CENTRO NAZIONALE DI RIFERIMENTO PER IL BOTULISMO Resoconto delle attività svolte nel 2008 e programmazione per il 2009 Indice Pag. Indice
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Introduzione
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Attività svolta nel 2008
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Diagnosi di laboratorio
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Metodiche analitiche
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Attività diagnostica nel 2008
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Isolamento, tipizzazione, sub tipizzazione molecolare e gestione dei ceppi di clostridi neurotossigeni
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Collaborazione con il Sistema di Allerta del Ministero Salute
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Raccolta ed elaborazione delle informazioni e dei dati epidemiologici relativi ai casi di sospetto botulismo umano e animale
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Aggiornamento e formazione professionale
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Consulenze e collaborazioni nazionali e internazionali
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Ricerca
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Pubblicazioni, convegni e relazioni
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Programmazione per l’anno 2009
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Introduzione Il botulismo è una grave sindrome neuroparalitica conseguente l’azione delle neurotossine botuliniche che agiscono bloccando il rilascio dell’Acetilcolina a livello delle terminazioni nervose e può colpire l’uomo, molti animali e alcuni pesci. Sei forme della malattia, sono state attualmente riconosciute nell’uomo e possono presentare un quadro sintomatologico variabile da forme lievi a forme fulminanti (botulismo alimentare, botulismo infantile, botulismo intestinale dell’adulto, botulismo da ferita, botulismo iatrogeno, botulismo da rilascio volontario/accidentale di neurotossine). Negli animali, invece sono state descritte soltanto tre forme (botulismo alimentare, botulismo intestinale, botulismo da ferita). Il botulismo alimentare è conseguente l’ingestione di alimenti contaminati con tossina preformata e può costituire un grave pericolo per la salute pubblica in relazione soprattutto alla correlazione con alimenti conservati di origine industriale. Il botulismo infantile e quello intestinale dell’adulto, invece sono conseguenti la temporanea colonizzazione intestinale e produzione della tossina in situ da parte dell’agente eziologico della malattia. Il botulismo da ferita, è una sindrome molto simile all’infezione tetanica in cui l’agente eziologico può colonizzare temporaneamente una ferita infetta. Oltre a casi dovuti a ferite accidentali (in massima parte infortuni sul lavoro), è in forte espansione soprattutto in Gran Bretagna il botulismo da ferita dovuto all’uso di droghe iniettabili. Il botulismo iatrogeno e quello da rilascio in volontario/accidentale, non sono forme naturali della malattia e possono essere correlate rispettivamente ad un erroneo uso in terapia/cosmesi e bioterrorismo. Gli agenti batterici responsabili della produzione delle neurotossine botuliniche sono tutti appartenenti al genere Clostridium. Oltre al ben noto Clostridium botulinum, anaerobio sporigeno in grado di produrre 7 varianti antigeniche di tossine botuliniche (A-F), sono stati correlati a casi di botulismo anche ceppi di Clostridium baratii produttore di tossina tipo F e Clostridium butyricum produttore di tossina tipo E.
Attività svolta nel 2008 Il Centro Nazionale di Riferimento per il Botulismo (CNRB), formalizzato con lettera del luglio 1988 e successiva Circolare n. 9 del 01-07-1996 del Ministero della Sanità, “Misure di prevenzione e controllo delle intossicazioni da botulino”, opera attualmente presso il reparto di Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica - Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare (DSPVSA) dell’Istituto Superiore di Sanità, con due unità di personale ( n.1 Dirigente di Ricerca; n. 1 OPTER). Dal 2008, collaborano con il CNRB anche tre unità di personale del reparto Pericoli Microbiologici Connessi agli Alimenti del DSPVSA (n. 1 Primo Ricercatore; n. 2 CTER con contratto a tempo determinato). Con l’ausilio del personale tecnico del reparto Pericoli ( n.1 unità di CTER) è stata richiesta all’Amministrazione dell’ISS, la formalizzazione dell’unità di reperibilità per i giorni festivi e notturni. Le altre due unità di personale del reparto Pericoli Microbiologici Connessi agli Alimenti, pur avendo dato la loro disponibilità in caso di emergenza, sono da anni maggiormente coinvolte nelle attività di ricerca. Le principali attività del CNRB possono essere così sintetizzate: • rapida diagnosi di laboratorio dei casi sospetti sia di origine alimentare che infettivo nell’uomo e negli animali con ricezione e analisi dei campioni 24 ore al giorno anche nei giorni festivi; • isolamento, tipizzazione sierologica, subtipizzazione molecolare e gestione dei ceppi di clostridi neurotossigeni isolati in occasione di casi di botulismo umano e animale; • collaborazione con le strutture periferiche del Sistema Sanitario Nazionale (SSN) per l’individuazione del veicolo alimentare nei casi di botulismo alimentare mediante indagini epidemiologiche; • collaborazione con il Sistema di Allerta del Ministero della Salute per la gestione delle emergenze alimentari in caso di coinvolgimento di conserve di origine industriali; • raccolta ed elaborazione delle informazioni e dei clinici ed epidemiologici relativi alle notifiche di sospetto caso di botulismo umano e animale; • formazione del personale che opera presso le strutture periferiche del SSN; • sviluppo e coordinamento di attività di ricerca con partners nazionali ed internazionali.
Diagnosi di laboratorio La diagnosi di laboratorio dei casi di botulismo riveste un carattere di particolare urgenza sia per la necessità di un tempestivo intervento sul paziente sia per l’individuazione dell’alimento, soprattutto in caso di coinvolgimento di prodotti industriali. Il CNRB esegue a titolo gratuito le analisi di laboratorio per la determinazione delle tossine botuliniche e delle spore di clostridi neurotossigeni in campioni biologici alimentari e ambientali su richiesta delle strutture del SSN al fine di effettuare la diagnosi di laboratorio dei sospetti casi di botulismo umano e animale. Il personale tecnico del CNRB è organizzato per la ricezione dei campioni e l’immediato inizio delle analisi di laboratorio 24 ore al giorno tutti i giorni dell’anno. Il personale del CNRB è inoltre in grado di fornire supporto tecnico scientifico agli operatori del SSN, dando le prime indicazioni di urgenza e indirizzando ai Centri Antiveleni competenti per il trattamento terapeutico e le modalità di reperimento del Siero Antibotulinico, che viene distribuito dal Ministero della Salute.
Metodiche analitiche La conferma di laboratorio dei sospetti casi di botulismo viene effettuata mediante ricerca di: • tossine botuliniche in campioni biologici (siero, feci, enema, contenuto gastrico, essudato da ferita, organi animali quali fegato, milza e intestino) e alimentari;
• spore di clostridi neurotossigeni in campioni biologici (tamponi rettali, feci, enema, contenuto gastrico, essudato da ferita, organi animali quali fegato, milza e intestino), alimentari e ambientali. Per la ricerca delle tossine botuliniche l’unico metodo validato è il test in vivo su topo da laboratorio (mouse test). Questo test richiede l’uso di antitossine botuliniche polivalente e monospecifiche e necessita di 3 giorni di analisi, anche se in alcuni casi positivi è possibile ottenere un risultato definitivo in 3-4 ore. Metodi alternativi in vitro basati sulla tecnica ELISA, sono stati sviluppati, ma al momento sembrano non avere la sensibilità e la specificità richieste, soprattutto se applicati a matrici complesse (campioni fecali e alimentari). Per la ricerca delle spore dei clostridi neurotossigeni viene utilizzato un metodo colturale, che prevede anche uno step di identificazione delle tossine mediante mouse test. Questo test necessita di 4 giorni di arricchimento in brodo nutritivo, e ulteriori 3 giorni di mouse test. Da diversi anni, in ottemperanza al D. L.vo n.116 del 27 gennaio 1992 “Attuazione della direttiva (CEE) n. 609/86 in materia di protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici”, e per ottenere risultati in tempi più rapidi (24-48 ore), al metodo colturale è stato associato un metodo di PCR multiplex che amplifica i geni che codificano per le diverse tossine botuliniche. Per quanto riguarda lo sviluppo di metodiche alternative all’uso degli animali da laboratorio, un gruppo di esperti del CNRB, sta sviluppando un metodo di analisi basato sulla PCR, per la ricerca di spore di clostridi neurotossigeni in seno alla Commissione CEN (Comitato Europeo di Normazione). Tale metodo, verrà recepito a livello internazionale dall’ISO. I metodi analitici in uso presso il CNRB, sono inclusi nel Sistema di Assicurazione della Qualità del Dipartimento.
Attività diagnostica nell’anno 2008 Nel corso dell’anno 2008, il CNRB ha ricevuto 27 segnalazioni di sospetti eventi di botulismo umano, che hanno coinvolto 29 persone. Sono stati inoltre studiati 7 sospetti eventi di botulismo animale in collaborazione con gli IZS di Lazio e Toscana sezione di Roma (3 episodi di botulismo aviario) e IZS delle Venezie sezione di Treviso (1 episodio di botulismo aviario, 1 episodio di botulismo in roditori collegato a quello aviario, 1 episodio di botulismo bovino, 1 episodio di botulismo intestinale del coniglio). Infine sono stati tipizzati 4 ceppi batterici isolati dall’IZS delle Venezie sezione di Treviso nello studio dell’episodio di botulismo del coniglio e un ceppo batterico isolato nello studio dell’episodio di botulismo bovino. Botulismo umano Nell’ambito delle attività di sorveglianza del botulismo umano, durante il 2008 sono stati analizzati 94 campioni biologici e 43 residui alimentari. Tali campioni sono stati inviati principalmente dagli Ospedali presso i quali è stato formulato il sospetto diagnostico, oppure dai Dipartimenti di Igiene Pubblica delle ASL di appartenenza dei pazienti. Nella tabella 1 è riportato il numero degli eventi e dei casi di botulismo umano segnalati al CNRB e confermati in laboratorio, raggruppati per forma di botulismo.
Tabella 1. Eventi e casi di botulismo studiati dal CNRB nel 2008 Forma di Eventi Eventi Casi Botulismo Riportati Confermati Riportati Alimentare 24 10 26 Infantile 2 Intestinale adulto 0 Ferita 0 0 0 Iatrogeno 1 0 1 TOTALE 25 10 29
Casi Confermati 12 1 0 0 0 13
Dei 24 eventi di botulismo alimentari riportati, 22 erano costituiti da un solo caso mentre due erano costituiti da 2 casi ognuno. Nella tabella 2 sono indicate alcune caratteristiche generali dei casi di botulismo alimentare confermati. Tabella 2. Caratteristiche dei casi di botulismo alimentare confermati in laboratorio nel 2008 N. N. Fascia Sesso Età Esito Regione Tipo di tossina evento caso di età 1 1 m 68 > 65 non Trentino Alto Adige B fatale 2 2 m 50 25-65 non Puglia B fatale 3 3 f 19 15-24 non Emilia Romagna B fatale 4 4 m n.n non Umbria B fatale 4 5 f n.n. non Umbria B fatale 5 6 f 48 25-65 non Puglia B fatale 6 7 m 46 25-65 non Liguria A fatale 6 8 f 46 25-65 non Liguria A fatale 7 9 m 69 > 65 Fatale Campania B 8 10 m 21 15-24 non Puglia B fatale 9 11 f 25 25-65 non Campania B fatale 10 12 f 64 25-65 non Campania B fatale m = maschile; f = femminile; n.n.= non nota
L’alimento incriminato è stato identificato in laboratorio in 5 eventi (7 casi); in 3 eventi (3 casi) non è stato identificato e in 2 eventi (2 casi) è stato indicato un alimento come “fortemente sospetto”. Un alimento viene classificato come fortemente sospetto quando non è possibile analizzarlo perché terminato o irreperibile; è in grado di supportare la crescita dei clostridi
neurotossigeni; è stato consumato da tutti i pazienti coinvolti nell’evento di botulismo confermato in laboratorio; i pazienti riferiscono che presentava caratteri organolettici alterati. Nella tabella 3 sono riportate le caratteristiche degli alimenti identificati in laboratorio. Tabella 3. Caratteristiche degli alimenti identificati in laboratorio N. evento Alimento Tipologia di alimento 3 Cime di rapa in olio Vegetali in olio 4 Salsa di tartufo in olio Vegetali in olio Crema di radicchio 6 Vegetali in olio e noci in olio 8 Cicoria in acqua Vegetali in acqua 9 Tonno in olio Tonno
Tipo di produzione Casalinga Industriale Industriale Casalinga Casalinga
In occasione degli eventi n. 4 e 6 (correlati ad alimenti di origine industriale) il Ministero della Salute ha immediatamente messo in atto il Sistema Rapido di Allerta. Il personale del CNRB ha fornito supporto tecnico-scientifico al personale che opera nel sistema di allerta, al personale dei Dipartimenti di Igiene Pubblica che hanno svolto in situ l’indagine epidemiologica e la raccolta delle confezioni alimentari invenduti, all’IZS di Lazio e Toscana sezione di Roma e all’IZS di Piemonte e Liguria sezione di Torino, che hanno condotto l’analisi di laboratorio dei campioni alimentari rispettivamente per l’evento n. 4 e 6. Per quanto riguarda i casi di botulismo infantile, durante il 2008 sono pervenute al CNRB 2 segnalazioni, ma solo 1 dei due casi è stato confermato in laboratorio. In occasione di casi di botulismo infantile ed intestinale dell’adulto, il CNRB effettua di routine un monitoraggio della presenza delle spore di clostridi neurotossigeni nelle feci dei pazienti. In questo caso, si è osservata una permanenza delle spore nel tratto intestinale per 29 giorni e sono stati analizzati 20 campioni fecali. Non è invece stato confermato in laboratorio un sospetto caso di botulismo iatrogeno. Botulismo animale Per quanto riguarda i casi di botulismo animale, durante l’anno 2008 si è osservato un incremento delle segnalazioni dei sospetti di botulismo aviario rispetto agli anni precedenti. Questo fenomeno è a nostro parere da imputare essenzialmente a tre aspetti: - sorveglianza dei casi di influenza aviaria; - aumento del sospetto diagnostico da parte dei medici veterinari e degli organi di vigilanza delle aree protette (Corpo Forestale dello Stato, Guardia Parco); - recepimento della Direttiva Zoonosi che include il botulismo tra le patologie da sottoporre a sorveglianza. Grazie anche al sistema di sorveglianza dell’influenza aviaria, tutti gli uccelli rivenuti morti nelle aree protette, vengono sottoposti a test diagnostici per la ricerca dell’agente virale responsabile dell’influenza e di altri agenti responsabili delle più comuni patologie aviarie. Tra i parametri che di routine vengono ricercati, soprattutto presso gli IZS che più attivamente collaborano con il CNRB, è stata introdotta anche la ricerca delle spore e delle tossine botuliniche. In questo modo, solo nel Lazio sono stati identificati 3 diversi focolai di botulismo aviario localizzati rispettivamente presso: • la riserva naturale di lago Lungo e Ripa Sottile (RI); • lago di Albano (RM); • tenuta di Castel Porziano (RM).
Le specie animali maggiormente interessate ai tre focolai sono state: Germano reale, Folaga Moretta, Airone, Gabbiano. Un ulteriore focolaio di botulismo aviario è stato identificato in provincia di Reggio Emilia e ha coinvolto principalmente la specie Germano reale. In occasione di questo focolaio sono stati analizzati anche dei ratti e delle nutrie rinvenuti morti nell’area interessata al focolaio aviario e anche su questi animali sono state identificate spore e tossine botuliniche. È stato inoltre studiato un episodio di botulismo bovino che ha portato alla morte di diversi capi in un azienda in provincia di Udine che produce latte e formaggi. In questo caso è stato possibile anche identificare la fonte dell’intossicazione in un riccio rinvenuto in una balla di fieno utilizzato per l’alimentazione dei bovini. Infine sono stati analizzati i contenuti intestinali di 3 conigli provenienti da uno stesso allevamento in provincia di Udine. In questa specie animale è ben conosciuta una patologia del sistema nervoso autonomo definita disautonomia. Una patologia simile è stata riscontrata anche nel cavallo, nel cane, nel gatto e nella lepre. Dal momento che nel cavallo e nel gatto la disautonomia è stata correlata alla presenza di C. botulinum nel contenuto intestinale di questi animali, alcuni animali morti con un quadro clinico riconducibile a questa patologia sono stati sottoposti alla ricerca di spore e tossine botuliniche, con esito negativo In occasione della sorveglianza dei casi di botulismo animale presso il CNRB sono stati analizzati un totale di 87 campioni e sono stati tipizzati 4 ceppi batterici isolati presso l’IZS delle Venezie sezione di Treviso.
Isolamento, tipizzazione, subtipizzazione molecolare e gestione dei ceppi di clostridi neurotossigeni Per quanto riguarda l’attività di isolamento, durante il 2008 sono stati isolati 16 ceppi batterici produttori di tossine botuliniche. Questi ceppi sono stati sottoposti a: • tipizzazione sierologica della tossina prodotta; • prove biochimiche di identificazione; • PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) per la subtipizzazione molecolare. Inoltre sono stati sottoposti a tipizzazione sierologica 4 ceppi batterici isolati presso l’IZS delle Venezie sezione di Treviso. Oltre alla PFGE, sono allo studio altre tecniche di sub tipizzazione molecolare come la AFLP (Amplified Fragmet Length Polymorphism) e la MLST (Multi Locus Sequence Typing). Attualmente presso il CNRB è conservata una ceppoteca contenente circa 400 ceppi di clostridi produttori di tossine botuliniche isolati in occasioni di casi di botulismo umano e animale, sorveglianze e indagini ambientali.
Collaborazione con il Sistema di Allerta In occasione dei due eventi di botulismo alimentare correlati a prodotti di origine industriale, è scattato il Sistema di Allerta e il personale del CNRB ha fornito il seguente supporto tecnico scientifico: maggio 2008 episodio di botulismo che ha coinvolto due pazienti ricoverati in Ospedale a Milano : -adesione alla richiesta da parte del Sistema di Allerta di assicurare supporto tecnico scientifico ai Laboratori coinvolti nelle analisi. -conferma delle analisi di laboratorio effettuate dall’IZS di Roma sui campioni dell’alimento coinvolto dell’episodio e comunicazione immediata dei risultati al Sistema di Allerta. luglio 2008 episodio di botulismo che ha coinvolto due pazienti ricoverati Ospedale a Genova:
-conferma di laboratorio dei due casi e immediato invio dei risultati al Sistema di Allerta. -collaborazione con l’IZS di Torino per la ricerca delle tossine e spore botuliniche nei campioni alimentari
Raccolta ed elaborazione delle informazioni e dei dati epidemiologici relativi ai casi di sospetto botulismo umano e animale In Italia il botulismo è una malattia a notifica obbligatoria dal 1975. Nel 1990, in occasione della revisione del sistema di sorveglianza delle malattie infettive, il botulismo è stato inserito nelle malattie di Classe I (che prevedono la notifica immediata del sospetto diagnostico). Nel 1996, il Ministero della Sanità, Dipartimento Prevenzione e Comunicazione, in collaborazione con l’ISS, ha elaborato una scheda per la notifica dei sospetti clinici. Tale scheda, viene compilata dai medici o/e dal personale dei Dipartimenti di Igiene Pubblica delle ASL in occasione di un sospetto caso di botulismo. La scheda viene inviata al Ministero della Salute, al Centro Nazionale di Epidemiologia, Sorveglianza e Promozione della Salute dell’ISS nonché al CNRB contestualmente ai campioni da sottoporre ad analisi per la conferma di Laboratorio. Presso il CNRB tutte le informazioni contenute nella scheda vengono raccolte ed elaborate a fini epidemiologici. Oltre alle informazioni contenute nella scheda di segnalazione di sospetto caso di botulismo, il CNRB elabora anche una serie di informazioni aggiuntive, che vengono raccolte per mezzo dei colloqui telefonici che intercorrono con i clinici, e nel caso di botulismo infantile, anche con i genitori e parenti dei pazienti. Per quanto riguarda il completamento del flusso informativo, il CNRB comunica tempestivamente i risultati delle indagini di laboratorio agli enti ospedalieri che hanno richiesto le stesse, al Ministero della Salute Dipartimento per la Sanità Pubblica Veterinaria, la Nutrizione e la Sicurezza alimentare e al Dipartimento Prevenzione e Comunicazione.
Aggiornamento e formazione professionale Durante l’anno 2008 il personale tecnico del CNRB, ha preso parte a 2 workshop europei di formazione e aggiornamento sulle tecniche di tipizzazione e sub tipizzazione molecolare in qualità di discente. Durante il primo workshop (durata di 2 giorni), tenutosi presso la Facoltà di Batteriologia Veterinaria dell’Università di Berna, sono state trattate diverse tecniche di sub tipizzazione molecolare in particolare la MLST. Questo evento formativo è stato organizzato in seno progetto europeo Biotracer gruppo di lavoro Genotyping. Durante il secondo workshop (durata di 5 giorni), tenutosi presso la Facoltà di Medicina Veterinaria dell’Università di Helsinki, sono state trattate le tecniche di PCR Real Time per la determinazione delle spore di clostridi neurotossigeni, la AFLP e il microarray applicato agli isolati di C. botulinum. Presso il CNRB, sono stati effettuati corsi di formazione ai quali hanno preso parte tecnici degli IZS delle Venezie sezione di Traviso, IZS di Lazio e Toscana sezione di Roma e il personale tecnico che collabora con il CNRB appartenente al reparto Pericoli Microbiologici Connessi agli Alimenti del DSPVSA, per un totale di 48 ore.
Consulenze e collaborazioni nazionali e internazionali Il personale del CNRB collabora attivamente da diversi anni con il Centro Antiveleni della Fondazione Maugeri di Pavia per quanto concerne il management e la terapia dei casi di botulismo umano sul territorio nazionale. Il personale del CNRB, fa parte del gruppo di lavoro ad hoc costituito presso il CEN (Tag 4), per la redazione del metodo ISO per la ricerca delle spore dei clostridi produttori di tossine
botuliniche mediante PCR, in seno al quale ha proposto il metodo che verrà adottato dal Comitato stesso. Sono inoltre in corso diverse collaborazioni internazionali nell’ambito del progetto di ricerca europeo Biotracer (Improved biotraceability of unintended microorganisms and their substances in food and feed chians). Nell’ambito di questo progetto il CNRB è coinvolto nello studio di metodi per la ricerca di spore di clostridi neurotossigeni mediante tecniche di PCR Real Time. In particolare il personale del CNRB ha partecipato alla redazione del progetto per quanto riguarda il WP 15 (tracing tools for bioterror organisms in feed and food chains), ha fornito ai partners europei il DNA di circa 100 ceppi di clostridi neurotossigeni, e partecipa alle prove interlaboratorio per la validazione dei metodi proposti e studiati nell’ambito delle attività del progetto stesso. Collaborazioni nazionali sono state sviluppate con gli IZS coinvolti nello studio di casi di botulismo umano ed animale e con il Dipartimento di Scienze degli Alimenti della Facoltà di Agraria dell’Università degli Studi di Teramo. Ulteriori collaborazioni scientifiche sono in atto, per quanto riguarda il botulismo infantile con: - Infant botulism treatment and prevention program (IBTPP) del California Department of Public Health; - Centro Nazionale per le Malattie Rare dell’ISS; - Alcuni ospedali pediatrici e reparti di terapia intensiva pediatrica, pediatria, di ospedali sul territorio nazionale. Particolarmente importante è la collaborazione che il personale del CNRB ha con il personale del reparto Pericoli Microbiologici Connessi agli Alimenti, del DSPVSA sia nell’attività di ricerca che nell’attività di conferma di laboratorio. Proprio grazie a questa collaborazione è stato possibile chiedere la formalizzazione dell’unità di reperibilità notturna e festiva, che prima del 2008 era effettuata dal solo personale del CNRB. Si rimane però in attesa della formalizzazione di tale richiesta presentata al Presidente dell’ISS tramite il Direttore del Dipartimento nel luglio 2008.(Si ribadisce con l’occasione l’urgenza di tale procedura). Sono infine in atto collaborazioni scientifiche a livello internazionale che prevedono scambi di procedure e protocolli sperimentali. A tal fine è stato acquisito dal CNRB i protocolli di AFLP in uso presso il laboratorio di riferimento per il botulismo della Health Protection Agency della Gran Bretagna. Sono stati inviati su richiesta del laboratorio di riferimento per il botulismo del CDC di Atlanta (USA) i protocolli in uso presso il CNRB per: • la conservazione dei ceppi produttori di neurotossine botuliniche; • la PFGE dei ceppi produttori di neurotossine botuliniche; E’ stato inviato su richiesta del laboratorio per la ricerca sulla qualità degli alimenti dell’AFSSA di Maisons-Alfort (Francia) il protocollo di PFGE dei ceppi produttori di neurotossine botuliniche. Sono stati forniti su richiesta degli IZS delle Venezie sezione di Treviso e ISZ di Lazio e Toscana sezione di Roma i protocolli di PCR multiplex per la determinazione dei geni che codificano per le tossine tipo A, B, E, F e delle tossine tipo C, D in uso presso il CNRB.
Ricerca Il CNRB sviluppa, promuove e coordina attività di ricerca nell’ambito delle varie forme di botulismo umano e animale. In particolare: - indagini per la valutazione dell’incidenza delle spore di clostridi neurotossigeni in diversi ambienti e in indicatori ambientali come miele e sale marino; - studio di metodiche analitiche alternative all’uso degli animali da laboratorio; - studio di metodiche analitiche rapide; - studio dei parametri fisiologici di crescita e tossinogenesi dei ceppi tossigeni di C. butyricum e dei ceppi di C. botulinum responsabili del botulismo animale;
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studio e valutazione mediante challenge test di tecnologie alimentari innovative.
Il CNRB è infine coinvolto in due progetti di ricerca: - “Biotracer - Improved biotraceability of unintended microorganisms and their substances in food and feed chains”, nell’ambito del Sixth Framework Programme finanziato dall’Unione Europea; -
“Rare diseases: Infant botulism”, nell’ambito del programma di collaborazione Italia-USA sulle malattie rare, finanziato dal Centro Nazionale delle Malattie Rare dell’ISS. Questo progetto coordinato dal CNRB è sviluppato anche in collaborazione con il Centro Antiveleni della Fondazione Maugeri di Pavia.
Pubblicazioni, convegni e relazioni n
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Fenicia L, Anniballi F. Botulism in Italy and UE: epidemiological data. Proceedings of: “Antitdotes in Depth 2008 and Chemical Emergencies Clinical and Public Health Issues”. International continuing education course in clinical toxicology. Pavia 15-17 maggio 2008. pag. 155-64. De Medici D, Anniballi F. Method to detect Clostridium botulinum and botulinum toxins. Proceedings of: “Antitdotes in Depth 2008 and Chemical Emergencies Clinical and Public Health Issues”. International continuing education course in clinical toxicology. Pavia 15-17 maggio 2008. pag. 169-73. Fenicia L, Anniballi F. Centro Nazionale di Riferimento per il Botulismo. Not Ist Super Sanità. 2008;21(6):11-15. Liguori V, De Luliis P, Di Biasi M, Selva L, Aureli P, Fencia L, Anniballi F. Primi episodi di botulismo infettivo dei puledri in Italia: casi clinici. Argomenti S.I.Ve.M.P. 2008;2:62-4. Liguori V, De Luliis P, Fenicia L, Anniballi F, and Aureli P. A case of wound botulism in a foal affected by gastric ulcers in Italy. J Equine Vet Sci;28(8):476-8. Bano L, Anniballi F, Delibato E, De Medici D, Agnoletti F, Cocchi M, Drigo I, Magistrali C, Fontana MC, Merialdi G, Arossa C, Fenicia L. Avian botulism in Italy: application of a duplex PCR assay as a useful tool for the isolation of neurotoxigenic strains. Presentato a: Clostridum botulinum – epidemiology, diagnosis, genetics, control and prevention. Helsinki, Finland, 16-19 June 2008. pag. 66. Fenicia L, Anniballi F, Aureli P. Human botulism in Italy, 1984-2007. Presentato a: Clostridum botulinum – epidemiology, diagnosis, genetics, control and prevention. Helsinki, Finland, 16-19 June 2008. pag.72. Fenicia L, Anniballi F, Di Giovangiulio M, De Medici D, Delibato E, Auricchio B. PFGE Analysis of Clostridium botulinum and Neurotoxigenic Clostridium butyricum Isolated in Italy, and Associated Epidemiological Findings – Preliminary Results. Presentato a: 45th Annual Interagency Botulism Research Coordinating Committee (IBRCC) Meeting. Philadelphia, Pennsylvania, USA – September 14-18, 2008. p-15 De Medici D, Fach P, Van Rotterdam B, Fenicia L, Wielinga PR, Segerman B, Anniballi F, Perelle S, Delibato E, Hoorfar J, and Knutsson R. Improvement of the European Laboratory Biopreparedness for the detection of BoNT-producing Clostridia in the Feed and Food Chain. Presentato a: 45th Annual Interagency Botulism Research Coordinating Committee (IBRCC) Meeting. Philadelphia, Pennsylvania, USA – September 14-18, 2008. p-14 Flores Rodas E M, Fenicia L, Anniballi F, De Angelis V, Del Frate S, Di Domenico I, Bilei S. Botulismo alimentare associato al consumo di salsa tartufata. Presentato a: X Congresso Nazionale della Società Italiana di Diagnostica di Laboratorio Veterinaria. Alghero, 22-24 ottobre 2008.
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Fenicia L, Anniballi F, De Medici D, Delibato E, Lonati D, Locatelli C. Research project “Infant Botulism” the first twelve months. Roma 29-31 October, 2008. Istisan Congressi 08/C10. p 55. Fenicia L, Anniballi F. Centro Nazionale di Riferimento per il Botulismo. AIVEMP newsletter. 2008;4:10-2. Fenicia L. Botulismo. In Quaderni ACP. Disponibile on line: http://quaderniacpnews.blogspot.com/2008/09/botulismo.html. Fenicia L. Il botulismo infantile. Relazione presentata nell’ambito del 4° giornata Patologia metabolica e nefrotossicologia in emergenza e terapia intensiva pediatrica. Roma, Policlinico A. Gemelli, 10 novembre 2008.
Programmazione per l’anno 2009 Per l’anno 2009 continuerà la sorveglianza dei casi di botulismo umano e animale e continueranno gli studi iniziati gli anni precedenti e in particolare: • trial interlaboratorio con i partners del progetto di ricerca Biotracer per la validazione di un protocollo per la determinazione dei geni che codificano per le tossine botuliniche tipo A, B, E, F e per regioni conservate del complesso delle tossine botuliniche; • trial interlaboratorio con i partners del progetto di ricerca Biotracer per la validazione di un kit customizzato per la ricerca dei geni che codificano per le tossine botuliniche tipo A, B, E, F; • sviluppo e validazione in house di un protocollo di Multiplex Real Time PCR per la determinazione simultanea dei geni che codificano per le tossine botuliniche tipo A, B, C, D, E, F; • realizzazione di un sito web per la divulgazione del botulismo infantile nell’ambito delle attività di cui al progetto di ricerca “Rare disease: Infant botulism”; • applicazione di AFPL per la sub tipizzazione molecolare dei ceppi isolati in occasione di casi di botulismo umano e animale e in occasione delle attività di monitoraggio e sorveglianza ambientale; • realizzazione di un progetto di ricerca per lo studio del botulismo animale in collaborazione con l’IZS delle Venezie sezione di Treviso; • realizzazione di un progetto di ricerca per la sorveglianza attiva dei casi di botulismo infantile in bambini con stipsi ed ipotonia, in collaborazione con Ospedali pediatrici e reparti di pediatria, terapia intensiva pediatrica, anestesia e rianimazione pediatrica, presenti sul territorio nazionale; • ricerca di spore di clostridi neurotossigeni in campioni di sale marino prelevati presso la Salina di Margherita di Savoia (FG); • applicazione della tecnica MLST e MLVA per la subtipizzazione molecolare di ceppi di Clostridium botulinum tipo A e B isolati presso il CNRB.
