THYDIS THYROID DISRUPTING MIXTURES AND EMBRYONIC NEURODEVELOPMENT MELANGES DE PERTURBATEURS THYROÏDIENS: EFFETS SUR LE DEVELOPPEMENT NEURONAL EMBRYONNAIRE PNRPE meeting 19/09/14 Responsable scientifique: Demeneix, Barbara, Directrice de l’ UMR 7221 MNHN/ CNRS, CP n°32 - 7 Rue Cuvier 75231 Paris CEDEX 5 France Tel: + 33 1 40 79 36 07 Fax: + 33 1 40 79 36 18 E-mail:
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Augmentation inexpliquée des maladies neuro-développementales 1) Maladies neuro-développementales comme les syndromes liés à l’autisme augmentent exponentiellement à travers le monde (Weintraub, 2011) Avril 2014 dernières statistiques aux USA (ASD): 1 enfant sur 68 et 1 garçon sur 42! Raffinement des méthodes de diagnostique ne peut pas expliquer l’ensemble de cette augmentation Environnement
From Demeneix B, Losing our minds?, in press
Impacts: • sociologique • Économique
2) Augmentation des cas d’hypothyroïdisme congénital (Harris &Pass 2007)
Rôle essentiel des hormones thyroïdiennes pour le développement du cerveau HT
Maternelle
HT
foetale
HT
Maternelle
TH
foetale
Hypothyroïdisme congénital
TH
Maternelle
TH
foetale
Crétinisme
TH
Maternelle
HT
foetale
Développement cérébral normal
Hypothyroïdisme Maternel
Quels sont les effets d’un hypothyroïdisme maternel?
Niveaux d’HT maternelles pendant les premiers mois de grossesse et le développement neuronal Epidémiologie HT Hypothyroïdisme maternel Premier trimestre Avant la formation de la glande thyroïde (24ème semaine)
Score QI (Haddow et al., 1999)
Risque d’autisme (âge 5 ans) (Roman et al., 2013)
Retard dans le développement psycho-moteur des enfants (Pop et al, 1999)
Niveau cellulaire
Perturbateurs thyroïdiens pendant la grossesse?
Migration Neuronale (cortex) Différenciation des interneurones GABAergic Manque de projections des cellules de Purkinje (cervelet)
Perturbateurs thyroïdiens pendant le développement embryonnaire: une réalité! Triclosan
BPA
Diethyl hexyl phtalate (DEHP) Dibutylphtalate
Benzophenone-3 PCB-153
4-4’-DDE
perchlorate PBDEs
Woodruff et al. 2011; Jensen et al., 2012
Et tous les autres …
Comment détecter les molécules agissant sur la signalisation thyroïdienne et étudier leurs effets sur le développement neuronal? 1) Détecter le potentiel perturbateur thyroïdien des molécules retrouvées dans le liquide amniotique seules ou en mixture (test XETA en cous de validation OCDE) 2) Exposer les embryons de xénope aux molécules en mixture: Définir une fenêtre d’exposition minimale étudier avec une approche gènes/candidats les effets sur: –gènes dérégulés chez les patients autistes –gènes de la signalisation thyroïdienne
3) Utiliser la mixture définie à la concentration définie, sur un modèle mammifère et étudier les transcrits des gènes du cortex et du cervelet (approche large échelle RNA seq)
Plan de travail TASK 1: Effects of contaminants on TH signalling XETA
Embryonic development (qPCR)
TASK 2: Window of exposure characterization. Embryonic development (qPCR)
TASK3: Embryonic exposure in mice . RNA seq on newborn’brains
Détecter le potentiel perturbateur thyroïdien de molécules chimiques: XETA traitement
renouvellements
Mesures de la fluorescence
Plaque 6 puits
n = 15 t par groupe
24h
48h
72h Plaque 96 puits
Fini et al., 2007 Tohme et al., 2010
T3
T3
EDC
treatment
renewal
renewal
DEHP
n = 15 t 24h
per group
48h
72h
Normalized fluorescene Units
Concentration mesurée dans le liquide amniotique: 0.11 10-6 M Usage restreint dans l’UE (Reach 143/2011). (Huang et al., 2014) Limite 21/02/2015 *** *
400
Potentialise l’effet T3 : 10-7M , 10-6M
300
200
Titration des transporteurs sanguins? Inhibition des désiodases?
100
0
DEHP (log) T 3 5nM
-
-8
-7
-6
-
-8
-7
-6
-
-
-
-
+
+
+
+
Pool de 3 expériences indépendantes n=45/par boite : ANOVA
treatment
renewal
renewal
n = 15 t per group
24h
48h
72h
Triclosan
Concentration mesurée dans le liquide amniotique: 0.7 10-7 M (Philippa et al., 2013)
ctrl
T3
T3+TCL 10-7M
Potentialise l’effet T3 : 10-7M Titration des transporteurs sanguins? Inhibition des désiodases?
Pool de 2 expériences indépendantes n=30/par boite : ANOVA
treatment renewal renewal
n = 15 t per group
24h
48h
72h
PCB-153
Un des PCBs les plus présents dans le sang du cordon ombilical et dans le liquide amniotique (0.2 10-8M)
Forme en U Potentialise l’effet T3 à 1012M, 10-6M et 10-5M
Pool de 3 expériences indépendantes n=45/par boite : ANOVA
treatment
renewal
PFOS
renewal
Measurement (plate reading)
n = 15 t 24h
per group
48h
72h
Concentration mesurée dans le liquide amniotique 0.8 10-8M Jensen et al., 2012 *
Normalized fluorescence Units
400 ** 300
Courbe en U inversé
200
Potentialise l’effet T3 à 10-10M et inhibe l’effet T3 à 10-5M.
100
0 PFOS T 3 5nM
-
-12
-10
-8
-6
-5
-
-12
-10
-8
-6
-5
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
treatment renewal renewal
n = 15 t per group
Benzophenone 3 24h
48h
72h
Concentration mesurée dans le liquide amniotqiue :0.86 10-7M (Philippa et al., 2013)
ctrl
T3
T3+BP3 10-6M
Normalized fluorescene Units
400
300
***
Pas d’effet significatif détecté
200
100
0 BP-3 (log)
-
-8
-7
-6
-
-8
-7
-6
T 3 5nM
-
-
-
-
+
+
+
+
Pool de 3 expériences indépendantes n=45/par boite : ANOVA
Molécules présentes dans le liquide amniotique et testées seules Inactive
Active Triclosan : active at 10-7M
Benzophenone 3: inactive 2-Napthol : inactive Bisphenol A : inactive at low doses Dibutylphthalate: inactive MEHP: inactive Lead: inactive
DEHP active at 10-7M; 10-6M Methylmercury : active 10-7M PFOS active (inverted U shape 10-10M; 10-5M) PCB-153: active U shape 10-12M PFOA: active 10-6M Hexobromochlorine(HCB) active (107M) BDE 209 : active 10-6M HBCD :agonist (high dose 10-5M) DEHA: active (inverted U Shape 1010M)
Importance du contrôle de la disponibilité en HTs Une diminution ou une augmentation de la disponibilité en HTs peut être délétère lors du développement cérébral. HTs ont un rôle dans la différenciation cellulaire des cellules souches neurales
Amniotic fluid mixture effect (15 chemicals) Amniotic fluid mixture-29/08/14
BPA triclosan BP-3 4-4'DDE HCB perchlorate DEHP DBP bde209 PCB 153 2-Naphtol PFOS PFOA Methylmercure Plomb
0.2 10-8M 0.7 10-7M 0.86 10-7M 0.66 10-9M 0.8 10-11M 0.3 10-8M 0.11 10-6M 0.24 10-6M 0.63 10-9M 0.2 10-8M 0.5 10-8M 0.8 10-8M 0.43 10-8M 0.5 10-7M 0.21 10-9M
Normalized fluorescence units
MIXTURE
concentration mesurée dans le liquide amiotique
*** *** *** * **
600 500 400
*** ** **
300
*) ***
200 100 0
T3 5nM T4 10nM
-
-
-
-
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
NH3 1µM
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
+
Mixture (x)
-
0.1
1
10
-
0.1
1
10
-
-
0.1
1
10
-
1expérience indépendante n=25/par boite : ANOVA
Comment détecter les molécules agissant sur la signalisation thyroïdienne et étudier leurs effets sur le développement neuronal? 1) Détecter le potentiel perturbateur thyroïdien des molécules retrouvées dans le liquide amniotique seules ou en mixture (test XETA en cous de validation OCDE) 2) Exposer les embryons de xénope aux molécules en mixture: Définir une fenêtre d’exposition minimale étudier avec une approche gènes/candidats les effets sur: –gènes dérégulés chez les patients autistes –gènes de la signalisation thyroïdienne
3) Utiliser la mixture définie à la concentration définie, sur un modèle mammifère et étudier les transcrits des gènes du cortex et du cervelet (approche large échelle RNA seq)
Exposition précoce à des perturbateurs affecte l’expression de gènes régulés par les HTs dio3 2.0
First trimester in Human Gastrulation Neurulation
1d
*
1.5
Organogenesis Thyroid gland 2d 3 d formation
1.0
0.5
NF1
NF10
NF24
NF37
NF41 0.0
qPCR
CTRL, T3, DEHP
CTRL
T3 5nM DEHP 0.5 10-6M
Conclusions • Effets de nombreuses molécules sur la signalisation thyroïdienne à des concentrations proches de celles retrouvées dans le liquide amniotique. • Effet de la mixture de molécules à la concentration 10x concentrée (à confirmer) • Mixture à tester sur embryons
Merci pour votre attention! Barbara DEMENEIX, Pr Sébastien LE MEVEL, IE Bilal MUGHAL, PhD student
