprodukterne sammen med frit cholesterol og fedtopløselige vitaminer over den luminale membran, specielt i duodenum og jejunum, mens galdesaltene først absorberes i ileum. De absorberede galdesalte afgives til v. porta og returneres til leveren, hvorefter processen starter forfra (galdesaltenes enterohepatiske kredsløb).

m

ad. 5. Cholesterol er udgangsmaterialet ved organismens produktion af en række steroide hormoner, bl.a.: 1) 1,25-dihydroxycholecalciferol, der dannes i nyrerne. 2) binyrebarkhormoner, bl.a. de egentlige binyrebarksteroider, cortisol (glycocorticoid) og aldosteron (mineralocorticoid) samt en mindre mængde af hormoner med androgen (anabolisk) effekt. 3) kønshormoner, bl.a. testosteron, der dannes i testes (Leydiske celler) og østradiol, der dannes i ovarier og placenta.

manan.dk

Vintereksamen 1997/98, Biokemi (ny ordning)

Essayopgave Biologiske membraner: struktur og egenskaber Besvarelsen skal indeholde: 1. En beskrivelse af en biologisk membrans opbygning, herunder hvilke lipidtyper/lipidkomponenter der indgår i den biologiske membran.

dk

2. En (kort) beskrivelse af syntesen af cellulære membraner, herunder en angivelse af, hvorledes den asymmetriske struktur opstår/fikseres. 3. En kort beskrivelse af, hvorledes membranproteiner indbygges i/fikseres til den biologiske membran.

an .

4. En redegørelse for forskellige mekanismer for transport over membraner, herunder de energimæssige forhold ved transporten.

Forslag til besvarelse

m

an

ad 1. En biologisk membran er opbygget af lipider, proteiner og (bundet til disse) evt. også kulhydrater. Lipidmolekylerne udgør membranens grundstruktur, idet de danner et sammenhængende lipiddobbeltlag, hvis stabilitet skyldes disse lipiders amfifile struktur. Det enkelte lipidmolekyle består af en hydrofob "hale" og et hydrofilt "hoved ". I vandig opløsning danner disse molekyler spontant det omtalte dobbeltlag, idet molekylernes apolære alifatiske sidekæder danner det hydrofobe indre i dobbeltlaget, mens de hydrofile polære og/eller ioniserede grupper danner de to ydre mod vandfasens orienterede lag som vist i nedenstående skitse:

De lipidtyper, der indgår i den biologiske membran, er fosfolipider, glycolipider og cholesterol. Det relative indhold af disse varierer i forskellige membrantyper.

manan.dk

Vintereksamen 1997/98, Biokemi (ny ordning)

ad 2. Syntesen af de cellulære membraners lipiddobbeltlag starter i det endoplasmatiske reticulum, når det drejer sig om fosfoglycerolipid, ceramid og cholesterol. Glycosyleringsreaktionerne i tilknytning til glycolipidsynteserne foregår især i Golgi-apparatet. Synteserne foregår i det cytosolære lag af det endoplasmatiske reticulums lipiddobbeltlag, idet enzymerne, der selv er membranproteiner, har de aktive sæder vendt ud mod cytosolen, hvorfra substraterne (acetylcoA m.fl.) tilføres. I tilknytning til syntesen foregår der en omfattende lipidtransport fra det ydre/cytosolære) til det indre (luminale) lipidenkeltlag, katalyseret af membranlipid translokaser (såkaldte flippaser), der er specifikke med hensyn til, hvilke membranlipider de flytter. Herved opstår membranens asymmetriske struktur.

an .

dk

ad 3. Membranproteiner, der udgør en strukturel og funktionel meget heterogen gruppe, kan med hensyn til deres strukturelle placering i membranerne inddeles i såkaldte integrale proteiner, der er placeret i membranens lipiddobbeltlag, og i perifere proteiner, der er bundet på membranens overflade. I de integrale membranproteiners polypeptidkæder findes en (eller flere) hydrofobe regioner, bestående af ca. 20 overvejende apolære aminosyrer, der oftest er foldet i "-helix-struktur. Med den kompakte "-helixstruktur kan de apolære aminosyresidekæder vende ud mod lipiddobbeltlagets apolære zone, og således fastholde membranproteinet i en bestemt rumlig orientering i forhold til membranens 2 sider. De perifere membranproteiner er bundet til membranens overflade ved oftest at være bundet til et eller flere af membranens integrale proteiner med noncovalente bindinger, men perifere membranproteiner kan også være bundet direkte (covalent) til membranlipider.

m

an

ad 4. Den biologiske lipidmembrans struktur med det apolære indre lag udgør en barriere for passage af de fleste polære og især ioniserede forbindelser. Kun apolære molekyler som fedtopløselige forbindelser, ilt og kuldioxyd er i stand til frit at diffundere gennem membranen, en proces der kaldes simpel diffusion. Ingen andre molekyler/transportsystemer medvirker ved transporten, der alene drives af koncentrationsforskellen på de to sider af membranen (= passiv transport). Også mindre polære molekyler som vand og ethanol er i stand til at passere membranen ved simpel diffusion. Større polære molekyler som f eks. glucose og ioniserede forbindelser (uanset hvor små) kan derimod vanskeligt/ikke passere membranen med en for cellernes metabolisme nødvendig hastighed. Sådanne forbindelser transporteres derfor næsten udelukkende over membranerne ved hjælp af de i membranerne indbyggede transportproteiner. Der er to typer af transportproteiner: 1) carrier proteiner, der binder det transporterede molekyle og undergår en række konformationsændringer i forbindelse med transporten og 2) kanalproteiner, der danner en vandfyldt pore, hvorigennem transporten foregår. Alle kanalproteiner og mange carrierproteiner katalyserer en passiv transport, kaldet faciliteret diffusion, hvor transporten foregår langs koncentrationsgradienten, for ladede molekyler langs den elektrokemiske gradient. En række carrierproteiner kan imidlertid også katalysere en såkaldt aktiv transport, hvor den transporterede forbindelse transporteres fra et lavere mod et højere potentiale (opkoncentreres) under energiforbrug. Den til transporten nødvendige energi leveres ved ATP-hydrolyse eller ved hjælp af en iongradient.