“ASPETTI TRADIZIONALI E INNOVATIVI NELLA CLINICA DELLA LEISHMANIOSI NEL CANE”
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ASPETTI CLINICI
VECCHIA TERMINOLOGIA/CLASSIFICAZIONI
Asintomatico Oligosintomatico Paucisitomatico Sintomatico Marcatamente sintomatico ……………. Numero dei segni clinici riscontrati, indipendentemente dalla gravità. Nessuna indicazione sulla risposta immunitaria e sulle alterazioni clinico-patologiche
Stadiazione
Visita clinica
Emocromocitometrico Profilo ematobiochimico
Diagnosi parassitologica
Esame delle urine
STADIAZIONE
Stadiazione dei cani affetti da leishmaniosi Stadio
Definizion e
Descrizione
A
Esposto
Cane senza alterazioni clinico-patologiche dimostrabili, nel quale i test diagnostici parassitologici risultino negativi ma siano evidenziabili titoli anticorpali specifici, non superiori a 4 volte il valore soglia del laboratorio di riferimento. I cani esposti solitamente soggiornano o hanno soggiornato in un’area dove è accertata la presenza di flebotomi
B
Infetto
Cane senza alterazioni clinico-patologiche dimostrabili, nel quale è possibile mettere in evidenza il parassita, con metodi diretti (microscopia, coltura o PCR) e con metodi indiretti (presenza di anticorpi specifici).
C
Malato
Cane infetto, nel quale sia dimostrabile qualunque alterazione clinico- patologica riferibile a leishmaniosi e nel quale sia dimostrabile il parassita o titoli anticorpali superiori a 4 volte il valore soglia del laboratorio di riferimento.
D
Malato con quadro clinico grave
Cane malato affetto da: (i) nefropatia proteinurica; (ii) insufficienza renale cronica; (iii) gravi malattie oculari che possano comportare la perdita funzionale e/o richiedano terapie immuno-depressanti; (iv) gravi malattie articolari che possano invalidare la funzione motoria e/o richiedano terapie immunodepressanti; (v) gravi malattie concomitanti, di natura infettiva, parassitaria, neoplastica, endocrina o dismetabolica.
E
Refrattari o
(Ea) Cane malato refrattario al trattamento (Eb) Cane malato sottoposto a trattamento, con recidiva precoce
Recidivo
Clinical staging of canine leishmaniosis
Incidenza (%) delle alterazioni clinicopatologiche Proteinuria PU/CU A/G Piastrinopenia Iperproteinemia Hct Azotemia GPT Creatinemia Fosf. Alcalina 0
10
20
30
40
50
60
70
ASPETTI DIAGNOSTICI
Andamento esami per Leishmaniosi canina in Campania ANNO ESAMI POSITIVI
%POS. NEGATIVI %NEG. REATTIVI
%REATT.
2004
14.269
2.000
14,0%
10.594
74,2%
1.675
11,7%
2005
11.538
1.567
13,6%
8.186
70,9%
1.785
15,5%
2006
11.790
1.617
13,7%
8.268
70,1%
1.905
16,2%
2007
16.795
1.712
10,2%
12.165
72,4%
2.918
17,4%
2008
17.415
1.374
7,9%
14.522
83,4%
1.519
8,7%
2009
15.899
1.727
10,9%
11.708
73,6%
2.464
15,5%
Detection of CanL infection during time
n-PCR →
Culture/Microscopy →
(100%)
(82%)
Serology →
(82% ≥ 1:160)
Clinical
(45%)
0-22 months (m: 4.5)
m= median time expressed in months This is not a standard pattern
0-2 months (m: 1)
3-14 months (m: 7)
Oliva et al., J.Clin.Microb., 2006
Months
BM Nested PCR
M9
neg
M15
pos
4.9
pos
320
2000
PLT
Patent Asymptomatic Asymptomatic infection
M18
pos
6.5
pos
5120
5000
RBC PLT Inverted A/G ratio
Patent Lymphoadenop Symptomatic athy (popliteal) infection
5000
RBC Inverted A/G ratio
Pale mucosae Loss of weight - Muscle atrophy
M21
pos
BM RT PCR
6.7
Lymphnode EMTM Culture
IFAT
neg
pos
ELISA
Haemato Biochemical parameters
Clinical examination
STATUS
<1/40
Neg.
normal
Mild weight loss
Negative
20480
Patent Symptomatic infection
BM RT PCR
Lymp hnode EMT M Cultur e
IFAT
Haemato Biochemical parameters
Clinical examination
STATUS
PLT
prescapular enlarged
negative
TP
asymptomatic
Subpatent infection
Months
BM Nested PCR
M9
neg
neg
<1/40
M15
Pos
neg
<1/40
M18
neg
neg
<1/40
WBC
Healthy negative
M21
neg
neg
<1/40
RBC TP
Healthy negative
M24
Pos
neg
1/160
M 30
neg
neg
M33
neg
neg
2.9
ELISA
(-)
normal
asymptomatic
Subpatent infection
<1/40
normal
asymptomatic
negative
<1/40
RBC TP
asymptomatic
negative
200/ND
Infezione Patente (attiva, in progressione verso malattia) sintomatici
asintomatici preclinici
? resistenti Estrema difficoltà di isolare il parassita Infezione Serbatoio non attivo ??? subpatente (non attiva, possibile regressione)
Reis AB et al., Res Vet Sci, 2006
ASPETTI TERAPEUTICI
Terapia x CanL Totale Glucantime + Allopurinol
78,8% 16,5%
Glucantime Alone
17,5%
Allopurinol Alone (Zyloric) Levamisole
4,7%
Marbofloxacine
2,8%
Vitamins
2,4%
Ripercol
1,9%
Renal protective
1,4%
Metronizadole
0,9%
Allopurinol + Levamisole
DK/NA
Base: Total sample n=212
0,9%
Other Multiple answer
Veterinari che impiegano ciascun protocollo
9,0% 0,9%
Nuova Molecola
Miltefosina
Mirò et al., 2009
20
Trattamento Glucantime+Allo Milteforan+Allo
Punteggio Clinico
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
0
14
28
84 140
Giorno
CT5 RT-QPCR Lab. di Madrid
Lab. di Milano Parasitic load vs time
70000
600x103
60000
500x103
Parasitic load (parasites/ml)
Parasitic load (parasites/ml)
Parasitic load vs time
50000 40000 30000 20000 10000
400x103
300x103
200x103
100x103
0
0 -10000
-100x103 Day 0
Day 28
Time Milteforan + Allopurinol Glucantime + Allopurinol
Day 0
Day 28
Time Milteforan + Allopurinol Glucantime + Allopurinol
Clinical staging of canine leishmaniosis
Proteinuria (62% )
PROFILASSI
Prevenire è meglio che curare
Le possibili strategie per il controllo della CanL sono inquadrabili in tre punti ritenuti fondamentali:
Lotta agli insetti vetori e prevenzione dalle punture Vaccinazione
dei cani sani
Eliminazione dei cani infetti/ammalati
La prevenzione dalla puntura dei flebotomi vettori è una profilassi che dovrebbe essere sempre applicata, indipendentemente dall’uso di farmaci o vaccini che non possono mai essere considerati risolutivi del problema in assoluto
Maroli et al., 2010
CHE VOGLIAMO OTTENERE CON UN VACCINO? Stimolazione del sistema immune
(per) prevenire infezione/malattia
27
PLASTICITY OF CD4+ T-CELL SUBSETS ALTHOUGH REGULATORY T CELLS PREVENT COMPLETE ELIMINATION OF THE INFECTION, THEY ARE CRUCIAL IN INHIBITING THE DEVELOPMENT OF SECONDARY IMMUNOPATHOLOGY. A BALANCE IS THEREFORE ACHIEVED BETWEEN INFECTION LIMITING. TH1 IMMUNITY AND IMMUNOPATHOLOGY-LIMITING REGULATION. THE REGULATORY ACTIVITY MIGHT COME FROM CLASSICAL INDUCED OR NATURAL TREG, BUT EQUALLY SOME LEISHMANIA-SPECIFIC TH1 CELLS MAY BE RE-PROGRAMMED TO BECOME IL-10 PRODUCING REGULATORY CELLS.
M. Day, CVBD forum, Nice 2011
STERILIZING IMMUNITY
CHRONIC INFECTION
Reis at al., Trends Parasitolgy 2010
CLASSIFYING DOG INFECTION STATUS FOR CHALLENGE STUDIES: Clinical parameters
Clinically healthy
Classification Leishmania Free (PCR-, Leishmania Culture -,Free Clinically well)
Leish DNA positive only (PCR+, Culture -, Clinically well)
Infection Status
No Evidence of active infection
Asymptomatic active infection (PCR +, Culture +, Clinically well)
Clinical signs and/or haematol/biochem abnormalities
Symptomatic active infection (PCR +, Culture +, Symptomatic)
Active infection confirmed (disease)
E I VACCINI ?????
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Vaccini di 1°
Vaccini di 2°
Vaccini di 3°
generazione
generazione
generazione
Parassiti uccisi
Vaccini vivi modificati Vaccini a DNA
Lisati di parassiti
Vaccini che usano
Vaccini basati su
autoclavati (AL)
batteri o virus
antigeni della saliva
ricombinanti (carriers dei flebotomi
di antigeni) Mix di parassiti vivi
Antigeni purificati
ed uccisi
di Leishmania Antigeni ricombinanti
Vaccini sintetici
Leishmune® FML (Fucose-Mannose-Ligand) glicoproteina di membrana adiuvata con saponine EFFICACIA NELLA PREVENZIONE DELLA MALATTIA Blocking Transmission Vaccine (Risultati ancora non confermati)
Immunoterapeutico, da solo od in associazione a farmaci convenzionali
CANILEISH®
ISS
DSCV
Luigi Gradoni Eleonora Fiorentino Gioia Buongiorno
Gaetano Oliva Valentina Foglia Manzillo Silvia Cappiello
Marina Gramiccia Titti Di Muccio Aldo Scalone
Rossella Paparcone Manuela Gizzarelli Paolo Muzj
Carmen Cañavate e Coll. : Istituto Carlos III, Madrid, Spagna Anne Marie Cousinier e Coll. : Virbac, Francia
I punti chiave: • Qual è la tecnologia del vaccino? • E’ sicuro? • E’ efficace? • Uso pratico del vaccino
Excreted-Secreted Proteins (ESP) Vantaggi: Proteine Parassitarie Solubili Conformazione “Naïve” (ottenute da L. infantum) Frazione Definita (molto meno complessa dell’estrazione dell’intero parassita) Pure. Assenza di altre proteine contaminanti Tutte le proteine provengono da Leishmania
Il principale antigene tra le ESP è il PSA (antigene di superficie del parassita) che è presente sia negli amastigoti che nei promastigoti Si ritiene che le proteine ESP siano coinvolte in varie interazioni ospiteparassita
L’adiuvante scelto •
Il miglior
adiuvante selezionato è stato il QA-21
• Si tratta di una frazione altamente purificata della saponina (QA saponin) che conserva un’elevata capacità come adiuvante e nel contempo un buon indice di sicurezza • Si ritiene sia un potente stimolante della risposta dominante Th1 • Il suo analogo utilizzato in medicina umana ( l’adiuvante QS-21) è il candidato per il più avanzato vaccino a livello mondiale contro la malaria : Fase III – GlaxoSmithKline (Ballou WR, 2009, 492).
Studi di campo che utilizzano il modello di infezione naturale (Gradoni L., Oliva G.) • Valutati 90 cuccioli Leishmania-free, vaccinati (45) e trasferiti in aree altamente endemiche (Italia, Spagna) per condurre uno studio di infezione naturale
• I soggetti sono stati controllati per 2 anni dall’immissione nel sito • L’infezione è stata monitorata con test ripetuti ogni 3 mesi: – Coltura della Leishmania (midollo osseo o linfonodo) – PCR (midollo osseo) nested e quantitative real-time PCR – Sierologia – Valutazioni cliniche
• Mediamente il 72% dei cani del gruppo di controllo testati con PCR sono risultati positivi almeno una volta durante lo studio (rispetto al 57% dei cani vaccinati)
Esito dello studio di campo • Riscontrata durante lo studio una più alta carica parassitaria nel gruppo di controllo (Real Time-PCR) • Maggiore probabilità dell’evoluzione verso l’infezione attiva nel gruppo di controllo (p=0.0265) • Maggiore probabilità di manifestare la sintomatologia nel gruppo di controllo (p=0.0466) • Le forme più gravi della malattia si sono manifestate maggiormente nel gruppo di controllo • L’effetto benefico del vaccino è quello di ridurre il rischio* per i cani di diventare soggetti con infezione attiva (rischio più basso di 3.6 volte) o sintomatici (rischio più basso di 4 volte) *Espresso come odds ratio – una misura della probabilità che un soggetto rimanga sano rispetto alla probabilità che sviluppi la malattia – per ogni cane malato sarà 4 volte maggiore la probabilità che siano sani i cani del gruppo dei vaccinati
Uso pratico • Il protocollo vaccinale è di 3 iniezioni con intervalli di 3 settimane seguite un richiamo vaccinale annuale • L’inizio dell’immunità è a 4 settimane dalla terza iniezione • E’ consigliato sverminare gli animali prima che inizi il protocollo
• Solo gli animali siero-negativi per Leishmania possono essere vaccinati • Sono osservati anticorpi transitori rilevabili con IFAT che possono essere differenziati da quelli dovuti all’infezione naturale tramite test sierologici rapidi attualmente in valutazione •
L'uso di misure per ridurre l'esposizione ai flebotomi non deve essere assolutamente abbandonato
