Karlstads universitet Inst för kemi, biomedicinska ämnen Biomedicinsk laboratorievetenskap
CELLODLING Teori kompendium
Sammanställd av: Birgitta Sundström
Innehållsförteckning Inledning
3
Sterilteknik
3
Hur man arbetar i en LAF-bänk
4
Innan arbetet påbörjas
5
Efter avslutat arbete
5
Underhåll fodras för säkerhet
6
Rengöring och desinficering
6
Desinfektionsmedel
6
Inkubatorer
7
Medium och pH
8
Att frysa och tina celler
8
Upptining av celler
9
Nedfrysning av celler
10
Tillväxtkurvor
11
Beräkning av fördubblingstid
11
Cellräkning
14
Kloning
15
Subkultivering
15
mekanisk subkultivering
15
enzymatisk subkultivering - trypsinering
15
2
Inledning Idag odlas vävnadsceller ofta som monolayer eller i suspension. Cellernas behov varierar och mammalieceller är mer svårodlade än mikroorganismer eftersom de behöver många fler näringsämnen och ofta växer på en speciellt behandlad yta. Om cellen ges rätt miljö kan de överleva, föröka sig och även uttrycka differentieringsegenskaper under odling. Cellerna kan kontrolleras under mikroskop eller analyseras biokemiskt och effekter av olika molekyler, ex. hormoner eller tillväxtfaktorer, som tillsätts eller tas bort kan studeras.
Sterilteknik Renlighet är den viktigaste förutsättningen för cellodling. Mikroorganismer (bakterier, svamp, virus och mykoplasma) delar sig ca 50 gånger snabbare än mammalieceller och kommer därför att snabbt växa över varje cellkultur. Idag anses laminar flow (LAF) bänk som obligatorisk vid varje form av cellodlingsarbete. Luften i en LAF-bänk filtreras genom ett HEPA-filter (High Efficient Particulate Air) och innehåller därför mycket få partiklar, vilket har reducerat antalet spontana infektioner i cellkulturer. Infektionsrisk finns fortfarande, eftersom den laminära luftströmmen störs vid arbete i bänken. För att ytterligare minska risken för spontana infektioner, bör luften i laboratoriet hållas så ren som möjligt. Antalet partiklar i laboratorieluften måste begränsas och följande förhållningsregler rekommenderas därför: • Fönstren hålls alltid stängda. • Luftintag förses med HEPA-filter • Dörren till cellodlingslaboratoriet hålls stängd • Så få människor som möjligt går in och ut ur laboratoriet • Om möjligt inrättas ytterligare ett rent rum, t.ex. i form av en sluss vid ingången till cellodlingslaboratoriet • Du bör byta arbetskläder och skor omedelbart utanför cellodlingslaboratoriets entré. För att undvika att partiklar sprids till omgivningen från en person via hans eller hennes arbetskläder, bör kläderna bytas minst en gång per dag. Rocken ska täcka dig så mycket som möjligt, d.v.s. sluta tätt vid hals och handleder • Sterila engångshandskar ska användas, eventuellt också munskydd och huvudbonad • Så få personal som möjligt ska arbeta samtidigt i laboratoriet, eftersom varje person avger partiklar • Du bör arbeta i lugnt tempo - en hårt arbetande person avger betydligt fler partiklar än en person i vila • Temperaturen bör ligga vid 20°C. Ju varmare laboratoriet är, desto fler partiklar avger personalen 3
• Om möjligt etableras ett svagt övertryck i laboratoriet, så att luften alltid cirkulerar från cellodlingslaboratoriet till omgivningen. • Allt som förs in i cellodlingslaboratoriet ska vara så fritt från damm som möjligt. Det som tål det, desinficeras med t.ex. 70% etanol innan det tas in i laboratoriet. Varor i papplådor packas upp utanför cellodlingslaboratoriet. I lokalen ska finnas så få saker som möjligt där damm (och därmed mikroorganismer) kan samlas. Detta underlättar även rengöring och desinficering. Använd ett rullbord för de saker som behövs under dagens arbete. Efter avslutat arbete kan rullbordet lätt tömmas och rengöras. För att begränsa persontrafiken in och ut ur laboratoriet, bör apparatur som är nödvändig för arbetet stå inne i rummet. För att begränsa antalet platser där damm kan samlas, bör apparatur som inte är nödvändig för det dagliga arbetet stå utanför laboratoriet. Hur man arbetar i en LAF-bänk. Arbetstekniken har stor betydelse för skyddsfunktionen. Det finns viktiga generella principer för arbetet, de är t. ex något olika för horisontell och vertikal LAF och de kan behöva modifieras pga arbetsmaterialets storlek, riskfaktorer - men en viss bästa arbetsteknik torde kunna formuleras. Här ges främst R3-kraven på arbetstekniken i bänken. • Ta först reda på att bänkens funktion är tillfredställande (luftflöde, filtertäthet, ljudnivå). Arbete får aldrig utföras när bänken går med reducerad fläkthastighet • Hand- och armrörelser ska vara långsamma (< 2 dm/s). Snabba rörelser skapar turbulens i den sterila luftströmmen. • Frontluckan skall befinna sig i arbetsläge under hela arbetsmomentet • Passage i arbetsöppningen med händer och objekt - långsamt, låg frekvens. Behov av materialsluss beaktas. • Minimera antalet transporter ut och in i arbetsutrymmet. Varje gång en arm förs in i LAFbänken kommer också partiklar in och dessutom uppstår turbulens i den sterila luftströmmen på grund av själva armrörelsen. • Alla utensilier ska placeras bakom de främre hålen i arbetsytan. Fyll aldrig arbetsutrymmet helt. Varje föremål som placeras på arbetsytan kommer att skapa turbulens i den sterila luftströmmen. • Allt arbete utförs bakom de främre hålen i arbetsytan. • Används långärmad skyddsrock, ska ärmarna sluta tätt om handlederna. Den luft, som kommer ut ur ärmen när den läggs på arbetsytan, kommer med större hastighet än den 4
laminära luftströmmen, varför den ”orena” luften från ärmen kommer att passera över arbetsytan och produkten. • Rör inte armar, händer eller icke-sterila utensilier över öppna odlingsflaskor / Petriskålar. Partiklar från de ”orena” föremålen riskerar att föras med den laminära luftströmmen ner i odlingsflaskorna / Petriskålarna. • Undvik hantering av kraftigt värmeavgivande produkter eller hjälpmedel eftersom de orsakar turbulens i luftströmmen. • Bänken får aldrig vara uppställningsplats. Använd transportvagn utanför, materialsluss e d. Inte heller ovanpå bänken får material placeras. • Stora maskiner o d bör placeras utanför LAF-zonen så att endast kritiska operationer utföres i zonen. • Ergonomiska aspekter är viktiga - en trött operatör slarvar lätt. Bra stol, rätt sitthöjd, armställning osv. • Placera bänken så att direkt drag mot arbetsöppningen undviks. • Placera heller inte bänken på plats där många människor passerar. Innan arbetet påbörjas • Ca 15 min. innan arbetet påbörjas startas fläkten och får gå med full hastighet. Den gröna indikeringslampan visar att bänken fungerar korrekt. • Arbetsutrymmet görs rent och desinficeras noggrant. Använd 70%-ig etanol eller liknande. Använd helst trasor som inte luddar. Till front- och sidorutor används normalt desinfektionsmedel -aldrig kloroform. Använd alltid mjuk trasa, som inte repar rutorna. • Produkter och hjälpmedel, som behövs för arbetsmomentet, rengörs och desinficeras -- om nödvändigt -- innan de placeras i arbetsutrymmet. • Den höj- och sänkbara frontrutan placeras i rätt arbetsläge och skall så förbli under hela arbetspasset. De hjälpmedel, som behövs för att utföra arbetet placeras inom bekvämt räckhåll. • Nödvändig personlig utrustning för både operatör och produkt, t.ex. handskar, mask, visir eller annan renrumsutrustning, tas på.
Efter avslutat arbete Produkt, tillhörande hjälpmedel samt arbetsutrymmet rengörs grundligt igen. Torka av fläkten noga och låt den gå ca 15 min. Låt eventuellt fläkten gå ytterligare en stund med reducerad hastighet. 5
Underhåll fordras för säkerhet I en LAF-bänk är luftflödets storlek och förfiltrets samt HEPA-filtrets funktion avgörande för funktionen. Genom filtrets gradvisa igensättning minskar luftflödet. Förfiltret måste bytas och fläktvarvtalet måste ev. korrigeras. Då HEPA-filtret måste bytas gäller att det nya filtret anslutes absolut tätt. Vis arbete med riskämnen tillkommer speciella avdödnings- och/eller filterbytes-åtgärder. LAF-bänkar i Rena Rum av hög klass behöver mycket sällan få HEPA-filtren bytta, livslängder om 10-20 år rapporteras.
Rengöring och desinficering För att förhindra en anhopning av mikroorganismer, måste cellodlingslaboratoriet totalrengöras och desinficeras innan arbetet påbörjas och därefter en gång per kvartal. Detta innebär totalrengöring med efterföljande desinficering omfattande tak, väggar, golv, stolar, skåp, lådor, hyllor, alla apparatur, CO2-inkubator och andra inventarier i laboratoriet. Orsaken till att man måste göra rent före desinficeringen, är att damm, smuts och intorkat organiskt material kan skydda mikroorganismerna och hindra desinficeringsmedlet från att komma i kontakt med dem. Dessutom avlägsnas genom rengöringen en del mikroorganismer som finns, så att det vid desinficeringens början inte är tal om några större mängder av mikroorganismer. Cellodlingslaboratoriet ska rengöras noggrant varje dag - om möjligt sist på dagen. Under nattens lopp tar LAF-bänken och eventuella luftreningsanläggningar hand om partiklar som virvlat upp vid rengöringen. Man använder rengöringsmedel som normalt används på laboratorier. Den dagliga rengöringen omfattar utvändig avtorkning av apparatur och arbetsbänkar samt golvtvätt. Daglig kemisk desinficering av golv och andra större ytor bör inte förekomma, dels för att det saknas dokumentation om effekten av detta, dels för att besvären och kostnaderna vid användning av kemiska desinficeringsmedel på större ytor är stora. Vid synlig smuts eller spill av infekterat material, kan man desinficera själva fläcken före rengöring. Handskar bör alltid användas vid bruk av kemiska desinficeringsmedel. Effekten av ett desinficeringsmedel beror dels på koncentrationen, dels på den tid medlet är i direkt kontakt med mikroorganismen. Desinficeringsmedel i utspädd form har en begränsad hållbarhet. För att ge desinficeringsmedlet tid att vara i kontakt med mikroorganismerna, tvättas ytorna med en duk som vridits ur i medlet. Ytorna får självtorka. Desinfektionsmedel Etanol, 70%: är särskilt effektivt mot bakterier och svamp. Effekten på virus är mindre väl dokumenterad. Etanol kan vara brandfarligt. Den förångas lätt från en lösning och upprepad 6
inandning av ångorna kan vara hälsovådligt. Alkoholer bör därför inte användas på stora ytor och inte heller i sprayform. Aldehyder: dödar svamp, bakterier, sporer och virus. Metaller angrips inte av aldehyder, men plast och gummi tar upp betydande mängder. Aldehyder är giftiga och irriterar ögon och slemhinnor. De är dessutom allergiframkallande. God ventilation är nödvändig, eftersom aldehyder lätt förångas. Fenoler: enkla fenoler fungerar bäst mot Grampositiva bakterier. Halogen- och alkylsubstituerade fenoler har störst verkan på Gramnegativa bakterier. Metaller angrips inte av fenoler, men gummi och plast tar upp stora mängder. Fenoler är giftiga vid upptagning genom huden och kan ge toxiska reaktioner. Fenoler förångas inte vid rumstemperatur. Oxidationsmedel: kloramin dödar alla bakterier, sporer, svampar och virus. Det verksamma kloröverskottet är bundet och effekten kommer långsamt. Hypoklorit har samma spektrum som kloramin. Det verksamma kloröverskotten är fritt och effekten snabb. Översyror har också ett spektrum motsvarande kloraminets. I utspädd form är oxidationsmedel i allmänhet ofarliga att använda. I koncentrerad form är de frätande och i likhet med starkare utspädda lösningar kan de ge hudirritationer. De klorhaltiga medlen luktat obehagligt. Vid längre tids kontakt med oxidationsmedel kan metaller korrodera. Slutsats: för att uppnå optimal effekt med ett medel som är så lite hälsovådligt som möjligt, rekommenderas kloramin till desinficering av stora ytor. Till mindre arealer rekommenderas 70%-ig etanol. När det gäller utrymmen som är svåra att desinficera med hjälp av en våt duk, kan man använda 70%-ig etanol i sprayform. Att göra sig av med dessa två desinficeringsmedel kräver inga särskilda förhållningsregler. Avfall i form av giftiga desinficeringsmedel kräver särskilda förhållningsregler, vilka bör kontrolleras för varje enskilt ämne.
Inkubatorer I den levande organismen är den optimala temperaturen för mammalieceller 37-37,5°C. Det är välkänt att cellerna börjar ta skada när temperaturen når 42°C. I kultur dör de flesta celler efter ca 10 timmar vid 42°C. Däremot tål de flesta mammalieceller en sänkning av temperaturen mycket bättre. I en kultur tål de flesta celler förvaring vid 20°C i över 24 timmar. Sänks temperaturen till 4°C, börjar cellerna dö efter några timmar. Det finns nästan inga celler som tål ihållande temperatursvängningar. Större svängningar än ±0,3°C bör undvikas. För att uppnå optimal tillväxt och/eller produktion bör celler därför odlas vid konstant temperatur, vanligtvis 37°C. För att temperaturen ska kunna hållas så konstant som möjligt, ska inkubatorkammaren vara omgiven av ett tjockt lager material med god värmeledningsförmåga. När vatten avdunstar från mediet, som cellerna växer i, stiger osmolariteten i mediet. En ökning av osmolariteten med 5-10% kommer att verka toxiskt på de flesta celler. Man bör därför se till att vatten inte förångas från mediet. Om cellerna odlas i öppna flaskor eller ventilerade Petri skålar bör den relativa luftfuktigheten (RH) i inkubationskammaren hållas på 95-98%. Den relativa fuktighetsgraden bestäms som förhållandet mellan vattenångans aktuella partialtryck och mättad vattenångas tryck vid gällande temperatur. 95-98% RH ligger alltså mycket nära mättad vattenånga. Ju högre temperaturen är, desto mer vatten kan luften innehålla i form av ånga. En relativ fuktighetsgrad på nästan 100% innebär en skillnad på 17
2°C på ytorna, vilket skapar kondens på den kallaste ytan. En del av vattenångan i det kallaste området måste nämligen bli till vatten (kondens), då den kallare luften inte kan innehålla lika mycket vatten i förångad form, som den varmare luften. Det är viktigt att kondens inte bildas på ytorna i inkubatorn, eftersom kondens utgör en utmärkt växtmiljö för mikroorganismer. Om gummilisten omkring dörren blir otät, kommer luft från rummet långsamt att strömma in i inkubatorn. Eftersom luften ute i rummet är kallare än luften inne i inkubatorn, kommer det att bildas kondens på ytorna inne i inkubatorn i det område, där den kalla luften kommer in. Finns sådana kondenssträngar på ytorna i inkubatorn, ska gummilisterna bytas ut.
Medium och pH Ett av de viktigaste ingredienserna vid cellodling är mediet. Det ska i princip imitera den vätska som normalt omger cellerna i den intakta organismen. I praktiken använder man ofta det medium som ger den snabbaste celltillväxten eftersom man oftast vill arbeta med en stor cellpopulation. Med snabb celltillväxt följer också genetisk instabilitet. Detta innebär att om odlingsmediet ändras kommer selektionstrycket att förändras och eftersom populationen från början visar upp en viss heterogenitet kan nya populationer få tillväxtfördel och utvecklas därför på bekostnad av övriga celler. Ett basalmedium uppfyller baskraven av salter, vitaminer, aminosyror och glukos förutom de krav på pH, buffertkapacitet och osmolaritet som cellen har. De flesta cellinjer odlas optimalt vid pH 7.2 - 7.5. Många hybridomceller trivs bäst inom pH intervallet 6.9 - 7.3. För att man hela tiden ska kunna kontrollera att de odlade cellerna har ett optimalt pH så innehåller medium ofta en pH indikator, vanligen fenolrött. För att undvika stora variationer av pH i cellernas omgivning innehåller mediet ett buffertsystem. Vanligtvis används kolsyra / bikarbonat som buffert. I öppna system upprätthåller man pH genom inkubation i CO2-inkubatorer med 5% CO2 i luft. I slutna system gasas flaskorna med en blandning av 5% CO2 i luft som kan köpas på tub. I slutna system kan man även använda andra buffertsubstanser ex. hepes som håller pH konstant utan att CO2 behöver tillsättas. Dessa kan då placeras i en termostaterad inkubator.
Att frysa och tina celler Celler som ska långtidförvaras förvaras vid så låg temperatur som möjligt. Flytande kväve är en lämplig förvaringsplats, -196°C i flytande fasen eller vid flytande kvävets ångfas, -156°C. Nedfrysning av celler görs för att behålla celler från låga passager och då speciellt icke transformerade celler. Nedfrysning under -130°C minskar risken för genetiska förändringar och kontamination. Bäst är att frysa celler som befinner sig i log-fas. Nedfrysningen måste vara så skonsam som möjligt eftersom om infrysning går för snabbt (>100°C / min) bildas iskristaller i cellen och om de fryses för långsamt (<1°C/min) så ökar cellens saltkoncentration. Optimalt är 13°C/min ned till -40, -50°C och därefter snabbt ned till -140°C. • Om man lägger kryorören i en volym på 1 liter (t.ex. en frigolitlåda med tjocka väggar och en inre volym av 1 liter) kan -80°C frysen användas till infrysning av celler. • Man kan också ställa rören i +4°C 30-60 min. och därefter flytta dem till -70°C frysen över natten för att sedan flyttas till flytande kvävefrys. 8
Kristallbildningen är den mest skadliga för cellen och för att minska denna tillsätts DMSO (dimetylsulfoxid) som penetrerar cellen och förhindrar kristallbildning. DMSO är toxiskt och därför används högst 10% (v/v). För att så stort antal celler som möjligt ska överleva upptining måste den ske så snabbt som möjligt. Cellerna måste också tvättas fria från DMSO så snart som möjligt.
9
Upptining av celler A. Cellodling - en praktisk handbok, AB Labassco Förlag, 1994 Den önskade ampullen finns i frys- och cellkartotek Gör i ordning medium för utsådd Var mycket noggrann med kontroll av pH. Under upptining är cellerna speciellt känsliga för ett avvikande pH, i synnerhet om det är högt. Snabb upptining är viktig Gör i ordning ett 37°C vattenbad. Den önskade ampullen finns i frysen och förs snabbt över till vattenbadet. Ampullen skakas försiktigt till dess att innehållet är flytande (20-60 sekunder). Därefter förs ampullen över till en bägare med 70%ig etanol och doppas ned helt och hållet. När den tagits upp är den klar att öppnas. Spädning av frysmedium Cellsuspensionen förs över till ett centrifugrör och 10 ml medium med serum tillsätts först droppvis, sedan något snabbare. Suspensionen centrifugeras vid ca 300 g i 10 minuter, supernatanten tas bort och cellerna resuspenderas i färskt medium och förs över till odlingsbehållare. Celltätheten ska vara 3-5 gånger den som vanligtvis används till subkultivering. Tillväxtresultatet noteras i kartoteket efter 24-48 timmar. B. Antibodies - A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1988 Ta fram den frysta ampullen och transportera i en kontainer med kolsyre is. Överför till cellodlingslaboratorium och start tina cellerna i 37°C vattenbad. Håll ampullen lock över vattenytan för att minska risken för kontamination. Blanda försiktigt några gånger. När cellerna nästan tinat helt, för över ampullen till LAF-bänken. Torka av ampullens utsida med 70%-ig etanol och skruva loss korken. Överför försiktigt cellsuspensionen med en steril Pastör pipett. Vidrör inte ampullens sidor med pipetten och överför innehållet till ett centrifugrör innehållande 10 ml medium med 10% FCS (rumstempererad). Centrifugera cellsuspensionen försiktigt (200g) under 5 minuter. Avlägsna supernatanten och resuspendera cellerna med nya 10 ml medium med 10%FCS. Överför cellsuspensionen till en cellodlingsflaska och vidare in i inkubator. Med bra utbyte (recovery), behöver du subkultivera cellerna inom 24 timmar efter utsådd. C. Ampullen tinas i 37°C vattenbad i en minut. Cellerna suspenderas i 10 ml iskallt odlingsmedium och centrifugeras 10 minuter. 10
Cellerna resuspenderas därefter i 5 ml 37°C odlingsmedium och överförs till en odlingsflaska. Nedfrysning av celler A. Framställning av cellsuspension med dubbel cellkoncentration För celler i monolayer: Låt cellerna växa till dess att de är subkonfluenta, d.v.s. till sen logaritmisk fas. Överför cellerna till suspension med hjälp av PBS med 0,25% trypsin eller med PBS med 0,125% trypsin och 0,01% EDTA. Tillsätt serumhaltigt medium till de suspenderade cellerna till dess att serum utgör minst 2% av suspensionen. Centrifugera cellsuspensionen vid ca 300g i 10 minuter. Därefter resuspenderas cellerna i färskt medium med serum och cellkoncentrationen justeras till 2x106 - 2x107 celler per ml. För celler i suspensionskultur: Cellsuspensionen centrifugeras och cellerna resuspenderas i färskt medium med serum och justeras till samma cellkoncentration som ovan. Framställning av frysmedium med dubbel koncentration av kryoskyddande ämnen Tillsätt DMSO eller glycerol i en koncentration av 20% till det färska mediet. Detta ska göras omedelbart före användning och i rumstemperatur, eftersom det sker en viss värmeutveckling. Blandning av cellsuspension och frysmedium Till 1 volym cellsuspension med dubbel koncentration av celler tillsätts samma volym frysmedium med dubbel koncentration av kryoskyddande ämne. Frysmediet tillsätts först droppvis, sedan snabbare och under försiktig omskakning. Detta ska göras i rumtemperatur. Cellsuspensionen innehåller nu 10% glycerol eller DMSO och 106-107 celler per ml. Det tillvägagångssätt som beskrivits ovan är en skonsam och bra metod, som gör det lätt att justera den önskade cellkoncentrationen. Om man använder glycerol bör denna metod användas. Om man använder DMSO kan man ofta få god överlevnad genom att resuspendera cellerna i frysmedium med 10% DMSO direkt efter centrifugering. Var uppmärksam på mediets pH Om det är nödvändigt leds en ström av fuktig luft/CO2 i lämplig blandning över mediet till dess att rätt pH-värde nåtts. B. Använd endast celler som är friska och snabbt delande. På nedfrysningsdagen, ”splitta” cellerna 1:10 i färskt medium. Överför cellerna i ett sterilt kylt centrifugeringsrör. Centrifugera vid 400g under 5 minuter vid 4°C.
11
Avlägsna supernatanten så noggrant som möjligt. Resuspendera cellerna försiktigt i kall 8% DMSO, 92% FCS. Lägre koncentrationer än 5% DMSO ger låga utbyten för de flesta hybridom. Cellkoncentrationen ska vara ca 5x106-5x107 celler/ml. Överför 0,5 ml cellsuspension till en kall frysampull. Placera ampullen i en frysrack vid -70°C över natten, eller omslut ampullen med flera lager papper och placera i -70°C. Normalt är det bäst att inte frysa många ampuller vid samma tillfälle. Lång exponering för DMSO i dessa koncentrationer är toxiskt för cellerna. Celler kan förvaras vid -70°C under kortare tider och förblir viabla under flera veckor eller månader. Långtidsförvaring kräver temperaturer vid -185°C, flytande kväve. Överför ampullen till flytande kväve kärl den följande dagen. C. Cellerna skördas och suspenderas i DMEM med 10% DMSO och 20% fetalt kalvserum. Frysampullerna innehåller 1 ml cellsuspension med 5 miljoner celler/ml. Ampullerna förvaras i flytande kväve.
Tillväxtkurvor Tillväxthastigheten bestäms bäst med hjälp av tillväxtkurvor som visar förändringen i antal celler i en kultur som funktion av tiden. Tillväxtkurvor används t.ex. till: • bestämning av tillväxthastigheten hos celler som etableras i kultur som ett led i karakteriseringen av cellernas egenskaper • kontroll av att en viss celltyps tillväxthastighet inte förändras efter lång tid i kultur • batch-testning: undersökning av om ett givet medium eller mediumsupplement ger goda tillväxtförhållanden • undersökning av hur tillväxten påverkas av behandling med tillväxtfaktorer, hormoner, transfektion med en gen och liknande • terapiförsök med vissa ämnen; ofta föredrar man denna typ av försök assay som ger mer direkta uttryck för celldöd När cellräkning ska ligga till grund för tillväxtkurvor, sås cellerna ut i lämplig koncentration i cellodlingsflaska ex. 5x104 - 5x105 celler / ml i 6-8 ml medium (överskott). Cellkoncentrationen beror på celltypen och det är viktigt att exakt lika antal celler sås i varje flaska. Vanligtvis sår man i tre flaskor och följer sedan varje flaska separat. Man skakar flaska försiktigt för att slå loss cellerna från botten och blandar samtidigt. Vid uttaget tar man endast den volym som ska föras över i en flaska. Om pipetten fylls helt för att sedan fördela cellerna kommer antalet celler att variera eftersom de har en tendens att sedimentera under pipetteringens gång. Tillväxtkurvan baseras på det genomsnittliga cellantalet vid varje räkningsdag - se räkning av celler. 12
Beräkning av fördubblingstid Beräkning av fördubblingstiden görs utifrån den linjära delen av kurvan i figuren nedan. Riktningskoefficienten, k, för linjen beräknas och fördubblingstiden bestäms som ln2/k=0,693/k Riktningskoefficienten kan också bestämmas genom linjär regressionsanalys på de punkter som svarar mot den linjära delen av tillväxtkurvan. Fördubblingsdelen härleds från exponentialfunktionen Nt = N0 ekt, där antal celler vid tiden t Nt N0 antal celler vid tiden 0 t tiden för celler i exponentiell tillväxt k konstant som anger riktningskoefficienten för kurvan Härledning: en fördubbling ⇒ Nt = 2xN0 ⇒ 2N0 = N0 ekt ⇒ 2 = ekt ⇒ ln2 = kt t = ln2 / k
13
Cellräkning Rengör en Bûrker räknekammare och sätt fast täckglaset. Totala antalet celler • Cellerna överförs i suspension via skakning om de sitter löst fast eller via trypsinering om de växer som monolayer. • Ta ut ett litet prov - ex. 0,5 ml - på den välblandade cellsuspensionen. • Tillsätt lika volym kristallviolett-lösning • Blanda röret och överför prov i räknekammaren. • Räkna 5 st A-rutor (motsvarar 0,1 mm3). • Beräkna medeltalet celler i varje ruta. • Antalet celler / stor ruta multipliseras med 104 motsvarar antal celler / ml. Glöm inte att multiplisera med spädningsfaktorn (2). Antalet celler bör ligga mellan 20-300 celler / ruta annars görs räkningen om med koncentrerad eller utspädd cellsuspension om. Kristallviolett lösning som används färgar alla cellkärnor oavsett om cellen lever eller är död. Om man vill bestämma antalet döda celler görs samma räkning med trypanblått (giftigt). Färgning av döda celler med trypanblått • I ett rör blandas lika delar cellsuspension med 0,4% trypanblått. • Låt stå 2-5 min. • Räkna i räknekammare • Beräkna antalet celler som ovan 14
Kloning Ett väsentligt problem vid vävnadsodling är cellernas genotypiska och fenotypiska instabilitet. med detta menas att de odlade cellerna kan förändra såväl sina genetiskt betingade egenskaper som de egenskaper (genotypiska), som inte orsakas av förändringar i arvsmassan utan, till ex., av förändringar i odlingsförhållanden (fenotypiska). På grund av denna genetiska instabilitet måste alla icke-klonade cellinjer samt klonade cellinjer efter ett fåtal passager betraktas som heterogena, d.v.s. att cellpopulationen består av celler med ett varierande antal olika egenskaper. Eftersom man räknar med en mutation per 106 celldelningar, kommer det i det dagliga arbetet med vävnadsodling alltid att finnas en risk för uppkomst av nya varianter. Med kloning avses etablering av en subpopulation av celler, som alla härstammar från en enda cell. Det finns olika typer av kloningsförfarande ex. spädningskloning och kloning i mjuk agar.
Subkultivering Vid odling av celler i ex. flaska kommer cellpopulationen att bli så stor att de måste delas upp på flera flaskor för att tillväxten ska fortsätta att vara optimal. På grund av de förändringar som kan uppstå under cellodling ska man vid varje subkulttivering notera passagenummer såväl som delningsförhållandet (split). Subkultivering av en cellpopulation ska helst ske exakt vid den tidpunkt då cellskiktet blir konfluent (sammanhängande). För monolayerkultur kräver subkultivering att cellerna lösgörs från underlaget på ett skonsamt sätt, så att så många celler som möjligt överlever och behåller sin vidhäftningsförmåga. Två metoder kan användas: en mekanisk och en enzymatisk. Mekanisk subkultivering Genom att skaka odlingsflaskan kan man få löst sittande celler att frigöras till suspension. Denna metod är lämplig för många hybridomcellinjer eftersom de inte fäster så hårt till plasten. Enzymatisk subkultivering - Trypsinering Trypsin är en vanlig enzymatisk metod för subkultivering. Enzymet kan användas i kombination med EDTA. Trypsin hämmas av komponenter i serum. Detta innebär att celler som odlas i seruminnehållande medium måste sköljas med PBS utan Ca2+ och Mg2+ innan trypsinet tillsätts. EDTA förstärker trypsinets verkan genom att komplexbinda ev. kvarvarande kalciumjoner.
15
